天然药物化学实验指导 一、前言 天然药物化学实验是整个天然药物化学课的重要组成部分。其主要目的是： 通过试验，检验在课堂上所学的理论知识。使学生对理性知识的理解更加深入，掌握得更加牢固。 通过试验，训练学生的基本操作技能，培养学生分析问题和解决问题的能力，使学生获得从事天然药物化学科研工作的基本训练。 在实验中，重点是要加强对学生基本操作技能的训练。天然药物化学实验要求学生掌握以下技能： 提取分离方面 要求掌握常用的经典方法的原理及操作。其中包括液-固提取法（浸渍、渗漉、回流提取等）、液-液萃取法（简单萃取法、梯度萃取法、反流分布法）、重结晶法等。 掌握纸色谱、柱色谱（包括吸附柱、离子交换柱等）的原理和基本操作。 鉴定方面 化学方法 ①掌握一般定性反应在鉴定中的用 ②掌握重要衍生物（乙酰化物、甲基化物生物碱盐类等）的制备方法及其在结构鉴定中的应用。 ③了解重要降解反应的原理及应用。 光谱方法 了解UV、IR、NMR、MS在天然物结构测定中的应用。目前要求学员能了解黄酮类化合物的UV、NMR波谱、蒽醌的IR以及麻黄生物碱的NMR谱特征。 二、天然药物化学实验须知 在天然药物化学实验中，所用的药品多数是挥发性、易燃、有毒、有腐蚀性、刺激性、甚至爆炸性药品，试验操作又常在加温加压等情况下进行，需要各种热源、电器或其他仪器，操作不慎易造成火灾、爆炸、中毒、触电等事故。但只要加强爱护国家财产和保障人民生民安全的责任心，提高警惕，消除隐患，注意实验规则，事故是可以避免的。 实 验 规 则 试验前必须预习实验内容，了解原理和操作规程。随时记录试验应记的项目，以作正式报告。 试验前应清点并检查仪器是否完整，装置是否正确，合格后方可进行试验。试验时不准做无关的事情，严禁吸烟，不得擅自离开，并应随时注意反应情况，仪器有否漏气，破裂等。 药品仪器都是国家财产，须节约爱护使用，公用物品，用完后立即放回原处。不可调错瓶塞，以免污染，仪器要洗刷干净。 操作易燃性有机溶剂，回流、蒸馏、减压蒸馏时，不能明火直接加热，要放沸石或一端封死的毛细管，若在加热时发现无沸石则应冷却后再加，防止爆沸冲出。减压系统应装有安全瓶。加液时应停火或远离火源，一般无漏气开口，冷凝水要通畅。起封易挥发溶剂瓶盖时，脸面要避免开瓶口慢慢启开，以防气体冲脸上。 有毒具腐蚀药品应妥善保管，操作后要立即洗手。勿粘及五官和创口，以免中毒。 实验中，有毒气或腐蚀性气体发生适应在通风橱中进行操作。必要时可戴好防护用具进行工作。 若将玻管插入塞中时，可在塞孔中涂些水和甘油等润滑剂，用布包住波管使其旋转而入，防止折断割伤。 试验台上不放无用的药品、仪器，在实验时要做到水槽、仪器、桌面、地上清洁整齐。 试验结束时，应将门、窗、水、电、煤气关好，室内打扫干净，并清点仪器后方可离去。 安全防火须知 实验室存放易燃性有机溶剂时要远离火源，不得超过500ml。 在进行易燃性有机溶剂实验时，一定要按着操作规程进行。不可将易挥发、易燃性有机溶剂倒入水槽或废液缸内。 烘箱内不能烘盛有易燃性溶剂的器皿。 消防器材，沙箱、石棉布、灭火器等应放在方便固定的地点，不能随意移动，均应处于备用状态。 万一不慎着火，要沉着冷静积极抢救，应立即切断室内电源和火源，用石棉布将着火部位盖严，使其断绝空气而熄灭。或是火势情况选用适当灭火器材进行灭火。在实验室使用二氧化碳灭火器较好，它具有不腐蚀不导电之优点。 在实验室中常发生的事故如下，应予以特别注意。 蒸馏或回流加热时，发现未放沸石，未等溶液冷却就补加沸石，结果溶液冲出瓶外于是引起火灾。 蒸馏易燃物时，忘记通冷凝水，大量蒸汽逸出亦易引起火灾。 蒸馏易燃物时塞子漏气引起火灾。 用三角烧瓶作减压装置的受器结果炸裂。 加压操作结束后，放气太快，使压力记冲破。 使用真空干燥器时，用完就直接开干燥器的放气阀，结果使泵内的机油被吸到干燥器中，样品被污染。 实验室水槽易发生用抹布和碎拖布条堵塞而造成水灾。 