微生物学教案
2003-2004学年第二学期
生物工程专业2001级1、2、3、4班用
计划学时：46学时(理论28 实验18)
教材：微生物学（沈萍主编）
参考书：微生物学 （第二版 ）（武汉大学等主编）
微生物学教程（第二版 ）周德庆主编
微生物世界
授课方式：多媒体课件
（该教案与多媒体课件配套使用）
任课教师：卫军
2004.2
第一章 绪 论
计划学时：2
重点：微生物和人类的关系，微生物的特点，微生物类群及微生物学的奠基人及其对微生物学的贡献。
一、微生物和你
微生物与人类关系的重要性，你怎么强调都不过分，微生物是一把十分锋利的双刃剑，它们在给人类带来巨大利益的同时也带来"残忍"的破坏。它给人类带来的利益不仅是享受，而且实际上涉及到人类的生存。在这本书中你们将读到微生物在许多重要产品中所起的不可替代的作用，例如：面包、奶酪、啤酒、抗生素、疫苗、维生素、酶等重要产品的生产(见第十五章)，同时也是人类生存环境中必不可少的成员，有了它们才使得地球上的物质进行循环(见第十一章)，否则地球上的所有生命将无法繁衍下去。此外，你在第十章还将会看到以基因工程为代表的现代生物技术的发展及其美妙的前景也是微生物对人类作出的又一重大贡献。
然而，这把双刃剑的另一面--微生物的"残忍"性给人类带来的灾难有时甚至是毁灭性的。1347年的一场由鼠疫杆菌(Yersinia pestis)引起的瘟疫几乎摧毁了整个欧洲，有1/3 的人(约2500万人)死于这场灾难，在此后的80年间，这种疾病一再肆虐，实际上消灭了大约75%的欧洲人口，一些历史学家认为这场灾难甚至改变了欧洲文化。我国在解放前也曾多次流行鼠疫，死亡率极高。今天，一种新的瘟疫--艾滋病(AIDS)也正在全球蔓延；癌症也正威胁着着人类的健康和生命；许多已被征服的传染病(如肺结核、虐疾、霍乱等)也有"卷土重来 "之势。据1999年8月世界卫生组织的统计，目前全世界有18.6亿人(相当于全球人口的32 %)患结核病。随着环境的污染日趋严重，一些以前从未见过的新的疾病(如军团病、埃博拉病毒病、霍乱0139新菌型、0157以及疯牛病等)又给人类带来了新的威胁。因此，你--未来的微生物学家或其他科学家任重道远。正确地使用微生物这把双刃剑，造福于人类是我们学习和应用微生物学的目的，也是每一个微生物学工作者义不容辞的责任。
二、微生物科学
? 1.研究对象及分类地位
微生物研究作为一门科学--微生物学，比动物学、植物学要晚得多，至今不过100多年的历史。因为微生物太小，需借助显微镜才能看清他们，因此微生物学(Microbiology)一般定义为研究肉眼难以看清的称之为微生物的生命活动的科学。这些微小生物包括：无细胞结构不能独立生活的病毒、亚病毒(类病毒、拟病毒、肮病毒)；具原核细胞结构的真细菌、古生菌以及具真核细胞结构的真菌(酵母、霉菌、蕈菌等)、单细胞藻类、原生动物等。但其中也有少数成员是肉眼可见的，例如近年来发现有的细菌是肉眼可见的：1993年正式确定为细菌的Epulopiscium fishelsoni以及1998年报道的Thiomargarita namibiensis(见第二章)，均为肉眼可见的细菌。所以上述微生物学的定义是指一般的概念，是历史的沿革，也仍为今天所适用。
由于微生物的极其多样性以及独特的生物学特性(个体小、繁殖快、分布广等)使其在整个生命科学中占据着举足轻重的地位。无论是1969年Whittaker提出的五界系统，还是1977年Woese提出的三域(domain)系统(见第12章)，微生物都占据了绝大多数的"席位"，分别为3/5 和2/3强。这是微生物在整个生物界的分类地位。在本章的后部分我们还将讨论微生物及微生物学对整个生命科学作出的巨大贡献及其生物学地位。
? 2.研究内容及分科
那么微生物学具体的研究内容是什么呢? 总的来说，微生物学是研究微生物在一定条件下的形态结构、生理生化、遗传变异以及微生物的进化、分类、生态等生命活动规律及其应用的一门学科。随着微生物学的不断发展，已形成了基础微生物学和应用微生物学，又可分为许多不同的分支学科，并还在不断地形成新的学科和研究领域。其主要的分科见图1-1。
三、微生物的发现和微生物学的发展
? 1.微生物的发现
在人们真正看到微生物之前，实际上已经猜想或感觉到它们的存在，甚至人们已经在不知不觉中应用它们。我国劳动人民已很早就认识到微生物的存在和作用，也是最早应用微生物的少数国家之一。据考古学推测，我国在8000年以前已经出现了曲蘖酿酒了，4000多年前我国酿酒已十分普遍，而且当时的埃及人也已学会烘制面包和酿制果酒，2500年前我国人民已发明酿酱、醋，知道用曲治消化道疾病。公元六世纪(北魏时期)，我国贾思勰的巨著"齐民要术"详细地记载了制曲、酿酒、制酱和酿醋等工艺。公元九世纪到十世纪我国已发明用鼻苗法种痘，用细菌浸出法开采铜。到了16世纪，古罗巴医生G.Fracastoro才明确提出疾病是由肉眼看不见的生物(living creatures)引起的。我国明末(1641年)医生吴又可也提出"戾气 "学说，认为传染病的病因是一种看不见的"戾气"，其传播途径以口、鼻为主。
但是真正看见并描述微生物的第一个人是荷兰商人安东·列文虎克(Antony Van Leeuwenhoe k, 1632～1723)(图1-2)，但他的最大贡献不是在商界而是他利用自制的显微镜发现了微生物世界(当时被称之为微小动物)，他的显微镜放大倍数为50～300倍，构造很简单，仅有一个透镜安装在两片金属薄片的中间，在透镜前面有一根金属短棒，在棒的尖端搁上需要观察的样品，通过调焦螺旋调节焦距。利用这种显微镜，列文虎克清楚地看见了细菌和原生动物 。首次揭示了一个崭新的生物世界--微生物界。由于他的划时代贡献，1680年被选为英国 皇家学会会员。
? 2.微生物学发展过程中的重大事件
由列文虎克揭示的多姿多彩的微生物世界吸引着各国学者去研究、探索，推动着微生物学的 建立和发展，表1-1列出了发展过程中的重大事件。
? 从表1-1列出的重大事件中，其发现或发明人就有30位获得诺贝尔奖，据有关统计表明，20世纪诺贝尔奖(生理和医学)获得者中，从事微生物问题研究的就占了1/3，这从另一个侧面看到了微生物学举足轻重的地位。也可见微生物学的发展对整个科学技术和社会经济的重大作用和贡献。
? 3.微生物学发展的奠基者
继列文虎克发现微生物世界以后的200年间，微生物学的研究基本上停留在形态描述和分门别类的阶段。直到19世纪中期，以法国的巴斯德(Louis Pasteur, 1822～1895)和德国的柯赫(Robert Koch, 1843～1910)为代表的科学家才将微生物的研究从形态描述推进到生理学研究阶段，揭露了微生物是造成腐败发酵和人畜疾病的原因，并建立了分离、培养、接种和灭菌等一系列独特的微生物技术，从而奠定了微生物学的基础，同时开辟了医学和工业微生物等分支学科。巴期德和柯赫是微生物学的奠基人。
1)巴斯德
巴斯德(图1-3)原是化学家，曾在化学上作出过重要的贡献，后来转向微生物学研究领域，为微生物学的建立和发展作出了卓越的贡献。主要集中在下列三方面。
? (1)彻底否定了"自然发生"学说
"自生说"是一个古老的学说，认为一切生物是自然发生的。到了17世纪，虽然由于研究植物和动物的生长发育和生活循环，使"自生说"逐渐软弱，但是由于技术问题，如何证实微生物不是自然发生的仍然是一个难题，这不仅是"自生说"的一个顽固阵地，同时也是人们正确认识微生物生命活动的一大屏障。巴斯德在前人工作的基础上，进行了许多试验，其中著名的曲颈瓶试验无可辩驳地证实，空气内确实含有微生物，它们引起有机质的腐败。巴斯德自制了一个具有细长而弯曲的颈的玻瓶，其中盛有有机物水浸液(图1-4)，经加热灭菌后，瓶内可一直保持无菌状态，有机物不发生腐败，因为弯曲的瓶颈阻挡了外面空气中微生物直达有机物浸液内，一旦将瓶颈打断，瓶内浸液中才有了微生物，有机质发生腐败。巴斯德的实验彻底否定了"自生说"，并从此建立了病原学说，推动了微生物学的发展。
(2)免疫学--预防接种
Jenner虽然早在1798年发明了种痘法可预防天花，但却不了解这个免疫过程的基本机制，因此，这个发现没能获得继续发展。1877年，巴斯德研究了鸡霍乱，发现将病原菌减毒可诱发免疫性，以预防鸡霍乱病。其后他又研究了牛、羊炭疽病和狂犬病，并首次制成狂犬疫苗，证实其免疫学说，为人类防病、治病作出了重大贡献。
(3)证实发酵是由微生物引起的
酒精发酵是一个由微生物引起的生物过程还是一个纯粹的化学反应过程，曾是化学家和微生物学家激烈争论的问题。巴斯德在否定"自生说"的基础上，认为一切发酵作用都可能和微生物的生长繁殖有关。经不断地努力，巴斯德终于分离到了许多引起发酵的微生物，并证实酒精发酵是由酵母菌引起的。此外，巴斯德还发现乳酸发酵、醋酸发酵和丁酸发酵都是不同细菌所引起的。为进一步研究微生物的生理生化奠定了基础。
(4)其他贡献
一直沿用至今天的巴斯德消毒法(60～65℃）作短时间加热处理，杀死有害微生物的一种消毒法)和家蚕软化病问题的解决也是巴斯德的重要贡献，他不仅在实践上解决了当时法国酒变质和家蚕软化病的实际问题，而且也推动了微生物病原学说发展，并深刻影响医学的发展。
? 2).柯赫
柯赫(图1-5)是著名的细菌学家，由于他曾经是一名医生，因此对病原细菌的研究作出了突出的贡
(1)具体证实了炭疽病菌是炭疽病的病原菌。
(2)发现了肺结核病的病原菌，这是当时死亡率极高的传染性疾病，因此柯赫获得了诺贝尔奖。
(3)提出了证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则--柯赫原则。由于柯赫在病原菌研究方面的开创性工作，自19世纪70年代至20世纪20年代成了发现病原菌的黄金时代，所发现的各种病原微生物不下百余种，其中还包括植物病原细菌。
柯赫除了在病原菌研究方面的伟大成就外，在微生物基本操作技术方面的贡献更是为微生物学的发展奠定了技术基础，这些技术包括：
(1)用固体培养基分离纯化微生物的技术，这是进行微生物学研究的基本前体，这项技术一直沿用至今。
(2)配制培养基(见第四章)。也是当今微生物学研究的基本技术之一。这二项技术不仅是具有微生物学研究特色的重要技术，而且也为当今动植物细胞的培养作出了十分重要的贡献。
巴斯德和柯赫的杰出工作，使微生物学作为一门独立的学科开始形成，并出现以他们为代表而建立的各分枝学科，例如细菌学(巴斯德、柯赫等)、消毒外科技术(J.Lister)，免疫学(巴斯德、Metchnikoff, Behring, Ehrlich等)、土壤微生物学(Beijernck Winogradsky等)、病毒学(IVanowsky、Beijerinck等)、植物病理学和真菌学(Bary, Berkeley等)、酿造学 (Hensen, Jorgensen等)以及化学治疗法(Ehrlish等)等。微生物学的研究内容日趋丰富，使微生物学发展更加迅速。
四、20世纪的微生物学
19世纪中期到20世纪初，微生物研究作为一门独立的学科已经形成，并进行着自身的发展。 但在20世纪早期还未与生物学的主流相汇合。当时大多数生物学家的研究兴趣是有关高等动植物细胞的结构和功能、生态学、繁殖和发育、遗传以及进化等；而微生物学家更关心的是感染 疾病的因子、免疫、寻找新的化学治疗药物以及微生物代谢等。到了20世纪40年代，随着生物学的发展，许多生物学难以解决的理论和技术问题十分突出，特别是遗传学上的争论问题，使得微生物这样一种简单而又具完整生命活动的小生物成了生物学研究的"明星"，微生物学很快与生物学主流汇合，并被推到了整个生命科学发展的前沿，获得了迅速的发展，在生命科学的发展中作出了巨大的贡献。
