第 14章 核酸的物理化学性质
(Physical and chemical properties of nucleic acid)
一、核酸的水解
二、核酸的酸碱性质
三、核酸的紫外吸收
四、核酸的变性、复性及杂交
一、核酸的水解
核酸可被水解的位点有磷酸酯键和糖苷键,
其中糖苷键更易被水解 。
核酸的酸水解
嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳
定, 对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷
键 。 DNA在 pH1.6于 37℃ 对水透析可完全除去嘌呤
碱；在 pH2.8于 100℃ 加热 1h,也可完全除去嘌呤碱 。
为了水解嘧啶糖苷键, 需要较高的温度 。 用甲
酸 （ 98%～ 100%） 密封加热至 175℃ 2h,无论
RNA或 DNA都可以完全水解, 产生嘌呤碱和嘧啶
碱, 缺点是尿嘧啶的回收率较低 。 改用三氟乙酸在
155℃ 加热 60min（ 对 DNA） 或 80min（ 对 RNA）,
嘧啶碱的回收率显著提高 。
核酸的碱水解
RNA的磷酸酯键易被碱水解, 产生核苷酸 。
DNA的磷酸酯键则不易被碱水解 。 这是因为 RNA
的核糖上有 2’－ OH,在碱作用下形成磷酸三酯 。
磷酸三酯极不稳定, 随即水解, 产生核苷 2’,3’
－环磷酸酯 。 该环磷酸酯继续水解产生 2’－核苷
酸和 3’－核苷酸 。
DNA一般对碱稳定, 若在 1mol/L NaOH中加
热至 100℃ 4h,可以得到小分子的寡聚脱氧核苷
酸 。
核酸的酶水解
水解核酸的酶种类很多 。 非特异性水
解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶, 如蛇毒
磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶 。 专一水解
核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶 。 另外还有
非特异水解糖苷键的糖苷酶 。
核酸酶的分类 Ⅰ
?按底物专一性分类：作用于 RNA的称为 RNA酶
（ ribonuclease,RNase） ；作用于 DNA的称为
DNA酶 （ deoxyribonuclease,DNase） 。
?按 对 底 物 作 用 的 方 式 可 分 为 核 酸 内 切 酶
（ endonuclease） 和核酸外切酶 （ exonuclease） 。
少数核酸酶既可内切又可外切 。
核酸酶的分类 Ⅱ
?按磷酸二酯键断裂的方式可将核酸酶分为两类,
一类断裂磷酸二酯键后磷酸保留在 5’位, 一类磷
酸保留在 3’位 。
?作用于双链的为双链酶, 作用于单链的为单链
酶 。 核酸外切酶有 5’→ 3’方向切割的, 也有 3’→ 5’
方向切割的, 分别称为 5’→ 3’外切酶和 3’→ 5’外切
酶 。 还有对特定核苷酸序列部位进行切割的 。
二、核酸的酸碱性质
碱基的解离
胞嘧啶的解离
碱基的解离 Ⅰ
胞嘧啶的解离
碱基的解离 Ⅱ
尿嘧啶的解离
胸腺嘧啶的解离
碱基的解离 Ⅲ
腺嘌呤的解离
鸟嘌呤的解离
核苷的解离
核苷中由于戊糖的存在, 碱基的解离
常数有所下降, 说明糖的存在增强了碱基
上可解离基团的酸性 。
核苷酸的解离
核酸中磷酸基的解离
核苷酸的解离曲线 Ⅰ
核苷酸的解离曲线 Ⅱ
尿苷酸的碱
基的碱性极
弱, 实际上
测不出其含
氮环的解离
曲线, 故不
能形成兼性
离子 。
小
牛
胸
腺DNA
的
滴
定
曲
线
从中间往
两边滴为
曲线 Ⅰ,
非缓冲区
较宽 。
从两边往
中间滴为
曲线 Ⅱ,
非缓冲区
较窄 。
三、核酸的紫外吸收
嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键, 使碱基, 核
苷, 核苷酸, 核酸在 240～ 290nm有强烈的吸收,
最大吸收值在 260nm附近 。
紫外吸收是实验室中最常用的定量测定 DNA
或 RNA浓度的方法 。 对于纯的样品, 只要测出
260nm的 A值即可计算出浓度 。 通常 A值为 1相当
于 50μg/ml双链 DNA,或 40μg/ml单链 DNA或 RNA。
测定紫外吸收值还可以鉴定核酸溶液的纯度 。
纯 DNA的 A260/A280应大于 1.8,纯 RNA应达到 2.0。
若低于此值说明含有杂质 。
摩尔磷吸光系数
有时核酸溶液的紫外吸收以摩尔磷的吸光
度来表示 。 摩尔磷即相当于摩尔核苷酸 。 先测
定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值, 然后求
出摩尔磷吸光系数 。
式中 A为测得的吸光度, c为磷的浓度, L
为比色杯的厚度, W为每升溶液中磷的重量
（ 克 ） 。
WL
A
cL
AP 98.30)( ???
