实验十 植物-微生物相互作用原理及其生态学和农学意义——根瘤菌和菌根真菌侵染状况的调查
一、目的:
自然界中植物与真菌、细菌、放线菌等微生物共生的现象非常普遍,这些共生关系通常是建立在植物向微生物提供碳水化合物,而微生物为植物提供氮、磷等营养元素基础之上的,共生关系能够保证植物和微生物正常生长。
全世界工业合成氮肥中的氮只占固氮总量的20%,绝大多数是通过生物固氮进行的。最常见的是生活在豆科植物根部的根瘤菌,能将大气中的游离态的氮,经过固氮酶的作用生成氮的化合物,以利于植物的利用。
丛枝菌根真菌能够与陆地上80%以上的植物建立共生关系,它增加帮助植物从土壤中获得根系无法吸收的磷,从而改善植物的磷营养状况,促进植物生长。据前人研究,丛枝菌根真菌能够提供给植物生长所需的90%以上的磷,50%以上的锌和铜。
很多研究表明,豆科植物同时接种根瘤菌和丛枝菌根真菌能够起到提高固氮酶活性,增加结瘤数和固氮量,提高植株磷含量的双重效果。因此,根瘤菌、丛枝菌根真菌菌剂是十分重要的生物肥料,在农业和自然生态体系中有着重要地位,在无公害农业、生态农业和土壤改良与保护方面有着广阔的应用前景。本实验的目的是:通过观察、检测豆科植物根瘤形态、数量、根瘤活性、根瘤菌结瘤能力;菌根真菌的结构和侵染率,了解植物与微生物共生现象的普遍性和重要性。
二、操作步骤:
根瘤菌接种和观察:
大豆种子表面消毒(用10%双氧水浸泡10分钟;或者用95%浸1分钟后再用0.2-0.4%HgCl2浸泡15分钟,无菌水洗净)后,在菌液中浸泡一下,立刻播入基质中。
如果用石英砂或者蛭石作为培养基质,则需要定期补充低氮营养液。低氮营养液的配方为如下,每天或者每隔一天浇一次。
低氮营养液配方(g/1000ml)
Ca(NO3)2·4H2O 0.03g
CaCl2·2H2O 0.10g
KH2PO4 0.1g
Na2HPO4·12H2O 0.15g
MgSO4·7H2O 0.12g
柠檬酸铁 0.05g
蒸馏水 1000ml
微量元素 1ml
微量元素配方
H3BO3 2.86g
MnSO4 1.81g
ZnSO4 0.22g
CuSO4 0.80g
H2MnO4 0.02g
蒸馏水 1000ml
植株生长20-30天后,连根挖出植株,洗去表面的基质。或者也从田里挖取植株根系,洗去表面的土壤。
观察是有无根瘤存在,评价接种是否成功。观察、记录根瘤的数量、在根系上的分布、色泽和形状等。根瘤还可以摘下称重,并用乙炔还原发测量固氮能力。按下式计算结瘤率:
结瘤率(%)=结瘤株数×100/接种总株数
观察根瘤内部的颜色:根瘤刚形成是是白色,并且是无效的(不具有固氮能力);随着根瘤继续生长,根瘤内部可以见到粉红色的成分,表明有豆血红蛋白形成。接着根瘤裂开病转为棕色。到植物衰老,生命结束时,未开裂的根瘤固氮活性愈来愈弱,无活性的血红蛋白取代了豆血红蛋白,根瘤内部变为绿色。根瘤的颜色可以定性评价其潜在固氮能力。
将根瘤用刀片切成两半,颜色可归类为:白色、粉红色、棕色和绿色,结果用百分数表示。
丛枝菌根真菌侵染、结构的观察
洗根:将根从土壤中洗出,剪成1cm长的根段(取样量0.5-1.0g)
消煮、透明:根段用10%KOH浸泡,90℃ 水浴中透明1h,水洗
酸化:用2%HCl浸泡5min
染色:直接加入0.05%曲利苯蓝(或酸性品红),90℃ 水浴30min,水洗
脱色:置于盛有乳酸甘油溶液的培养皿脱色
制片:在培养皿中将染色后的根段分散均匀,随机选取30条根段,分别排放在2张载玻片上,用30%的甘油,加盖盖玻片在100-400×的显微镜下观察丛枝菌根真菌的结构。
菌根侵染率测量:
根段法:根据Trouvelot等(1986)的方法,按照菌根侵染和丛枝丰度分级的标准,输入等级参数,用“mycocalc”软件,可计算出真菌侵染潜力(F%),真菌侵染强度(M%),根内泡囊形成率(V%)和丛枝的形成率(A%)。
方格交叉法:将根系转移至培养皿中,解剖镜下观察染成蓝色的根段(即:被侵染了的根段)与网格在纵横两个方向上的交叉点数;同时测量总的根段与网格在纵横两个方向上的交叉点数。用下式计算菌根侵染率:
菌根侵染率(%)=被侵染的根段的纵横两个方向总交叉点数×100/总根段的交叉点数
实验报告
定性、定量地描述根瘤的基本特征,丛枝菌根真菌的结构特征等