第四章 基因操作
Gene manipulation
第一节 碱基互补的能力
一, DNA的热变性
1,G－ C含量高的 DNA具有较高的熔解温度, 可以根据熔解
温度的不同将 GC含量不同的 DNA分子分开, 并可推测 DNA分
子中 G－ C的相对含量 。
2,根据熔解温度的差别在 DNA分子中作基因定位和分离基
因 。 组蛋白是与核 DNA结合的碱性蛋白, 富含精氨酸, 其编码
区相对富含 G－ C对 。
海胆组蛋白基因在较底温度时（ 61℃ ）的变性电镜图，
每种组蛋白基因被一个富含 A－ T对区域间隔开。用 S1核酸酶
处理，消除单链。
H1
H2A H3 H2B H4
二, 互补单链的复性
利用互补单链复性的特点可以确定基因缺失的位置和大小：一个缺失突
变体的 DNA和一个野生型的 DNA一起复性后就可确定缺失区 。
a b c d e
a,b,c,d,e,
a b d e
a,b,d,e,
a b c d e
a,b,c,d,e,
a b d e
a,b,d,e,
a b
c
d e
a,b,d,e,
Heat
Mix and cool
三, 染色体上 DNA序列的定位
用特异性 RNA或 DNA作探针与染色体上相
应的 DNA互补区域作杂交, 从而确定该特异性
基 因 的 位 置 称 染色体原位杂交 （ in situ
hybridization of chromosome） 。
In situ
hybridization
of human
metaphase
chromosomes
using
fluorescent
technique
(FISH)
第二节 限制性内切酶
一, 宿主限制现象
X X
A B
X-A X-B
A B A B
X-A X-B X-A X-B 100% 100% 0.002% 100%
Phage
Infect
Bacteria
从两个不同菌株 A和 B来的噬菌体 X具有不同的感染能力
X-A
A
X-A B X-B A
X-A
100% 100%
很差
无法分离到能感染 A细菌的 X-B来的噬菌体
用很少一些
感染力差的
结果说明,噬菌体的宿主范围取决于它所来源的细菌
菌株, 而不是噬菌体的基因型； 宿主的基因型对噬菌
体有一种修饰作用, 但并不改变噬菌体 DNA的序列 。
细菌的基因型决定该细菌对各种噬菌体感染的敏感性
,一种噬菌体的基因型决定它所能感染细菌的范围,
它们之间具有密切的依赖和限止关系 。
在不同基因型的细菌中生长的噬菌体其具有不同的
感染能力
二, DNA的修饰
☆ 是什么限制了 X－ B噬菌体在菌株 A中的繁殖呢？
是由于宿主的一种核酸酶的作用, 它能将噬菌体
DNA切成许多无感染力的片段, 宿主细胞具有破坏其
陌生 DNA的防卫系统 。
☆ 怎样保护宿主自身的 DNA和感染性 X－ A噬菌体 DNA免受宿
主核酸酶的攻击？
有一种酶能在特定序列上修饰特异性碱基, 但是并
不改变这些碱基的编码性质 。 如在胞嘧啶和腺嘌呤上
增加一个甲基后就能保护 DNA免受核酸酶的攻击, 该
过程称 甲基化作用 （ methylation） 。
?在宿主限制现象中有两个相互的过程,
（ 1） 由于宿主核酸酶的作用破坏了侵入
的噬菌体 DNA,从而 限制 了噬菌体的繁
殖；
（ 2） 噬菌体 DNA修饰 免除了限制酶的
作用 。
Bacterium A has the capacity to modify DNA whereas B does not
三, 限制酶的特异性
1970年, Hamilton Smith从流感嗜血杆菌 d株分离到能识别特
定核苷酸序列, 切点专一的限制酶－ HindII
↓
5’－ G－ T－ Py－ Pu－ A－ C－ 3’
3’－ C－ A－ Pu－ Py－ T－ G－ 5’
↑
Smith进一步证明宿主诱导的甲基化作用保护了具有同样序列
的 DNA免受 HindII的切割,
↓ m
5’－ G－ T－ Py－ Pu－ A－ C－ 3’
3’－ C－ A－ Pu－ Py－ T－ G－ 5’
m ↑
*
*
Py,pyrimidine
Pu,purine
E.coli的 R质粒的一个基因产生的限制酶 EcoRI,它对 SV40
病毒的环状 DNA分子上只有一个切点 。
5’－ G－ A－ A－ T－ T－ C－ 3’
3’－ C－ T－ T－ A－ A－ G－ 5’
上述序列是旋转对称的 。 由于切点是错开的, 因此使 SV40
的环状分子切开成具有 粘性末端 （ sticky ends） 的线状分子 。
上述序列中腺嘌呤的甲基化也能保护 DNA免受 EcoRI的切割 。
m
m
回文序列 —palindrome
↓
5’…… G A A T T C …… 3’
3’…… C T T A A G …… 5’
↑
EcoRI切点的两条链中的序列从相反方向阅读是一样的, 称为
回文序列 —palindrome。 从正向和反向阅读是同一句子,
ABLE WAS I ERE I SAW ELBA
几种限制酶的名称和识别序列
T↓C T A G A
A G A T C↑T
Xba I
C T G C A↓G
G↑A C G T C
Pst I
A↓A G C T T
T T C G A↑A
Hind III
G A T↓A T C
C T A↑ T A G
EcoR V
G↓A A T T C
C T T A A↑G
EcoR I
G↓G A T C C
C C T A G↑G
Bam H I
识别位点序列 内切酶
四, 限制酶作图
1,在 DNA分子上确定限制酶切点的相对顺序
是一种重要的染色体作图法 。 从图上任何两个
切点之间的距离可估计出核苷酸的数目 。
2,方法要点：特定来源的 DNA经不同的酶消
化后, 样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离, 可得
到限制位点的图谱 。
1 2 3 4 5
5,
3,
3,
5,
酶 1
酶 2
1 2 3 4 5
32P
32P
酶 1
酶 2 Digestion
1 2
3 4
5
32P
1
2 3
4 5
32P
32P
A
B
C
D
E
F
(a)
(b)
32P
1 2 3 4 5
1
2
3
4
5
酶 2
A B C
1 2 3 4 5
D E F
1 2 4
5
酶 1
(a) (b)
根据重叠的亚片段排列原先片段的顺序
亚片段 位于原先片段
1
2
3
4
5
A D
A E
B E
B F
C F
(c)
3
根据重叠的亚片段排列原先片段的顺序, 可以得到一个 DNA的酶切图谱 。
1
1 2
2 3
3 4
4 5
5
D
A
E
B
F
C
1 2 3 4 5
2 1 2 1 酶切位点
2 1 2 1
酶切图谱
练习题,
从某一生物的基因组 Bam HI文库中获得了长
3.0kb的片断,如用 EcoRI消化该片断获得 1.7kb、
0.9kb和 0.4kb三种片断 ;如用 Hind Ⅲ 消化获得 1.6kb
和 1.4kb片断 ;如用上述两酶混合消化获得 1.2kb、
0.9kb,0.5kb合 0.4kb四种片断 。 根据上述结果绘制
限制性图谱 。 要求标出 EcoRI,HindⅢ 和 BamHI的
位点和它们间的距离 。
第三节 重组 DNA
? 在细菌细胞中选择性地扩增特定
DNA 片 段 的 过 程 称 分 子 克 隆
（ molecular cloning） 。
重组 DNA技术的基本步骤
（ 1） 获得目的基因, 一般是有重要生物学功能的外源基因 。
（ 2） 在限制性内切酶和连接酶的作用下, 将目的基因与克隆
载体相连接, 组成一个新的重组 DNA分子 （ recombinant DNA
（ 3） 将重组 DNA分子引入受体细胞, 并在细胞中进行 DNA
复制, 最常用的受体细胞为大肠杆菌 。
（ 4） 对转化子 （ 含有重组分子的受体细胞 ） 进行筛选和鉴定
,以确认含有外源基因 。
大量培养细胞可获得目的基因的大量拷贝，或基因表达的产
物等。
一般意义上的重组
DNA技术专指在细菌
细胞中特异性地扩增
特定 DNA片段的分子
克隆技术，广义上的
重组 DNA技术还延伸
到整个基因工程的应
用领域 。
重组 DNA技术的基本步骤
外源
DNA 载体
重组 E.coli
目的基因的制备
构建重组 DNA分子, 首先要获得有用的目的基因片段,
最常用的方法有三种,
（ 1） 直接从一生物中提取基因组 DNA,并构建该基因
组的文库 （ gene library） 再从中调出目的基因的克隆 。
（ 2） 以 mRNA为模板反转录合成互补的 DNA,称 cDNA
,并构建 cDNA克隆 。
（ 3） 采用聚合酶链反应 （ PCR） 特异性地扩增某一目的
基因的片段 。
细胞内总 DNA的提取和基因文库的构建
各种生物的特定组织 （ 如血液, 肝脏, 植物组织, 细菌细胞等 ）
都含有大分子量的 DNA。 由于目的基因位于整个基因组 DNA中,
难以检出和分离, 可以先将基因组 DNA用内切酶切成较小的片段
,再将它们分别与载体相连, 并转入细菌细胞中进行繁殖和扩增
,再对各个不同的克隆作出检定 。
非选择性地在细菌细胞中克隆某一生物的随机 DNA片段的过程称
鸟枪法,全部克隆集合体称某一生物的 基因文库 。组成一个生物
的基因文库的全部重组质粒或重组噬菌体中的目的基因就代表了
一个生物的整个基因组。
一, 直接产生粘性末端用于组成一个新的重组
DNA分子 （ recombinant DNA） 16-2
二, 加尾连接 （ Tailing）
1,同聚物加尾
末端转移酶 （ terminal transferase） 能催化 DNA的 3’末端加上
核苷酸尾, 如将 dA和 dT加到不同的 DNA末端, 就可以连接成重组
质粒, polyG和 polyC也可用相同方法加尾 。
同聚物加尾连接的优点：加尾后 DNA片段自身不会环化,
可提高异源 DNA重组率 。 缺点：加入的 polyA和 polyT可能影响基
因表达；外源基因克隆扩增后不能用限制酶重新从重组质粒中切
出来 。
TTAA
AATT 5,
3,
3,5,
5,
3,
3,
5,
AAA
AAAA
5,3,
5,3,
AAA
AAAA
TT TTT
TT TT
AAAA
AAAAA
T TT TT
TT TT
5,3,
3,5,
5,
3,
3,
5,
5,
3,5,
3,
E coRI
外切酶
末端转移酶 dATP
shear
外切酶
末端转移酶
dTTP TTTT
TTTTT
Plasmid
DNA
Drosophila DNA
DNA polymerase,DNA ligase
末端转移酶（
terminal
transferase）能
催化 DNA的 3’
末端加上核苷
酸尾，如将 dA
和 dT加到不同
的 DNA末端，
就可以连接成
重组质粒
2,人工接头的应用
人工接头是一个合成的含有特定限制酶识别顺序的核苷酸片段
。
EcoRI
↓
C C G A A T T C G G EcoRI
G G C T T A A G C C 人工接头
↑
EcoRI
＋
T4DAN 连接酶
人工接头
EcoRI
外源 DNA
粘性末端用于连接载体
人
工
接
头
的
应
用
四, 载体 Vectors
能使克隆的片段不断复制的一类 DNA分子称载体, 应具备以
下特点,
（ 1） 分子量小, 核苷酸序列清楚, 具有一些单一酶切位点或
人工插入的多克隆位点区 。
（ 2） 分子中具有一个复制起始点, 能使载体自身和插入的外
源 DNA共同复制 。
（ 3） 具有易于筛选重组分子的标志, 如抗药性 。
(4) 比较容易从宿主细胞中回收
1,质粒,
双链环状 DNA分子, 能经转化导入 E.celi中
优点：能使宿主细胞产生抗性, 便于选择质粒
,在细胞中的拷贝数多 。
A color-enhanced electron mincrograph of circular
plasmid molecules isolated from the bacterium E.coli,
.The plasmid pUC18 offers several advantages as
a vactor for cloning
Cloning with a plasmid vector,16-9
利用 Lac Z基因的插入失活筛选重组子
许多载体的多克隆位点区插入在
Lac Z基因区中。 Lac Z基因编码
β-半乳糖苷酶的一个亚基，它可
以使携带载体的细菌在含有 X-
gal（能被 β-半乳糖苷酶水解的底
物）的培养界上形成 蓝色的菌落
。 当外源基因插入到多克隆位点
区后就阻断了 Lac Z基因的编码
区，使 Lac Z基因失去了功能，
因此，凡是插入了外源基因的重
组质粒进入宿主细胞后，这些细
胞就不能利用 X-gal，结果在培
养基上形成 白色的菌落。 挑选出
白色菌落可作进一步鉴定。
A Petri plate showing the growth of bacterial
cells after uptake of recombinant plasmids,16-
6
菌落原位杂交筛选和鉴定克隆的基因
根据重组质粒中的目的
基因的序列，合成一段
与之互补的 DNA序列，
并使其标记上放射性同
位素，该段 DNA称为探
针。再用探针与菌落中
的 DNA进行杂交，可从
许多未知的菌落中挑选
出克隆有目的基因的菌
落。
2,λ噬菌体 它
的头部通常能包
装进 45kb 长的
