实验十 植物－微生物相互作用原理及其生态学和农学意义——根瘤菌和菌根真菌侵染状况的调查 一、目的： 自然界中植物与真菌、细菌、放线菌等微生物共生的现象非常普遍，这些共生关系通常是建立在植物向微生物提供碳水化合物，而微生物为植物提供氮、磷等营养元素基础之上的，共生关系能够保证植物和微生物正常生长。 全世界工业合成氮肥中的氮只占固氮总量的20％，绝大多数是通过生物固氮进行的。最常见的是生活在豆科植物根部的根瘤菌，能将大气中的游离态的氮，经过固氮酶的作用生成氮的化合物，以利于植物的利用。 丛枝菌根真菌能够与陆地上80％以上的植物建立共生关系，它增加帮助植物从土壤中获得根系无法吸收的磷，从而改善植物的磷营养状况，促进植物生长。据前人研究，丛枝菌根真菌能够提供给植物生长所需的90％以上的磷，50％以上的锌和铜。 很多研究表明，豆科植物同时接种根瘤菌和丛枝菌根真菌能够起到提高固氮酶活性，增加结瘤数和固氮量，提高植株磷含量的双重效果。因此，根瘤菌、丛枝菌根真菌菌剂是十分重要的生物肥料，在农业和自然生态体系中有着重要地位，在无公害农业、生态农业和土壤改良与保护方面有着广阔的应用前景。本实验的目的是：通过观察、检测豆科植物根瘤形态、数量、根瘤活性、根瘤菌结瘤能力；菌根真菌的结构和侵染率，了解植物与微生物共生现象的普遍性和重要性。 二、操作步骤： 根瘤菌接种和观察： 大豆种子表面消毒（用10％双氧水浸泡10分钟；或者用95％浸1分钟后再用0.2-0.4%HgCl2浸泡15分钟，无菌水洗净）后，在菌液中浸泡一下，立刻播入基质中。 如果用石英砂或者蛭石作为培养基质，则需要定期补充低氮营养液。低氮营养液的配方为如下，每天或者每隔一天浇一次。 低氮营养液配方（g/1000ml） Ca(NO3)2·4H2O 0.03g CaCl2·2H2O 0.10g KH2PO4 0.1g Na2HPO4·12H2O 0.15g MgSO4·7H2O 0.12g 柠檬酸铁 0.05g 蒸馏水 1000ml 微量元素 1ml 微量元素配方 H3BO3 2.86g MnSO4 1.81g ZnSO4 0.22g CuSO4 0.80g H2MnO4 0.02g 蒸馏水 1000ml 植株生长20－30天后，连根挖出植株，洗去表面的基质。或者也从田里挖取植株根系，洗去表面的土壤。 观察是有无根瘤存在，评价接种是否成功。观察、记录根瘤的数量、在根系上的分布、色泽和形状等。根瘤还可以摘下称重，并用乙炔还原发测量固氮能力。按下式计算结瘤率： 结瘤率（％）＝结瘤株数×100/接种总株数 观察根瘤内部的颜色：根瘤刚形成是是白色，并且是无效的（不具有固氮能力）；随着根瘤继续生长，根瘤内部可以见到粉红色的成分，表明有豆血红蛋白形成。接着根瘤裂开病转为棕色。到植物衰老，生命结束时，未开裂的根瘤固氮活性愈来愈弱，无活性的血红蛋白取代了豆血红蛋白，根瘤内部变为绿色。根瘤的颜色可以定性评价其潜在固氮能力。 将根瘤用刀片切成两半，颜色可归类为：白色、粉红色、棕色和绿色，结果用百分数表示。 丛枝菌根真菌侵染、结构的观察 洗根：将根从土壤中洗出，剪成1cm长的根段（取样量0.5-1.0g） 消煮、透明：根段用10%KOH浸泡，90℃ 水浴中透明1h，水洗 酸化：用2%HCl浸泡5min 染色：直接加入0.05%曲利苯蓝（或酸性品红），90℃ 水浴30min，水洗 脱色：置于盛有乳酸甘油溶液的培养皿脱色 制片：在培养皿中将染色后的根段分散均匀，随机选取30条根段，分别排放在2张载玻片上，用30%的甘油，加盖盖玻片在100-400×的显微镜下观察丛枝菌根真菌的结构。 菌根侵染率测量： 根段法：根据Trouvelot等（1986）的方法，按照菌根侵染和丛枝丰度分级的标准，输入等级参数，用“mycocalc”软件，可计算出真菌侵染潜力（F%），真菌侵染强度（M%），根内泡囊形成率（V%）和丛枝的形成率（A%）。 方格交叉法：将根系转移至培养皿中，解剖镜下观察染成蓝色的根段（即：被侵染了的根段）与网格在纵横两个方向上的交叉点数；同时测量总的根段与网格在纵横两个方向上的交叉点数。用下式计算菌根侵染率： 菌根侵染率（％）＝被侵染的根段的纵横两个方向总交叉点数×100/总根段的交叉点数 实验报告 定性、定量地描述根瘤的基本特征，丛枝菌根真菌的结构特征等