1.多学科交叉促进微生物学全面发展
微生物学走出了独自发展，以应用为主的狭窄研究范围，与生物学发展的主流汇合、交叉， 获得全面、深入的发展。而首先与之汇合的是遗传学、生物化学。1941年Beadle和Tatum用粗糙脉胞菌(Neurospora crasa)分离出一系列生化突变株，将遗传学和生物化学紧密结合起来，不仅促进微生物学本身向纵深发展，形成了新的基础研究学科--微生物遗 传学和微生物生理学，而且也推动了分子遗传学的形成。与此同时，微生物的其他分支学科也得到迅速发展 ，如细菌学、真菌学、病毒学、微生物分类学、工业微生物学、土壤微生物学、植物病理学、医学微生物学及免疫学等。还有60年代发展起来的微生物生态学、环境微生物学等。这些都是原来独立的学科相互交叉、渗透而形成的。微生物的一系列生命活动规律，包括遗传变异、细胞结构和功能，微生物的酶及生理生化等的研究逐渐发展起来，到了20世纪50年代微生物学全面进入分子研究水平，并进一步与迅速发展起来的分子生物学理论和技术以及其他学科汇合，使微生物学发展成为生命科学领域内一门发展最快，影响最大、体现生命科学发展主流的前沿科学。
微生物学应用性广泛，进入20世纪，特别是40年代后，微生物的应用也获得重大进展。抗生素的生产已成为现代化的大企业；微生物酶制剂已广泛用于农、工、医各方面 ；微生物的其它产物，如有机酸、氨基酸、维生素、核苷酸等，都利用微生物进行大量生产。微生物的利用已组成一项新兴的发酵工业，并逐步朝着人为有效控制的方面发展。80年代初，在基因工程的带动下，传统的微生物发酵工业已从多方面发生了质的变化，成为现代生物技术的重要组成部分。
2.微生物学推动生命科学的发展
(1)促进许多重大理论问题的突破
生命科学由整体或细胞研究水平进入分子水平，取决于许多重大理论问题的突破，其中微生物学起了重要甚至关键的作用，特别是对分子遗传学和分子生物学的影响最大。我们知道"突变"是遗传学研究的重要手段，但是只有在1941年Beadle和Tatum用粗糙脉胞霉进行的突变实验，才使基因和酶的关系得以阐明，提出了"一个基因一个酶"的假说。有关突变的性质和来源(自发突变)也是由于S.Luria和M .Delbruck(1943)利用细菌进行的突变所证实。长期争论而不能得到解决的"遗传物 质的基础是什么?"的重大理论问题，只有在以微生物为材料进行研究所获得的结果才无可辩驳地证实：核酸是遗传信息的携带者，是遗传物质的基础(见第八章)。这一重大突破也为 1953年WotsonCrick DNA双螺旋结构的提出起了战略性的决定作用，从而奠定了分子遗传 学的基础。此外，基因的概念--遗传学发展的核心，也与微生物学的研究息息相关，例如，著名的"断裂基因"的发现来源于对病毒的研究(第七章)；所谓"跳跃基因"(可转座因子)的发现虽然首先来源于McClintock对玉米的研究，但最终得到证实和公认是由于对大肠杆菌的研究。基因结构的精细分析、重叠基因的发现，最先完成的基因组测序等都与微生物学发展密不可分。
以研究生命物质的物理、化学结构及其功能为己任的分子生物学，如果没有遗传密码的阐明，不知道基因表达调控的机制，那将是"无源之水，无本之本"。正是微生物学的研究和发展为之奠定了基础。60年代Nirenberg等人通过研究大肠杆菌无细胞蛋白质合成体系及多聚尿苷酶，发现了苯丙氨酸的遗传密码，继而完成了全部密码的破译，为人类从分子水平上研究生命现象开辟了新的途径。Jacob等人通过研究大肠杆菌诱导酶的形成机制而提出的操纵子学说，阐明了基因表达调控的机制，为分子生物学的形成奠定了基础。此外，DNA、RNA、蛋白质的合成机制以及遗传信息传递的"中心法则"的提出等都涉及到微生物学家所作出的卓越贡献。
(2)对生命科学研究技术的贡献
微生物学的建立虽然比高等动、植物学晚，但发展却十分迅速。动、植物由于结构的复杂性及技术方法的限制而相对发展缓慢，特别是人类遗传学的限制更大。20世纪中后期由于微生物学的消毒灭菌，分离培养等技术的渗透和应用的拓宽及发展，动、植物细胞也可以像微生物一样在平板或三角瓶中培养，可以在显微镜下进行分离，甚至可以像微生物的工业发酵一样，在发酵罐中进行生产。今天的转基因动物、转基团植物的转化技术也源于微生物转化的理论和技术。
70年代，由于微生物学的许多重大发现，包括质粒载体，限制性内切酶，连接酶，反转录酶等，才导致了DNA重组技术和遗传工程的出现(见第十章)，使整个生命科学翻开了新的一页，使人类定向改变生物、根治疾病、美化环境的的梦想将成为现实。
(3)微生物与"人类基因组计划"
"人类基因组计划"的全称为"人类基因组作图和测序计划"。这是一项当今世界耗资巨大(30亿美元)，其深远意义堪与阿波罗登月计划媲美的最大的科学工程。要完成如此浩大的工程，除了需要多学科(数、理、化、信息、计算机等)的交叉外，模式生物的先行至关重要，因为模式生物一般背景清楚，基因组小，便于测定和分析，可从中获取经验改进技术方法。而这些模式生物除极少数(例如果蝇、线虫、拟南芥等)为非微生物外，绝大部分为细菌和酵母，目前已完成了近20多种独立生活的微生物基因组的序列测定，在此过程中由于基因组作图和测序方法的不断改进，大大加快了基因组计划进展，预计"人类基因组计划"有可能提前2-3年完成(2003年左右)。
测序工作只是"计划"的一部分，紧接着是更巨大的工程--后基因组研究，其主要任务是认识基因与基因组的功能。目前微生物基因组序列分析表明，在某些微生物中存在一些与人类某些遗传疾病相类似的基因，因此可以利用这些细菌的模型来研究这些基因的功能，为认识庞大的人类基因组及其功能提供简便的模式。
总之，20世纪的微生物学一方面在与其它学科的交叉和相互促进中，获得令人瞩目的发展。 另一方面也为整个生命科学的发展作出了巨大的贡献，并在生命科学的发展中占有重要的地位。
(4)我国微生物学的发展
我国是具有五千年文明史的古国，我国劳动人民对微生物的认识和利用是最早的几个国家之一。特别是在制酒、酱油、醋等微生物产品以及用种痘、麦曲等进行防病治疗等方面具有卓越的贡献。但微生物作为一门科学进行研究，我国起步较晚。中国学者开始从事微生物学研究在 20世纪之初，那时一批到西方留学的中国科学家开始较系统地介绍微生物学知识，从事微生物学研究。1910～1921年间伍连德用近代微生物学知识对鼠疫和霍乱病原的探索和防治，在中国最早建立起卫生防疫机构，培养了第一支预防鼠疫的专业队伍，在当时这项工作居于国际先进地位。20～30年代，我国学者开始对医学微生物学有了较多的实验研究，其中汤飞凡等在医学细菌学、病毒学和免疫学等方面的某些领域做出过较高水平的成绩，例如沙眼病原体的分离和确证是具有国际领先水平的开创性工作。30年代开始在高等学校设立酿造科目和农产制造系，以酿 造为主要课程，创建了一批与应用微生物学有关的研究机构，魏岩寿等在工业微生物方面做出了开拓性工作，戴芳澜和俞大绂等是我国真菌学和植物病理学的奠基人；张宪武和陈华癸等对根瘤菌固氮作用的研究开创了我国农业微生物学；高尚荫创建了我国病毒学的基础理论研究和第一个微生物学专业。但总的说来，在新中国成立之前，我国微生物学的力量较弱且分散，未形成我国自己的队伍和研究体系，也没有我国自己的现代微生物工业。
新中国成立以后，微生物学在我国有了划时代的发展，一批主要进行微生物学研究的单位建立起来了，一些重点大学创设了微生物学专业。现代化的发酵工业、抗生素工业、生物农药和菌肥工作已经形成一定规模，特别是改革开放以来，我国微生物学无论在应用和基础理论研究方面都取得了重要的成果，例如我国抗生素的总产量已耀居世界首位，我国的两步法生产维生素C的技术居世界先进水平。培养了一大批微生物学人才。近年来，我国学者瞄准世界微生物学科发展前沿，进行微生物基因组学的研究，现已完成痘苗病毒天坛株的全基因组测序，最近又对我国的辛德毕斯毒株(变异株)进行了全基因组测序。1999年又启动了从我国云南省腾冲地区热海沸泉中分离得到的泉生热袍菌全基因组测序，目前取得可喜进展。我国微生物进入了一个全面发展的新时期。但从总体来说，我国的微生物学发展水平除个别领域 或研究课题达到国际先进水平，为国外同行承认外，绝大多数领域与国外先进水平相比，尚有相当大的差距。因此如何发挥我国传统应用微生物技术的优势，紧跟国际发展前沿，赶超世界先进水平，还需作出艰苦的努力。
五、21世纪微生物学展望
1.微生物基因组学研究将全面展开
所谓"基因组学"是1986年由Thomas Roderick首创，至今已发展为一专门的学科领域，包括全基因组的序列分析、功能分析和比较分析，是结构、功能和进化基因组学交织的学科。
如果说20世纪刚刚兴起的微生物基因组研究是给"长跑"中的"人类基因组计划"助一臂之力的话，那么21世纪微生物基因组学将在继续作为人类基因组计划"的主要模式生物，在后基因组研究(认识基因与基因组功能)中发挥不可取代的作用外，会进一步扩大到其他微生物，特别是与工农业及与环境、资源有关的重要微生物。目前已经完成基因组测序的微生物主要是模式微生物、特殊微生物及医用微生物。而随着基因组作图测序方法的不断进步与完善，基因组研究将成为一种常规的研究方法，为从本质上认识微生物自身以及利用和改造微生物将产生质的飞跃。并将带动分子微生物学等基础研究学科的发展。
2.以了解微生物之间、微生物与其他生物、微生物与环境的相互作用为研究内容的微生物生态学、环境微生物、细胞微生物学等，将在基因组信息的基础上获得长足发展，为人类的生存和健康发挥积极的作用。
3.微生物生命现象的特性和共性将更加受到重视。
微生物生命现象的特性和共性可概括为：
(1)微生物具有其它生物不具备的生物学特性，例如可在其他生物无法生存的极端环境下生存和繁殖，具有其他生物不具备的代谢途径和功能 ，如化能营养、厌氧生活、生物固氮和不释放氧的光合作用等，反映了微生物极其丰富的多样性。
(2)微生物具有其他生物共有的基本生物学特性：生长、繁殖、代谢、共用一套遗传密码等，甚至其基因组上含有与高等生物同源的基因，充分反映了生物高度的统一性。
(3) 易操作性：微生物个体小、结构简单、生长周期短，易大量培养，易变异，重复性强等优势，十分易于操作。
微生物具备生命现象的特性和共性，将是21世纪进一步解决生物学重大理论问题，如生命起源与进化，物质运动的基本规律等，和实际应用问题，如新的微生物资源的开发利用，能源、粮食等的最理想的材料。
4.与其他学科实现更广泛的交叉，获得新的发展。
5.微生物产业将呈现全新的局面
小结
1.微生物是由荷兰商人列文虎克首先发现的，至今有300多年的历史。微生物的主要特征是：个体小、结构简单、繁殖快、易培养、易变异、分布广。它一方面具有其它生物不具备的生物学特性，另一方面它也具有其它生物共有的基本生命特征。
2.微生物学是研究微生物在一定条件下的形态结构、生理生化、遗传变异以及微生物的进化、分类、生态等生命活动规律及其应用的一门学科。诞生于19世纪中期，其奠基人是法国的巴斯德和德国的柯赫。20世纪获得全面发展，形成了许多分支学科。特别是40年代以后微生物学促进了整个生命科学的发展，跃居中心地位。
3.我国是最早知道利用微生物的少数国家之一。但作为一门学科发展起始于20世纪初，曾在某些病原菌的研究和防治以及微生物在工、农业上的应用和研究等方面，作出具国际先进水平的工作。近年来，在微生物基因组的研究工作方面与国际发展前沿接轨，在微生物应用方面已取得可喜成绩。
4.21世纪的微生物学将更加绚丽多彩。多学科的交叉、基因组研究的深入和扩展将使微生物学的基础研究及其应用出现前所未有的局面。
思 考 题
1.用具体事例说明人类与微生物的关系。
2.简述微生物学在生命科学发展中的地位，并描绘其前景。
4.为什么说巴斯德和柯赫是微生物学的奠基人?