DNA分子, 基因
组中间部分是裂
解性生长的非必
需区, 因此在其
区域内转换插入
大的外源 DNA片
段可以不影响其
复制功能 。
3,单链病毒
在感染 E.coli过程中, 感染性单链能转变为双链的
复制型 。 分离这种复制型的双链可用作克隆的载
体 。 这种噬菌体用作克隆的优点：在重新感染合
适的宿主时, 它产生的噬菌体颗粒是单链 DNA，
为 DNA序列分析提供方便 。
4,表达载体 Expression Vectors
具有合适的转录和转译起始信号, 外源基因
插入合适的区域后能够表达的载体 。 某些载
体质粒既具有 E.coli的复制起始区, 又具有动
物病毒 SV40的复制起点, 这样的质粒既可在
E.coli中复制, 又可在培养的动物细胞中复制
,应此称为穿梭载体 。 Shuttle Vectors
第四节 重组 DNA方法学
一, 克隆战略
1,无选择地从一个限制酶切的混合物中克隆全
部片段, 然后再筛选所需的目的基因 。
非选择性地在细菌中克隆一个高等生物的随
机 DNA片段的方法称为鸟枪法 （ Shotgunning）,
全部克隆的集合体称为一个基因文库 （ gene
bank,or gene library） 。 组成一个基因文库的全
部重组质粒或全部重组噬菌体代表了一个生物整
个基因组 。
2,用一目的基因的一个探针从整个 DNA酶切
片段的集合体中选出合适的酶切片段，然后再克
隆特定的片段。
组成一个基因文库的全部重组质粒或全部重组噬菌体代表
了一个生物整个基因组。
二、鉴定
克隆的基
因
1．用特定的内
切酶消化重组
质粒，电泳比
较切出片段的
大小。
2,Southern Blotting
酶切和电泳只能对重组克隆作出初步鉴定，可得
知克隆片段的大小但尚难确定克隆片段是否目的基因
。 Southern发明了一种对电泳凝胶中的 DNA作分子杂
交鉴定的方法。该方法可用于重组质粒鉴定，转基因
生物中外源基因的插入位置，遗传病的分子诊断等。
单链 DNA能结合到硝酸纤维滤膜上，酶切物经电
泳后，琼脂糖胶作变性处理，然后将 DNA吸印到膜
上，用 32P标记的 DNA或 RNA探针与膜上的 DNA作杂
交，自显影后可显示出目的基因的位置和大小。
The Southern blotting technique
southern blot
after
hybridization,
exposure,and
development,
The bands
show DNA
fragments
complementar
y to the
nucleotide
sequence of
the probe,
3,用 cDNA克隆作探针, 从基因文库中筛选目的基因
克隆 。
用反转译酶从 mRNA制备 cDNA,全部 cDNA片段与质粒载
体相连, 转化 E.coli得到的全部克隆称为 cDNA文库 。
* 一个基因的 cDNA克隆和 genomic克隆可能在大小上有很大
区别, 为什么？
4,直接分析克隆基因表达的蛋白
在生物的不同器官和
组织，或在细胞的不同
的分化阶段会有某些特
定基因的表达，此时细
胞中的特定基因会特异
性转录成特定蛋白的
mRNA，因此可用反转
录方法获得该基因的
cDNA。
用反转录酶从 mRNA合
成 cDNA；全部 cDNA片
段与载体相连并转入细
菌细胞获得的全部克隆
称 cDNA 文库, 再从
cDNA文库中调出目的
cDNA克隆 。
思考题,
假定人生长激素基因的 cDNA(1kb)已经插
入在某一载体的 BamHI和 EcoRI的酶切位点中
，该克隆大小为 5kb。例举两种鉴定该基因的
具体方法，要求写出实验步骤，并且用图表
示鉴定结果。
三，克隆基因的定点诱变
□ 意义,基因的功能通常是通过其突变体来认识其作用的。在
重组 DNA 技术中常需研究 DNA 序列上特定部位的功能，或改变
基因编码区个别氨基酸的密码子以提高该基因表达蛋白质活性
等。
□ 定义,特异性地改变某一基因的方法称
定点诱变
site-directed mutagenesis
克隆基因的定点诱变
根据基因中欲改变位点的核
苷酸序列设计一段引物，引
物中含有突变的碱基。在聚
合酶作用下，合成一条互补
的含有突变基因的链，将杂
合双链引入大肠杆菌细胞，
经复制后会产生一个野生型
和一个突变型基因的细胞，
再用分子杂交法作鉴定。
思考：如何用分子杂交法 筛选和 鉴
定一个野生型和一个突变型基因？
第五节 DNA序列分析
DNA序列分析是最终了解基因结构和组成的重要工
具,在人类基因组计划中测定人基因组的全部核苷酸
序列是该计划的核心 。 1977年 Sanger发明了以双脱
氧核苷三磷酸 （ 2’3’ddNTPs） 作为 DNA合成终止剂
的, 末端终止法,, 开创了基因核苷酸序列测定的
先河, 最早完成了 Φ× 174全部序列的测定 。
为此 Sanger第二次获得诺贝尔奖 。
发现了重叠基因
Sanger等最早对 Φ× 174病毒作 DNA序
列分析, 该病毒基因组全长 5400bp,共编
码 9种蛋白质, 但根据该 9种蛋白质分子量
推算其编码区, 明显超过病毒基因组
5400bp长的核苷酸所能编码的容量 。 如何
解开这个谜？ Sanger回答了这个问题,在
基因组中存在重叠基因 ！
重叠基因
定义：在一种蛋白质的核苷酸编码序
列中包含了另一种蛋白质的编码序列
，所不同的是各自以不同的读码框转
译。 Φ× 174病毒的重叠基因如下,
A
B
C D J F G H
E
重叠基因概念与密码子的非重叠性
Sanger采用独创的序列分析方法对 Φ× 174病毒基因组作序
列分析，提出了令世人惊讶的重叠基因概念，是对基因认识的
重大发展。 重叠基因是利用两种不同的读码框架编码两
种不同的蛋白质，在每一读码框中密码子解读仍是不
重叠的。 如下图,
aa1 aa2 3 59 60 61 62 63 149 150 151 152 ↑
ATG AGT CAA …… GTT TAT GGT ACG CTG ……GAA GGA GTG ATG TAA
175 189 445
aa1 aa2 3 4 89 90 ↓
基因 E开始 基因 E终止
↑
基因 D开始 基因 D终止
Sanger序列分析方法原理
采用单链 DNA（ 或将含有外源基因的重组质粒 DNA
变性 ）, 在引物和 DNA聚合酶的作用下, 在四组独立
的反应中除加有 4种 dNTPs外 （ 其中之一为同位素标
记 ）, 再分别加入 4种 ddNTPs中的一种作为链延伸的
终止剂, 结果将在四组反应管中产生长度不等的 4组
寡核苷酸链, 它们分别终止于被测链的每一个 A,G
,C或 T。 如在加有 ddATP的反应管中产生的是一系列以 A为
结尾的寡核苷酸链；在加有 ddGTP的反应管中形成的是以 G为
结尾一组寡核苷酸链等等, 再经聚丙烯酰胺凝胶电泳, 转膜和
放射自显影即可从放射自显影胶片上读出 DNA序列 。
O
Base
H H
O = P – P – P – O
O O O
O O O
2’,3’ddNTP的结构，注意其 3’位置是一个 H而不是 OH，
因此后续的脱氧核苷酸不能接到 3’位上 从 而造成链的终止
。
Sanger
DNA
序
列
分
析
示
意
图
DNA sequencing gel
showing the
separation of
fragments
in the four
sequencing
reactions (one per
lane),
In DNA sequencing
using
dideoxynucleotides
labeled with
fluorescent dyes,all
four ddNTPs are
added to the same
tube,and during
primer extension,all
combinations of
chains are produced,
16-20
Automated DNA sequencing using fluorescent
dyes,one for each base,
思考题,
假定某一克隆基因的部分序列为
5, —TCACGTAAGT—3,, 试根据
Sanger序列分析方法原理 画出测定上述
序列的放射自显影示意图, 并对示意
图作必要的标注和解释 。
第六节 基因工程
由基因工程方法产生的生物称为转基因生
物, 它一般是指由导入外源 DNA的细胞
发育而成的生物 。
基因工程
□ 定义：根据分子生物学和遗传学的原理，将一种生物的
遗传物质 DNA转移到另一生物体中，使后者获得新的遗传性
状或表达出所需要的产物。
一、利用微生物基因工程生产重组基因工程药物
利用基因工程技术不但能得到大量的具有特殊功能的基因。而
且可以让这些特殊功能的基因生产出具有特殊功能的蛋白质药
物，这是目前 基因工程 领域中最活跃最有成果和极富商业价值
的领域之一，究其原因,
（ 1）蛋白质和多肽是基因表达的直接产物，可用重组 DNA技
术进行研究和生产。
（ 2）具有生物活性的蛋白和多肽是珍稀而具有很高医疗价值
的药物，用常规分离的方法很难制取。
目前有几十种基因工程药物, 常用的有：干扰素, 白细胞
介素, 乙肝疫苗, 人胰岛素和人生长激素等 。
人类最早的商业化基因工程药物是 人胰岛素和人生长激素
,于 80年代初投放市场, 用大肠杆菌来生产, 是 基因工程
发展的里程碑 。
□ 胰岛素是治疗糖尿病的重要药物, 之前从猪或牛的胰
腺中提取分离, 含量少而且会有毒素 。
□ 人生长激素是治疗侏儒症, 青少年增高和促进创伤组
织修复的药物, 生长激素具有种属特异性, 从动物脑组织
来源的生长激素不能用于人类, 之前只能从刚死亡的人大
脑垂体中分离纯化, 来源极有限；而且发现长期应用会对
人类有毒副作用 。
The method used to synthesize recombinant human
insulin,
19-15
溴化氰
例子
大鼠肝脏 F抗原 蛋白基因在大肠杆菌中表达
F蛋白定位在肝细胞浆中, 正常人肝组
织中的 F蛋白含量是血清中 1370倍, 只有肝
细胞被破坏时, F抗原才释放到血浆中, 使
血清中 F抗原含量升高,
F抗原用作肝病诊断, 首先需获得纯的 F抗原 。
目前国内外大多采用生化提取的方法从人肝脏组织
中分离 F抗原, 由于难以得到 F抗原纯品, 给大量制
备诊断试剂带来困难 。
利用原核 （ 大肠杆菌 ） 表达系统, 成功表达了
大鼠肝脏 F抗原, 表达产物经 SDS-PAGE,Western-
blot分析, 分子量为 43kD,同时具有 F抗原的免疫学
活性, 可作为一种基因工程产品用于今后的免疫检
测工作 。
方法,
基因克隆。 提取大鼠肝脏总 RNA，对其进行反
转录和 PCR（ RT-PCR）扩增出目的基因（ F-
antigen’s cDNA），然后将其与 pET-15b载体进行
连接，转化大肠杆菌 BL21(DE3)plyss，在含
氨卞青霉素和氯霉素的培养基上筛选转化子
。将酶切结果正确的表达质粒命名为
pET15b-F。
表达载体 pET15b-F 构建示意图
F抗原表达
经 IPTG诱导后，含表达载体 pET15b-F的表达
菌株表达出一外源蛋白，该蛋白大小在 43kD左右，
与文献报道大鼠 F蛋白大小一致。且在该表达系
统中得到高表达,外源蛋白表达量约占全菌总蛋
白的 40%。
F抗原纯化与鉴定
离心后所得包涵体蛋白经过初步纯化和溶
解后, 经过亲和层析柱 （ Ni2+-charged IDA
His-bind column） 纯化, 得到一分子量约为
43kD的单一蛋白带 （ Fig.A泳道 8） 。
表达产物的 Western-blot鉴定结果显示：该表
达蛋白可与豚鼠抗人 F 蛋白的抗血清发生特
异性结合反应, 在硝酸纤维素膜上呈现一条
分子量为 43kD的显色带 （ Fig.B）
SDS-PAGE and Western-blot of the expressed F Antigen
(A) 1.Protein molecular weight standard; 2.pET15b-F induced by IPTG;
3.inclusion body of the lysate; 4.supernatant of the lysate; 5.pET15b-F non-induced
by IPTG; 6.pET-15b induced by IPTG; 7.non-plasmid induced by IPTG; 8.purified
target protein
(B) Western-blot of the purified target protein,Guinea pig polyclonal antiserum
against human F antigen was used as primary antibody,
(A) 1 2 3 4 5 6 7 8 (B)
二、用真核细胞表达和生产基因工程药物
虽然用大肠杆菌细胞表达基因工程药具有许多优点, 如成本
低等, 但由于原核系统表达的真核基因蛋白有时缺乏生物活
性, 其原因由于原核生物缺乏合适的转译后修饰机制 。 因此
用真核细胞表达和生产基因工程药物已受到重视 。
□ 真核细胞反应器,
外源基因在合适的载体带动下转染进入体外培养的哺乳动物
细胞, 昆虫细胞或酵母细胞, 通过大规模培养细胞表达外源
基因 。
几种重要的基因工程药物已可用真核细胞反应器完成
治疗癌症抗病毒