DNA的增色效应和减色效应
一般天然 DNA的 ε(P)为～ 6600,RNA为
7700～ 7800。 单链核酸的 ε(P)比双链核酸的大,
核苷酸单体的 ε(P)更大 。 双链 DNA变性成单链
后 ε(P)值增大, 称为增色效应；复性后 ε(P)值减
小, 称为减色效应 。 这是因为双链结构使碱基
对的 π电子云发生重叠, 减少了对紫外光的吸收 。
DNA
的
紫
外
吸
收
光
谱
1.天然 DNA
2.变性 DNA
3.核苷酸总
吸光度值
四、核酸的变性、复性及杂交
核酸的变性
核酸的变性就是双链之间的氢键断裂, 成
为单链 。 变性主要是双链 DNA变成单链, 也可
以是单链 RNA分子内的局部双链变成单链 。 使
核酸变性的因素有高温, 过酸过碱, 变性剂等 。
常用的核酸变性剂有尿素, 甲醛 。
DNA分子的熔点 Tm
在 DNA分子的热变性中, 随着温度的升高,
当温度达到一定值后, 双链开始解开, 然后有
一个迅速的解链, 成为无规线团, 变性的温度
区间很窄, 我们把双链 DNA解开一半时所需的
温度称为该 DNA的熔点 （ Tm） 。 DNA的 Tm一
般在 82～ 95℃ 之间 。
DNA分子的热变性曲线
影响 DNA分子 Tm的因素
（ 1） DNA的均一性 （ 此点与 Tm无关 ）,异质的
DNA变性温度范围宽, 均质的 DNA变性温度范围窄 。
（ 2） G－ C含量,G－ C之间有 3个氢键, 所以 G－ C
含量越高 Tm越高 。 通过测定 Tm值, 可以推算出
DNA中 G－ C的含量, 其经验公式为 。
（ 3） 介质中的离子强度：一般说离子强度低时 Tm
低, 变性温度范围较宽；离子强度高时 Tm高, 变性
温度范围较窄 。
44.2)3.69( ???? Tmx CG
RNA的变性曲线
RNA只有局部的双螺旋, 所以其 Tm较低,
变性温度范围较宽 。 不管是 DNA还是 RNA，
加入甲酰胺可降低其 Tm值 。 双链 RNA的变性
曲线几乎与双链 DNA相同 。
1.一种浮萍的 18SrRNA
2.酵母的杀伤 RNA（ 双
链 ） 加甲酰胺
3.同 2,但无甲酰胺
DNA的复性
变性 DNA在适当条件下, 可以使两条分
开的单链重新缔合成双链 DNA,这个过程称
为复性 （ renaturation） 。 将热变性的单链
DNA骤然冷却, DNA不能复性, 只有缓慢降
温才能使热变性的 DNA复性, 这个过程又称
为退火 （ annealing） 。
不同 DNA的复性曲线
DNA的杂交
杂交就是以标记了的异源 DNA或 RNA片段为探
针, 检测与之互补的 DNA或 RNA的存在 。
第 15章 核酸的研究方法
(Research methods of nucleic acid)
一,核酸的分离、提纯和定量测定
二,核酸的超速离心
三、核酸的 凝胶电泳
四,核酸的核苷酸序列测定
五,DNA聚合酶链反应（ PCR）
六,DNA的化学合成
一,核酸的分离、提纯
和定量测定
DNA的分离 Ⅰ
真核生物细胞中的染色体 DNA与碱性的组
蛋白结合在一起, 成为核蛋白 （ DNP）, DNP