第二章微生物的纯培养和显微技术
计划学时：2
重点：微生物的分离和纯培养技术，常用的菌种保藏方法。细菌、放线菌、霉菌、酵母菌等的形态特征。
大多数动物植物的研究、利用都能以个体为单位进行，而微生物由于个体微小，在绝大多数情况下都是利用群体来研究其属性，微生物的物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存。在微生物学中，在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物（culture），而只有一种微生物的培养物称为纯培养物（pure culture）。由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利用和重复结果，因此把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进行微生物学研究的基础。相应的，微生物个体微小的特点也决定了显微技术是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。显微技术包括显微标本的制作、观察、测定、分析及记录等方面的内容。实际上，正是由于显微技术及微生物纯培养技术的建立才使我们得以认识丰富多彩的微生物世界，并真正使对微生物的研究发展成为一门科学。
第一节 微生物的分离和纯培养
一、无菌技术
微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。因此，在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术（aseptic technique），它是保证微生物学研究正常进行的关键。
1. 微生物培养的常用器具及其灭菌
试管、玻璃烧瓶、平皿（culture dish，Petri dish）等是最为常用的培养微生物的器具，在使用前必须先行灭菌，使容器中不含任何生物。培养微生物的营养物质（称为培养基（culture medium））可以加到器皿中后一起灭菌，也可在单独灭菌后加到无菌的器具中。最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。
2. 接种操作
用接种环或接种针分离微生物，或在无菌条件下把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器进行培养，是微生物学研究中最常用的基本操作。由于打开器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染，因此微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进行，其要点是在火焰附近进行熟练的无菌操作（图2-1），或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作（图2-2）。操作箱或操作室内的空气可在使用前一段时间内用紫外灯或化学药剂灭菌。有的无菌室通无菌空气维持无菌状态。
用以挑取和转接微生物材料的接种环及接种针，一般采用易于迅速加热和冷却的镍铬合金等金属制备，使用时用火焰灼烧灭菌。而移植液体培养物可采用无菌吸管或移液枪。
二、用固体培养基分离纯培养
单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落（colony）。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔（lawn）。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据（图2-3）。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板（culture plate）的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。
1. 稀释倒平板法（pour plate method）
先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1,000、1:10,000......），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。
2. 涂布平板法（spread plate method）
由于将含菌材料先加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，而且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落（图2-4）。
3. 平板划线法（streak plate method）
用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线（图2-5），微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。
4. 稀释摇管法（dilution shake culture method）
用固体培养基分离严格厌氧菌有它特殊的地方。如果该微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采用通常的方法制备平板，然后置放在封闭的容器中培养，容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行，它是稀释倒平板法的一种变通形式* 。先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间（图2-6）。进行单菌落的挑取和移植，需先用一只灭菌针将液体石蜡--石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。
三、用液体培养基分离纯培养
对于大多数细菌和真菌，用平板法分离通常是满意的，因为它们的大多数种类在固体培养基上长得很好。然而迄今为止并不是所有的微生物都能在固体培养基上生长，例如一些细胞大的细菌、许多原生动物和藻类等，这些微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。
通常采用的液体培养基分离纯化法是稀释法。接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了，得到纯培养物的机率就会急剧下降。因此，采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。
四、单细胞（孢子）分离
稀释法有一个重要缺点，它只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类，而在自然界，很多微生物在混杂群体中都是少数。这时，可以采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞（或单孢子）分离法。单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体很小的细菌则较难。
对于较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体，并在大量的灭菌培养基中转移清洗几次，除去较小微生物的污染。这项操作可在低倍显微镜，如解剖显微镜下进行。对于个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪，在显微镜下进行。目前，市场上有售的显微操作仪种类很多，一般是通过机械、空气或油压传动装置来减小手的动作幅度，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。在没有显微操作仪时，也可采用一些变通的方法在显微镜下进行单细胞分离，例如将经适当稀释后的样品制备成小液滴在显微镜下观察，选取只含一个细胞的液体来进行纯培养物的分离。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中采用。
五、选择培养分离
没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。在一种培养基上接种多种微生物，只有能生长的才生长，其它被抑制。如果某种微生物的生长需要是已知的，也可以设计一套特定环境使之特别适合这种微生物的生长，因而能够从自然界混杂的微生物群体中把这种微生物选择培养出来，尽管在混杂的微生物群体中这种微生物可能只占少数。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离，是十分重要的，特别对于从自然界中分离、寻找有用的微生物。在自然界中，除了极特殊的情况外，在大多数场合下微生物群落是由多种微生物组成的，因此，要从中分离出所需的特定微生物是十分困难的，尤其当某一种微生物所存在的数量与其它微生物相比非常少时，单采用一般的平板稀释方法几乎是不可能分离到该种微生物的。例如，若某处的土壤中的微生物数量在108时，必须稀释到10-6才有可能在平板上分离到单菌落，而如果所需的微生物的数量仅为102~3，显然不可能在一般通用的平板上得到该微生物的单菌落。要分离这种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法。或抑制使大多数微生物不能生长，或造成有利于该菌生长的环境，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯培养分离。
1. 利用选择平板进行直接分离
主要根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件，有多种方法可以采用。例如在从土壤中筛选蛋白酶产生菌时，可以在培养基中添加牛奶或酪素制备培养基平板，微生物生长时若产生蛋白酶则会水解牛奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白质水解圈。通过菌株培养时产生的蛋白质水解圈对产酶菌株进行筛选，可以减少工作量，将那些大量的非产蛋白酶菌株淘汰；再如，要分离高温菌，可在高温条件进行培养；要分离某种抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上进行分离；有些微生物如螺旋体、粘细菌、蓝细菌等能在琼脂平板表面或里面滑行，可以利用它们的滑动特点进行分离纯化，因为滑行能使它们自己和其它不能移动的微生物分开。可将微生物群落点种到平板上，让微生物滑行，从滑行前沿挑取接种物接种，反复进行，得到纯培养物。
2. 富集培养
主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。富集条件可根据所需分离的微生物的特点从物理、化学、生物、及综合多个方面进行选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等等许多方面。图2-7描述了采用富集方法从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸（?-hydroxybenzyl acid）的微生物的实验过程。首先配制以对羟基苯甲酸为唯一碳源的液体培养基并分装于烧瓶中，灭菌后将少量的土壤样品接种于该液体培养基中，培养一定时间，原来透明的培养液会变得浑浊，说明已有大量微生物生长。取少量上述培养液转移至新鲜培养液中重新培养，该过程经数次重复后能利用对羟基苯甲酸的微生物的比例在培养物中将大大提高，将培养液涂布于以对羟基苯甲酸为唯一碳源的琼脂平板，得到的微生物菌落中的大部分都是能降解对羟基苯甲酸的微生物。挑取一部分单菌落分别接种到含有及缺乏对羟基苯甲酸的液体培养基中进行培养，其中大部分在含有对羟基苯甲酸的培养基中生长，而在没有对羟基苯甲酸的培养基中表现为没有生长，说明通过该富集程序的确得到了欲分离的目标微生物。通过富集培养使原本在自然环境中占少数的微生物的数量大大提高后，可以再通过稀释倒平板或平板划线等操作得到纯培养物。
富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生理条件的几乎无穷尽的组合形式可应用于从自然界选择出特定微生物的需要。富集培养方法提供了按照意愿从自然界分离出特定已知微生物种类的有力手段，只要掌握这种微生物的特殊要求就行。富集培养法也可用来分离培养出由科学家设计的特定环境中能生长的微生物，尽管我们并不知道什么微生物能在这种特定的环境中生长。
六、二元培养物
分离的目的通常是要得到纯培养。然而，在有些情况下这是做不到的或是很难作到的。但可用二元培养物作为纯化培养的替代物。只有一种微生物的培养物称为纯培养物，含有二种以上微生物的培养物称为混合培养物，而如果培养物中只含有二种微生物，而且是有意识的保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。例如二元培养物是保存病毒的最有效途径，因为病毒是细胞生物的严格的细胞内寄生物。有一些具有细胞的微生物也是严格的其它生物的细胞内寄生物，或特殊的共生关系。对于这些生物，二元培养物是在实验室控制条件下可能达到的最接近于纯培养的培养方法。
在自然环境中，猎食细小微生物的原生动物也很容易用二元培养法在实验室培养，培养物由原生动物和它猎食的微生物二者组成。例如，纤毛虫、变形虫和粘菌。对这些生物，二者的关系可能并不是严格的。这些生物中有些能够纯培养，但是其营养要求往往极端复杂，制备纯培养的培养基很困难、很费事。
七、微生物的保藏技术
通过分离纯化得到的微生物纯培养物，还必须通过各种保藏技术使其在一定时间内不死亡，不会被其它微生物污染，不会因发生变异而丢失重要的生物学性状，否则就无法真正保证微生物研究和应用工作的顺利进行。菌种或培养物保藏是一项最重要的微生物学基础工作，微生物菌种是珍贵的自然资源，具有重要意义，许多国家都设有相应的菌种保藏机构，例如，中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM），中国典型培养物保藏中心（CCTCC），美国典型菌种保藏中心（ATCC），美国的“北部地区研究实验室”（NRRL），荷兰的霉菌中心保藏所（CBS），英国的国家典型菌种保藏中心（NCTC）以及日本的大阪发酵研究所（IFO）等。国际微生物学联合会（IAMS）还专门设立了世界菌种保藏联合会（WFGC），用计算机储存世界上各保藏机构提供的菌种数据资料，可以通过国际互联网查询和索取，进行微生物菌种的交流、研究和使用。