预防病毒性肝炎
治疗血友病
治疗贫血症
治疗心脏病
促生长，增强免疫功能
酵母菌
酵母菌
哺乳动物细胞
哺乳动物细胞
哺乳动物细胞
昆虫细胞
α干扰素
乙肝疫苗
集落刺激因子
红细胞生成素
组织溶纤酶原激活剂
人生长激素
应 用 细 胞 名 称
昆虫细胞杆状病毒表达系统
(Insect cell and Baculovirus Expression System)
是一种高效的真核细胞表达系统
杆状病毒因其病毒粒子呈棒状或杆状而得名。
苜蓿尺蠖核型多角体病毒 (Autographa californica
multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)作
为杆状病毒 -昆虫细胞真核基因表达系统的载体被
广泛应用。
1,幼虫吞食了感染有多角体的食物,多角体在消化道的碱性环境下溶解，释放出病
毒颗粒,
2,每个病毒颗粒的脂蛋白外被又与肠壁细胞的质膜相融合，最终将核壳体释放至
胞质中，核壳体再将自己的 DNA转入细胞核内。
3,在感染后 12h采用出芽方式离开宿主细胞，在跨过宿主细胞的质膜时，以宿主的
质膜形成自己的外被，形成表型为 出芽型病毒粒子（ budded virus,BV）,
生活史
Polyhedrin
Protein
Virion
Envolope
Nucleocapsid
cross-section
Nucleocapsid
Longitudinal-section
Polyhedron envelope
DNA-蛋白复合体由 39KD衣壳蛋白外被所包围，形成一个核衣壳，若干个
核衣壳外面再包被一层脂蛋白外被就成为病毒颗粒。几个病毒颗粒聚集成
一簇，嵌在晶状基质中成为一个多角体包含体。
多角体包含
体的组成
?杆状病毒基因表达的级联式时序调控
杆状病毒的基因表达分为 4个时期：极早期
（ immediate-early,α）, 晚早期 (delayed-early,β)、
晚期 (late,γ)和极晚期 (very late,δ)。 通常, 每一后
续时期基因的表达水平都高于前一时期基因表达
的水平, 其中极晚期基因表达水平显著提高, 这
也是构建杆状病毒表达载体的基础 。 如 Fig所示 。
Fig Schematic representation of the four phases
of baculovirus gene expression in vitro
多角体蛋白
P10蛋白
由于 多角体蛋白基因及 P10蛋白基因具
有非常高效的启动子, 同时由于 这两个基
因的产物不参与感染病毒颗粒的形成, 可
以从病毒基因组中去除而不会对病毒的复
制及感染造成影响 。
由于这两个特点, 使人们得以设计利用
杆状病毒启动子在昆虫细胞中表达外源基
因,
杆状病毒表达载体构建
由于 AcMNPV基因组的巨大, 不可能用
单一的限制性酶来对它进行操作, 所以
目前使用的杆状病毒表达载体系统大多
采用构建转移载体 （ transfer vector）
的方法 。
将带有外源基因的转移载体 DNA和野
生型病毒 DNA共转染体外培养的昆虫细胞，
使得转移载体与野生型病毒发生同源重组，
外源基因取代多角体基因,如 Fig所示。
通过重组病毒空斑纯化得到能表达外源基
因的重组病毒。
Transfer vecter Pp Cloned gene Pt 5,3,
Polyhedrin gene AcMNPV DNA
Recombinant AcMNPV
Fig,共转染发生同源重组获得重组病毒
野生型病毒感染的昆虫细胞由于存在多
角体基因, 空斑测定时产生有多角体的空斑
（ occ+） 。 重组后由于多角体蛋白基因已被
外源基因所取代, 只能产生无多角体的空斑
（ occ-） 。 在光学显微镜下根据折光率的不
同可区分这两种不同表型的空斑 。 由此经过
几轮的空斑纯化即可获得多角体缺陷的重组
病毒 。 用重组病毒感染宿主细胞, 感染后期
得到外源基因的高效表达 。
与野生型病毒共转染培养的昆虫细胞
用磷酸钙沉淀法将重组转移载体质粒
pVL1393-hGH与野生型病毒 AcMNPV DNA共
转染贴壁培养状态良好的 Sf9细胞，由于
pVL1393多角体启动子两侧存在与多角体基因
同源序列，可与野生型病毒基因发生同源重
组，从而使人生长激素基因替代野生型病毒
中的多角体蛋白基因，得到重组病毒 rAcV-
hGH 。
重组病毒的 Southern 杂交鉴定, hGH cDNA整合
进杆状病毒基因组的正确位置中
表达产物的 SDS-PAGE与 Western-blot分析
三、植物基因工程
□ 定义,将外源目的基因导入体外培养的植物组织或细胞，
通过组织或细胞培养使之发育成完整的再生植株 ——转基因
植株。
1,冠瘿瘤 ——天然的植物基因工
程
自然界某些植物受到农杆菌的侵染会形成肿瘤 ——冠瘿
瘤。其形成的机理是由于 农杆菌 中含有的一种诱发肿瘤的质
粒所引起的，称为 Ti质粒（ tumor-inducing plasmid，简称 Ti
质粒）。 Ti质粒上的一段 DNA能转移到侵染的植物部位细胞
中，并插入到植物染色体中，由于该片段（称 T-DNA）上具
有诱发肿瘤的基因，所以能诱发植物产生肿瘤。
T-DNA
Tumor production Nopaline synthesis
T-DNA transfer
function
Nopaline
utilization
Origin of replication
Ti plasmid
Ti质粒（胭脂碱型）简图
冠瘿瘤 ——天然的植物基因工程
2,农杆菌 Ti质粒作为植物基因工程载体
科学家根据冠瘿瘤形成的分子机理，通过改建农杆菌 Ti质
粒，使 Ti质粒中的致瘤基因失活，同时插入目的基因，使之成
为基因工程载体。通过感染转化植物组织和细胞，并使之培养
成完整的植株。
Cointegrate Ti-plasmid
Tobacco plant cell
Trasformed cell
Cultured cell Plantlet Transgenic
tobacco plant
Cell of
transgenic plant
植物基因工程 程序图
3,抗除草剂基因工程 (Gene transfer of
glyphosate resistance)
草甘膦在低浓度时非常有效，对人无毒，
可被土壤中微生物分解。
草甘膦能被植物细胞的叶绿体的酶（
EPSP合成酶 ）所分解，该酶对细菌和植物中
的氨基酸的合成很重要，没有这种酶的作用
，植物就会干枯和死亡。
从抗草甘膦的细菌中分离和克隆 EPSP合
成酶的基因和抗除草剂基因工程
抗除草剂基因工
程示意图
首先从抗草甘膦的
细菌中分离和克隆
EPSP合成酶基因，
再进行植物抗除草
剂基因工程
Gene transfer of
glyphosate
resistance
Tobacco leaves
expressing the
hepatitis B
antigen,
转基因植物叶片
表达乙肝病毒表
面抗原。
叶片用抗乙肝病
毒表面抗原的抗
体处理的结果。
正常 叶片
4,具有易于长期保鲜的转基因西红柿的制作过
程原理如下,
通常的西红柿不易保存保鲜，这是由于一种蛋白酶的催化
成熟的结果。将这种酶的基因分离出来，再根据该基因序列结
构合成它的互补基因，再将这种互补基因转入到西红柿植株中
，它将会产生出一种与上述蛋白酶基因正常转录的 mRNA相互
补的 mRNA（ 称反义 RNA），并且与之结合成双链，使之不能
正常翻译成催化西红柿成熟的蛋白酶。未成熟的西红柿易于长
期保存保鲜和运输。只需用乙烯处理后即可成熟供应市场 。
转基因西红柿的途径
5,植物细胞的转化方法
（ 1） 叶圆片共培养转化
（ 2） 单细胞水平上的转化
在 Kan培养基上选择转化的组织 ——再生植株 。
5,转基因植株的遗传
以孟德尔比例传递 。
转基因植株的一对染色体
Kan
自交
1/4 Kans
1/2 Kanr
1/4Kanr
思考 题,
Kanr 能在转基因植株中以组成型的方式
表达, 如对转化植株的花药作培养所得花
粉植株抗性和敏感性比例如何？ 转化植株
自交或与野生型回交的结果如何？
四,转基因动物
1.定义,转基因动物是指以实验方法导入外源
基因,并在其基因组内稳定整合并能遗传给后代
的一类动物,
2.意义,
(1).建立转基因动物模型以研究外源基因在整
体动物中的表达调控规律 ;
(2).改变动物基因型使其表型更符合人类需要 ;
(3).可用转基因动物产生人类需要的生物活性
物质,
转基因生物反应器
□ 定义,将目的基因导
入动物体内形成转基因生
物，由于基因表达，可以
从转基因动物的特定组织
或器官（乳汁、血液等）
获得目的基因产物。使转
基因动物象一个活的发酵
罐一样来生产目的基因的
产物。
采用上述方法获得的转
基因羊，可从羊奶中提取
出治疗心脏病的药物 tPA（
组织溶解酶原激活剂）。
转基因的方法,
按基因导入方式划分,建立转基因动物主要有,
显微注射法,
反转录病毒感染法
胚胎干细胞法,
显微注射与反转录病毒感染方法都是把 DNA直接导入
受精卵或在不同的发育阶段,
受精卵 四细胞胚胎 囊胚 原肠胚 转基因动物
显微注射 反转录病毒感染
DNA DNA
在受精卵不同发育阶段的转基因方法
转基因动物的应用
研究遗传疾病的基因治疗
人类伦理道德一般不允许直接对人的受精卵进行基
因操作，一般是将处理过的体细胞移植到患者体内。但
这种操作具有一定的危险性，必须首先在动物体内进行
试验。所以,通过培育缺陷性状得到矫正的动物 (或细
胞 ) 可以为这类疾病的基因治疗提供动物 (或细胞 )模型。
基因剔除技术
研究人类基因功能的重要手段是
基因敲除。
由于人和老鼠的基因非常接近，因此当怀疑人类基因
图谱中的某一片段同某种疾病相关时，就将老鼠体内
的这个基因去除掉，看它会长成什么样。
如果没眼，那么被去除的基因就是决定长眼的基因。
基因敲除（ gene knock out）
是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水
平上将该基因去除，然后从整体观察实验动物，推
测相应基因的功能。 这与早期生理学研究中常用的
切除部分 -观察整体 -推测功能的三部曲思想相似 。
基因敲除还包括引入新基因及引入定点突变。既可
以是用突变基因敲除相应的正常基因，也可以用正
常基因敲除相应的突变基因。
基因敲除的应用领域主要有,
1、建立人类疾病的转基因动物模型
基因敲除小鼠是研究疾病的发生机理、分子基础及诊断
治疗的重要实验材料。
2、改造动物基因型,
研究基因敲除小鼠在胚胎发育及生命各期的表现，可以
得到该基因在生长发育中的作用，为研究基因的功能和生物
效应提供模式。
3、治疗遗传病
去除多余基因或修饰改造原有异常基因以达到治疗的目的,
五, 动物克隆技术
克隆的基本概念
克隆是英文 clone的译音，最早来自希
腊字 clonos，意指树枝条。动词 clonizos
是砍树枝。名词 clone意指无性繁殖（系
），作为动词意指产生无性繁殖系的过
程，所以 clone 可以称为无性繁殖或复制
现在的克隆技术可分为三个层次：基
因、细胞、个体。,
克隆技术的生物学基础
——细胞及细胞的全能性
根据细胞学说，细胞是一切生物体
的结构和功能单位，无论是进行有
性繁殖还是进行无性繁殖的生物，
都是有细胞构成的。 要突破生物有
性繁殖和无性繁殖的界限应该从它
们的共性出发，从操作细胞开始。
克隆技术所依赖的理论基础
19世纪 30年代提出细胞学说, 细胞是生
物有机体的结构和生命活动的单位, 又是
生物个体和系统发育的基础,
1902年 Haberlandt提出植物细胞全能性
的设想 。 根据细胞理论, 提出高等植物器
官和组织可以不断分割直至单个细胞的观
点 。
细胞全能性 （ Cell totipotency）,任何一个
处于细胞分化临界期之前的细胞, 只要处于
合适的条件即可以发育为完整的生物体, 也
可以发育成任何组织或器官等 。
例如植物体的每个细胞都具有在离体条
件下诱导分化形成完整植株的能力, 这是由
于每个细胞都具有完整基因组实现的 。
植物细胞全能性实验的重要事件,
1,Steward,1958,从胡罗卜根游离单细胞培养成
完整植株 。
2,Guha,1964,曼陀罗花药培养成单倍体植株 。
3.Takebe,1971,烟草原生质体培养成植株 。
动物细胞的全能性？
长期认为在动物发育的早期胚胎阶段，
每个胚胎细胞都具有全能性，但是随着胚
胎发育，胚胎细胞逐渐失去了这种全能性
而开始功能分化，有的发育成神经组织，
有的发育成肌肉组织。
关键的问题是：动物细胞的分化过程是不
可逆的吗？
1,动物克隆的早期设想,
1938年，德国胚胎学家 Hans Spemann提出了用成
年体细胞的核移植到未受精的卵细胞中，来实现动
物的无性繁殖，未成功
2,从低等动物开始，两栖类和鱼类
1952年 Robert Briggs和 Thomas J King用囊胚核移
植方法产生了蝌蚪，未生成青蛙。
1962年 Gurdon 用成年蛙体细胞克隆出青蛙,
1965年童第周完成了金鱼的核移植成功。
3.1984年 Steen Willadsen 成功利用胚胎细胞的
细胞核移植到未受精的卵细胞中产生了一头绵
羊，后来有小鼠，兔，山羊，牛，猪等克隆成
功。
4,以后长期用较晚期胚胎细胞和体细胞核移植
一直失败,
产生了一种观点：用高度分化的动物体细胞进
行克隆在生物学上是不可能的?