三、试验方法（选编） 黄酮类化合物紫外光谱鉴定法 测定黄酮类化合物UV光谱用的诊断试剂及其配制方法 黄酮类化合物光谱测定程序 黄酮类化合物UV光谱特征与结构解析方法 结构解析示例 薄层色谱法 氧化 还原 脱水 水解 卤代 酶的催化作用 酯化 硝化 衍生物的制备 混合反应 柱色谱法 吸附柱色谱法 吸附力 吸附等温线 线性容量 常用吸附剂 吸附剂的规律 洗脱剂的规律 溶剂的吸附亲和性 （二）柱色谱的操作 四、实验部分 实 验 安 排  实验 题 目 学时  一 离子交换树脂法提取一叶秋碱 4  二 吸碱树脂的碱化及石油醚回流 4  三 一叶秋碱的m.p. TLC等鉴别 4  四 芦丁的提取与鉴别 4  五 芦丁的酸水解和糖的纸色谱 4  六 芦丁的十乙酸化合物制备及芦丁 4  七 大黄蒽醌类化合物的提取与分离 4  八 缓冲纸色谱法 4  九 PH梯度法分离蒽醌类化合物 4  总计  36   实验一 一叶秋碱的分离和鉴定 概述 大戟科植物一叶秋（Securinega suffruticosa (Pall) Rehd）也称叶底珠，别名狗杏条，我国资源十分丰富。其根、叶和嫩枝中均含有多种生物碱，结构已经清楚的有十几种。其中一叶秋碱含量最高，并已用于临床。一叶秋碱和它的衍生物能兴奋中枢X神经，增强心肌收缩，升高血压，临床用硝酸一叶秋碱治疗面神经麻痹，小儿麻痹骶神经炎和股外侧神经炎感染引起的多发性神经炎，成为神经科疾患的常见药物。 一叶秋碱味淡黄色棱形晶体，难溶于水，易溶于醇、氯仿、较难溶于石油醚，其结构如下：  实验目的、要求 目的 通过一叶秋碱的提取分离掌握用离子交换树脂法提取分离生物碱的原理和方法。 要求 分离得到纯的一叶秋碱，并制备其衍生物，加以鉴定。 试验方法 提取分离方法（见下图） 生物碱的定性实验 ① 取渗漉液1ml，加硅钨酸试剂数滴，产生淡黄色沉淀。 ② 取渗漉液1ml，加碘化钾试剂数滴，产生淡棕褐色沉淀。 ③ 取渗漉液1ml，加碘化铋钾试剂数滴，产生棕红色沉淀。 一叶秋碱衍生物的制备 硝酸一叶秋碱的制备 称取一叶秋碱200mg，加6ml乙醚及9ml无水乙醇，使生物碱全部溶解，滴加10%硝酸无水乙醇液14ml，滴加乙醚至浑浊、放置，白色结晶析出后，过滤，结晶用无水乙醇-乙醚（1：1）洗涤数次、干燥，即得硝酸一叶秋碱。 硝酸一叶秋碱、无嗅、味苦，溶于水，难溶于醇。mp.222℃。 一叶秋碱的甲基化物的制备 称取样品100mg，碘甲烷（MeI）0.4ml及丙酮10ml水浴回流1hr，放冷结晶析出后，过滤，结晶用乙醚洗涤，用NeOH-EtOH重结晶，获得黄色针状结晶，mp.232℃。 反应式：  鉴定 TLC 吸附剂：Al2O3（碱性Ⅱ~Ⅲ，粒度＞200目） 展开剂：a. CHCl3 : Ben. : EtOH (25:25:2) b. CHCl3 c. Et2O ② IR νmax1790cm-1（不饱和内酯环上的质子） 1730 cm-1（内酯的羰基） 1620 cm-1（双键） ③ UV λmax 256.6, 311.6 nm 4 比旋光度的测定 [α]=-1042 （四）实验指导 1．本实验讲解要点及注意事项 ① 详细讲解用离子交换树脂提取生物碱的原理。 ② 强调装树脂柱的操作，避免柱中存有气泡。 ③ 指导学生注意交换时的流速及检查流出液的变化，引导学生分析发生变化的原因。 ④ 在使用沙氏提取器时，应用试教，讲解安装方法。 ⑤ 用石油醚回流洗脱时应注意防火。 ⑥ 回流洗脱时间不得小于3小时。 2．实验报告要求 ① 定性实验结果，反应原理。 ② 上柱前药液的PH值，半小时后流出液的PH值，两个半小时之后的PH值。试述发生变化的原因。 ③ 描图说明鉴定结果。 ④ 分析UV、IR光谱图。 （五）思考题 1．用树脂提取生物碱的原理是什么？为什么提取生物碱时必须考虑交联度？ 2．用石油醚从树枝上回流洗脱一叶秋碱的原理是什么？ 