溶于水和浓盐溶液 （ 如 1mol/L NaCl）, 但不溶
于生理盐水 （ 0.14mol/L NaCl） 。 利用这一性质,
可将细胞破碎后用浓盐溶液提取, 然后用水稀
释至 0.14mol/L,使 DNP纤维沉淀出来 。 用玻璃
棒将 DNP纤维缠绕在棒上, 再经多次溶解和沉
淀以纯化 DNP。
DNA的分离 Ⅱ
用水饱和的苯酚抽提, DNA溶于上层水相,
变性蛋白质沉淀于两相的界面上或停留在酚相
中 。 如此反复操作以除净蛋白质 。 将含 DNA的
水相合并, 在有盐的条件下加 2倍体积的冷乙醇,
将 DNA沉淀出来, 用乙醚或乙醇洗涤沉淀 。 用
此方法可得到纯的 DNA。
用 RNase处理除去残留的 RNA 。 为了得到
大分子的 DNA,应防止核酸酶和机械力对 DNA
的破坏 。
RNA的分离
分离 RNA时要特别注意防止 RNase对 RNA
的降解 。 RNase无处不在, 且不易灭活 。
制备 RNA通常需要注意 3点,
① 所有用于制备 RNA的玻璃器皿都要经过高温
烘烤, 塑料用具须经高压灭菌, 不能高压灭菌的
器具要用 0.1% 焦 碳 酸 二 乙 酯 （ diethyl
pyrocarbonate,DEPC,RNase的不可逆抑制剂 ）
浸泡处理, 再煮沸以除净 DEPC。
② 在破碎细胞的同时加入强的蛋白质变性剂 （ 如
盐酸胍 ） 。
③ 在提取和纯化 RNA的试剂中加入 RNase的抑制
剂 （ 如 RNasin） 。
RNA的分离方法
目前最常用的制备 RNA的方法有两个,
1,用酸性胍盐 /苯酚 /氯仿抽提, 然后用苯酚和氯
仿多次抽提除去蛋白质 。 异硫氰酸胍是极强烈的
蛋白质变性剂 。 此法用于小量制备 RNA。
2,用胍盐 /氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离
心 。 蛋白质密度 <1.33g/cm3,在最上层； DNA密
度在 1.71g/cm3 左右, 位 于 中 间 ； RNA 密度
>1.89g/cm3,沉在底部 。
分离 poly(A)+ RNA通常采用寡聚胸腺嘧啶脱
氧核苷酸亲和层析法 。
核酸含量的测定
?紫外分光光度法
?定磷法
?定糖法
核酸的超速离心 Ⅰ
(核酸密度的测定 )
将 8.0mol/L的 CsCl装入离心管中, DNA样
品溶于 CsCl溶液, 加在离心管顶部 。 以 45000转
/分的速度离心 16小时以上, 此时离心管中形成
线性的 CsCl密度梯度, 底部为 1.80g/cm3,顶部
为 1.55g/cm3。 DNA样品带停留在与之密度相应
的位置 。 根据此位置的 CsCl密度, 可知 DNA的
密度 。
核酸的超速离心 Ⅱ
也可用一已知密度的 DNA与待测密度的
DNA一起离心, 根据两条带的位置及已知 DNA
的密度, 计算出待测 DNA的密度 。
式中 ρ和 ρ0分别为待测 DNA和标准 DNA的密
度, r和 r0分别为待测 DNA和标准 DNA区带位置
与离心轴心的距离, ω为角速度 （ 弧度 /秒 ） 。
(核酸密度的测定 )
1020220 10)(2.4 ????? rr???