5,Wilmut,1997年, 用绵羊乳腺细胞核移植,
实现了在去核卵细胞中重新编程
（ Reprogramming）, 开创了高等动物体细胞
克隆新时期 。
动物克隆技术的发展经历从胚胎细胞的克
隆（包括胚胎切割）到体细胞克隆的过程
胚胎细胞克隆技术
产生的新个体并非是亲代的自我复制,
而是多生了几 个双胞胎，并未引起世人注意。
体细胞克隆可达到亲代个体的自我复制。
□ 核移植技术
将供体复制对象的细胞核转入到去掉细胞核的
卵细胞中 。 由于体细胞包含有全部的遗传信息
,可以从体细胞获得完整的动物个体 。
克隆羊, 多莉, 的诞生说明动物体细胞也具有
全能性, 因此它是真正意义上的动物克隆,
动物克隆的基本过程
以克隆羊为例，动物克隆的基本过程如下图
克隆动物的应用,
1,快速克隆出优良的种畜和遗传上一致的
实验动物；
2,动物资源的种质保存，包括地球上频危
动物的挽救等（异种核 移植） ；
3,生产移植器官；
4,与转基因技术相结合研制生物
反应器生产基因药物。
转基因体细胞克隆技术比转基因动物（
通过原核注射）的方法优越：后者整合率
和表达率低，经常出现嵌合体。
5.克隆人 。 是全世界注目的焦点, 有人设计了克隆人的技术路
线
动物克隆中急待解决的问题
1.成功率 低 (1-3%)
2.供体核和受体胞质细胞周期的同步
化是影响克隆胚胎发育的重要因素,
3.线粒体来源的问题,
发现有些克隆动物的线粒体 (mtDNA)为杂合体,既
有受体胞质的,也有供体细胞来的,
4.端粒酶的问题,
正常细胞没有端粒酶，所以端粒会随着细胞分裂而
变短，细胞衰老。那么 克隆动物是否会随着供体细
胞的缩短的端粒而提前衰老呢？
有发现 Dolly 羊的端粒限制性片段平均长度（ mean terminal
restriction fragment,TRF) 比同龄对照短。供体细胞培养时
间越长,TRF越短,
□ 动物克隆的危险性,
1,克隆动物已出现广泛的免疫缺陷或早期夭亡 。
2,克隆动物过程中也极有可能产生遗传性的变异
（ 无性系变异 ）, 这在植物的克隆中已广泛得到
研究和验证 （ 会发生染色体变异, 基因组 DNA扩
增和某些转位因子的激活 ） 。
第七节 遗传病 ——基因诊
断 和基因治疗
一、基因诊断
□ 感染性疾病的诊断,人类感染了外源的
病毒、细菌等引起的传染性疾病的诊断可以直接分析患者的
组织、器官或血液等来确定是否有外来病源性生物的基因。
如 HIV的 DNA序列已经搞清，可以根据该序列设计合成一段
引物，再从受检人的血液或组织中抽提极微量的 DNA为模板
进行 DNA的扩增，如获得与 HIV DNA序列相同的特定长度的
DNA片段，即可确定受检者携带 HIV病毒。
□ 人类遗传性
疾病的产前诊断
人类有 200多
种遗传病可用基
因诊断技术作出
准确的诊断，甚
至在发病前和出
生前作出诊断。
如胎儿的羊水和
胎盘绒毛细胞可
从母体内取得，
取出的细胞可以
进行染色体核型
、性别、生化和
基因组缺陷的检
测
1,检测限制性位点的变化
（ 1） 镰形细胞贫血症是编码血红蛋白 β链的一个决定谷氨酸的密
码子 GAG变成了编码缬氨酸的密码子 GTG,从而使血红蛋白质分
子结构和功能发生根本的改变, 该患者的红细胞由正常的园盘形
变成镰刀形 。
正常红细胞 镰形红细胞
（ 2） 检测原理,由于血红蛋白基因上单个核苷酸的替换 （ A→T）,
使该部位的正常序列由 CCTGAGG变成 CCTGTGG,从而使患者 DNA
中消失了一个可被特定内切酶 （ Mst II） 切割的切点 。 Mst II识别的序
列为 CC↑TNAGG。 下图为正常和异常蛋白, 基因和内切酶识别位点
变化图 。
β—珠蛋白基因
—————————————————— ///////// 内 含 子 ///////////////////////////
—————————————————— ↑ 0.2kb ↑ 1.1kb ↑
M M M
（在异常中消失）
— 脯 ——缬 ——谷 —
—CC T—GTG—GAG—
Mst II识别位点消失
异常 S
— 脯 ——谷 ——谷 —
—CC T—GAG—GAG—
Mst II识别位点
正常 A
氨基酸序列和基因序列 血红蛋白类型
( 3 ),Southern杂交检测镰形细胞贫血症
提取羊水或绒毛细胞 DNA,用限制性内切酶 Mst II对 DNA酶
解, 经电泳和 Southern吸引转膜后, 用放射性标记的 β-株蛋
白基因探针对膜上的 DNA作杂交, 根据经放射自显影后的
胶片上杂交斑点的多少和位置可作出诊断,
正常人的 β-珠蛋白基因 （ βAβA） 中有 3个 Mst II切点, 可将该
DNA上切成 2个片段, 它们为 0.2kb和 1.1kb长, 因此会在相
应位置产生二条杂交带；异常患者的 β珠蛋白基因 （ βSβS）
中, 只有 2个切点, 可将该 DNA切一条长 1.3kb的片段 。 突变
携带者 （ 杂合子 ）, 其 β-珠蛋白等位基因中, 一个是正常的
基因, 它有 3个切点, 切成 2个片段；另一个携带突变的基因
片段中只有 2个切点, 产生一个大的片段 。
( 4 ),Southern杂交检测结果
2, 异 常 序 列 检 测 ( allele-specific
oligonucleotides,ASO)
如果某一特定核苷酸发生异常, 可用在该基因相应区
段上正常的野生型序列的寡核苷酸作为探针, 经
Southern杂交确定,杂交时的温度是重要条件 。 因为
野生型和突变型只差一个核苷酸, 都可能与正常野生
型探针杂交 。 在较高温度时, 互补序列才能杂交, 只
有一个错配碱基的 DNA也不能杂交 。
Genotype determination using allele-specific oligonucleotides
(ASOs),
19-7
3,PCR检测法
用 Southern杂交法对镰形细胞贫血症作产前诊断需要足够的细胞
,并需提取纯化 DNA,并作酶切和杂交等步骤, 不但所需时间
较长, 而且有一定的风险 。
PCR法：根据 β-珠蛋白基因序列设计二条引物；取得极微量胎儿
绒毛细胞或患者血液，裂介细胞粗提 DNA，然后作 PCR扩增，无
论是正常或异常者都会产生 1.3kb长的 DNA片段。再对扩增样品
作酶切和电泳，其结果可直接从电泳图获得：该法简便，只需微
量细胞就可作出诊断。
正常 异常 携带者
1.3
电 1.1
泳
↓ 0.2
□ PCR原理
（ 1） 变性, 在 95℃ 高温下
模板双链 DNA解开成单链
DNA。
（ 2） 退火, 将反应系统降
至 55℃, 使引物能与模板
单链 DNA的特定部位配对
结合 。
（ 3） 链延伸：在 72℃, 以
单链为模板, 在引物的 3’末
端以互补原则合成新链 。
每一周期可使目的基因扩
增一倍, 经 30个周期可扩
增 230目的基因片段 。 PCR
技术是 DNA操作的重大发
明, Mullis等获得了 1993年
诺贝尔奖 。
4,基因芯片技术
（ DNA microarrays or DNA chips)
□ 概念,基因芯片技术是 DNA杂交探针
与半导体工业技术相结合的产物。将各种
探针固定于支持物上后与带有荧光标记的
DNA样品分子进行杂交，通过检测每个
探针分子的杂交信号，进而获取被测样品
中 DNA分子的数量和序列信息。该技术
可用于大规模筛查由基因突变引起的疾病
。
□ 检测原理和步骤,
(1)．制作芯片：根据疾病基因中的突变位点区域的
核苷酸序列合成 20个核苷酸长的探针，将其固定于芯
片上，芯片上可固定成千上万个探针。
（ 2）．从被测对象的细胞中提取 DNA，用酶切成较
小的片段，并对 DNA作荧光标记，并熔解成单链。
（ 3）, 将样品滴加到芯片上并与芯片上的探针杂交
,凡是与探针互补的酶切片段会固定于特定位置上,
不能互补的片段会被洗脱掉 。
（ 4）, 对芯片上的荧光作扫描和分析 。
Gene screening using a DNA
microarray,
遗传咨询的若干伦理问题
遗 传 病 的 定 义
遗传病是由于遗传物质
发生改变而造成的疾病，
它可在上下代之间按一
定的方式垂直传递，并
且在有血缘关系的个体
间由于遗传继承，有一
定的发病比例。
遗 传 疾 病 的 分 类
（一）染色体病
（二）单基因遗传病
（三）多基因遗传病
遗传病的发病率有增高趋势
? 1956年活婴中有先天性缺陷患儿的
比例约 4‰ ；
? 1968年活婴中有先天性缺陷患儿的
比例约 6‰ ；
? 1977年活婴中有先天性缺陷患儿的
比例约 10.8‰ ；
遗传病本身具有的严重性
? 遗传性 (hereditary),
患者家庭的上、下垂直发病或同代间的水平发病,
家系中往往有多个发病的个体；
? 先天性 (inborn),
在胎儿期即存在遗传损害，生后即出现缺陷，给
预防和治疗造成极大的困难；
? 终生性 (life long),
患者受累终生直至死亡
（ AR）
（ AR）
（ AR）
（ AD）
（ XR）
（线粒体病）
遗传服务中应遵循的伦理学
原则
遗传服务的四大伦理原则
? 尊 重 自 主
? 行 善
? 无 伤 害
? 公 正
产前诊断中涉及道德问题上
的 4项基本准则
? 尊重夫妇双方的选择
? 对个人和家庭不产生伤害
? 产前诊断的结果可靠
? 产前诊断和遗传咨询的自愿
性
二、基因治疗（ gene therapy）
人类的遗传性疾病治疗的常规方法,（ 1） 手术
治疗, 如先天性心脏病通过手术加以矫正,（ 2）
药物治疗, 如生长激素缺乏症 （ 侏儒 ） 可注射人
生长激素等 。
□ 基因治疗定义, 应用基因工程手段用正
常基因导入基因有缺陷的靶细胞中, 使正
常基因表达, 并合成相应的产物, 使细胞
恢复正常的功能, 使疾病得到治疗 。
□ 基因治疗的类别,根据基因转移到受体细胞
的不同, 可分为体细胞基因治疗和生殖细胞基
因治疗 。
（ 1）, 体细胞基因治疗,将正常的外源基
因导入到患者特定的体细胞中, 并使其正常表
达, 合成患者所缺的某种蛋白质或酶, 使患者
的症状得以改善 。
（ 2）, 生殖细胞基因治疗,将正常基因导
入患者的生殖细胞, 受精卵或早期胚胎细胞中
,使这类细胞中的某些异常基因的功能得以恢
复, 最终发育成正常个体 。
1,基因治疗方法和步骤
(1)．通常将正常的基因首先与基因转移的载体相连
接,常采用的载体有 反转录病毒载体和腺病毒载体 。
(2),将患者的体细胞 （ 称靶细胞 ） 作体外培养, 常用
的有 T淋巴细胞, 骨髓干细胞, 皮肤成纤维细胞, 肌细胞, 肝
细胞等
(3),外源基因的转移, 将外源基因通过载体导入到靶细
胞中, 常用转染的方法 （ 加入磷酸钙 ） 导入到细胞中, 并与
细胞中核 DNA整合到一起, 也可用重组病毒感染靶细胞转移
外源基因 。
(4),对能正常表达目的基因的靶细胞作检定后回输
到患者体内 。
重症联合免疫缺陷 （ Severe combined
immunodeficiency disease,简称 SCID）, 患者
缺乏正常人体免疫功能, 其染色体上编码 腺苷
脱氨酶 （ 简称 ADA） 的基因发生突变所致 。 由
于 ADA是嘌呤代谢中的一种酶, 该基因缺陷将
导致患者身体细胞中脱氧腺苷的累积, 达到高
浓度时脱氧腺苷将对免疫系统细胞 （ 如 T-细胞
和 B-细胞 ） 产生毒性 。
2.基因治疗实例
1990年, 美国第一次对 SCID病人作基因治疗,
其步骤为,
（ 1）, 将正常 ADA基因与反转录病毒载体相连, 构建重组病
毒表达载体 。
（ 2）, 从患体体内分离有免疫缺陷的 T淋巴细胞 。
（ 3）, 用重组病毒感染体外培养的 T淋巴细胞, 使正常 ADA基
因插入到 T淋巴细胞基因组中 。
（ 4）, 培养细胞并确认该基因正常表达 。
（ 5）, 将含有正常基因的 T淋巴细胞回输到患者的骨髓组织中
。 经 5-6个月的基因治疗, 患者体内 T淋巴细胞的数量恢复到正
常水平, 体内 ADA酶几乎达到正常水平, 免疫功能得到恢复 。
Gene therapy for treatment of severe combined
immunodeficiency (SCID),a fatal disorder of the immune
system caused by absence of the enzyme adenosine deaminase
(ADA)
Ashanti DiSilva,
the first person to
be treated by gene
therapy,
第八节
基因工程生物技术和社会伦理问题
由于生物技术与人类社会的
密切联系，所以引起的争论
也十分强烈。
“巨大的力量意味着重大的责任”
——美国总统生命伦理咨询委员会
伯格会议和 HGP的启示
P.Berg
美国斯坦福大学教授
1975 伯
格会议
是否可暂停基因重组
实验，先着手制定共
同遵循的规范
伯格会议和 HGP的启示
人类基因组计划
（ HGP）
相关伦理、法律和社会影响的研究
（ ELSI）
生命科学史乃至全部科学技术史上的第一次
600万犹太亡灵的呼唤
信奉优生学的科学家把, 人类遗传学
和种族卫生概念, 等狂热鼓吹人类不
平等的优生学著作送给希特勒，成为
他推行种族屠杀政策的重要“科学”依据
日本 731部队的细菌武器试验
731部队遗址
从 1933年至 1945年,731部
队等一直在进行人体细菌武
器试验。据不完全统计，因
此而死亡的不下 3000人。
美国的梅毒试验
1932年，美国在 Tuskegee镇对
感染梅毒的 25~60岁的男性黑人
进行“梅毒自然史“的研究
时间长达 40年之久
如此不文明的行为
为什么会发生在一个
最文明的时代
最文明的国家
最文明的群体？
科学与人文的携手
? 什么是生命伦理学
BIO-ETHICS
在跨学科、跨文化的背景下，对
生命科学和医学的伦理学，包括道
德见解，判断，行为，政策等进行
系统的研究
生命伦理学关注的若干热点
和难点
辅助生殖
克隆技术 人类基因组研究
转基因食品
胚胎干细胞
辅助生育的伦理道德的问题
生殖技术的开展概况
(一 )人工体内受精（ artificial insemination ）
1.用丈夫精液的人工受精
(artificial insemination by husband,AIH)
2.用捐赠者精液的人工授精
(artificial insemination by donor AID)
3.借腹生子
(surrogate mother代理母亲 )
(二 )人工体外受精（ in vitro fertilization）
生殖技术的伦理和法律问题
1.谁该是孩子的父母?
异源性人工体内、体外受精的孩子可有多
个父母，包括遗传父母，养育父母，完全父母，
孕育母亲。在多个父母共存的情况下，谁应该
成为孩子的真正父母呢？是按照遗传关系将孩
子的父母确定为遗传父母，还是遵循抚养教育
的原则将养育父母确认为真正的父母？
2.代理母亲合乎道德吗?
代理母亲分娩后都要将孩子给不孕
症一方抚养。国外在 20世纪 70年代末开始
有代理母亲，现在美国有代理母亲中心，
我国也有极个别妇女原意接受代理母亲者，
并少数实施，但不可避免的是存在有关代
理母亲的法律案件。
3.精液，卵子和胚胎是否可以商品化?
1,精液商品化可能使精子库为追求盈利而忽视精子的质量；
2.供精者可能为金钱隐瞒自己的遗传缺陷或传染病；
3.供精者多次供精，从而造成同一供精者的精液为多数妇女使用；
4.精液的商品化也会产生连锁反应，促使其他人体组织或器官的商
品化如卵子和胚胎的商品化。
4.非婚妇女能否进行人工授精?