生物的生长一般都需要一定的水分，适宜的温度和合适的营养，微生物也不例外。菌种保藏就是根据菌种特性及保藏目的的不同，给微生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。例如利用培养基或宿主对微生物菌株进行连续移种，或改变其所处的环境条件，例如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等，令菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保存，有的可保藏几十年或更长时间。在需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力。
1. 传代培养保藏
传代培养与培养物的直接使用密切相关，是进行微生物保藏的基本方法。常用的有琼脂斜面、半固体琼脂柱及液体培养等。采用传代法保藏微生物应注意针对不同的菌种而选择使用适宜的培养基，并在规定的时间内进行移种，以免由于菌株接种后不生长或超过时间不能接活，丧失微生物菌种。在琼脂斜面上保藏微生物的时间因菌种的不同而有较大差异，有些可保存数年，而有些仅数周。一般来说，通过降低培养物的代谢或防止培养基干燥，可延长传代保藏的保存时间。例如在菌株生长良好后，改用橡皮塞封口或在培养基表面覆盖液体石蜡，并放置低温保存；将一些菌的菌苔直接刮入蒸馏水或其它缓冲液后，密封置4℃保存，也可以大大提高某些菌的保藏时间及保藏效果，这种方法有时也被称为悬液保藏法。
由于菌种进行长期传代十分繁琐，容易污染，特别是会由于菌株的自发突变而导致菌种衰退，使菌株的形态、生理特性、代谢物的产量等发生变化，因此在一般情况下，在实验室里除了采用传代法对常用的菌种进行保存外，还必须根据条件采用其它方法，特别是对那些需要长期保存的菌种更是如此。
2. 冷冻保藏
将微生物处于冷冻状态，使其代谢作用停止以达到保藏的目的。大多数微生物都能通过冷冻进行保存，细胞体积大者要比小者对低温更敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁者敏感。其原因与低温会使细胞内的水分形成冰晶，从而引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。进行冷冻时，适当采取速冻的方法，可因产生的冰晶小而减少对细胞的损伤。当从低温下移出并开始升温时，冰晶又会长大，故快速升温也可减少对细胞的损伤。冷冻时的介质对细胞的损伤也有显著的影响。例如，0.5 mol / L左右的甘油或二甲亚枫可透入细胞，并通过降低强烈的脱水作用而保护细胞；大分子物质如糊精、血清蛋白、脱脂牛奶或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）虽不能透入细胞，但可通过与细胞表面结合的方式而防止细胞膜受冻伤。因此，在采用冷冻法保藏菌种时，一般应加入各种保护剂以提高培养物的存活率。
一般来说，保藏温度越低，保藏效果越好。在常用的冷冻保藏方法中，液氮保藏可达到—196℃。因此，从适用的微生物范围、存活期限、性状的稳定性等方面来看，该方法在迄今使用的各种微生物保藏方法中是较理想的一种。但液氮保藏需使用专用器具，一般仅适合一些专业保藏机构采用。与此相应，冰箱保藏使用更为普遍。例如在各种基因工程手册中，一般都推荐在—70℃低温冰箱中保存菌株或细胞的某些特殊生理状态（添加甘油做保护剂），例如经诱导建立了感受态的细胞。在没有低温冰箱的条件下，也可利用—20~30℃的普通冰箱保存菌种。但应注意加有保护剂的细胞混合物的共融点处在这个温度范围内，常会由于冰箱可能产生的微小温度变化引起培养物的反复融化和再结晶，而对菌体形成强烈的损伤。因此采用普通冰箱冷冻保存菌种的效果往往远低于低温冰箱，应注意经常检查保藏物的存活情况，随时转种。
3. 干燥保藏法
水份对各种生化反应和一切生命活动至关重要，因此，干燥，尤其是深度干燥是微生物保藏技术中另一项经常采用的手段。
沙土管保存和冷冻真空保藏是最常用的二项微生物干燥保藏技术。前者主要适用于产孢子的微生物，如芽孢杆菌、放线菌等。一般将菌种接种斜面，培养至长出大量的孢子后，洗下孢子制备孢子悬液，加入无菌的沙土试管中，减压干燥，直至将水分抽干，最后用石蜡、胶塞等封闭管口，置冰箱保存。此法简便易行，并可以将微生物保藏较长时间，适合一般实验室及以放线菌等为菌种的发酵工厂采用。
冷冻真空保藏是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻结，然后在真空下通过冰的升华作用除去水分。达到干燥的样品可在真空或惰性气体的密闭环境中置低温保存，从而使微生物处于干燥、缺氧及低温的状态，生命活动处于休眠，可以达到长期保藏的目的。用冰升华的方式除去水分，手段比较温和，细胞受损伤的程度相对较小，存活率及保藏效果均不错，而且经抽真空封闭的菌种安瓿管的保存、邮寄、使用均很方便。因此冷冻真空干燥保藏是目前使用最普遍，也是最重要的微生物保藏方法，大多数专业的菌种保藏机构均采用此法作为主要的微生物保存手段。
除上述方法外，各种微生物菌种保藏的方法还有很多，如纸片保藏、薄膜保藏、寄主保藏等。由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。
第二节 显微镜和显微技术
绝大多数微生物的大小都远远低于肉眼的观察极限，因此，一般必须借助显微镜放大系统的作用才能看到到它们的个体形态和内部构造。除了放大外，决定显微观察效果的还有二个重要的因素，即分辨率和反差。分辨率是指能辨别两点之间最小距离的能力，而反差是指样品区别于背景的程度，它们与显微镜的自身特点有关，但也取决于进行显微观察时对显微镜的正确使用及良好的标本制作和观察技术，这就是显微技术。而现代的显微技术，不仅仅是观察物体的形态、结构，而且发展到对物体的组成成分定性和定量，特别是与计算科学技术的结合出现的图象分析、模拟仿真等技术，为探索微生物的奥秘增添了强大武器。
一、显微镜的种类及原理
1. 普通光学显微镜
现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜座、支架、载物台、调焦螺旋等部件，是显微镜的基本组成单位，主要是保证光学系统的准确配制和灵活调控，在一般情况下是固定不变的。而光学系统由物镜、目镜、聚光器等组成，直接影响着显微镜的性能，是显微镜的核心。一般的显微镜都可配置多种可互换的光学组件，通过这些组件的变换可改变显微镜的功能，如明视野、暗视野、相差等。
对任何显微镜来说，分辨率是决定其观察效果的最重要指标。从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：
式中?为所用光源波长；?为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离（图2-8）；n为玻片与物镜间介质的折射率，显微观察时可根据物镜的特性而选用不同的介质，例如空气（n=1.0）、水（n=1.33）、香柏油（n=1.52）等。n sin?也被表示为数值孔径值（Numerical Aperture，NA），它是决定物镜性能的最重要指标。光学显微镜在使用最短波长的可见光（?=450nm）作为光源时在油镜下可以达到其最大分辨率，0.18 ?m（表2-1）。由于肉眼的正常分辨能力一般为 0.25 mm左右，因此光学显微镜有效的最高总放大倍数只能达到 1,000~1,500倍，在此基础上进一步提高显微镜的放大能力对观察效果的改善并无帮助。
2. 暗视野显微镜
明视野显微镜的的照明光线直接进入视野，属透射照明。生活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的，不易看清。而暗视野显微镜则利用特殊的聚光器实现斜射照明，给样品照明的光不直接穿过物镜，而是由样品反射或折射后再进入物镜（图 2-9），因此，整个视野是暗的，而样品是明亮的。正如我们在白天看不到的星辰却可在黑暗的夜空中清楚地显现一样，在暗视野显微镜中由于样品与背景之间的反差增大，可以清晰地观察到在明视野显微镜中不易看清的活菌体等透明的微小颗粒。而且，即使所观察微粒的尺寸小于显微镜的分辨率，依然可以通过它们散射的光而发现其存在。因此，暗视野法主要用于观察生活细菌的运动性。
3. 相差显微镜
光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的变化，因此，用普通光学显微镜观察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨。然而，由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光的相位差人肉眼感觉不到，但相差显微镜配备有特殊的光学装置——环状光阑和相差板，利用光的干涉现象，能将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强。正由于样品的这种反差是以不同部位的密度差别为基础形成的，因此，相差显微镜使人们能在不染色的情况下比较清楚地观察到在普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构，是显微技术的一大突破，为此，其发明人F. Zernike获得了1953年的诺贝尔奖。
4. 荧光显微镜
有些化合物（荧光素）可以吸收紫外线并转放出一部分为光波较长的可见光，这种现象称为荧光。因此，在紫外线的照射下，发荧光的物体会在黑暗的背景下表现为光亮的有色物体，这就是荧光显微技术的原理。由于不同荧光素的激发波长范围不同，因此同一样品可以同时用二种以上的荧光素标记，它们在荧光显微镜下经过一定波长的光激发发射出不同颜色的光。荧光显微技术在免疫学、环境微生物学、分子生物学中应用十分普遍。
5. 透射电子显微镜
由于显微镜的分辨率取决于所用光的波长，人们从本世纪初开始就尝试用波长更短的电磁波取代可见光来放大成像，以制造分辨本领更高的显微镜。1933年，德国人E. Ruska 制成了世界上第一台以电子作为“光源”的显微镜----电子显微镜。其理论依据是：电子束通过电磁场时会产生复杂的螺旋式运动，但最终的结果是正如光线通过玻璃透镜时一样，产生偏转、汇聚或发散，并同样可以聚集成像。而一束电子具有波长很短的电磁波的性质，其波长与运动速度成反比，速度越快，波长越短。在理论上，电子波的波长最短可达到0.005 nm，所以电子显微镜的分辨能力要远高于光学显微镜（图2-10）。几十年来，电子显微技术发展很快，应用也日益广泛，对包括微生物学在内的许多学科的进步都起了巨大的推动作用。
6. 扫描电子显微镜
扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope SEM）与光学显微镜和透射电镜不同，它的工作原理类似于电视或电传真照片。电子枪发出的电子束被磁透镜汇聚成极细的电子“探针”，在样品表面进行“扫描”，电子束扫到的地方就可激发样品表面放出二次电子（同时也有一些其它信号）。二次电子产生的多少与电子束入射角度有关，也即是与样品表面的立体形貌有关。与此同时，在观察用的荧光屏上另一个电子束也做同步的扫描。二次电子由探测器收集，并在那里被闪烁器变成光信号，再经光电倍增管和放大器又变成电压信号来控制荧光屏上电子束的强度。这样，样品上产生二次电子多的地方，在荧光屏上相应的部位就越亮，我们就能得到一幅放大的样品立体图像。
7. 扫描隧道显微镜
在光学显微镜和电子显微镜的结构和性能得到不断完善的同时，基于其它各种原理的显微镜也不断问世，使人们认识微观世界的能力和手段得到不断提高，其中80年代才出现的扫描隧道显微镜（Scanning Tunneling Microscope，STM）是显微镜领域的新成员，主要原理是利用了量子力学中的隧道效应。
近年来,在STM的基础上又发展出了另一种扫描探针式显微镜，原子力显微镜（Atomic Force Microscope，AFM）。AFM也是利用细小的探针对样品表面进行恒定高度的扫描来对样品进行“观察”，但它不是通过隧道电流，而是通过一个激光装置来监测探针随样品表面的升降变化来获取样品表面形貌的信息，因此，与STM不同，AFM可以用于对不具导电性，或导电能力较差的样品进行观察。
二、显微观察样品的制备
样品制备是显微技术的一个重要环节，直接影响着显微观察效果的好坏。一般来说，在利用显微镜观察、研究生物样品时，除要根据所用显微镜使用的特点采用合适的制样方法外，还应考虑生物样品的特点，尽可能地使被观察样品的生理结构保持稳定，并通过各种手段提高其反差。
1. 光学显微镜的制样
光学显微镜是微生物学研究的最常用工具，有活体直接观察和染色观察二种基本使用方法。
(1) 活体观察
可采用压滴法、悬滴法及菌丝埋片法等在明视野、暗视野或相差显微镜下对微生物活体进行直接观察。其特点是可以避免一般染色制样时的固定作用对微生物细胞结构的破坏，并可用于专门研究微生物的运动能力、摄食特性、及生长过程中的形态变化如细胞分裂、芽孢萌发等动态过程。
①压滴法：将菌悬液滴于载玻片上，加盖盖玻片后立即进行显微镜观察；
②悬滴法：在盖玻片中央加一小滴菌悬液后反转置于特制的凹玻载片上后进行显微镜观察。为防止液滴蒸发变干，一般还应在盖玻片四周加封凡士林；
③菌丝埋片法：将无菌小块玻璃纸铺于平板表面，涂布放线菌或霉菌孢子悬液，经培养，取下玻璃纸置于载玻片上，用显微镜对菌丝的形态进行观察。
(2) 染色观察
一般微生物菌体小而无色透明，在光学显微镜下，细胞体液及结构的折光率与其背景相差很小，因此用压滴法或悬滴法进行观察时，只能看到其大体形态和运动情况。若要在光学显微镜下观察其细致形态和主要结构，一般都需要对它们进行染色，从而借助颜色的反衬作用提高观察样品不同部位的反差。
染色前必须先对涂在载玻片上的样品进行固定，其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上，二是增加其对染料的亲和力。常用酒精灯火焰加热和化学固定二种方法。固定时应注意尽量保持细胞原有形态，防止细胞膨胀和收缩。而染色则根据方法和染料等的不同可分为很多种类，如细菌的染色，可简单概括如下：
?第三节 显微镜下的微生物
计划学时：7学时
重点：细菌、酵母菌、放线菌、霉菌的形态结构与功能
微生物类群庞杂，种类繁多，包括细胞型和非细胞型两类。凡具有细胞形态的微生物称为细胞型微生物，按系统发育和细胞结构它们分属于细菌（Bacteria）、古生菌（Archaea）和真核生物（Eukarya）。而不具细胞结构的病毒、类病毒，行寄生生活，它们的许多生活特性类同于寄主生物。本节将主要介绍在显微镜下细胞型微生物的一般形态和细胞大小，对丰富多彩的微生物世界有一个初步的认识。
一、细菌和古生菌
虽然从系统发育来看，细菌和古生菌是二种完全不同的生物类群，但它们的细胞结构却基本一致，同属原核生物（Prokaryote），在显微镜下的形态也十分类似。
1. 细菌的形态和排列