实验二 芦丁的提取及鉴定 （一）概述 芦丁（Rutin）广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米（为植物Sophora japonica的未开放的花蕾）和荞麦中含量最高，可作为大量提取芦丁的原料。芦丁是由斛皮素（Quercetin）3位上的羟基与芸香糖（Rutinose）〔为葡萄糖（Glucose）与鼠李糖（Rhamnose）组成的双糖〕脱水合成的苷。 芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174~178℃，无水物188~190℃。溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。 芦丁具有维生素P样作用。有助于保持及恢复毛细血管的正常弹性，主要用作防治高血压病的辅助治疗剂，亦可用于防治因缺乏芦丁所致的其他出血症。 实验目的和要求 实验目的 ① 通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。 ② 通过芦丁结构的检识，了解苷类结构研究的一般程序和方法。 ③ 了解UV及NMR在黄酮类化合物结构鉴定中的应用。 要求 ① 要拿到以下三个化合物：芦丁、槲皮素、芦丁的全乙酰化合物。 ② 能够拿根据化学试验及UV、NMR数据初步推断出芦丁的结构。并对黄酮类化合物的结构测定有一般性的了解。 试验方法 芦丁的提取与分离（见下图） 芦丁的鉴定 ① 芦丁的定性反应 取芦丁3~4mg，加乙醇5~6ml使其溶解，分成三份作下述试验： A. 取上述溶液1~2ml，加2滴浓盐酸，在酌加少许镁粉，注意观察颜色变化情况。 B. 取上述溶液1~2ml，然后滴加2%柠檬酸的甲醇溶液，注意观察颜色变化情况，在继续向试管中加入2%ZrOCl2的甲醇溶液，并详细记录颜色变化情况。 C. 取上述溶液1~2ml，然后再加入10%α-等体积的萘酚乙醇溶液，摇匀，沿管壁滴加浓硫酸，注意观察两液面产生的颜色变化。 ② 芦丁的紫外光谱解析 取芦丁溶于色谱纯甲醇中，加入规定的试剂，测定其UV光谱，试解析光谱并初步判断其结构。 芦丁的NMR波谱解析 A. 芦丁的三甲基硅醚NMR谱的解析 B. 十乙酰化芦丁的NMR光谱解析 ④ 芦丁水解后糖与苷元的鉴定 A. 水解方法：精密称取芦丁1g（±0.01g），加1%硫酸100ml，加热40min，放冷静置，过滤。所得沉淀用少许水洗除酸，干燥称重，计算苷元与糖的重量比。然后用乙醇（95%大约10ml）进行重结晶，即得苷元。 B. 苷元的鉴定：用纸色谱法与对照品对照。  芦丁的提取与分离流程图 （四）实验指导 1．本实验讲解要点及注意事项 ① 芦丁提取方法，重点介绍碱-酸法的原理及注意事项。 ② 定性实验的目的、意义及注意事项。 ③ UV及NMR光谱在芦丁结构检识中的应用。 2．实验报告要求 ① 碱-酸法提取芦丁的原理 ② 定性反应的反应机理 ③ 黄酮类UV和NMR的特点 ④ 详细记录定性反应结果 ⑤ 绘制色谱结果模拟图，并计算Rf值 3．思考题 ① 苷类结构的检识大体程序如何？ ② 苷类水解有几种催化方法？ ③ 怎样确定芦丁结构中糖基是连接在槲皮素3-O-上？ ④ 怎样证明芦丁分子中只含有一个葡萄糖基一个鼠李糖？ ⑤ 苷元的结构是怎样确定的？ ⑥ 怎样确定苷键的构型？ ⑦ 芦丁的全乙酰化物的制备与苷元乙酰化物（槲皮素）的制备有何不同？为什么？ 试验三 大黄中蒽醌类成分的提取分离和鉴定 （一）概述 大黄记载于《神农本草经》等许多文献中，用于泄下、健胃、清热、解毒等。 自古以来，大黄在植物性泻下药中占有重要位置，是一位很早就被各国药典所收载的世界性生药。大黄的种类繁多，优质大黄是蓼科植物掌叶大黄（Rheum palmatclm L），大黄（R. officinale Baill）及唐古特大黄（R. tangutium Maxim.et Regll）的根茎及根，大黄中含有多种游离的羟基蒽醌类化合物以及它们与糖所形成的苷。