未婚，同性恋，离婚的女子及寡
妇是否可依其请求而实施供体人工授精。
对此各国的伦理和法律不太一致，在我
国由于计划生育政策和传统观念的影响，
该项做法是不大可能进行的。
胚胎干细胞
两大争论焦点
1.如何看待胚胎
2.是否必然滑向生殖性克隆
?当今最激烈而敏感的伦理之争
?一场“文化战争”
2001年 8月，罗马天主教皇
保罗二世对美国总统布什说,
不要资助那些研究胚胎干细
胞的人，他们
毁灭生命、败坏道德。
?在科学与人文之间寻求平衡
英国沃诺克委员会（ Warnock
Committee）
14天前的胚胎（前胚胎），还是 既无感觉又无知
觉的细胞团,还不构成道德主体，可以作为研究对
象，用来治病救人、造福人类。但必须遵循严格的
伦理规范。
□ 基因隐私权
1,在升学, 求职, 婚姻, 保险等领域的影响 。
2,缩命论思想 。
□ 生物技术用于研制生化武器, 给
人类带来灾难 。
生命伦理学进入大学课堂
? 随着生命科学和医学的发展，生命伦理问
题必定会越来越突出、越来越重要。这是
不可抗拒的文化潮流，也是社会文明进步
的重要表现。
新世纪的教育必须适应这一趋势。
?学习生命科学和医学的大学生、研究生，
是否具有生命伦理的理念和知识，至为
关键，是他们专业知识的重要组成部分。
?非生物专业的学生，学习生命伦理学，
对于培育他们 以人为本 的理念和情怀，
尊重生命、关爱生命,也大有助益。
Gene manipulation
第一节 碱基互补的能力
一, DNA的热变性
1,G－ C含量高的 DNA具有较高的熔解温度, 可以根据熔解
温度的不同将 GC含量不同的 DNA分子分开, 并可推测 DNA分
子中 G－ C的相对含量 。
2,根据熔解温度的差别在 DNA分子中作基因定位和分离基
因 。 组蛋白是与核 DNA结合的碱性蛋白, 富含精氨酸, 其编码
区相对富含 G－ C对 。
海胆组蛋白基因在较底温度时（ 61℃ ）的变性电镜图，
每种组蛋白基因被一个富含 A－ T对区域间隔开。用 S1核酸酶
处理，消除单链。
H1
H2A H3 H2B H4
二, 互补单链的复性
利用互补单链复性的特点可以确定基因缺失的位置和大小：一个缺失突
变体的 DNA和一个野生型的 DNA一起复性后就可确定缺失区 。
a b c d e
a,b,c,d,e,
a b d e
a,b,d,e,
a b c d e
a,b,c,d,e,
a b d e
a,b,d,e,
a b
c
d e
a,b,d,e,
Heat
Mix and cool
三, 染色体上 DNA序列的定位
用特异性 RNA或 DNA作探针与染色体上相
应的 DNA互补区域作杂交, 从而确定该特异性
基 因 的 位 置 称 染色体原位杂交 （ in situ
hybridization of chromosome） 。
In situ
hybridization
of human
metaphase
chromosomes
using
fluorescent
technique
(FISH)
第二节 限制性内切酶
一, 宿主限制现象
X X
A B
X-A X-B
A B A B
X-A X-B X-A X-B 100% 100% 0.002% 100%
Phage
Infect
Bacteria
从两个不同菌株 A和 B来的噬菌体 X具有不同的感染能力
X-A
A
X-A B X-B A
X-A
100% 100%
很差
无法分离到能感染 A细菌的 X-B来的噬菌体
用很少一些
感染力差的
结果说明,噬菌体的宿主范围取决于它所来源的细菌
菌株, 而不是噬菌体的基因型； 宿主的基因型对噬菌
体有一种修饰作用, 但并不改变噬菌体 DNA的序列 。
细菌的基因型决定该细菌对各种噬菌体感染的敏感性
,一种噬菌体的基因型决定它所能感染细菌的范围,
它们之间具有密切的依赖和限止关系 。
在不同基因型的细菌中生长的噬菌体其具有不同的
感染能力
二, DNA的修饰
☆ 是什么限制了 X－ B噬菌体在菌株 A中的繁殖呢？
是由于宿主的一种核酸酶的作用, 它能将噬菌体
DNA切成许多无感染力的片段, 宿主细胞具有破坏其
陌生 DNA的防卫系统 。
☆ 怎样保护宿主自身的 DNA和感染性 X－ A噬菌体 DNA免受宿
主核酸酶的攻击？
有一种酶能在特定序列上修饰特异性碱基, 但是并
不改变这些碱基的编码性质 。 如在胞嘧啶和腺嘌呤上
增加一个甲基后就能保护 DNA免受核酸酶的攻击, 该
过程称 甲基化作用 （ methylation） 。
?在宿主限制现象中有两个相互的过程,
（ 1） 由于宿主核酸酶的作用破坏了侵入
的噬菌体 DNA,从而 限制 了噬菌体的繁
殖；
（ 2） 噬菌体 DNA修饰 免除了限制酶的
作用 。
Bacterium A has the capacity to modify DNA whereas B does not
三, 限制酶的特异性
1970年, Hamilton Smith从流感嗜血杆菌 d株分离到能识别特
定核苷酸序列, 切点专一的限制酶－ HindII
↓
5’－ G－ T－ Py－ Pu－ A－ C－ 3’
3’－ C－ A－ Pu－ Py－ T－ G－ 5’
↑
Smith进一步证明宿主诱导的甲基化作用保护了具有同样序列
的 DNA免受 HindII的切割,
↓ m
5’－ G－ T－ Py－ Pu－ A－ C－ 3’
3’－ C－ A－ Pu－ Py－ T－ G－ 5’
m ↑
*
*
Py,pyrimidine
Pu,purine
E.coli的 R质粒的一个基因产生的限制酶 EcoRI,它对 SV40
病毒的环状 DNA分子上只有一个切点 。
5’－ G－ A－ A－ T－ T－ C－ 3’
3’－ C－ T－ T－ A－ A－ G－ 5’
上述序列是旋转对称的 。 由于切点是错开的, 因此使 SV40
的环状分子切开成具有 粘性末端 （ sticky ends） 的线状分子 。
上述序列中腺嘌呤的甲基化也能保护 DNA免受 EcoRI的切割 。
m
m
回文序列 —palindrome
↓
5’…… G A A T T C …… 3’
3’…… C T T A A G …… 5’
↑
EcoRI切点的两条链中的序列从相反方向阅读是一样的, 称为
回文序列 —palindrome。 从正向和反向阅读是同一句子,
ABLE WAS I ERE I SAW ELBA
几种限制酶的名称和识别序列
T↓C T A G A
A G A T C↑T
Xba I
C T G C A↓G
G↑A C G T C
Pst I
A↓A G C T T
T T C G A↑A
Hind III
G A T↓A T C
C T A↑ T A G
EcoR V
G↓A A T T C
C T T A A↑G
EcoR I
G↓G A T C C
C C T A G↑G
Bam H I
识别位点序列 内切酶
四, 限制酶作图
1,在 DNA分子上确定限制酶切点的相对顺序
是一种重要的染色体作图法 。 从图上任何两个
切点之间的距离可估计出核苷酸的数目 。
2,方法要点：特定来源的 DNA经不同的酶消
化后, 样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离, 可得
到限制位点的图谱 。
1 2 3 4 5
5,
3,
3,
5,
酶 1
酶 2
1 2 3 4 5
32P
32P
酶 1
酶 2 Digestion
1 2
3 4
5
32P
1
2 3
4 5
32P
32P
A
B
C
D
E
F
(a)
(b)
32P
1 2 3 4 5
1
2
3
4
5
酶 2
A B C
1 2 3 4 5
D E F
1 2 4
5
酶 1
(a) (b)
根据重叠的亚片段排列原先片段的顺序
亚片段 位于原先片段
1
2
3
4
5
A D
A E
B E
B F
C F
(c)
3
根据重叠的亚片段排列原先片段的顺序, 可以得到一个 DNA的酶切图谱 。
1
1 2
2 3
3 4
4 5
5
D
A
E
B
F
C
1 2 3 4 5
2 1 2 1 酶切位点
2 1 2 1
酶切图谱
练习题,
从某一生物的基因组 Bam HI文库中获得了长
3.0kb的片断,如用 EcoRI消化该片断获得 1.7kb、
0.9kb和 0.4kb三种片断 ;如用 Hind Ⅲ 消化获得 1.6kb
和 1.4kb片断 ;如用上述两酶混合消化获得 1.2kb、
0.9kb,0.5kb合 0.4kb四种片断 。 根据上述结果绘制
限制性图谱 。 要求标出 EcoRI,HindⅢ 和 BamHI的
位点和它们间的距离 。
第三节 重组 DNA
? 在细菌细胞中选择性地扩增特定
DNA 片 段 的 过 程 称 分 子 克 隆
（ molecular cloning） 。
重组 DNA技术的基本步骤
（ 1） 获得目的基因, 一般是有重要生物学功能的外源基因 。
（ 2） 在限制性内切酶和连接酶的作用下, 将目的基因与克隆
载体相连接, 组成一个新的重组 DNA分子 （ recombinant DNA
（ 3） 将重组 DNA分子引入受体细胞, 并在细胞中进行 DNA
复制, 最常用的受体细胞为大肠杆菌 。
（ 4） 对转化子 （ 含有重组分子的受体细胞 ） 进行筛选和鉴定
,以确认含有外源基因 。
大量培养细胞可获得目的基因的大量拷贝，或基因表达的产
物等。
一般意义上的重组
DNA技术专指在细菌
细胞中特异性地扩增
特定 DNA片段的分子
克隆技术，广义上的
重组 DNA技术还延伸
到整个基因工程的应
用领域 。
重组 DNA技术的基本步骤
外源
DNA 载体
重组 E.coli
目的基因的制备
构建重组 DNA分子, 首先要获得有用的目的基因片段,
最常用的方法有三种,
（ 1） 直接从一生物中提取基因组 DNA,并构建该基因
组的文库 （ gene library） 再从中调出目的基因的克隆 。
（ 2） 以 mRNA为模板反转录合成互补的 DNA,称 cDNA
,并构建 cDNA克隆 。
（ 3） 采用聚合酶链反应 （ PCR） 特异性地扩增某一目的
基因的片段 。
细胞内总 DNA的提取和基因文库的构建
各种生物的特定组织 （ 如血液, 肝脏, 植物组织, 细菌细胞等 ）
都含有大分子量的 DNA。 由于目的基因位于整个基因组 DNA中,
难以检出和分离, 可以先将基因组 DNA用内切酶切成较小的片段
,再将它们分别与载体相连, 并转入细菌细胞中进行繁殖和扩增
,再对各个不同的克隆作出检定 。
非选择性地在细菌细胞中克隆某一生物的随机 DNA片段的过程称
鸟枪法,全部克隆集合体称某一生物的 基因文库 。组成一个生物
的基因文库的全部重组质粒或重组噬菌体中的目的基因就代表了
一个生物的整个基因组。
一, 直接产生粘性末端用于组成一个新的重组
DNA分子 （ recombinant DNA） 16-2
二, 加尾连接 （ Tailing）
1,同聚物加尾
末端转移酶 （ terminal transferase） 能催化 DNA的 3’末端加上
核苷酸尾, 如将 dA和 dT加到不同的 DNA末端, 就可以连接成重组
质粒, polyG和 polyC也可用相同方法加尾 。
同聚物加尾连接的优点：加尾后 DNA片段自身不会环化,
可提高异源 DNA重组率 。 缺点：加入的 polyA和 polyT可能影响基
因表达；外源基因克隆扩增后不能用限制酶重新从重组质粒中切
出来 。
TTAA
AATT 5,
3,
3,5,
5,
3,
3,
5,
AAA
AAAA
5,3,
5,3,
AAA
AAAA
TT TTT
TT TT
AAAA
AAAAA
T TT TT
TT TT
5,3,
3,5,
5,
3,
3,
5,
5,
3,5,
3,
E coRI
外切酶
末端转移酶 dATP
shear
外切酶
末端转移酶
dTTP TTTT
TTTTT
Plasmid
DNA
Drosophila DNA
DNA polymerase,DNA ligase
末端转移酶（
terminal
transferase）能
催化 DNA的 3’
末端加上核苷
酸尾，如将 dA
和 dT加到不同
的 DNA末端，
就可以连接成
重组质粒
2,人工接头的应用
人工接头是一个合成的含有特定限制酶识别顺序的核苷酸片段
。
EcoRI
↓
C C G A A T T C G G EcoRI
G G C T T A A G C C 人工接头
↑
EcoRI
＋
T4DAN 连接酶
人工接头
EcoRI
外源 DNA
粘性末端用于连接载体
人
工
接
头
的
应
用
四, 载体 Vectors
能使克隆的片段不断复制的一类 DNA分子称载体, 应具备以
下特点,
（ 1） 分子量小, 核苷酸序列清楚, 具有一些单一酶切位点或
人工插入的多克隆位点区 。
（ 2） 分子中具有一个复制起始点, 能使载体自身和插入的外
源 DNA共同复制 。
（ 3） 具有易于筛选重组分子的标志, 如抗药性 。
(4) 比较容易从宿主细胞中回收
1,质粒,
双链环状 DNA分子, 能经转化导入 E.celi中
优点：能使宿主细胞产生抗性, 便于选择质粒
,在细胞中的拷贝数多 。
A color-enhanced electron mincrograph of circular
plasmid molecules isolated from the bacterium E.coli,
.The plasmid pUC18 offers several advantages as
a vactor for cloning
Cloning with a plasmid vector,16-9
利用 Lac Z基因的插入失活筛选重组子
许多载体的多克隆位点区插入在
Lac Z基因区中。 Lac Z基因编码
β-半乳糖苷酶的一个亚基，它可
以使携带载体的细菌在含有 X-
gal（能被 β-半乳糖苷酶水解的底