在显微镜下不同细菌的形态可以说是千差万别，丰富多采，但就单个有机体而言，其基本形态可分为球状、杆状与螺旋状三种（图2-14）。尽管是单细胞生物，许多细菌也常以成对、成链、成簇的形式生长，例如双球菌（图2-15---肺炎球菌，旧称肺炎双球菌）、链球菌（图2-16）、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌等。
除了球菌、杆菌、螺旋菌三种基本形态外，还有许多具其它形态的细菌。例如柄杆菌（prosthecate bacteria）细胞上有柄（stalk）、菌丝（hyphae）、附器（appendages）等细胞质伸出物，细胞呈杆状或梭状，并有特征性的细柄（图2-17）；球衣菌（Sphaerotilus），能形成衣鞘（sheath），杆状的细胞呈链状排列在衣鞘内而成为丝状（图 2-18）；而支原体（Mycoplasma）由于只有细胞膜，没有细胞壁，故细胞柔软，形态多变，具有高度多形性。即使在同一培养基中，细胞也常出现不同大小的球状、环状、长短不一的丝状、杆状及不规则的多边形态。（图 2-19）等。另外，人们还发现了细胞呈星形和方形的细菌（图2-20）
有些细菌具有特定的生活周期，在不同的生长阶段具有不同的形态，例如放线菌、粘细菌等。放线菌是生产抗生素的重要微生物，大多由分枝发达的菌丝组成。而根据菌丝的形态和功能又可分为营养菌丝、气生菌丝和孢子丝三种，其中孢子丝的形态特征是放线菌的重要鉴定指标。（图2-21，2-22）
细菌的形态明显地受环境条件的影响，如培养时间、培养温度、培养基的组成与浓度等发生改变，均能引起细菌形态的改变。一般处于幼龄阶段和生长条件适宜时，细菌形态正常、整齐，表现出特定的形态。在较老的培养物中，或不正常的条件下，细胞常出现不正常形态，尤其是杆菌，有的细胞膨大，有的出现梨形，有的产生分枝，有时菌体显著伸长以至呈丝状等。这些不规则的形态统称为异常形态，若将它们转移到新鲜培养基中或适宜的培养条件下又可恢复原来的形态。
2. 古生菌
在显微镜下，古生菌与细菌具有类似的个体形态，但它们多生活于一些生存条件十分恶劣的极端环境中，例如高温、高盐、高酸等。图2-23所列的隐蔽热网菌（Pyrodictium occultum）是迄今所发现的最耐热的生物之一，它的最适生长温度为105℃。而热原体（Thermoplasma）没有细胞壁，其形态也象细菌中的支原体一样呈多形性（图2-24）。
3. 原核生物的细胞大小
原核生物的细胞大小随种类不同差别很大。有的与最大的病毒粒子大小相近，在光学显微镜下勉强可见，有的与藻类细胞差不多，几乎肉眼就可辨认，但多数居于二者之间。
尽管细菌细胞微小，采用显微镜测微尺能较容易、较准确地测量出它们的大小；也可通过投影法或照相制成图片，再按放大倍数测算。球菌大小以其直径表示，杆菌和螺旋菌以其长度和宽度表示。不过螺旋菌的长度是菌体两端点间的距离，而不是真正的长度，它的真正长度应按其螺旋的直径和圈数来计算。细菌大小的比较见图2-25。
值得指出的是，在显微镜下观察到的细菌的大小与所用固定染色的方法有关。经干燥固定的菌体比活菌体的长度，一般要缩短1/3-1/4；若用衬托菌体的负染色法，其菌体往往大于普通染色法，甚至比活菌体还大，具有荚膜的细菌中最易出现这种现象。此外，影响细菌形态变化的因素同样也影响细菌的大小。除少数例外，一般幼龄细菌比成熟的或老龄的细菌大得多。例如枯草芽孢杆菌，培养4小时的比培养24小时的细胞长5-7倍，但宽度变化不明显。细菌大小随菌龄而变化，这可能与代谢废物积累有关。另外，培养基中渗透压增加也会导致细胞变小。
二、真菌
霉菌、酵母菌、以及大型真菌如蘑菇等皆为真菌，均属真核微生物。它们种类繁多，形态各异、大小悬殊，细胞结构多样。由于霉菌和酵母菌在生物学特性、研究方法、以及它们在自然界的分布和作用，对动物、植物和人类的有益、有害效应等方面均与细菌相似，故有关真菌方面的研究霉菌和酵母菌较为详细。
1. 霉菌
霉菌（mold）是一些“丝状真菌”的统称，不是分类学上的名词。霉菌菌体均由分枝或不分枝的菌丝（hypha）构成。许多菌丝交织在一起，称为菌丝体（mycelium）。菌丝在光学显微镜下呈管状，直径约为2~10?m，比一般细菌和放线菌菌丝大几到几十倍。霉菌菌丝有两类（图2-26）：1）无隔膜菌丝，整个菌丝为长管状单细胞，细胞质内含有多个核。其生长过程只表现为菌丝的延长和细胞核的裂殖增多以及细胞质的增加。如根霉、毛霉、犁头霉等。2）多数为有隔膜菌丝，菌丝由横隔膜分隔成成串多细胞，每个细胞内含有一个或多个细胞核。有些菌丝，从外观看虽然像多细胞，但横隔膜上有小孔，使细胞质和细胞核可以自由流通，而且每个细胞的功能也都相同。如青霉菌、曲霉菌、白地霉等绝大多数霉菌菌丝均属此类。
在固体培养基上，部分菌丝伸入培养基内吸收养料，称为营养菌丝；另一部分则向空中生长，称为气生菌丝。有的气生菌丝发育到一定阶段，分化成繁殖菌丝。
霉菌在自然界分布极广，土壤、水域、空气、动植物体内外均有它们的踪迹。它们同人类的生产、生活关系密切，是人类实践活动中最早认识和利用的一类微生物。现在，霉菌在发酵工业上广泛用来生产酒精、抗生素（青霉素、灰黄霉素）、有机酸（柠檬酸、葡萄糖酸、延胡索酸等）、酶制剂（淀粉酶、果胶酶、纤维素酶等）、维生素、甾体激素等。在农业上用于饲料发酵、植物生长刺激素（赤霉素）、杀虫农药（白僵菌剂）等。腐生型霉菌在自然界物质转化中也有十分重要的作用。另外，霉菌也是造成许多食品霉变变质的主要原因。例如，据统计全世界平均每年由于霉变而不能食（饲）用的谷物约占2%，这是一笔相当惊人的经济损失。
2. 酵母菌
酵母菌（yeast）是一群单细胞的真核微生物。这个术语也是无分类学意义的普通名称，通常用于以芽殖或裂殖来进行无性繁殖的单细胞真菌，以与霉菌区分开。极少数种可产生子囊孢子进行有性繁殖。
在光学显微镜下，大多数酵母菌为单细胞，一般呈卵圆形、圆形、圆柱形或柠檬形。大小约为1~5×5~30 mm，最大可达100 mm。各种酵母菌有其一定的大小和形态，但也随菌龄和环境条件而异。即使在纯培养中，各个细胞的形状、大小亦有差别。有些酵母菌细胞与其子代细胞连在一起成为链状，成为假丝酵母（图 2-27）。
酵母菌与人类生活关系也十分密切，在酿造、食品、医药工业等方面占有重要地位。另外，酵母菌细胞蛋白质含量高达细胞干重的50%以上，并含有人体必需的氨基酸，所以酵母菌可以成为食品和饲料的重要补充。当然，酵母菌也常给人类带来危害。腐生型酵母菌能使食品、纺织品和其它原料腐败变质，少数嗜高渗压酵母菌如鲁氏酵母（Saccharomyces rouxii）、蜂蜜酵母（Saccharomyces mellis）可使蜂蜜、果酱败坏；有的酵母菌还可引起人和植物的病害。例如白假丝酵母（Candida albicans，又称白色念珠菌）可引起皮肤、粘膜、呼吸道、消化道以及泌尿系统等的多种疾病。而新型隐球酵母（Cryptococcus neoformans）还能引起慢性脑膜炎、肺炎等疾病。
三、藻类
藻类（algae）是指除苔藓植物和维管束植物以外，基本上有叶绿素，可进行光合作用，并伴随放出氧气的一大类真核生物，它们大多属于只有通过显微镜才能观察到个体形态的微生物。但也有一些藻类个体很大，例如大的海藻可长达若干英尺。
藻类的大小、形态有很大差别（图2-28），许多是单细胞的，也有些藻类是单细胞的群体。有些群体可以是由分裂后单个的、相似的细胞互相粘连而成的简单聚集，也可能是由具有特殊功能的，分化了的不同细胞所组成，它们变得很复杂，而且表面结构类似于高等植物。
藻类在自然界，特别是各种水体中广泛存在，常常是影响水质的重要原因。例如有些自来水的怪味就是在供水系统中生长的藻类引起的，而藻类在近海的大量繁殖，也会由于水中氧气的大量消耗而引起鱼类和其它海洋生物的窒息、死亡，形成对渔业生产影响极大的赤潮。
四、原生动物
原生动物（Prokaryote）是一类缺少真正细胞壁，细胞通常无色，具有运动能力，并进行吞噬营养的单细胞真核生物。它们个体微小，大多数都需要显微镜才能看见。
原生动物在自然界，特别是海水、淡水中大量存在，它们也与各种动植物在不同组织水平上形成共生体，有些对宿主无害，有些对宿主有利，有些对宿主有害。也有一些原生动物能引起人类疾病。
小 结
1 从混合在一起的微生物群体中得到特定的某一种微生物的纯培养，是研究和利用微生物的最重要的环节之一。无菌操作技术是微生物学的重要技术，而且广泛地被其它学科和生产实际所利用。
2 通过稀释或划线等手段，在琼脂平板上得到微生物的单菌落是最常用的纯种分离手段。
3 传代培养、干燥保藏、冷冻保藏是通常使用的微生物菌种保藏技术。
4 微生物个体微小，通常必须通过显微镜才能观察到其个体形态，而进行显微观察时，分辨率和反差是决定显微观察效果的二个最重要的因素。它们与显微镜的特性有关，也取决于样品的制备与观察技术。无论是光学显微镜还是电子显微镜，其设备和技术发展迅速，应用面越来越广泛和深入。
5 在显微镜下微生物的大小与形态千差万别，丰富多彩，是区分不同微生物的重要依据之一。
思 考 题
1. 一般说来，严格的无菌操作是一切微生物工作的基本要求，但在分离与培养极端嗜盐菌时常在没有点酒精灯的普通实验台上倾倒培养平板、在日常环境中直接打开皿盖观察和挑取菌落，而其研究结果并没有因此受到影响，你知道这是为什么吗？
2. 如果希望从环境中分离得到厌氧固氮菌，你该如何设计实验？
3 .为什么光学显微镜的目镜通常都是15×？是否可以采用更大放大倍率的目镜（如30×）来进一步提高显微镜的总放大倍数？
4. 培养条件对微生物个体的大小有那些影响？你是否能很快地在显微镜下区分同为单细胞的细菌、酵母菌、和原生动物？
第三章 微生物的细胞结构与功能
计划学时：5
重点：原核微生物的细胞结构与功能，真核微生物的细胞结构与功能。
在有细胞构造的微生物中，按其细胞，尤其是细胞核的构造和进化水平上的差别，可把它们分为原核微生物和真核微生物两个大类。近年来正在越来越深入研究的古细菌（archaebacteria）或古生菌（archaea），尽管其在进化谱系上与真细菌（eubacteria）和真核生物相互并列，但其在细胞构造上却与真细菌较为接近，同属于原核生物。因此，有关古生菌细胞构造和功能的内容，拟放在原核微生物一节中加以讨论。
第一节 原核微生物
原核微生物是指一大类细胞核无核膜包裹，只有称作核区(nuclear region)的裸露DNA的原始单细胞生物，包括真细菌和古生菌两大群。真细菌的细胞膜含由酯键连接的脂类，细胞壁中含特有的肽聚糖（无壁的枝原体除外），DNA中一般没有内含子（但近年来也有例外的发现）。细菌、放线菌、蓝细菌、枝原体、立克次氏体和衣原体等都属于真细菌。以下就以最常见的细菌作主要代表详细阐述原核生物细胞的各部分构造和功能。
细菌细胞的模式构造见图3-1。其中把一般细菌都有的构造称一般构造，而把部分细菌具有的或一般细菌在特殊环境下才有的构造称为特殊构造。
一、细胞壁
细胞壁（cell wall）是位于细胞最外的一层厚实、坚韧的外被，主要由肽聚糖构成，有固定细胞外形和保护细胞等多种生理功能。通过染色、质壁分离（plasmolysis）或制成原生质体后再在光学显微镜下观察，可证实细胞壁的存在；用电子显微镜观察细菌超薄切片等方法，更可确证细胞壁的存在。细胞壁的主要功能有：①固定细胞外形和提高机械强度，从而使其免受渗透压等外力的损伤。例如，有报道说大肠杆菌（Escherichia coli）的膨压(turgor)可达2个大气压（相当于汽车内胎的压力）；②为细胞的生长、分裂和鞭毛运动所必需。失去了细胞壁的原生质体，也就丧失了这些重要功能；③阻拦酶蛋白和某些抗生素等大分子物质（分子量大于800）进入细胞，保护细胞免受溶菌酶、消化酶和青霉素等有害物质的损伤；④赋予细菌具有特定的抗原性、致病性以及对抗生素和噬菌体的敏感性。
原核生物的细胞壁除了具有以上的共性外，在革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和古生菌中，还有其各自的特性，这就是细胞壁的多样性。图3-2和表3-1就是革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌细胞壁在构造和成分上的主要差别。
1、革兰氏阳性细菌的细胞壁
革兰氏阳性细菌细胞壁的特点是厚度大（20~80nm）和化学组分简单，一般只含90%肽聚糖和10%磷壁酸。
又称粘肽(mucopeptide)、胞壁质(murein)或粘质复合物(mucocomplex)，是真细菌细胞壁中的特有成分。革兰氏阳性菌——金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）具典型的肽聚糖，它的肽聚糖厚约20~80nm，由40层左右的网格状分子交织成的网套覆盖在整个细胞上。肽聚糖分子是由肽与聚糖两部分组成，其中的肽有四肽尾和肽桥两种，聚糖则由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸相互间隔连接而成，呈长链骨架状（图3-3）。看似复杂的肽聚糖分子，若把它的基本组成单位剖析一下，就显得十分简单了（图3-4）。从图3-4可知，每一肽聚糖单体由三部分组成：
①双糖单位：由一个N-乙酰葡糖胺通过β-1,4-糖苷键与另一个N-乙酰胞壁酸相连，后者为原核生物所特有的已糖。这一双糖单位中的β-1,4-糖苷键很容易被一种广泛分布于卵清、人的泪液和鼻涕以及部分细菌和噬菌体中的溶菌酶(lysozyme)所水解（水解位点在N-乙酰胞壁酸的1碳和N-乙酰葡糖胺的4碳间），从而引起细菌因肽聚糖细胞壁的“散架”而死亡。
②四肽尾或四肽侧链(tetrapeptide side chain)：是由四个氨基酸分子按L型与D型交替方式连接而成。在金黄色葡萄球菌中，接在N-乙酰胞壁酸上的四肽尾为L-ala →D-glu → L-lys → D-ala，其中两种D型氨基酸在细菌细胞壁之外很少出现。
③肽桥或肽间桥(peptide interbridge)：在金黄色葡萄球菌中，肽桥为甘氨酸五肽，它起着连接前后两个四肽尾分子的“桥梁”作用。目前所知的肽聚糖已超过100种，在这一“肽聚糖的多样性”中，主要的变化发生在肽桥上。
（2）磷壁酸（teichoic acid）
是结合在革兰氏阳性细菌细胞壁上的一种酸性多糖，主要成分为甘油磷酸或核糖醇磷酸。磷壁酸可分两类，其一为壁磷壁酸，它与肽聚糖分子间进行共价结合，含量会随培养基成分而改变，一般占细胞壁重量的10%，有时可接近50%。用稀酸或稀碱可以提取。其二为跨越肽聚糖层并与细胞膜相交联的膜磷壁酸（又称脂磷壁酸），由甘油磷酸链分子与细胞膜上的磷脂进行共价结合后形成。其含量与培养条件关系不大。可用45%热酚水提取，也可用热水从脱脂的冻干细菌中提取。磷壁酸有五种类型，主要为甘油磷壁酸和核糖醇磷壁酸两类，前者在干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)等细菌中存在，后者在金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌属(Bacillus)等细菌中存在。图3-5表示甘油磷壁酸的构造及其与肽聚糖分子中的N-乙酰胞壁酸的共价连接方式。