核酸的超速离心 Ⅲ
含 G－ C多的 DNA密度大, DNA中 G－ C
的百分含量与其浮力密度呈正比, 所以测出了
DNA的浮力密度就可以计算出其 G－ C百分含
量 。
（ 测定 DNA中 G－ C含量 ）
6 5 8.11 0 0.0 ?? ? CGx?
100.0
658.1??
?
?
CGx
核酸的超速离心 Ⅳ
RNA只有局部双螺旋, 它的浮力密度比双
链 DNA高, 双链 DNA又比蛋白质的密度高,
双链 DNA变性后成为单链, 密度增加 。 利用密
度梯度离心可以研究核酸分子的构象变化及其
动力学过程 。
（ 溶液中核酸构象的研究 ）
核酸的超速离心 Ⅴ
离心时加入溴
化乙锭, 离心后用
紫外光照射, 可观
察到 DNA条带的
红色荧光 。
（ 纯化核酸 ）
三、核酸的凝胶电泳
(琼脂糖凝胶电泳 )
以琼脂糖凝胶为支持物时, DNA电泳的迁移
率决定于以下因素,
（ 1） 核酸分子的大小 。 迁移率与分子量成反比 。
（ 2） 胶浓度 。 胶浓度大则网孔小, 核酸的迁移率
变小 。
（ 3） DNA的构象 。 一般条件下超螺旋的 DNA迁移
率 >线性 DNA>开环 DNA。 但凝胶中的溴乙锭浓度
有此有影响 。
琼脂糖凝胶电泳
在进行 RNA电泳时, 常加入甲醛 。 加甲醛的
目的是使 RNA变性, 而不是使蛋白质变性 。
电泳后将胶浸泡在溴乙锭溶液中染色, 紫外
光照射下观察电泳结果 。 也可在制胶时就加入溴
乙锭, 这样可以在电泳过程中用紫外灯照射, 观
察电泳的进程 。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳
分辨率高, 可分辨长度差 1个核苷酸的两个
DNA分子 。 但聚丙烯酰胺凝胶只能分离小分子
量的 DNA。 电泳后除了用溴乙锭染色外, 还可
以用银染, 银染的灵敏度比溴乙锭高 。
(Physical and chemical properties of nucleic acid)
一、核酸的水解
二、核酸的酸碱性质
三、核酸的紫外吸收
四、核酸的变性、复性及杂交
一、核酸的水解
核酸可被水解的位点有磷酸酯键和糖苷键,
其中糖苷键更易被水解 。
核酸的酸水解
嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳
定, 对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷
键 。 DNA在 pH1.6于 37℃ 对水透析可完全除去嘌呤
碱；在 pH2.8于 100℃ 加热 1h,也可完全除去嘌呤碱 。
为了水解嘧啶糖苷键, 需要较高的温度 。 用甲
酸 （ 98%～ 100%） 密封加热至 175℃ 2h,无论
RNA或 DNA都可以完全水解, 产生嘌呤碱和嘧啶
碱, 缺点是尿嘧啶的回收率较低 。 改用三氟乙酸在
155℃ 加热 60min（ 对 DNA） 或 80min（ 对 RNA）,
嘧啶碱的回收率显著提高 。
核酸的碱水解
RNA的磷酸酯键易被碱水解, 产生核苷酸 。
DNA的磷酸酯键则不易被碱水解 。 这是因为 RNA
的核糖上有 2’－ OH,在碱作用下形成磷酸三酯 。
磷酸三酯极不稳定, 随即水解, 产生核苷 2’,3’
－环磷酸酯 。 该环磷酸酯继续水解产生 2’－核苷
酸和 3’－核苷酸 。
DNA一般对碱稳定, 若在 1mol/L NaOH中加