物）的培养界上形成 蓝色的菌落
。 当外源基因插入到多克隆位点
区后就阻断了 Lac Z基因的编码
区，使 Lac Z基因失去了功能，
因此，凡是插入了外源基因的重
组质粒进入宿主细胞后，这些细
胞就不能利用 X-gal，结果在培
养基上形成 白色的菌落。 挑选出
白色菌落可作进一步鉴定。
A Petri plate showing the growth of bacterial
cells after uptake of recombinant plasmids,16-
6
菌落原位杂交筛选和鉴定克隆的基因
根据重组质粒中的目的
基因的序列，合成一段
与之互补的 DNA序列，
并使其标记上放射性同
位素，该段 DNA称为探
针。再用探针与菌落中
的 DNA进行杂交，可从
许多未知的菌落中挑选
出克隆有目的基因的菌
落。
2,λ噬菌体 它
的头部通常能包
装进 45kb 长的
DNA分子, 基因
组中间部分是裂
解性生长的非必
需区, 因此在其
区域内转换插入
大的外源 DNA片
段可以不影响其
复制功能 。
3,单链病毒
在感染 E.coli过程中, 感染性单链能转变为双链的
复制型 。 分离这种复制型的双链可用作克隆的载
体 。 这种噬菌体用作克隆的优点：在重新感染合
适的宿主时, 它产生的噬菌体颗粒是单链 DNA，
为 DNA序列分析提供方便 。
4,表达载体 Expression Vectors
具有合适的转录和转译起始信号, 外源基因
插入合适的区域后能够表达的载体 。 某些载
体质粒既具有 E.coli的复制起始区, 又具有动
物病毒 SV40的复制起点, 这样的质粒既可在
E.coli中复制, 又可在培养的动物细胞中复制
,应此称为穿梭载体 。 Shuttle Vectors
第四节 重组 DNA方法学
一, 克隆战略
1,无选择地从一个限制酶切的混合物中克隆全
部片段, 然后再筛选所需的目的基因 。
非选择性地在细菌中克隆一个高等生物的随
机 DNA片段的方法称为鸟枪法 （ Shotgunning）,
全部克隆的集合体称为一个基因文库 （ gene
bank,or gene library） 。 组成一个基因文库的全
部重组质粒或全部重组噬菌体代表了一个生物整
个基因组 。
2,用一目的基因的一个探针从整个 DNA酶切
片段的集合体中选出合适的酶切片段，然后再克
隆特定的片段。
组成一个基因文库的全部重组质粒或全部重组噬菌体代表
了一个生物整个基因组。
二、鉴定
克隆的基
因
1．用特定的内
切酶消化重组
质粒，电泳比
较切出片段的
大小。
2,Southern Blotting
酶切和电泳只能对重组克隆作出初步鉴定，可得
知克隆片段的大小但尚难确定克隆片段是否目的基因
。 Southern发明了一种对电泳凝胶中的 DNA作分子杂
交鉴定的方法。该方法可用于重组质粒鉴定，转基因
生物中外源基因的插入位置，遗传病的分子诊断等。
单链 DNA能结合到硝酸纤维滤膜上，酶切物经电
泳后，琼脂糖胶作变性处理，然后将 DNA吸印到膜
上，用 32P标记的 DNA或 RNA探针与膜上的 DNA作杂
交，自显影后可显示出目的基因的位置和大小。
The Southern blotting technique
southern blot
after
hybridization,
exposure,and
development,
The bands
show DNA
fragments
complementar
y to the
nucleotide
sequence of
the probe,
3,用 cDNA克隆作探针, 从基因文库中筛选目的基因
克隆 。
用反转译酶从 mRNA制备 cDNA,全部 cDNA片段与质粒载
体相连, 转化 E.coli得到的全部克隆称为 cDNA文库 。
* 一个基因的 cDNA克隆和 genomic克隆可能在大小上有很大
区别, 为什么？
4,直接分析克隆基因表达的蛋白
在生物的不同器官和
组织，或在细胞的不同
的分化阶段会有某些特
定基因的表达，此时细
胞中的特定基因会特异
性转录成特定蛋白的
mRNA，因此可用反转
录方法获得该基因的
cDNA。
用反转录酶从 mRNA合
成 cDNA；全部 cDNA片
段与载体相连并转入细
菌细胞获得的全部克隆
称 cDNA 文库, 再从
cDNA文库中调出目的
cDNA克隆 。
思考题,
假定人生长激素基因的 cDNA(1kb)已经插
入在某一载体的 BamHI和 EcoRI的酶切位点中
，该克隆大小为 5kb。例举两种鉴定该基因的
具体方法，要求写出实验步骤，并且用图表
示鉴定结果。
三，克隆基因的定点诱变
□ 意义,基因的功能通常是通过其突变体来认识其作用的。在
重组 DNA 技术中常需研究 DNA 序列上特定部位的功能，或改变
基因编码区个别氨基酸的密码子以提高该基因表达蛋白质活性
等。
□ 定义,特异性地改变某一基因的方法称
定点诱变
site-directed mutagenesis
克隆基因的定点诱变
根据基因中欲改变位点的核
苷酸序列设计一段引物，引
物中含有突变的碱基。在聚
合酶作用下，合成一条互补
的含有突变基因的链，将杂
合双链引入大肠杆菌细胞，
经复制后会产生一个野生型
和一个突变型基因的细胞，
再用分子杂交法作鉴定。
思考：如何用分子杂交法 筛选和 鉴
定一个野生型和一个突变型基因？
第五节 DNA序列分析
DNA序列分析是最终了解基因结构和组成的重要工
具,在人类基因组计划中测定人基因组的全部核苷酸
序列是该计划的核心 。 1977年 Sanger发明了以双脱
氧核苷三磷酸 （ 2’3’ddNTPs） 作为 DNA合成终止剂
的, 末端终止法,, 开创了基因核苷酸序列测定的
先河, 最早完成了 Φ× 174全部序列的测定 。
为此 Sanger第二次获得诺贝尔奖 。
发现了重叠基因
Sanger等最早对 Φ× 174病毒作 DNA序
列分析, 该病毒基因组全长 5400bp,共编
码 9种蛋白质, 但根据该 9种蛋白质分子量
推算其编码区, 明显超过病毒基因组
5400bp长的核苷酸所能编码的容量 。 如何
解开这个谜？ Sanger回答了这个问题,在
基因组中存在重叠基因 ！
重叠基因
定义：在一种蛋白质的核苷酸编码序
列中包含了另一种蛋白质的编码序列
，所不同的是各自以不同的读码框转
译。 Φ× 174病毒的重叠基因如下,
A
B
C D J F G H
E
重叠基因概念与密码子的非重叠性
Sanger采用独创的序列分析方法对 Φ× 174病毒基因组作序
列分析，提出了令世人惊讶的重叠基因概念，是对基因认识的
重大发展。 重叠基因是利用两种不同的读码框架编码两
种不同的蛋白质，在每一读码框中密码子解读仍是不
重叠的。 如下图,
aa1 aa2 3 59 60 61 62 63 149 150 151 152 ↑
ATG AGT CAA …… GTT TAT GGT ACG CTG ……GAA GGA GTG ATG TAA
175 189 445
aa1 aa2 3 4 89 90 ↓
基因 E开始 基因 E终止
↑
基因 D开始 基因 D终止
Sanger序列分析方法原理
采用单链 DNA（ 或将含有外源基因的重组质粒 DNA
变性 ）, 在引物和 DNA聚合酶的作用下, 在四组独立
的反应中除加有 4种 dNTPs外 （ 其中之一为同位素标
记 ）, 再分别加入 4种 ddNTPs中的一种作为链延伸的
终止剂, 结果将在四组反应管中产生长度不等的 4组
寡核苷酸链, 它们分别终止于被测链的每一个 A,G
,C或 T。 如在加有 ddATP的反应管中产生的是一系列以 A为
结尾的寡核苷酸链；在加有 ddGTP的反应管中形成的是以 G为
结尾一组寡核苷酸链等等, 再经聚丙烯酰胺凝胶电泳, 转膜和
放射自显影即可从放射自显影胶片上读出 DNA序列 。
O
Base
H H
O = P – P – P – O
O O O
O O O
2’,3’ddNTP的结构，注意其 3’位置是一个 H而不是 OH，
因此后续的脱氧核苷酸不能接到 3’位上 从 而造成链的终止
。
Sanger
DNA
序
列
分
析
示
意
图
DNA sequencing gel
showing the
separation of
fragments
in the four
sequencing
reactions (one per
lane),
In DNA sequencing
using
dideoxynucleotides
labeled with
fluorescent dyes,all
four ddNTPs are
added to the same
tube,and during
primer extension,all
combinations of
chains are produced,
16-20
Automated DNA sequencing using fluorescent
dyes,one for each base,
思考题,
假定某一克隆基因的部分序列为
5, —TCACGTAAGT—3,, 试根据
Sanger序列分析方法原理 画出测定上述
序列的放射自显影示意图, 并对示意
图作必要的标注和解释 。
第六节 基因工程
由基因工程方法产生的生物称为转基因生
物, 它一般是指由导入外源 DNA的细胞
发育而成的生物 。
基因工程
□ 定义：根据分子生物学和遗传学的原理，将一种生物的
遗传物质 DNA转移到另一生物体中，使后者获得新的遗传性
状或表达出所需要的产物。
一、利用微生物基因工程生产重组基因工程药物
利用基因工程技术不但能得到大量的具有特殊功能的基因。而
且可以让这些特殊功能的基因生产出具有特殊功能的蛋白质药
物，这是目前 基因工程 领域中最活跃最有成果和极富商业价值
的领域之一，究其原因,
（ 1）蛋白质和多肽是基因表达的直接产物，可用重组 DNA技
术进行研究和生产。
（ 2）具有生物活性的蛋白和多肽是珍稀而具有很高医疗价值
的药物，用常规分离的方法很难制取。
目前有几十种基因工程药物, 常用的有：干扰素, 白细胞
介素, 乙肝疫苗, 人胰岛素和人生长激素等 。
人类最早的商业化基因工程药物是 人胰岛素和人生长激素
,于 80年代初投放市场, 用大肠杆菌来生产, 是 基因工程
发展的里程碑 。
□ 胰岛素是治疗糖尿病的重要药物, 之前从猪或牛的胰
腺中提取分离, 含量少而且会有毒素 。
□ 人生长激素是治疗侏儒症, 青少年增高和促进创伤组
织修复的药物, 生长激素具有种属特异性, 从动物脑组织
来源的生长激素不能用于人类, 之前只能从刚死亡的人大
脑垂体中分离纯化, 来源极有限；而且发现长期应用会对
人类有毒副作用 。
The method used to synthesize recombinant human
insulin,
19-15
溴化氰
例子
大鼠肝脏 F抗原 蛋白基因在大肠杆菌中表达
F蛋白定位在肝细胞浆中, 正常人肝组
织中的 F蛋白含量是血清中 1370倍, 只有肝
细胞被破坏时, F抗原才释放到血浆中, 使
血清中 F抗原含量升高,
F抗原用作肝病诊断, 首先需获得纯的 F抗原 。
目前国内外大多采用生化提取的方法从人肝脏组织
中分离 F抗原, 由于难以得到 F抗原纯品, 给大量制
备诊断试剂带来困难 。
利用原核 （ 大肠杆菌 ） 表达系统, 成功表达了
大鼠肝脏 F抗原, 表达产物经 SDS-PAGE,Western-
blot分析, 分子量为 43kD,同时具有 F抗原的免疫学
活性, 可作为一种基因工程产品用于今后的免疫检
测工作 。
方法,
基因克隆。 提取大鼠肝脏总 RNA，对其进行反
转录和 PCR（ RT-PCR）扩增出目的基因（ F-
antigen’s cDNA），然后将其与 pET-15b载体进行
连接，转化大肠杆菌 BL21(DE3)plyss，在含
氨卞青霉素和氯霉素的培养基上筛选转化子
。将酶切结果正确的表达质粒命名为
pET15b-F。
表达载体 pET15b-F 构建示意图
F抗原表达
经 IPTG诱导后，含表达载体 pET15b-F的表达
菌株表达出一外源蛋白，该蛋白大小在 43kD左右，
与文献报道大鼠 F蛋白大小一致。且在该表达系
统中得到高表达,外源蛋白表达量约占全菌总蛋
白的 40%。
F抗原纯化与鉴定
离心后所得包涵体蛋白经过初步纯化和溶
解后, 经过亲和层析柱 （ Ni2+-charged IDA
His-bind column） 纯化, 得到一分子量约为
43kD的单一蛋白带 （ Fig.A泳道 8） 。
表达产物的 Western-blot鉴定结果显示：该表
达蛋白可与豚鼠抗人 F 蛋白的抗血清发生特
异性结合反应, 在硝酸纤维素膜上呈现一条
分子量为 43kD的显色带 （ Fig.B）
SDS-PAGE and Western-blot of the expressed F Antigen
(A) 1.Protein molecular weight standard; 2.pET15b-F induced by IPTG;
3.inclusion body of the lysate; 4.supernatant of the lysate; 5.pET15b-F non-induced
by IPTG; 6.pET-15b induced by IPTG; 7.non-plasmid induced by IPTG; 8.purified
target protein
(B) Western-blot of the purified target protein,Guinea pig polyclonal antiserum
against human F antigen was used as primary antibody,
(A) 1 2 3 4 5 6 7 8 (B)
二、用真核细胞表达和生产基因工程药物