磷壁酸的主要生理功能为：
①其磷酸分子上较多的负电荷可提高细胞周围Mg2+的浓度，进入细胞后就可保证细胞膜上一些需Mg2+的合成酶提高活性；
②贮藏磷元素；
③增强某些致病菌如A族链球菌(Streptococcus)对宿主细胞的粘连、避免被白细胞吞噬以及抗补体的作用；
④赋予革兰氏阳性细菌以特异的表面抗原；
⑤可作为噬菌体的特异性吸附受体；
⑥能调节细胞内自溶素(autolysin)的活力，借以防止细胞因自溶而死亡。因为在细胞正常分裂时，自溶素可使旧壁适度水解并促使新壁不断插入，而当其活力过强时，则细菌会因细胞壁迅速水解而死亡。
2、革兰氏阴性细菌的细胞壁
（1）肽聚糖
革兰氏阴性细菌的肽聚糖可举大肠杆菌为代表。它的肽聚糖埋藏在外膜层之内，是仅由1~2层肽聚糖网状分子组成的薄层(2~3nm)，含量约占细胞壁总重的10%，故对机械强度的抵抗力较革兰氏阳性菌弱。其结构单体与上述革兰氏阳性菌基本相同，差别仅在于：
①四肽尾的第3个氨基酸不是L-lys，而是被一种只有在原核微生物细胞壁上才有的内消旋二氨基庚二酸(m-DAP)所代替；
②没有特殊的肽桥，其前后两个单体间的连接仅通过甲四肽尾的第4个氨基酸——D-ala的羧基与乙四肽尾的第3个氨基酸——mDAP的氨基直接相连，因而只形成较为疏稀、机械强度较差的肽聚糖网套（图3-6）。
（2）外膜(outer membrane)
位于革兰氏阴性细菌细胞壁外层，由脂多糖、磷脂和脂蛋白等若干种蛋白质组成的膜，有时也称为外壁（见图3-2）。
脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）：是位于革兰氏阴性细菌细胞壁最外层的一层较厚（8~10nm）的类脂多糖类物质，由类脂A、核心多糖(core polysaccharide)和O-特异侧链（O-specific side chain，或称O-多糖或O-抗原）三部分组成。其主要功能为：
①其中的类脂A是革兰氏阴性细菌致病物质——内毒素的物质基础；
②因其负电荷较强，故与磷壁酸相似，也有吸附Mg2+、Ca2+等阳离子以提高其在细胞表面浓度的作用；
③由于LPS结构的多变，决定了革兰氏阴性细菌细胞表面抗原决定簇的多样性，例如，根据LPS抗原性的测定，国际上已报道过的沙门氏菌属(Salmonella)的抗原型多达2107种（1983年）；
④是许多噬菌体在细胞表面的吸附受体；
⑤具有控制某些物质进出细胞的部分选择性屏障功能，例如，它可透过若干种较小的分子（嘌呤、嘧啶、双糖、肽类和氨基酸等），但能阻拦溶菌酶、抗生素（青霉素等）、去污剂和某些染料等较大分子进入细胞膜。要维持LPS结构的稳定性，必须有足够的2+存在。如果用EDTA等螯合剂去除Ca2+和降低离子键，就会使LPS解体。这时，其内壁层的肽聚糖分子就会暴露出来，因而易被溶菌酶所水解。
LPS的分子结构较为复杂，现表解如下：
在LPS中，类脂A的种类较少（大约有7~8种），它是革兰氏阴性细菌内毒素的物质基础，其结构见图3-7。
在LPS的核心多糖区和O-特异侧链区中有几种独特的糖，例如2-酮-3-脱氧辛糖酸（KDO）、L-甘油-D-甘露庚糖和阿比可糖（Abq, 即3,6-二脱氧-D-半乳糖），它们的结构见图3-8。在沙门氏菌中，LPS中的O-特异侧链种类极多，因其抗原性的差异故很易用灵敏的血清学方法加以鉴定，这在传染病的诊断中有其重要意义，例如由此可对某传染病的传染原进行地理定位等。
（3）外膜蛋白(outer membrane protein)
指嵌合在LPS和磷脂层外膜上的蛋白。有20余种，但多数外膜蛋白的功能还未清楚。其中的脂蛋白(lipoprotein)是一种通过共价键使外膜层牢固地连接在肽聚糖内壁层上的蛋白，分子量约为7200。另有两种蛋白研究得较为清楚，都称孔蛋白（porins）。每个孔蛋白分子是由三个相同分子量（36000）蛋白亚基组成的一种三聚体跨膜蛋白，中间有一直径约1nm的孔道，通过孔的开、闭，可阻止某些抗生素进入外膜层。已知有两种孔蛋白，其一是非特异性孔蛋白(nonspecific porin)，其充水孔道可通过分子量小于800~900的任何亲水性分子，如双糖、氨基酸、二肽和三肽；另一为特异性孔蛋白(specific porin或specific channel protein)，其上存在专一性结合位点，只容许一种或少数几种相关物质通过，其中最大的孔蛋白可通过分子量较大的物质，如维生素B12和核苷酸等。除脂蛋白和孔蛋白外，还有一些外膜蛋白与噬菌体的吸附或细菌素的作用有关。
(4）周质空间* (periplasmic space, periplasm)
又称壁膜间隙。在革兰氏阴性细菌中，一般指其外膜与细胞膜之间的狭窄空间（宽约12~15nm），呈胶状。在周质空间中，存在着多种周质蛋白（periplasmic proteins），包括：
①水解酶类，例如蛋白酶、核酸酶等；
②合成酶类，例如肽聚糖合成酶；
③结合蛋白（具有运送营养物质的作用）；
④受体蛋白（与细胞的趋化性相关）。周质蛋白可通过渗透休克法（osmotic shock）或称“冷休克”的方法释放。此法系根据突然改变渗透压并使细胞发生物理性裂解的原理。其主要步骤是：将细菌放在用Tris缓冲液配制、含EDTA的20%蔗糖溶液中保温，使其发生质壁分离（plasmolysis），接着快速地用4℃的0.005mol/L MgCl2溶液稀释并降温，使细胞外膜突然破裂并释放周质蛋白。经离心即可从上清液中提取周质蛋白。
革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌间由于细胞壁和其他构造的不同，就产生了一系列形态、构造、化学组分、染色反应、生理功能和致病性等的差别，这些差别对微生物学的研究和实际应用都十分重要，现列表如下（表3-2）。
3、古生菌的细胞壁
在古生菌中，除了热原体属(Thermoplasma)没有细胞壁外，其余都具有与真细菌类似功能的细胞壁。然而，从细胞壁的化学成分来看，则差别甚大。已研究过的一些古生菌，它们细胞壁中没有真正的肽聚糖，而是由多糖（假肽聚糖）、糖蛋白或蛋白质构成的。例如：
（1）假肽聚糖(pseudopeptidoglycan)细胞壁
甲烷杆菌属(Methanobacterium)古生菌的细胞壁是由假肽聚糖组成的（图3-9）。它的多糖骨架是由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰塔罗糖胺糖醛酸(N-acetyltalosaminouronic acid)以β-1,3糖苷键（不被溶菌酶水解！）交替连接而成，连在后一氨基糖上的肽尾由L-glu、L-ala和L-lys三个L型氨基酸组成，肽桥则由L-glu一个氨基酸组成。
（2）独特多糖细胞壁
甲烷八叠球菌(Methanosarcina)的细胞壁含有独特的多糖，并可染成革兰氏阳性。这种多糖含半乳糖胺、葡糖醛酸、葡萄糖和乙酸，不含磷酸和硫酸。
（3）硫酸化多糖细胞壁
一属极端嗜盐古生菌——盐球菌属(Halococcus)的细胞壁是由硫酸化多糖组成的。其中含葡萄糖、甘露糖、半乳糖和它们的氨基糖，以及糖醛酸和乙酸。
（4）糖蛋白(glycoprotein)
细胞壁 极端嗜盐的另一属古生菌——盐杆菌属(Halobacterium)的细胞壁是由糖蛋白组成的，其中包括葡萄糖、葡糖胺、甘露糖、核糖和阿拉伯糖，而它的蛋白部分则由大量酸性氨基酸尤其是天冬氨酸组成。这种带强负电荷的细胞壁可以平衡环境中高浓度的Na+，从而使其能很好地生活在20%～25%高盐溶液中。
（5）蛋白质细胞壁
少数产甲烷菌的细胞壁是由蛋白质组成的。但有的是由几种不同蛋白组成，如甲烷球菌(Methanococcus)和甲烷微菌(Methanomicrobium)，而另一些则由同种蛋白的许多亚基组成，例如甲烷螺菌属(Methanospirillum)。
4、缺壁细菌
虽然细胞壁是原核生物的最基本构造，但在自然界长期进化中和在实验室菌种的自发突变中都会发生缺细胞壁的种类；此外，在实验室中，还可用人为的方法抑制新生细胞壁的合成或对现成细胞壁进行酶解而获得缺壁细菌。现把四类缺壁细菌归纳如下：
（1）L型细菌（L-form of bacteria）
1935年，在英国李斯德预防研究所中发现一种由自发突变而形成的细胞壁缺损细菌——念珠状链杆菌（Streptobacillus moniliformis），它的细胞膨大，对渗透敏感，在固体培养基上形成“油煎蛋”似的小菌落。由于李斯德（Lister）研究所的第一字母是“L”，故称L型细菌。后来发现，许多革兰氏阳性或阴性细菌在实验室或宿主体内都可形成L型。严格地说，L型细菌应专指那些实验室或宿主体内通过自发突变而形成的遗传性稳定的细胞壁缺陷菌株。
（2）原生质体（protoplast）
指在人为条件下，用溶菌酶除尽原有细胞壁或用青霉素抑制新生细胞壁合成后，所得到的仅有一层细胞膜包裹着的圆球状渗透敏感细胞，一般由革兰氏阳性细菌形成。
（3）球状体(sphaeroplast)
又称原生质球，指还残留着部分细胞壁，尤其是革兰氏阴性细菌外膜的原生质体。
上述原生质体和球状体的共同特点是：无完整的细胞壁，细胞呈球状，对渗透压极其敏感，革兰氏染色阴性，即使有鞭毛也无法运动，对相应噬菌体不敏感，细胞不能分裂，等等。当然，如在形成原生质体或球状体以前已有噬菌体侵入，则它仍能正常复制、增殖和裂解；同样，如在形成原生质体前正在形成芽孢，则该芽孢也仍能正常形成。原生质体或球状体比正常有细胞壁的细菌更易导入外源遗传物质，故是研究遗传规律和进行原生质体育种的良好实验材料。
（4）枝原体(Mycoplasma)
是在长期进化过程中形成的、适应自然生活条件的无细胞壁的原核生物。因它的细胞膜中含有一般原核生物所没有的甾醇，所以即使缺乏细胞壁，其细胞膜仍有较高的机械强度。
5、革兰氏染色的机制
通过一个多世纪的实践证明，由革兰(C.Gram)于1884年发明的革兰氏染色法是一种极其重要的鉴别染色法，它不仅可用于鉴别真细菌，也可鉴别古生菌。60年代初，萨顿(Salton)曾提出细胞壁在革兰氏染色中的关键作用。至1983年，彼弗里奇(T.Beveridge)等用铂代替革兰氏染色中媒染剂碘的作用，再用电子显微镜观察到结晶紫与铂复合物可被细胞壁阻留，这就进一步证明了革兰氏阳性和阴性菌主要由于其细胞壁化学成分的差异而引起了物理特性（脱色能力）的不同，正是这一物理特性的不同才决定了染色反应的不同。其中细节为：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞膜内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物（CVI dye complex）。革兰氏阳性细菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次多和交联致密，故遇乙醇或丙酮作脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会溶出缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色。反之，革兰氏阴性细菌因其细胞壁薄、外膜层的类脂含量高、肽聚糖层薄和交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此，通过乙醇脱色后细胞退成无色。这时，再经沙黄等红色染料进行复染，就使革兰氏阴性菌呈现红色，而革兰氏阳性菌则仍保留紫色（实为紫加红色）了。
二、细胞壁以内的构造——原生质体
1、细胞质膜(cytoplasmic membrane)
又称质膜(plasma membrane)、细胞膜(cell membrane)或内膜(inner membrane)，是紧贴在细胞壁内侧、包围着细胞质的一层柔软、脆弱、富有弹性的半透性薄膜，厚约7～8nm，由磷脂（占20%～30%）和蛋白质（占50%～70%）组成。通过质壁分离、鉴别性染色或原生质体破裂等方法可在光学显微镜下观察到；用电子显微镜观察细菌的超薄切片，则可更清楚地观察到它的存在。电镜观察到的细胞质膜，是在上下两暗色层之间夹着一浅色中间层的双层膜结构。这是因为，组成细胞膜主要成分的磷脂，是由两层磷脂分子按一定规律整齐地排列而成的。其中每一个磷脂分子由一个带正电荷且能溶于水的极性头（磷酸端）和一个不带电荷、不溶于水的非极性尾（烃端）所构成。极性头朝向内外两表面，呈亲水性，而非极性端的疏水尾则埋入膜的内层，于是形成了一个磷脂双分子层。在极性头的甘油3C上，不同种微生物具有不同的R基，如磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇等（图3-10）。在原核微生物的细胞质膜上多数含磷脂酰甘油，此外，在革兰氏阴性细菌中，多数还含磷脂酰乙醇胺，在分枝杆菌中则含磷脂酰肌醇，等等。而非极性尾则由长链脂肪酸通过酯键连接在甘油的C1和C2位上组成，其链长和饱和度因细菌种类和生长温度而异，通常生长温度要求越高的种，其饱和度也越高，反之则低。
有关细胞质膜的结构与功能的解释，较多的学者仍倾向于1972年由辛格（J.S.Singer）和尼科尔森（G.L.Nicolson）所提出的液态镶嵌模型(fluid mosaic model)。其要点为：①膜的主体是脂质双分子层；②脂质双分子层具有流动性；③整合蛋白因其表面呈疏水性，故可“溶”于脂质双分子层的疏水性内层中；④周边蛋白表面含有亲水基团，故可通过静电引力与脂质双分子层表面的极性头相连；⑤脂质分子间或脂质与蛋白质分子间无共价结合；⑥脂质双分子层犹如一“海洋”，周边蛋白可在其上作“漂浮”运动，而整合蛋白则似“冰山”状沉浸在其中作横向移动。有关细胞质膜的模式构造可见图3-11。
细胞膜的生理功能为：
①选择性地控制细胞内、外的营养物质和代谢产物的运送；
②是维持细胞内正常渗透压的屏障；
③合成细胞壁和糖被的各种组分（肽聚糖、磷壁酸、LPS、荚膜多糖等）的重要基地；
④膜上含有氧化磷酸化或光合磷酸化等能量代谢的酶系，是细胞的产能场所；
⑤是鞭毛基体的着生部位和鞭毛旋转的供能部位。
原核微生物的细胞质膜上一般不含胆固醇等甾醇，这一点与真核生物明显不同。但缺乏细胞壁的原核生物——枝原体（Mycoplasma）则属例外。在其细胞膜上因含有hopanoid类甾醇而增强了坚韧性，故在一定程度上弥补了因缺壁而带来的不足。多烯类抗生素因可破坏含甾醇的细胞质膜，故可抑制枝原体和真核生物，但对其他的原核生物则无抑制作用。
间体（mesosome，或中体）是一种由细胞质膜内褶而形成的囊状构造，其中充满着层状或管状的泡囊。多见于革兰氏阳性细菌。每个细胞含一至少数几个。着生部位可在表层或深层，前者与某些酶如青霉素酶的分泌有关，后者与DNA的复制、分配以及与细胞分裂有关。近年来也有学者提出不同的看法，认为“间体”仅是电镜制片时因脱水操作而引起的一种赝像。