热至 100℃ 4h,可以得到小分子的寡聚脱氧核苷
酸 。
核酸的酶水解
水解核酸的酶种类很多 。 非特异性水
解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶, 如蛇毒
磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶 。 专一水解
核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶 。 另外还有
非特异水解糖苷键的糖苷酶 。
核酸酶的分类 Ⅰ
?按底物专一性分类：作用于 RNA的称为 RNA酶
（ ribonuclease,RNase） ；作用于 DNA的称为
DNA酶 （ deoxyribonuclease,DNase） 。
?按 对 底 物 作 用 的 方 式 可 分 为 核 酸 内 切 酶
（ endonuclease） 和核酸外切酶 （ exonuclease） 。
少数核酸酶既可内切又可外切 。
核酸酶的分类 Ⅱ
?按磷酸二酯键断裂的方式可将核酸酶分为两类,
一类断裂磷酸二酯键后磷酸保留在 5’位, 一类磷
酸保留在 3’位 。
?作用于双链的为双链酶, 作用于单链的为单链
酶 。 核酸外切酶有 5’→ 3’方向切割的, 也有 3’→ 5’
方向切割的, 分别称为 5’→ 3’外切酶和 3’→ 5’外切
酶 。 还有对特定核苷酸序列部位进行切割的 。
二、核酸的酸碱性质
碱基的解离
胞嘧啶的解离
碱基的解离 Ⅰ
胞嘧啶的解离
碱基的解离 Ⅱ
尿嘧啶的解离
胸腺嘧啶的解离
碱基的解离 Ⅲ
腺嘌呤的解离
鸟嘌呤的解离
核苷的解离
核苷中由于戊糖的存在, 碱基的解离
常数有所下降, 说明糖的存在增强了碱基
上可解离基团的酸性 。
核苷酸的解离
核酸中磷酸基的解离
核苷酸的解离曲线 Ⅰ
核苷酸的解离曲线 Ⅱ
尿苷酸的碱
基的碱性极
弱, 实际上
测不出其含
氮环的解离
曲线, 故不
能形成兼性
离子 。
小
牛
胸
腺DNA
的
滴
定
曲
线
从中间往
两边滴为
曲线 Ⅰ,
非缓冲区
较宽 。
从两边往
中间滴为
曲线 Ⅱ,
非缓冲区
较窄 。
三、核酸的紫外吸收
嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键, 使碱基, 核
苷, 核苷酸, 核酸在 240～ 290nm有强烈的吸收,
最大吸收值在 260nm附近 。
紫外吸收是实验室中最常用的定量测定 DNA
或 RNA浓度的方法 。 对于纯的样品, 只要测出
260nm的 A值即可计算出浓度 。 通常 A值为 1相当
于 50μg/ml双链 DNA,或 40μg/ml单链 DNA或 RNA。
测定紫外吸收值还可以鉴定核酸溶液的纯度 。
纯 DNA的 A260/A280应大于 1.8,纯 RNA应达到 2.0。
若低于此值说明含有杂质 。
摩尔磷吸光系数
有时核酸溶液的紫外吸收以摩尔磷的吸光
度来表示 。 摩尔磷即相当于摩尔核苷酸 。 先测
定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值, 然后求
出摩尔磷吸光系数 。
式中 A为测得的吸光度, c为磷的浓度, L
为比色杯的厚度, W为每升溶液中磷的重量
（ 克 ） 。
WL
A
cL
AP 98.30)( ???