虽然用大肠杆菌细胞表达基因工程药具有许多优点, 如成本
低等, 但由于原核系统表达的真核基因蛋白有时缺乏生物活
性, 其原因由于原核生物缺乏合适的转译后修饰机制 。 因此
用真核细胞表达和生产基因工程药物已受到重视 。
□ 真核细胞反应器,
外源基因在合适的载体带动下转染进入体外培养的哺乳动物
细胞, 昆虫细胞或酵母细胞, 通过大规模培养细胞表达外源
基因 。
几种重要的基因工程药物已可用真核细胞反应器完成
治疗癌症抗病毒
预防病毒性肝炎
治疗血友病
治疗贫血症
治疗心脏病
促生长，增强免疫功能
酵母菌
酵母菌
哺乳动物细胞
哺乳动物细胞
哺乳动物细胞
昆虫细胞
α干扰素
乙肝疫苗
集落刺激因子
红细胞生成素
组织溶纤酶原激活剂
人生长激素
应 用 细 胞 名 称
昆虫细胞杆状病毒表达系统
(Insect cell and Baculovirus Expression System)
是一种高效的真核细胞表达系统
杆状病毒因其病毒粒子呈棒状或杆状而得名。
苜蓿尺蠖核型多角体病毒 (Autographa californica
multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)作
为杆状病毒 -昆虫细胞真核基因表达系统的载体被
广泛应用。
1,幼虫吞食了感染有多角体的食物,多角体在消化道的碱性环境下溶解，释放出病
毒颗粒,
2,每个病毒颗粒的脂蛋白外被又与肠壁细胞的质膜相融合，最终将核壳体释放至
胞质中，核壳体再将自己的 DNA转入细胞核内。
3,在感染后 12h采用出芽方式离开宿主细胞，在跨过宿主细胞的质膜时，以宿主的
质膜形成自己的外被，形成表型为 出芽型病毒粒子（ budded virus,BV）,
生活史
Polyhedrin
Protein
Virion
Envolope
Nucleocapsid
cross-section
Nucleocapsid
Longitudinal-section
Polyhedron envelope
DNA-蛋白复合体由 39KD衣壳蛋白外被所包围，形成一个核衣壳，若干个
核衣壳外面再包被一层脂蛋白外被就成为病毒颗粒。几个病毒颗粒聚集成
一簇，嵌在晶状基质中成为一个多角体包含体。
多角体包含
体的组成
?杆状病毒基因表达的级联式时序调控
杆状病毒的基因表达分为 4个时期：极早期
（ immediate-early,α）, 晚早期 (delayed-early,β)、
晚期 (late,γ)和极晚期 (very late,δ)。 通常, 每一后
续时期基因的表达水平都高于前一时期基因表达
的水平, 其中极晚期基因表达水平显著提高, 这
也是构建杆状病毒表达载体的基础 。 如 Fig所示 。
Fig Schematic representation of the four phases
of baculovirus gene expression in vitro
多角体蛋白
P10蛋白
由于 多角体蛋白基因及 P10蛋白基因具
有非常高效的启动子, 同时由于 这两个基
因的产物不参与感染病毒颗粒的形成, 可
以从病毒基因组中去除而不会对病毒的复
制及感染造成影响 。
由于这两个特点, 使人们得以设计利用
杆状病毒启动子在昆虫细胞中表达外源基
因,
杆状病毒表达载体构建
由于 AcMNPV基因组的巨大, 不可能用
单一的限制性酶来对它进行操作, 所以
目前使用的杆状病毒表达载体系统大多
采用构建转移载体 （ transfer vector）
的方法 。
将带有外源基因的转移载体 DNA和野
生型病毒 DNA共转染体外培养的昆虫细胞，
使得转移载体与野生型病毒发生同源重组，
外源基因取代多角体基因,如 Fig所示。
通过重组病毒空斑纯化得到能表达外源基
因的重组病毒。
Transfer vecter Pp Cloned gene Pt 5,3,
Polyhedrin gene AcMNPV DNA
Recombinant AcMNPV
Fig,共转染发生同源重组获得重组病毒
野生型病毒感染的昆虫细胞由于存在多
角体基因, 空斑测定时产生有多角体的空斑
（ occ+） 。 重组后由于多角体蛋白基因已被
外源基因所取代, 只能产生无多角体的空斑
（ occ-） 。 在光学显微镜下根据折光率的不
同可区分这两种不同表型的空斑 。 由此经过
几轮的空斑纯化即可获得多角体缺陷的重组
病毒 。 用重组病毒感染宿主细胞, 感染后期
得到外源基因的高效表达 。
与野生型病毒共转染培养的昆虫细胞
用磷酸钙沉淀法将重组转移载体质粒
pVL1393-hGH与野生型病毒 AcMNPV DNA共
转染贴壁培养状态良好的 Sf9细胞，由于
pVL1393多角体启动子两侧存在与多角体基因
同源序列，可与野生型病毒基因发生同源重
组，从而使人生长激素基因替代野生型病毒
中的多角体蛋白基因，得到重组病毒 rAcV-
hGH 。
重组病毒的 Southern 杂交鉴定, hGH cDNA整合
进杆状病毒基因组的正确位置中
表达产物的 SDS-PAGE与 Western-blot分析
三、植物基因工程
□ 定义,将外源目的基因导入体外培养的植物组织或细胞，
通过组织或细胞培养使之发育成完整的再生植株 ——转基因
植株。
1,冠瘿瘤 ——天然的植物基因工
程
自然界某些植物受到农杆菌的侵染会形成肿瘤 ——冠瘿
瘤。其形成的机理是由于 农杆菌 中含有的一种诱发肿瘤的质
粒所引起的，称为 Ti质粒（ tumor-inducing plasmid，简称 Ti
质粒）。 Ti质粒上的一段 DNA能转移到侵染的植物部位细胞
中，并插入到植物染色体中，由于该片段（称 T-DNA）上具
有诱发肿瘤的基因，所以能诱发植物产生肿瘤。
T-DNA
Tumor production Nopaline synthesis
T-DNA transfer
function
Nopaline
utilization
Origin of replication
Ti plasmid
Ti质粒（胭脂碱型）简图
冠瘿瘤 ——天然的植物基因工程
2,农杆菌 Ti质粒作为植物基因工程载体
科学家根据冠瘿瘤形成的分子机理，通过改建农杆菌 Ti质
粒，使 Ti质粒中的致瘤基因失活，同时插入目的基因，使之成
为基因工程载体。通过感染转化植物组织和细胞，并使之培养
成完整的植株。
Cointegrate Ti-plasmid
Tobacco plant cell
Trasformed cell
Cultured cell Plantlet Transgenic
tobacco plant
Cell of
transgenic plant
植物基因工程 程序图
3,抗除草剂基因工程 (Gene transfer of
glyphosate resistance)
草甘膦在低浓度时非常有效，对人无毒，
可被土壤中微生物分解。
草甘膦能被植物细胞的叶绿体的酶（
EPSP合成酶 ）所分解，该酶对细菌和植物中
的氨基酸的合成很重要，没有这种酶的作用
，植物就会干枯和死亡。
从抗草甘膦的细菌中分离和克隆 EPSP合
成酶的基因和抗除草剂基因工程
抗除草剂基因工
程示意图
首先从抗草甘膦的
细菌中分离和克隆
EPSP合成酶基因，
再进行植物抗除草
剂基因工程
Gene transfer of
glyphosate
resistance
Tobacco leaves
expressing the
hepatitis B
antigen,
转基因植物叶片
表达乙肝病毒表
面抗原。
叶片用抗乙肝病
毒表面抗原的抗
体处理的结果。
正常 叶片
4,具有易于长期保鲜的转基因西红柿的制作过
程原理如下,
通常的西红柿不易保存保鲜，这是由于一种蛋白酶的催化
成熟的结果。将这种酶的基因分离出来，再根据该基因序列结
构合成它的互补基因，再将这种互补基因转入到西红柿植株中
，它将会产生出一种与上述蛋白酶基因正常转录的 mRNA相互
补的 mRNA（ 称反义 RNA），并且与之结合成双链，使之不能
正常翻译成催化西红柿成熟的蛋白酶。未成熟的西红柿易于长
期保存保鲜和运输。只需用乙烯处理后即可成熟供应市场 。
转基因西红柿的途径
5,植物细胞的转化方法
（ 1） 叶圆片共培养转化
（ 2） 单细胞水平上的转化
在 Kan培养基上选择转化的组织 ——再生植株 。
5,转基因植株的遗传
以孟德尔比例传递 。
转基因植株的一对染色体
Kan
自交
1/4 Kans
1/2 Kanr
1/4Kanr
思考 题,
Kanr 能在转基因植株中以组成型的方式
表达, 如对转化植株的花药作培养所得花
粉植株抗性和敏感性比例如何？ 转化植株
自交或与野生型回交的结果如何？
四,转基因动物
1.定义,转基因动物是指以实验方法导入外源
基因,并在其基因组内稳定整合并能遗传给后代
的一类动物,
2.意义,
(1).建立转基因动物模型以研究外源基因在整
体动物中的表达调控规律 ;
(2).改变动物基因型使其表型更符合人类需要 ;
(3).可用转基因动物产生人类需要的生物活性
物质,
转基因生物反应器
□ 定义,将目的基因导
入动物体内形成转基因生
物，由于基因表达，可以
从转基因动物的特定组织
或器官（乳汁、血液等）
获得目的基因产物。使转
基因动物象一个活的发酵
罐一样来生产目的基因的
产物。
采用上述方法获得的转
基因羊，可从羊奶中提取
出治疗心脏病的药物 tPA（
组织溶解酶原激活剂）。
转基因的方法,
按基因导入方式划分,建立转基因动物主要有,
显微注射法,
反转录病毒感染法
胚胎干细胞法,
显微注射与反转录病毒感染方法都是把 DNA直接导入
受精卵或在不同的发育阶段,
受精卵 四细胞胚胎 囊胚 原肠胚 转基因动物
显微注射 反转录病毒感染
DNA DNA
在受精卵不同发育阶段的转基因方法
转基因动物的应用
研究遗传疾病的基因治疗
人类伦理道德一般不允许直接对人的受精卵进行基
因操作，一般是将处理过的体细胞移植到患者体内。但
这种操作具有一定的危险性，必须首先在动物体内进行
试验。所以,通过培育缺陷性状得到矫正的动物 (或细
胞 ) 可以为这类疾病的基因治疗提供动物 (或细胞 )模型。
基因剔除技术
研究人类基因功能的重要手段是
基因敲除。
由于人和老鼠的基因非常接近，因此当怀疑人类基因
图谱中的某一片段同某种疾病相关时，就将老鼠体内
的这个基因去除掉，看它会长成什么样。
如果没眼，那么被去除的基因就是决定长眼的基因。
基因敲除（ gene knock out）
是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水
平上将该基因去除，然后从整体观察实验动物，推
测相应基因的功能。 这与早期生理学研究中常用的
切除部分 -观察整体 -推测功能的三部曲思想相似 。
基因敲除还包括引入新基因及引入定点突变。既可
以是用突变基因敲除相应的正常基因，也可以用正
常基因敲除相应的突变基因。
基因敲除的应用领域主要有,
1、建立人类疾病的转基因动物模型
基因敲除小鼠是研究疾病的发生机理、分子基础及诊断
治疗的重要实验材料。
2、改造动物基因型,
研究基因敲除小鼠在胚胎发育及生命各期的表现，可以
得到该基因在生长发育中的作用，为研究基因的功能和生物
效应提供模式。
3、治疗遗传病
去除多余基因或修饰改造原有异常基因以达到治疗的目的,
五, 动物克隆技术
克隆的基本概念
克隆是英文 clone的译音，最早来自希
腊字 clonos，意指树枝条。动词 clonizos
是砍树枝。名词 clone意指无性繁殖（系
），作为动词意指产生无性繁殖系的过
程，所以 clone 可以称为无性繁殖或复制
现在的克隆技术可分为三个层次：基
因、细胞、个体。,
克隆技术的生物学基础
——细胞及细胞的全能性
根据细胞学说，细胞是一切生物体
的结构和功能单位，无论是进行有
性繁殖还是进行无性繁殖的生物，
都是有细胞构成的。 要突破生物有
性繁殖和无性繁殖的界限应该从它
们的共性出发，从操作细胞开始。
克隆技术所依赖的理论基础
19世纪 30年代提出细胞学说, 细胞是生
物有机体的结构和生命活动的单位, 又是
生物个体和系统发育的基础,
1902年 Haberlandt提出植物细胞全能性
的设想 。 根据细胞理论, 提出高等植物器
官和组织可以不断分割直至单个细胞的观
点 。
细胞全能性 （ Cell totipotency）,任何一个
处于细胞分化临界期之前的细胞, 只要处于
合适的条件即可以发育为完整的生物体, 也
可以发育成任何组织或器官等 。
例如植物体的每个细胞都具有在离体条
件下诱导分化形成完整植株的能力, 这是由
于每个细胞都具有完整基因组实现的 。
植物细胞全能性实验的重要事件,
1,Steward,1958,从胡罗卜根游离单细胞培养成
完整植株 。
2,Guha,1964,曼陀罗花药培养成单倍体植株 。
3.Takebe,1971,烟草原生质体培养成植株 。
动物细胞的全能性？
长期认为在动物发育的早期胚胎阶段，
每个胚胎细胞都具有全能性，但是随着胚
胎发育，胚胎细胞逐渐失去了这种全能性
而开始功能分化，有的发育成神经组织，
有的发育成肌肉组织。
关键的问题是：动物细胞的分化过程是不
可逆的吗？
1,动物克隆的早期设想,
1938年，德国胚胎学家 Hans Spemann提出了用成
年体细胞的核移植到未受精的卵细胞中，来实现动
物的无性繁殖，未成功
2,从低等动物开始，两栖类和鱼类
1952年 Robert Briggs和 Thomas J King用囊胚核移
植方法产生了蝌蚪，未生成青蛙。
1962年 Gurdon 用成年蛙体细胞克隆出青蛙,
1965年童第周完成了金鱼的核移植成功。
3.1984年 Steen Willadsen 成功利用胚胎细胞的
细胞核移植到未受精的卵细胞中产生了一头绵
羊，后来有小鼠，兔，山羊，牛，猪等克隆成
功。
4,以后长期用较晚期胚胎细胞和体细胞核移植
一直失败,
产生了一种观点：用高度分化的动物体细胞进
行克隆在生物学上是不可能的?