2、细胞质和内含物
细胞质（cytoplasm）是细胞质膜包围的除核区外的一切半透明、胶状、颗粒状物质的总称。含水量约80%。原核微生物的细胞质是不流动的，这一点与真核生物明显不同。细胞质的主要成分为核糖体（由50S大亚基和30S小亚基组成）、贮藏物、多种酶类和中间代谢物、质粒、各种营养物和大分子的单体等，少数细菌还有类囊体、羧酶体、气泡或伴孢晶体等。细胞质内形状较大的颗粒状构造称为内含物(inclusion body)，包括各种贮藏物和羧酶体、气泡等。
（1）贮藏物(reserve materials)
贮藏物是一类由不同化学成分累积而成的不溶性沉淀颗粒，主要功能是贮存营养物。种类很多，表解如下：
①聚-β-羟丁酸(poly-β-hydroxybutyrate, PHB)：是存在于许多细菌细胞质内属于类脂性质的碳源类贮藏物，不溶于水，可溶于氯仿，可用尼罗蓝或苏丹黑染色，具有贮藏能量、碳源和降低细胞内渗透压的作用。当巨大芽孢杆菌 在含乙酸或丁酸的培养基中生长时，细胞内贮藏的PHB可达其干重的60%。在棕色固氮菌 的孢囊中也含PHB。
PHB于1929年被发现，至今已发现60属以上的细菌能合成并贮藏。由于它无毒、可塑、易降解，故认为是生产医用塑料、生物降解塑料的良好原料。若干产碱菌 、固氮菌 和假单胞菌 是主要的生产菌种。近年来，又发现在一些革兰氏阳性和阴性好氧菌、光合厌氧细菌中，都存在PHB类化合物，它们与PHB仅是R基不同（R=CH3时即为PHB）。这类化合物可统称为聚羟链烷酸 。
②多糖类贮藏物：包括糖原和淀粉类。在真细菌中以糖原为多。糖原可用碘液染成褐色，在光学显微镜下可见。
③异染粒(metachromatic granules)：又称迂回体或捩转菌素(volutin granules)，这是因为它最早是在迂回螺菌 被发现并可用美蓝或甲苯胺蓝染成红紫色的缘故。颗粒大小为0.5～1.0μm，是无机偏磷酸的聚合物，分子呈线状，n值在2～106间。一般在含磷丰富的环境下形成。功能是贮藏磷元素和能量，并可降低细胞的渗透压。在白喉棒杆菌 和结核分枝杆菌 中极易见到，因此可用于有关细菌的鉴定。异染粒的化学结构为：
④藻青素（cyanophycin）：通常存在于蓝细菌中，是一种内源性氮源贮藏物，同时还兼有贮存能源的作用。一般呈颗粒状，由含精氨酸和天冬氨酸残基（1:1）的分枝多肽所构成，分子量在25,000～125,000范围内。
（2）磁小体(megnetosome) 197
勃莱克摩(R.P.Blakemore)在一种称为折叠螺旋体 的趋磁细菌中发现。目前所知的趋磁细菌主要为水生螺菌属 和嗜胆球菌属 中。这些细菌细胞中含有大小均匀、数目不等的磁小体，其成分为Fe3O4，外有一层磷脂、蛋白或糖蛋白膜包裹，是单磁畴晶体，无毒，大小均匀（20～100nm），每个细胞内有2～20颗。形状为平截八面体、平行六面体或六棱柱体等。其功能是导向作用，即借鞭毛游向对该菌最有利的泥、水界面微氧环境处生活。目前认为趋磁菌有一定的实用前景，包括生产磁性定向药物或抗体，以及制造生物传感器等。
（3）羧酶体(carboxysome)
又称羧化体，是存在于一些自养细菌细胞内的多角形或六角形内含物。其大小与噬菌体相仿，约10nm，内含1,5-二磷酸核酮糖羧化酶，在自养细菌的CO2固定中起着关键作用。在排硫硫杆菌 、那不勒斯硫杆菌 、贝日阿托氏菌属 、硝化细菌和一些蓝细菌中均可找到羧酶体。
（4）气泡（gas vocuoles）
是在许多光合营养型、无鞭毛运动的水生细菌中存在的充满气体的泡囊状内含物，大小为0.2～1.0μm×75nm，内由数排柱形小空泡组成，外有2nm厚的蛋白质膜包裹，其功能是调节细胞比重以使细胞漂浮在最适水层中获取光能、O2和营养物质。每个细胞含几个至几百个气泡。如鱼腥蓝细菌属 、顶孢蓝细菌属 、盐杆菌属 、暗网菌属 和红假单胞菌 的一些种中都有气泡。
3、核区（nuclear region or area）
又称核质体(nuclear body)、原核 、拟核(nucleoid)或核基因组(genome)。指原核生物所特有的无核膜结构、无固定形态的原始细胞核。用富尔根(Feulgen)染色法染色后，可见到呈紫色的形态不定的核区。它是一个大型环状双链DNA分子，只有少量蛋白质与之结合，长度一般为0.25～3.00mm，例如，大肠杆菌的核区DNA长约1.1～1.4mm，枯草芽孢杆菌的约为1.7mm，嗜血流感杆菌 约0.832mm。每个细胞所含的核区数与该细菌的生长速度有关，一般为1～4个。在快速生长的细菌中，核区DNA可占细胞总体积的20%。细菌的核区除在染色体复制的短时间内呈双倍体外，一般均为单倍体。核区是细菌负载遗传信息的主要物质基础。
4、特殊的休眠构造——芽孢
某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低、抗逆性极强的休眠体，称为芽孢（endospore或spore，偶译“内生孢子”）。每一营养细胞内仅生成一个芽孢。芽孢是整个生物界中抗逆性最强的生命体，在抗热、抗化学药物、抗辐射和抗静水压等方面，更是首屈一指。一般细菌的营养细胞不能经受70℃以上的高温，可是，它们的芽孢却有惊人的耐高温能力。例如，肉毒梭菌 的芽孢在100℃沸水中要经过5.0～9.5h才被杀死，至121℃时，平均也要10min才杀死：热解糖梭菌 的营养细胞在50℃下经数分钟即可杀死，但它的一群芽孢却须在132℃下经4.4min才能杀死其中的90%。芽孢的抗紫外线能力一般是其营养细胞的一倍。巨大芽孢杆菌芽孢的抗辐射能力要比大肠杆菌的营养细胞强36倍。芽孢的休眠能力更是突出。在其休眠期间，不能检查出任何代谢活力，因此称为隐生态（cryptobiosis）。一般的芽孢在普通的条件下可保持几年至几十年的生活力。但文献中还有许多更突出的记载，如：环状芽孢杆菌 的芽孢在植物标本上（英国）已保存200～300年；一种高温放线菌 的芽孢在建筑材料中（美国）已保存2000年；普通高温放线菌 的芽孢在湖底冻土中（美国）已保存7500年；一种芽孢杆菌(Bacillus sp) 的芽孢在琥珀内蜜蜂肠道中（美国）已保存2500万～4000万年。
（1）产芽孢细菌的种类
能产芽孢的细菌属不多，最主要的是属于革兰氏阳性杆菌的两个属——好氧性的芽孢杆菌属 和厌氧性的梭菌属 。球菌中只有芽孢八叠球菌属 产生芽孢。螺菌中的孢螺菌属 也产芽孢。此外，还发现少数其他杆菌可产生芽孢，如芽孢乳杆菌属 、脱硫肠状菌属 、考克斯氏体属(Coxiella)、鼠孢菌属 和高温放线菌属 等。芽孢的有无、形态、大小和着生位置是细菌分类和鉴定中的重要指标。
（2）芽孢的构造
从图3-13和以下的表解中就可以较清楚地了解芽孢的细致构造和主要功能。
图3-13 细菌芽孢构造模式图
皮层(cortex)在芽孢中占有很大体积（36%～60%），内含大量为芽孢皮层所特有的芽孢肽聚糖，其特点是呈纤维束状、交联度小、负电荷强、可被溶菌酶水解。此外，皮层中还含有占芽孢干重7%～10%的吡啶二羧酸钙盐（calcium picolinate, DPA-Ca），但不含磷壁酸。皮层的渗透压可高达20个大气压左右，含水量约70%，略低于营养细胞（约80%），但比芽孢整体的平均含水量（40%左右）高出许多。芽孢的核心（core）又称芽孢原生质体，由芽孢壁、芽孢质膜、芽孢质和核区四部分组成，它的含水量极低（10%～25%），因而特别有利于抗热、抗化学药物（如H2O2），并可避免酶的失活。除芽孢壁中不含磷壁酸以及芽孢质中含DPA-Ca外，核心中的其他成分与一般细胞相似。图3-14示芽孢特有的芽孢肽聚糖和吡啶-2,6-二羧酸钙盐的分子构造。
产芽孢的细菌当其细胞停止生长即环境中缺乏营养及有害代谢产物积累过多时，就开始形成芽孢。从形态上来看，芽孢形成可分七个阶段（图3-15）：
①DNA浓缩，束状染色质形成；
②细胞膜内陷，细胞发生不对称分裂，其中小体积部分即为前芽孢（forespore）；
③前芽孢的双层隔膜形成，这时芽孢的抗辐射性提高；
④在上述两层隔膜间充填芽孢肽聚糖后，合成DPA，累积钙离子，开始形成皮层，再经脱水，使折光率增高；
⑤芽孢衣合成结束；
⑥皮层合成完成，芽孢成熟，抗热性出现；
⑦芽孢囊裂解，芽孢游离外出。在枯草芽孢杆菌中，芽孢形成过程约需8h，其中参与的基因约有200个。在芽孢形成过程中，伴随着形态变化的还有一系列化学成分和生理功能的变化（见图3-16）。
图3-15 芽孢形成的七个阶段
（4）芽孢萌发(germination)
由休眠状态的芽孢变成营养状态细菌的过程，称为芽孢的萌发，它包括活化(activation)、出芽(germination)和生长(outgrowth)三个具体阶段。在人为条件下，活化作用可由短期热处理或用低pH、强氧化剂的处理而引起。例如，枯草芽孢杆菌的芽孢经7天休眠后，用60℃处理5min即可促进其发芽。当然也有要用100℃加热10min才能促使活化的芽孢。由于活化作用是可逆的，故处理后必须及时将芽孢接种到合适的培养基中去。有些化学物质可显著促进芽孢的萌发，称作萌发剂(germinants)，例如L-丙氨酸、Mn2+、表面活性剂(n-十二烷胺等)和葡萄糖等。相反，D-丙氨酸和重碳酸钠等则会抑制某些细菌芽孢的发芽。发芽的速度很快，一般仅需几分钟。这时，芽孢衣中富含半胱氨酸的蛋白质的三维空间结构发生可逆性变化，从而使芽孢的透性增加，随之促进与发芽有关的蛋白酶活动。接着，芽孢衣上的蛋白质逐步降解，外界阳离子不断进入皮层，于是皮层发生膨胀、溶解和消失。接着外界的水分不断进入芽孢的核心部位，使核心膨胀、各种酶类活化，并开始合成细胞壁。在发芽过程中，为芽孢所特有的耐热性、光密度和折射率等特性都逐步下降，DPA-Ca、氨基酸和多肽逐步释放，核心中含量较高的可防止DNA损伤的小酸溶性芽孢蛋白（SASPs, small acid-soluble spore proteins）迅速下降，接着就开始其生长阶段。这时，芽孢核心部分开始迅速合成新的DNA、RNA和蛋白质，于是出现了发芽并很快变成新的营养细胞。当芽孢发芽时，芽管可以从极向或侧向伸出，这时，它的细胞壁还是很薄甚至不完整的，因此，出现了很强的感受态（competence）——接受外来DNA而发生遗传转化的可能性增强了。 有关芽孢和营养细胞特点的比较可见表3-3。
（5）芽孢的耐热机制
关于芽孢耐热的本质至今尚无公认的解释。较新的是渗透调节皮层膨胀学说(osmoregulatory expanded cortex theory)，由于它综合了不少较新的研究成果，因此有一定的说服力。该学说认为，芽孢的耐热性在于芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差和皮层的离子强度很高，从而使皮层产生极高的渗透压去夺取芽孢核心的水分，其结果造成皮层的充分膨胀，而核心部分的细胞质却变得高度失水，因此，具极强的耐热性。从皮层成分来看，它含有大量交联度低（～6%）、负电荷强的芽孢肽聚糖，它与低价阳离子一起赋予皮层的高渗透压特性，从而使皮层的含水量增高，随之增大了体积（图3-17）。由此可知，芽孢整体的含水量少，并不说明其各层次的含水量是均一的，其中皮层与核心间含水量的差别是极其明显的。芽孢有生命部位——核心部位含水量的稀少（10%～25%），才是其耐热机制的关键所在。除皮层膨胀渗透调节学说外，还有别的学说来解释芽孢的高度耐热机制。例如，针对在芽孢形成过程中会合成大量的为营养细胞所没有的DPA-Ca，不少学者提出Ca2+与DPA的螯合作用会使芽孢中的生物大分子形成一种稳定而耐热性强的凝胶。总之，有关芽孢耐热机制是一个重要的有待进一步深入研究的基础理论问题。
（6）研究芽孢的意义
芽孢是少数几属真细菌所特有的形态构造，因此，它的存在和特点成了细菌分类、鉴定中的重要形态学指标。由于芽孢具有高度耐热性，所以用高温处理含菌试样，可轻而易举地提高芽孢产生菌的筛选效率。由于芽孢的代谢活动基本停止，因此其休眠期特长，这就为产芽孢菌的长期保藏带来了极大的方便。由于芽孢具有高度耐热性和其他抗逆性，因此，是否能消灭一些代表菌的芽孢就成了衡量各种消毒灭菌手段的最重要的指标。例如，若对肉类原料上的肉毒梭菌（Clostridium botulinum）灭菌不彻底，它就会在成品罐头中生长繁殖并产生极毒的肉毒毒素，危害人体健康。已知它的芽孢在pH＞7.0时在100℃下要煮沸5.0～9.5h才能杀灭，如提高到115℃下进行加压蒸汽灭菌，需10～40min才能杀灭，而在121℃下则仅需10min。这就要求食品加工厂在对肉类罐头进行灭菌时，应掌握在121℃下维持20min以上。另外，在外科器材灭菌中，常以有代表性的产芽孢菌——破伤风梭菌(C. tetani)和产气荚膜梭菌(C. perfringens)这两种严重致病菌的芽孢耐热性作为灭菌程度的依据，即要在121℃灭菌10min或115℃下灭菌30min才可。在实验室尤其在发酵工业中，灭菌要求更高。原因是在自然界经常会遇到耐热性最强的嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的污染，而一旦遭其污染，则经济损失和间接后果就十分严重。已知其芽孢在121℃下须维持12min才能杀死，由此就规定了工业培养基和发酵设备的灭菌至少要在121℃下保证维持15min以上。若用热空气进行干热灭菌，则芽孢的耐热性更高，因此，就规定干热灭菌的温度为150～160℃下维持1～2h。
（7）伴孢晶体（parasporal crystal）
少数芽孢杆菌，例如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)在其形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体——δ内毒素，称为伴孢晶体。它的干重可达芽孢囊重的30%左右，由18种氨基酸组成。由于伴孢晶体对200多种昆虫尤其是鳞翅目的幼虫有毒杀作用，因而可将这类产伴孢晶体的细菌制成有利于环境保护的生物农药——细菌杀虫剂。苏云金芽孢杆菌除产生上述毒素外，有的还会产生3种外毒素（α、β、γ）和其他杀虫毒素。
（8）细菌的其他休眠构造
细菌的休眠构造除上述的芽孢外，还有孢囊（cyst，由固氮菌产生）、粘液孢子（myxospore，由粘球菌产生）、蛭孢囊(bdellocyst，由蛭弧菌产生)和外生孢子(exospore,由嗜甲基细菌和红微菌产生)，等等。孢囊是固氮菌(Azotobacter)尤其是棕色固氮菌（A.vinelandii）等少数细菌在缺乏营养的条件下，由营养细胞的外壁加厚、细胞失水而形成的一种抗干旱但不抗热的圆形休眠体，一个营养细胞仅形成一个孢囊，因此与芽孢一样，也没有繁殖功能。孢囊在适宜的外界条件下，可发芽和重新进行营养生长。有关孢囊的特性及其与芽孢的比较可见表3-4。
三、细胞壁以外的构造
在某些原核生物的细胞壁外，会着生一些特殊的附属物，包括糖被、鞭毛、菌毛和性菌毛等。