DNA的增色效应和减色效应
一般天然 DNA的 ε(P)为～ 6600,RNA为
7700～ 7800。 单链核酸的 ε(P)比双链核酸的大,
核苷酸单体的 ε(P)更大 。 双链 DNA变性成单链
后 ε(P)值增大, 称为增色效应；复性后 ε(P)值减
小, 称为减色效应 。 这是因为双链结构使碱基
对的 π电子云发生重叠, 减少了对紫外光的吸收 。
DNA
的
紫
外
吸
收
光
谱
1.天然 DNA
2.变性 DNA
3.核苷酸总
吸光度值
四、核酸的变性、复性及杂交
核酸的变性
核酸的变性就是双链之间的氢键断裂, 成
为单链 。 变性主要是双链 DNA变成单链, 也可
以是单链 RNA分子内的局部双链变成单链 。 使
核酸变性的因素有高温, 过酸过碱, 变性剂等 。
常用的核酸变性剂有尿素, 甲醛 。
DNA分子的熔点 Tm
在 DNA分子的热变性中, 随着温度的升高,
当温度达到一定值后, 双链开始解开, 然后有
一个迅速的解链, 成为无规线团, 变性的温度
区间很窄, 我们把双链 DNA解开一半时所需的
温度称为该 DNA的熔点 （ Tm） 。 DNA的 Tm一
般在 82～ 95℃ 之间 。
DNA分子的热变性曲线
影响 DNA分子 Tm的因素
（ 1） DNA的均一性 （ 此点与 Tm无关 ）,异质的
DNA变性温度范围宽, 均质的 DNA变性温度范围窄 。
（ 2） G－ C含量,G－ C之间有 3个氢键, 所以 G－ C
含量越高 Tm越高 。 通过测定 Tm值, 可以推算出
DNA中 G－ C的含量, 其经验公式为 。
（ 3） 介质中的离子强度：一般说离子强度低时 Tm
低, 变性温度范围较宽；离子强度高时 Tm高, 变性
温度范围较窄 。
44.2)3.69( ???? Tmx CG
RNA的变性曲线
RNA只有局部的双螺旋, 所以其 Tm较低,
变性温度范围较宽 。 不管是 DNA还是 RNA，
加入甲酰胺可降低其 Tm值 。 双链 RNA的变性
曲线几乎与双链 DNA相同 。
1.一种浮萍的 18SrRNA
2.酵母的杀伤 RNA（ 双
链 ） 加甲酰胺
3.同 2,但无甲酰胺
DNA的复性
变性 DNA在适当条件下, 可以使两条分
开的单链重新缔合成双链 DNA,这个过程称
为复性 （ renaturation） 。 将热变性的单链
DNA骤然冷却, DNA不能复性, 只有缓慢降
温才能使热变性的 DNA复性, 这个过程又称
为退火 （ annealing） 。
不同 DNA的复性曲线
DNA的杂交
杂交就是以标记了的异源 DNA或 RNA片段为探
针, 检测与之互补的 DNA或 RNA的存在 。
第 15章 核酸的研究方法
(Research methods of nucleic acid)
一,核酸的分离、提纯和定量测定
二,核酸的超速离心
三、核酸的 凝胶电泳
四,核酸的核苷酸序列测定
五,DNA聚合酶链反应（ PCR）
六,DNA的化学合成
一,核酸的分离、提纯
和定量测定
DNA的分离 Ⅰ
真核生物细胞中的染色体 DNA与碱性的组
蛋白结合在一起, 成为核蛋白 （ DNP）, DNP
溶于水和浓盐溶液 （ 如 1mol/L NaCl）, 但不溶
于生理盐水 （ 0.14mol/L NaCl） 。 利用这一性质,
可将细胞破碎后用浓盐溶液提取, 然后用水稀
释至 0.14mol/L,使 DNP纤维沉淀出来 。 用玻璃
棒将 DNP纤维缠绕在棒上, 再经多次溶解和沉
淀以纯化 DNP。
DNA的分离 Ⅱ
用水饱和的苯酚抽提, DNA溶于上层水相,
变性蛋白质沉淀于两相的界面上或停留在酚相
中 。 如此反复操作以除净蛋白质 。 将含 DNA的
水相合并, 在有盐的条件下加 2倍体积的冷乙醇,
将 DNA沉淀出来, 用乙醚或乙醇洗涤沉淀 。 用
此方法可得到纯的 DNA。
用 RNase处理除去残留的 RNA 。 为了得到
大分子的 DNA,应防止核酸酶和机械力对 DNA
的破坏 。
RNA的分离
分离 RNA时要特别注意防止 RNase对 RNA
的降解 。 RNase无处不在, 且不易灭活 。