5,Wilmut,1997年, 用绵羊乳腺细胞核移植,
实现了在去核卵细胞中重新编程
（ Reprogramming）, 开创了高等动物体细胞
克隆新时期 。
动物克隆技术的发展经历从胚胎细胞的克
隆（包括胚胎切割）到体细胞克隆的过程
胚胎细胞克隆技术
产生的新个体并非是亲代的自我复制,
而是多生了几 个双胞胎，并未引起世人注意。
体细胞克隆可达到亲代个体的自我复制。
□ 核移植技术
将供体复制对象的细胞核转入到去掉细胞核的
卵细胞中 。 由于体细胞包含有全部的遗传信息
,可以从体细胞获得完整的动物个体 。
克隆羊, 多莉, 的诞生说明动物体细胞也具有
全能性, 因此它是真正意义上的动物克隆,
动物克隆的基本过程
以克隆羊为例，动物克隆的基本过程如下图
克隆动物的应用,
1,快速克隆出优良的种畜和遗传上一致的
实验动物；
2,动物资源的种质保存，包括地球上频危
动物的挽救等（异种核 移植） ；
3,生产移植器官；
4,与转基因技术相结合研制生物
反应器生产基因药物。
转基因体细胞克隆技术比转基因动物（
通过原核注射）的方法优越：后者整合率
和表达率低，经常出现嵌合体。
5.克隆人 。 是全世界注目的焦点, 有人设计了克隆人的技术路
线
动物克隆中急待解决的问题
1.成功率 低 (1-3%)
2.供体核和受体胞质细胞周期的同步
化是影响克隆胚胎发育的重要因素,
3.线粒体来源的问题,
发现有些克隆动物的线粒体 (mtDNA)为杂合体,既
有受体胞质的,也有供体细胞来的,
4.端粒酶的问题,
正常细胞没有端粒酶，所以端粒会随着细胞分裂而
变短，细胞衰老。那么 克隆动物是否会随着供体细
胞的缩短的端粒而提前衰老呢？
有发现 Dolly 羊的端粒限制性片段平均长度（ mean terminal
restriction fragment,TRF) 比同龄对照短。供体细胞培养时
间越长,TRF越短,
□ 动物克隆的危险性,
1,克隆动物已出现广泛的免疫缺陷或早期夭亡 。
2,克隆动物过程中也极有可能产生遗传性的变异
（ 无性系变异 ）, 这在植物的克隆中已广泛得到
研究和验证 （ 会发生染色体变异, 基因组 DNA扩
增和某些转位因子的激活 ） 。
第七节 遗传病 ——基因诊
断 和基因治疗
一、基因诊断
□ 感染性疾病的诊断,人类感染了外源的
病毒、细菌等引起的传染性疾病的诊断可以直接分析患者的
组织、器官或血液等来确定是否有外来病源性生物的基因。
如 HIV的 DNA序列已经搞清，可以根据该序列设计合成一段
引物，再从受检人的血液或组织中抽提极微量的 DNA为模板
进行 DNA的扩增，如获得与 HIV DNA序列相同的特定长度的
DNA片段，即可确定受检者携带 HIV病毒。
□ 人类遗传性
疾病的产前诊断
人类有 200多
种遗传病可用基
因诊断技术作出
准确的诊断，甚
至在发病前和出
生前作出诊断。
如胎儿的羊水和
胎盘绒毛细胞可
从母体内取得，
取出的细胞可以
进行染色体核型
、性别、生化和
基因组缺陷的检
测
1,检测限制性位点的变化
（ 1） 镰形细胞贫血症是编码血红蛋白 β链的一个决定谷氨酸的密
码子 GAG变成了编码缬氨酸的密码子 GTG,从而使血红蛋白质分
子结构和功能发生根本的改变, 该患者的红细胞由正常的园盘形
变成镰刀形 。
正常红细胞 镰形红细胞
（ 2） 检测原理,由于血红蛋白基因上单个核苷酸的替换 （ A→T）,
使该部位的正常序列由 CCTGAGG变成 CCTGTGG,从而使患者 DNA
中消失了一个可被特定内切酶 （ Mst II） 切割的切点 。 Mst II识别的序
列为 CC↑TNAGG。 下图为正常和异常蛋白, 基因和内切酶识别位点
变化图 。
β—珠蛋白基因
—————————————————— ///////// 内 含 子 ///////////////////////////
—————————————————— ↑ 0.2kb ↑ 1.1kb ↑
M M M
（在异常中消失）
— 脯 ——缬 ——谷 —
—CC T—GTG—GAG—
Mst II识别位点消失
异常 S
— 脯 ——谷 ——谷 —
—CC T—GAG—GAG—
Mst II识别位点
正常 A
氨基酸序列和基因序列 血红蛋白类型
( 3 ),Southern杂交检测镰形细胞贫血症
提取羊水或绒毛细胞 DNA,用限制性内切酶 Mst II对 DNA酶
解, 经电泳和 Southern吸引转膜后, 用放射性标记的 β-株蛋
白基因探针对膜上的 DNA作杂交, 根据经放射自显影后的
胶片上杂交斑点的多少和位置可作出诊断,
正常人的 β-珠蛋白基因 （ βAβA） 中有 3个 Mst II切点, 可将该
DNA上切成 2个片段, 它们为 0.2kb和 1.1kb长, 因此会在相
应位置产生二条杂交带；异常患者的 β珠蛋白基因 （ βSβS）
中, 只有 2个切点, 可将该 DNA切一条长 1.3kb的片段 。 突变
携带者 （ 杂合子 ）, 其 β-珠蛋白等位基因中, 一个是正常的
基因, 它有 3个切点, 切成 2个片段；另一个携带突变的基因
片段中只有 2个切点, 产生一个大的片段 。
( 4 ),Southern杂交检测结果
2, 异 常 序 列 检 测 ( allele-specific
oligonucleotides,ASO)
如果某一特定核苷酸发生异常, 可用在该基因相应区
段上正常的野生型序列的寡核苷酸作为探针, 经
Southern杂交确定,杂交时的温度是重要条件 。 因为
野生型和突变型只差一个核苷酸, 都可能与正常野生
型探针杂交 。 在较高温度时, 互补序列才能杂交, 只
有一个错配碱基的 DNA也不能杂交 。
Genotype determination using allele-specific oligonucleotides
(ASOs),
19-7
3,PCR检测法
用 Southern杂交法对镰形细胞贫血症作产前诊断需要足够的细胞
,并需提取纯化 DNA,并作酶切和杂交等步骤, 不但所需时间
较长, 而且有一定的风险 。
PCR法：根据 β-珠蛋白基因序列设计二条引物；取得极微量胎儿
绒毛细胞或患者血液，裂介细胞粗提 DNA，然后作 PCR扩增，无
论是正常或异常者都会产生 1.3kb长的 DNA片段。再对扩增样品
作酶切和电泳，其结果可直接从电泳图获得：该法简便，只需微
量细胞就可作出诊断。
正常 异常 携带者
1.3
电 1.1
泳
↓ 0.2
□ PCR原理
（ 1） 变性, 在 95℃ 高温下
模板双链 DNA解开成单链
DNA。
（ 2） 退火, 将反应系统降
至 55℃, 使引物能与模板
单链 DNA的特定部位配对
结合 。
（ 3） 链延伸：在 72℃, 以
单链为模板, 在引物的 3’末
端以互补原则合成新链 。
每一周期可使目的基因扩
增一倍, 经 30个周期可扩
增 230目的基因片段 。 PCR
技术是 DNA操作的重大发
明, Mullis等获得了 1993年
诺贝尔奖 。
4,基因芯片技术
（ DNA microarrays or DNA chips)
□ 概念,基因芯片技术是 DNA杂交探针
与半导体工业技术相结合的产物。将各种
探针固定于支持物上后与带有荧光标记的
DNA样品分子进行杂交，通过检测每个
探针分子的杂交信号，进而获取被测样品
中 DNA分子的数量和序列信息。该技术
可用于大规模筛查由基因突变引起的疾病
。
□ 检测原理和步骤,
(1)．制作芯片：根据疾病基因中的突变位点区域的
核苷酸序列合成 20个核苷酸长的探针，将其固定于芯
片上，芯片上可固定成千上万个探针。
（ 2）．从被测对象的细胞中提取 DNA，用酶切成较
小的片段，并对 DNA作荧光标记，并熔解成单链。
（ 3）, 将样品滴加到芯片上并与芯片上的探针杂交
,凡是与探针互补的酶切片段会固定于特定位置上,
不能互补的片段会被洗脱掉 。
（ 4）, 对芯片上的荧光作扫描和分析 。
Gene screening using a DNA
microarray,
遗传咨询的若干伦理问题
遗 传 病 的 定 义
遗传病是由于遗传物质
发生改变而造成的疾病，
它可在上下代之间按一
定的方式垂直传递，并
且在有血缘关系的个体
间由于遗传继承，有一
定的发病比例。
遗 传 疾 病 的 分 类
（一）染色体病
（二）单基因遗传病
（三）多基因遗传病
遗传病的发病率有增高趋势
? 1956年活婴中有先天性缺陷患儿的
比例约 4‰ ；
? 1968年活婴中有先天性缺陷患儿的
比例约 6‰ ；
? 1977年活婴中有先天性缺陷患儿的
比例约 10.8‰ ；
遗传病本身具有的严重性
? 遗传性 (hereditary),
患者家庭的上、下垂直发病或同代间的水平发病,
家系中往往有多个发病的个体；
? 先天性 (inborn),
在胎儿期即存在遗传损害，生后即出现缺陷，给
预防和治疗造成极大的困难；
? 终生性 (life long),
患者受累终生直至死亡
（ AR）
（ AR）
（ AR）
（ AD）
（ XR）
（线粒体病）
遗传服务中应遵循的伦理学
原则
遗传服务的四大伦理原则
? 尊 重 自 主
? 行 善
? 无 伤 害
? 公 正
产前诊断中涉及道德问题上
的 4项基本准则
? 尊重夫妇双方的选择
? 对个人和家庭不产生伤害
? 产前诊断的结果可靠
? 产前诊断和遗传咨询的自愿
性
二、基因治疗（ gene therapy）
人类的遗传性疾病治疗的常规方法,（ 1） 手术
治疗, 如先天性心脏病通过手术加以矫正,（ 2）
药物治疗, 如生长激素缺乏症 （ 侏儒 ） 可注射人
生长激素等 。
□ 基因治疗定义, 应用基因工程手段用正
常基因导入基因有缺陷的靶细胞中, 使正
常基因表达, 并合成相应的产物, 使细胞
恢复正常的功能, 使疾病得到治疗 。
□ 基因治疗的类别,根据基因转移到受体细胞
的不同, 可分为体细胞基因治疗和生殖细胞基
因治疗 。
（ 1）, 体细胞基因治疗,将正常的外源基
因导入到患者特定的体细胞中, 并使其正常表
达, 合成患者所缺的某种蛋白质或酶, 使患者
的症状得以改善 。
（ 2）, 生殖细胞基因治疗,将正常基因导
入患者的生殖细胞, 受精卵或早期胚胎细胞中
,使这类细胞中的某些异常基因的功能得以恢
复, 最终发育成正常个体 。
1,基因治疗方法和步骤
(1)．通常将正常的基因首先与基因转移的载体相连
接,常采用的载体有 反转录病毒载体和腺病毒载体 。
(2),将患者的体细胞 （ 称靶细胞 ） 作体外培养, 常用
的有 T淋巴细胞, 骨髓干细胞, 皮肤成纤维细胞, 肌细胞, 肝
细胞等
(3),外源基因的转移, 将外源基因通过载体导入到靶细
胞中, 常用转染的方法 （ 加入磷酸钙 ） 导入到细胞中, 并与
细胞中核 DNA整合到一起, 也可用重组病毒感染靶细胞转移
外源基因 。
(4),对能正常表达目的基因的靶细胞作检定后回输
到患者体内 。
重症联合免疫缺陷 （ Severe combined
immunodeficiency disease,简称 SCID）, 患者
缺乏正常人体免疫功能, 其染色体上编码 腺苷
脱氨酶 （ 简称 ADA） 的基因发生突变所致 。 由
于 ADA是嘌呤代谢中的一种酶, 该基因缺陷将
导致患者身体细胞中脱氧腺苷的累积, 达到高
浓度时脱氧腺苷将对免疫系统细胞 （ 如 T-细胞
和 B-细胞 ） 产生毒性 。
2.基因治疗实例
1990年, 美国第一次对 SCID病人作基因治疗,
其步骤为,
（ 1）, 将正常 ADA基因与反转录病毒载体相连, 构建重组病
毒表达载体 。
（ 2）, 从患体体内分离有免疫缺陷的 T淋巴细胞 。
（ 3）, 用重组病毒感染体外培养的 T淋巴细胞, 使正常 ADA基
因插入到 T淋巴细胞基因组中 。
（ 4）, 培养细胞并确认该基因正常表达 。
（ 5）, 将含有正常基因的 T淋巴细胞回输到患者的骨髓组织中
。 经 5-6个月的基因治疗, 患者体内 T淋巴细胞的数量恢复到正
常水平, 体内 ADA酶几乎达到正常水平, 免疫功能得到恢复 。
Gene therapy for treatment of severe combined
immunodeficiency (SCID),a fatal disorder of the immune
system caused by absence of the enzyme adenosine deaminase
(ADA)
Ashanti DiSilva,
the first person to
be treated by gene
therapy,
第八节
基因工程生物技术和社会伦理问题
由于生物技术与人类社会的
密切联系，所以引起的争论
也十分强烈。
“巨大的力量意味着重大的责任”
——美国总统生命伦理咨询委员会
伯格会议和 HGP的启示
P.Berg
美国斯坦福大学教授
1975 伯
格会议
是否可暂停基因重组
实验，先着手制定共
同遵循的规范
伯格会议和 HGP的启示
人类基因组计划
（ HGP）
相关伦理、法律和社会影响的研究
（ ELSI）
生命科学史乃至全部科学技术史上的第一次
600万犹太亡灵的呼唤
信奉优生学的科学家把, 人类遗传学
和种族卫生概念, 等狂热鼓吹人类不
平等的优生学著作送给希特勒，成为
他推行种族屠杀政策的重要“科学”依据
日本 731部队的细菌武器试验
731部队遗址
从 1933年至 1945年,731部
队等一直在进行人体细菌武
器试验。据不完全统计，因
此而死亡的不下 3000人。
美国的梅毒试验
1932年，美国在 Tuskegee镇对
感染梅毒的 25~60岁的男性黑人
进行“梅毒自然史“的研究
时间长达 40年之久
如此不文明的行为
为什么会发生在一个
最文明的时代
最文明的国家
最文明的群体？
科学与人文的携手
? 什么是生命伦理学
BIO-ETHICS
在跨学科、跨文化的背景下，对
生命科学和医学的伦理学，包括道
德见解，判断，行为，政策等进行
系统的研究
生命伦理学关注的若干热点
和难点
辅助生殖
克隆技术 人类基因组研究
转基因食品
胚胎干细胞
辅助生育的伦理道德的问题
生殖技术的开展概况
(一 )人工体内受精（ artificial insemination ）
1.用丈夫精液的人工受精
(artificial insemination by husband,AIH)
2.用捐赠者精液的人工授精
(artificial insemination by donor AID)
3.借腹生子
(surrogate mother代理母亲 )
(二 )人工体外受精（ in vitro fertilization）
生殖技术的伦理和法律问题
1.谁该是孩子的父母?
异源性人工体内、体外受精的孩子可有多
个父母，包括遗传父母，养育父母，完全父母，
孕育母亲。在多个父母共存的情况下，谁应该
成为孩子的真正父母呢？是按照遗传关系将孩
子的父母确定为遗传父母，还是遵循抚养教育
的原则将养育父母确认为真正的父母？
2.代理母亲合乎道德吗?
代理母亲分娩后都要将孩子给不孕
症一方抚养。国外在 20世纪 70年代末开始
有代理母亲，现在美国有代理母亲中心，
我国也有极个别妇女原意接受代理母亲者，
并少数实施，但不可避免的是存在有关代
理母亲的法律案件。
3.精液，卵子和胚胎是否可以商品化?
1,精液商品化可能使精子库为追求盈利而忽视精子的质量；
2.供精者可能为金钱隐瞒自己的遗传缺陷或传染病；
3.供精者多次供精，从而造成同一供精者的精液为多数妇女使用；
4.精液的商品化也会产生连锁反应，促使其他人体组织或器官的商
品化如卵子和胚胎的商品化。
4.非婚妇女能否进行人工授精?
未婚，同性恋，离婚的女子及寡
妇是否可依其请求而实施供体人工授精。
对此各国的伦理和法律不太一致，在我
国由于计划生育政策和传统观念的影响，
该项做法是不大可能进行的。
胚胎干细胞
两大争论焦点
1.如何看待胚胎
2.是否必然滑向生殖性克隆
?当今最激烈而敏感的伦理之争
?一场“文化战争”
2001年 8月，罗马天主教皇
保罗二世对美国总统布什说,
不要资助那些研究胚胎干细
胞的人，他们
毁灭生命、败坏道德。
?在科学与人文之间寻求平衡
英国沃诺克委员会（ Warnock
Committee）
14天前的胚胎（前胚胎），还是 既无感觉又无知
觉的细胞团,还不构成道德主体，可以作为研究对
象，用来治病救人、造福人类。但必须遵循严格的
伦理规范。
□ 基因隐私权
1,在升学, 求职, 婚姻, 保险等领域的影响 。
2,缩命论思想 。
□ 生物技术用于研制生化武器, 给
人类带来灾难 。
生命伦理学进入大学课堂
? 随着生命科学和医学的发展，生命伦理问
题必定会越来越突出、越来越重要。这是
不可抗拒的文化潮流，也是社会文明进步
的重要表现。
新世纪的教育必须适应这一趋势。
?学习生命科学和医学的大学生、研究生，
是否具有生命伦理的理念和知识，至为
关键，是他们专业知识的重要组成部分。
?非生物专业的学生，学习生命伦理学，
对于培育他们 以人为本 的理念和情怀，
尊重生命、关爱生命,也大有助益。