已经知道的羟基蒽醌主要有下列五种：  R1 R2 名 称 晶 形 熔 点  -H -COOH 大黄酸(Rhein) 黄色针晶 318~320℃  -CH3 -OH 大黄素(Emodin) 橙色针晶 256~257℃  -H -CH2OH 芦荟大黄素(Aloe-emodin) 橙色细针晶 206~208℃  -CH3 - 大黄素甲醚(Physcion) 砖红色针晶 207℃  -H -CH3 大黄酚(Chyrsophanol) 金色片状结晶 196℃   大黄中蒽醌苷元，其结构不同，因而酸性强弱也不同。大黄酸连有-COOH，酸性最强；大黄素连有β-OH，酸性第二；芦荟大黄素连有苄醇-OH，酸性第三；大黄素甲醚和大黄酚均具有1,8-二酚羟基，前者连有-OCH3和-CH3，后者只连有-CH3，因而后者酸性排在第四位。 （二）实验目的和要求 1．学习缓冲纸色谱的基本操作技术，并能根据色谱结果，设计液液萃取法分离混合物的实验方案。 2．掌握PH梯度法的原理及操作技术。 3．通过磷酸氢钙柱色谱分离大黄酚及大黄素甲醚的试验，进一步熟悉柱色谱操作技术。 4．学习蒽醌类化合物鉴定方法。 （三）实验方法 1．大黄总蒽醌苷元的提取  注意：①大黄中的蒽醌类成分大部分与糖结合，以蒽醌的形式存在于植物组织中。所以要用酸水解使其生成苷元。蒽醌苷元可溶于氯仿、苯及乙醚等有机溶剂，用苯时应注意苯蒸气的挥发，严防中毒；②所得的氯仿液中如带有酸水液，应该用分液漏斗分出弃去，并用蒸馏水回洗一次除去酸性以免影响梯度萃取。氯仿提取液放置中如有沉淀析出，可滤取之，该沉淀多为大黄素，余液进行下一步分离试验用。 2．总蒽醌苷元分离方案的设计 ① 大黄总蒽醌苷元的纸色谱 ② 蒽醌类成分的缓冲纸色谱试验 ③ 最佳萃取剂及其用量的确定 各种萃取剂用量的确定 新分离方法的设计 蒽醌类成分的分离与精制 大黄酸的分离与精制 将含有总游离蒽醌的氯仿液450ml移至1000ml的大分液漏斗中，加PH8缓冲液275ml振摇萃取，静置至彻底分层，放出氯仿液后，到出碱水液至置250ml烧杯中，加HCl酸化至PH=3，待黄色沉淀析出完全后，过滤、干燥，干燥后的样品加冰醋酸10ml加热使溶，趁热过滤，滤液静置，析出黄色针晶为大黄酸，过滤即得纯品。 大黄素的分离与精制 将提过大黄酸的氯仿液继续移至分液漏斗中，用PH9.9缓冲液275ml振摇萃取，彻底分层后，分出碱水层，并用HCl酸化至PH=3，析出棕黄色沉淀，过滤，沉淀经干燥后，用10ml冰醋酸加热使溶，趁热过滤，析出橙色大针晶，过滤后，即得大黄素纯品。 芦荟大黄素的分离和精制 余下氯仿液移至分液漏斗后，加5%NaCO3:5%NaOH (9:1) 碱水液540ml或用0.5%KOH540ml振摇萃取，碱水液加HCl酸化，析出的沉淀过滤干燥，用10ml乙酸乙酯重结晶，得黄色针晶的芦荟大黄素纯品。 ④ 大黄酚和大黄素甲醚的分离——磷酸氢钙柱色谱 蒽醌类成分的鉴定 ① 纸色谱鉴定 ② IR光谱解析 （四）实验指导 1．本实验讲解要点及注意事项。 ① PH梯度萃取的原理及注意事项。 ② 如何设计萃取分离方案的程序与方法。 ③ 蒽醌化合物红外光谱的特点。 ④ 分离萃取时一定注意乳化层的分出，不要混入，并且每步最好用新鲜CHCl3，回洗碱水液。 ⑤ 缓冲液的配制和碱液的配制要准确，严格注意检查。 每步萃取时，利用纸色谱检查跟踪萃取效果，如未达到预想效果应及时纠正。 2．实验报告要求 ① 记录大黄总蒽醌的提取方法。 ② 总蒽醌的纸色谱检查结果（附色谱图）。 ③ 总蒽醌的缓冲纸色谱结果，并说明它对总蒽醌分离方案设计有何启示。 ④ 记录总蒽醌的分离程序（包括溶剂用量），及各分离物粗品的纸色谱检查结果，与原设计有何出入，原因何在？ ⑤ 记录大黄素、大黄酸、芦荟大黄素的精制方法及纸色谱、红外光谱的鉴定结果。