制备 RNA通常需要注意 3点,
① 所有用于制备 RNA的玻璃器皿都要经过高温
烘烤, 塑料用具须经高压灭菌, 不能高压灭菌的
器具要用 0.1% 焦 碳 酸 二 乙 酯 （ diethyl
pyrocarbonate,DEPC,RNase的不可逆抑制剂 ）
浸泡处理, 再煮沸以除净 DEPC。
② 在破碎细胞的同时加入强的蛋白质变性剂 （ 如
盐酸胍 ） 。
③ 在提取和纯化 RNA的试剂中加入 RNase的抑制
剂 （ 如 RNasin） 。
RNA的分离方法
目前最常用的制备 RNA的方法有两个,
1,用酸性胍盐 /苯酚 /氯仿抽提, 然后用苯酚和氯
仿多次抽提除去蛋白质 。 异硫氰酸胍是极强烈的
蛋白质变性剂 。 此法用于小量制备 RNA。
2,用胍盐 /氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离
心 。 蛋白质密度 <1.33g/cm3,在最上层； DNA密
度在 1.71g/cm3 左右, 位 于 中 间 ； RNA 密度
>1.89g/cm3,沉在底部 。
分离 poly(A)+ RNA通常采用寡聚胸腺嘧啶脱
氧核苷酸亲和层析法 。
核酸含量的测定
?紫外分光光度法
?定磷法
?定糖法
核酸的超速离心 Ⅰ
(核酸密度的测定 )
将 8.0mol/L的 CsCl装入离心管中, DNA样
品溶于 CsCl溶液, 加在离心管顶部 。 以 45000转
/分的速度离心 16小时以上, 此时离心管中形成
线性的 CsCl密度梯度, 底部为 1.80g/cm3,顶部
为 1.55g/cm3。 DNA样品带停留在与之密度相应
的位置 。 根据此位置的 CsCl密度, 可知 DNA的
密度 。
核酸的超速离心 Ⅱ
也可用一已知密度的 DNA与待测密度的
DNA一起离心, 根据两条带的位置及已知 DNA
的密度, 计算出待测 DNA的密度 。
式中 ρ和 ρ0分别为待测 DNA和标准 DNA的密
度, r和 r0分别为待测 DNA和标准 DNA区带位置
与离心轴心的距离, ω为角速度 （ 弧度 /秒 ） 。
(核酸密度的测定 )
1020220 10)(2.4 ????? rr???
核酸的超速离心 Ⅲ
含 G－ C多的 DNA密度大, DNA中 G－ C
的百分含量与其浮力密度呈正比, 所以测出了
DNA的浮力密度就可以计算出其 G－ C百分含
量 。
（ 测定 DNA中 G－ C含量 ）
6 5 8.11 0 0.0 ?? ? CGx?
100.0
658.1??
?
?
CGx
核酸的超速离心 Ⅳ
RNA只有局部双螺旋, 它的浮力密度比双
链 DNA高, 双链 DNA又比蛋白质的密度高,
双链 DNA变性后成为单链, 密度增加 。 利用密
度梯度离心可以研究核酸分子的构象变化及其
动力学过程 。
（ 溶液中核酸构象的研究 ）
核酸的超速离心 Ⅴ
离心时加入溴
化乙锭, 离心后用
紫外光照射, 可观
察到 DNA条带的
红色荧光 。
（ 纯化核酸 ）
三、核酸的凝胶电泳
(琼脂糖凝胶电泳 )
以琼脂糖凝胶为支持物时, DNA电泳的迁移
率决定于以下因素,
（ 1） 核酸分子的大小 。 迁移率与分子量成反比 。
（ 2） 胶浓度 。 胶浓度大则网孔小, 核酸的迁移率
变小 。
（ 3） DNA的构象 。 一般条件下超螺旋的 DNA迁移
率 >线性 DNA>开环 DNA。 但凝胶中的溴乙锭浓度
有此有影响 。
琼脂糖凝胶电泳
在进行 RNA电泳时, 常加入甲醛 。 加甲醛的
目的是使 RNA变性, 而不是使蛋白质变性 。
电泳后将胶浸泡在溴乙锭溶液中染色, 紫外
光照射下观察电泳结果 。 也可在制胶时就加入溴
乙锭, 这样可以在电泳过程中用紫外灯照射, 观
察电泳的进程 。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳
分辨率高, 可分辨长度差 1个核苷酸的两个
DNA分子 。 但聚丙烯酰胺凝胶只能分离小分子
量的 DNA。 电泳后除了用溴乙锭染色外, 还可
以用银染, 银染的灵敏度比溴乙锭高 。