1、糖被(glycocalyx)
包被于某些细菌细胞壁外的一层厚度不定的胶状物质，称为糖被。糖被的有无、厚薄除与菌种的遗传性相关外，还与环境（尤其是营养）条件密切相关。糖被按其有无固定层次、层次厚薄又可细分为荚膜（capsule或macrocapsule，大荚膜）、微荚膜(microcapsule)、粘液层(slime layer)和菌胶团(zoogloea)。
荚膜的含水量很高，经脱水和特殊染色后可在光学显微镜下看到。在一般实验室中，最方便的方法是用碳素墨水对产荚膜菌进行负染色（又称背景染色），就可在光学显微镜下清楚地观察到它的存在。糖被的主要成分是多糖、多肽或蛋白质，尤以多糖居多。少数细菌如黄色杆菌属(Xanthobacter)的菌种既具有α-聚谷氨酰胺荚膜，又有含大量多糖的粘液层。这种粘液层无法通过离心沉淀，有时甚至将培养容器倒置时，呈凝胶状的培养基仍不会流出。糖被主要成分及其代表菌表解如下：
荚膜的功能为：
①保护作用：其上大量极性基团可保护菌体免受干旱损伤；可防止噬菌体的吸附和裂解；一些动物致病菌的荚膜还可保护它们免受宿主白细胞的吞噬，例如，有荚膜的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)就更易引起人的肺炎；又如，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的荚膜既可使其粘附于人体呼吸道并定植，又可防止白细胞的吞噬；
②贮藏养料，以备营养缺乏时重新利用，如黄色杆菌的荚膜等；
③作为透性屏障或（和）离子交换系统，可保护细菌免受重金属离子的毒害；
④表面附着作用，例如引起龋齿的唾液链球菌 和变异链球菌就会分泌一种己糖基转移酶，使蔗糖转变成果聚糖，它可使细菌牢牢粘附于牙齿表面，由细菌发酵糖类产生的乳酸在局部累积后，可腐蚀牙表珐琅质层，引起龋齿；某些水生丝状细菌的鞘衣状荚膜也有附着作用；
⑤细菌间的信息识别作用，如根瘤菌属(Rhizobium)；
⑥堆积代谢废物。
细菌糖被与人类的科学研究和生产实践有密切的关系。糖被的有无及其性质的不同可用于菌种鉴定，例如某些难以观察到的微荚膜的致病菌，只要用极为灵敏的血清学反应即可鉴定。在制药工业和试剂工业中，人们可以从肠膜状明串珠菌的糖被中提取葡聚糖以制备“代血浆”或葡聚糖生化试剂(如 “Sephadex”)；利用野油菜黄单胞菌 的粘液层可提取十分有用的胞外多糖——黄原胶(xanthan或Xc，又称黄杆胶，结构见图3-18），它可用于石油开采中的钻井液添加剂，也可用于印染、食品等工业中；产生菌胶团的细菌在污水的微生物处理过程中具有分解、吸附和沉降有害物质的作用。当然，若不加防范，有些细菌的糖被也可对人类带来不利的影响。例如，肠膜状明串珠菌若污染制糖厂的糖汁，或是污染酒类、牛乳和面包，就会影响生产和降低产品质量；在工业发酵中，若发酵液被产糖被的细菌所污染，就会阻碍发酵过程的正常进行和影响产物的提取；某些致病菌的糖被会对该病的防治造成严重障碍；由几种链球菌荚膜引起的龋齿更是全球范围内严重危害人类健康的高发病，等等。
2、鞭毛(flagellum,复flagella)
生长在某些细菌体表的长丝状、波曲的蛋白质附属物，称为鞭毛，其数目为一至数十条，具有运动功能。
鞭毛的长度一般为15～20μm，直径为0.01～0.02μm。观察鞭毛最直接的方法用电子显微镜。用特殊的鞭毛染色法使染料沉积在鞭毛上，加粗后的鞭毛也可用光学显微镜观察。在暗视野中，对水浸片或悬滴标本中运动着的细菌，也可根据其运动方式判断它们是否具有鞭毛。在下述两情况下，单凭肉眼观察也可初步推断某细菌是否存在着鞭毛：
①在半固体（含0.3%～0.4%琼脂）直立柱中用穿刺法接种某一细菌，经培养后，若在穿刺线周围有呈混浊的扩散区，说明该菌具有运动能力，并可推测其长有鞭毛，反之，则无鞭毛；
②根据某菌在平板培养基上的菌落外形也可推断它有无鞭毛，一般地说，如果该菌长出的菌落形状大、薄且不规则，边缘极不圆整，说明该菌运动能力很强，反之，若菌落外形圆整、边缘光滑、厚度较大，则说明它是无鞭毛的细菌。
原核微生物（包括古生菌）鞭毛的构造由基体、钩形鞘和鞭毛丝三部分组成。革兰氏阳性细菌和阴性细菌在基体的构造上稍有区别。革兰氏阴性细菌的鞭毛最为典型，现以大肠杆菌的鞭毛为例。它的基体(basal body)由四个盘状物即环（ring）组成，最外层的L环连在细胞壁最外层的外膜上，接着是连在肽聚糖内壁层的P环，第三个是靠近周质空间的S环，它与第四个环即M环连在一起称S-M环或内环，共同嵌埋在细胞质膜上。S-M环被一对Mot蛋白包围，由它驱动S-M环快速旋转。在S-M环的基部还存在一个Fli蛋白，起着键钮的作用，它可根据细胞提供的信号令鞭毛进行正转或逆转。目前已清楚地知道，鞭毛基体实为一精致、超微型的马达，其能量来自细胞膜上的质子动势(proton motive potential)。据计算，鞭毛旋转一周约消耗1000个质子。把鞭毛基体与鞭毛丝连在一起的构造称钩形鞘或鞭毛钩(hook)，直径约17nm，其上着生一条长约15～20μm的鞭毛丝(filament)。鞭毛丝是由许多直径为4.5nm的鞭毛蛋白（flagellin）亚基沿着中央孔道（直径为20nm）螺旋状缠绕而成，每周为8～10个亚基。鞭毛蛋白是一种呈球状或卵圆状蛋白，分子量为3万～6万，它在细胞质内合成，由鞭毛基部通过中央孔道输送到鞭毛游离的顶部进行自装配。因此，鞭毛的生长方式是在其顶部延伸而非基部延伸。图3-19即为革兰氏阴性细菌鞭毛的构造模式图。
革兰氏阳性细菌的鞭毛结构较为简单。枯草芽孢杆菌鞭毛的基体仅有S和M两个环，而鞭毛丝和钩形鞘则与革兰氏阴性菌相同。
鞭毛的功能是运动，这是原核生物实现其趋性（taxis）即趋向性的最有效方式。 鞭毛菌的运动速度极快，例如螺菌鞭毛转速可达每秒40周（超过一般电动机的转速）。极生鞭毛菌的运动速度明显高于周生鞭毛菌。一般速度在每秒20～80μm范围，最高可达每秒100μm（每分钟达到3000倍体长），超过了陆上跑得最快的动物——猎豹的速度（每分钟1500倍体长或每小时110公里）。
在各类细菌中，弧菌、螺菌类普遍都有鞭毛；杆状细菌中，假单胞菌类都长有极生鞭毛，其他的有的着生周生鞭毛，有的没有；球菌中，仅个别的属例如动球菌属 的种才长鞭毛。鞭毛在细胞表面的着生方式多样，主要有单端鞭毛菌 、端生丛毛菌(lophotricha)、两端鞭毛菌 和周毛菌 等几种。
鞭毛的有无和着生方式在细菌的分类和鉴定工作中，是一项十分重要的形态学指标。
3、菌毛(fimbria，复数fimbriae)*
菌毛曾有多种译名（纤毛，纟散毛，伞毛，线毛或须毛等），是一种长在细菌体表的纤细、中空、短直、数量较多的蛋白质类附属物，具有使菌体附着于物体表面的功能。它的结构较鞭毛简单，无基粒等复杂构造。它着生于细胞膜上，穿过细胞壁后伸展于体表（全身或仅两端），直径3～10nm。由许多菌毛蛋白(pilin)亚基围绕中心作螺旋状排列，呈中空管状。每个细菌约有250～300条菌毛。有菌毛的细菌一般以革兰氏阴性致病菌居多，借助菌毛可把它们牢固地粘附于宿主的呼吸道、消化道、泌尿生殖道等的粘膜上，进一步定植和致病，有的种类还可使同种细胞相互粘连而形成浮在液体表面上的菌醭等群体结构。淋病的病原菌——淋病奈氏球菌 长有大量菌毛，它们可把菌体牢牢粘附在患者的泌尿生殖道的上皮细胞上，尿液无法冲掉它们，待其定植、生长后，就会引起严重的性病。
4、性毛(pili,单数pilus)
又称性菌毛(sex-pili或F-pili)，构造和成分与菌毛相同，但比菌毛长，数量仅一至少数几根。性毛一般见于革兰氏阴性细菌的雄性菌株（即供体菌）中，其功能是向雌性菌株（即受体菌）传递遗传物质。有的性毛还是RNA噬菌体的特异性吸附受体。
第二节 真核微生物
凡是细胞核具有核膜、能进行有丝分裂、细胞质中存在线粒体或同时存在叶绿体等细胞器的生物，称为真核生物(eukaryotes)。微生物中的真菌、显微藻类、原生动物以及地衣均属于真核生物。典型真核细胞的构造可见图3-20。由图可知，真核细胞与原核细胞相比，其形态更大、结构更为复杂、细胞器的功能更为专一。真核生物已发展出许多由膜包围着的细胞器(organelles)，如内质网、高尔基体、溶酶体、微体、线粒体和叶绿体等，更重要的是，它们已进化出有核膜包裹着的完整的细胞核，其中存在着构造极其精巧的染色体，它的双链DNA长链已与组蛋白和其他蛋白密切结合，以更完善地执行生物的遗传功能。真核生物与原核生物二者的差别列在表3-5中。
一、细胞壁
具有细胞壁的真核微生物主要是真菌（包括酵母菌和丝状真菌）和藻类。
1、真菌的细胞壁
真菌细胞壁的主要成分是多糖，另有少量的蛋白质和脂类。多糖构成了细胞壁中有形的微纤维与无定形基质(metrix)的物质基础。微纤维部分似建筑物中的钢筋，都是单糖的β(1→4)聚合物，可使细胞壁保持坚韧；基质似混凝土等充填物，包括甘露聚糖、β(1→3)、β(1→6)和α(1→3)葡聚糖以及少量蛋白质。许多研究发现，不同的真菌，其细胞壁所含多糖的种类也不同，在低等真菌中，以纤维素为主，酵母菌以葡聚糖为主，而发展至高等陆生真菌时，则以几丁质为主（表3-6）。
即使是同一种真菌，在其不同生长阶段中，细胞壁的成分也会出现明显的变化，且与其功能和进化历史相关，例如，鲁氏毛霉(Mucor roxianus)细胞壁的几丁质含量在孢囊孢子中仅2%，至酵母型阶段含8%，菌丝型阶段为9%，而在孢囊梗中则含18%。真核微生物细胞壁的功能与原核微生物类似，除具有固定外形外，还有保护细胞免受各种外界因子（渗透压、病原微生物等）损伤等功能。
（1）酵母菌的细胞壁
酵母菌细胞壁的厚度为25～70nm，重量约占细胞干重的25%，主要成分为葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质和几丁质（总共超过90%），另有少量脂质。它们在细胞壁上自外至内的分布次序是甘露聚糖、蛋白质、葡聚糖（图3-21）。葡聚糖(glucan)位于细胞壁的内层，是赋予酵母细胞机械强度的主要物质基础。它分两类，其一占含量的85%，分子量为240000，称β-(1→3)葡聚糖，呈长扭曲的链状；另一为含量较低、呈分枝的网状分子，是以β-(1→6)方式连接的葡聚糖。甘露聚糖(mannan)是甘露糖分子以α-(1→6)相连的分枝状聚合物，位于细胞壁外侧，呈网状，若把它去除后，细胞仍维持正常形态。蛋白质夹在葡聚糖和甘露聚糖中间，呈三明治状，它常与甘露聚糖作共价结合而形成一复合物。蛋白质含量一般仅甘露聚糖的1/10。它们除少数为结构蛋白外，多数是起催化作用的酶，如葡聚糖酶、甘露聚糖酶、蔗糖酶、碱性磷酯酶和酯酶等。几丁质(chitin)在酵母细胞壁中的含量很低，仅在其形成芽体时合成，然后分布于芽痕的周围。与真菌细胞壁密切相关的四种糖的结构见图3-22。
不同种、属酵母菌的细胞壁成分差异也很大，且并非各种酵母都含有甘露聚糖。例如，点滴酵母 和荚膜内孢霉 的细胞壁成分以葡聚糖为主，只含少量甘露聚糖；一些裂殖酵母 则仅含葡聚糖而不含甘露聚糖，取代甘露聚糖的是含有较多的几丁质。
（2）丝状真菌的细胞壁
以研究得较多的粗糙脉孢菌 为例，其最外层由β(1→3)和β(1→6)无定形葡聚糖组成（厚度为87nm）；接着是由糖蛋白组成的、嵌埋在蛋白质基质层中的粗糙网（厚49nm）；再下为蛋白质层（厚9nm）；最内层的壁由放射状排列的几丁质微纤维丝组成（厚18nm）。（图3-23）
（3）藻类的细胞壁
藻类细胞壁的厚度一般为10～20nm，也有更薄的，如蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidis)的壁仅为3～5nm。其结构骨架多由纤维素组成，它以微纤丝的方式成层状排列（占干重的50%～80%），其余为间质多糖。间质多糖主要是杂多糖，还含少量蛋白质和脂类。杂多糖的具体种类随种而异，例如：
①在褐藻中是褐藻酸(algnic acid)，它由D-甘露糖醛酸和L-葡萄糖醛酸聚合而成；
②在岩藻中是岩藻素(fucoidin)，它是硫酸酯化的L-岩藻糖的聚合物；
③在红藻——石花菜属(Gelidium)中是琼脂，它是半乳糖和半乳糖醛酸的聚合物，经提取后制成的产品，在微生物培养基的制造和食品工业等领域中有着广泛的用途；
④在小球藻中主要是半乳糖和鼠李糖通过β-糖苷键连接的多聚体；等等。
二、鞭毛与纤毛
在有些真核微生物细胞的表面长有或长或短的毛发状细胞器，具有运动功能，较长者（150～200μm）称鞭毛，较短者(5～10μm)，则称纤毛(cilia，单cilium)。真核生物的鞭毛与原核生物鞭毛在运动功能上虽相同，但在构造、运动机理和所耗能源形式等方面都有显著的差别。
具有鞭毛的真核微生物有鞭毛纲 的原生动物以及藻类和低等水生真菌的游动孢子或配子等。具有纤毛的真核微生物主要是属于纤毛纲 的各种原生动物，例如常见的草履虫 等。
鞭毛与纤毛的构造基本相同，都由伸出细胞外的鞭杆（shaft）、嵌埋在细胞质膜上的基体(basal body)以及把这两者相连的过渡区共三部分组成。鞭杆的横切面呈“9+2”型，即中心有一对包在中央鞘中的相互平行的中央微管，其外围绕一圈（9个）微管二联体(doublets)，整个鞭杆由细胞质膜包裹。每条微管二联体由A、B两条中空的亚纤维组成，其中A亚纤维是一完全微管，即每圈由13个球形微管蛋白(tubulin)亚基环绕而成，而B亚纤维则是由10个亚基围成，所缺3个亚基与A亚纤维共用。A亚纤维上伸出内外两条动力蛋白臂(dynein arms)，这是一种能被Ca2+和Mg2+激活的ATP酶，可水解ATP以释放供鞭毛运动的能量。通过动力蛋白臂与相邻的微管二联体的作用，可使鞭毛作弯曲运动。在相邻的微管二联体间有微管连丝蛋白（nexin）使之相连。此外，在每条微管二联体上还有伸向中央微管的放射辐条(radial spoke)，其端部呈游离状态。（图3-24）基体的结构与鞭杆接近。直径约120～170nm，长约200～500nm。但在电镜下其横切面呈“9+0”型，且其外围是9个三联体，中央没有微管和鞘。
三、细胞质膜
真核生物的细胞都有细胞质膜的构造。对没有细胞壁的真核细胞来说，细胞质膜就是它的外部屏障。真核细胞与原核细胞在其质膜的构造和功能上十分相似，两者的主要差别用如表3-7。 ?
四、细胞核
细胞核(nucleus)是细胞内遗传信息（DNA）的储存、复制和转录的主要场所，外形为球状或椭圆体状。一切真核生物都有形态完整、有核膜包裹的细胞核，它对细胞的生长、发育、繁殖和遗传、变异等起着决定性的作用。每个细胞通常只含一个核，有的含两至多个，例如须霉属(Phycomyces)和青霉属(Penicillium)的真菌，有时每个细胞内竟含20～30个核，占了细胞总体积的20%～25%，而在真菌的菌丝顶端细胞中，常常找不到细胞核。真核生物的细胞核由核被膜、染色质、核仁和核基质等构成。
1、核被膜(nuclear envelope)
是包在细胞核外、由核膜和核纤层(nuclear lamina)两部分所组成的外被，其上有许多核孔。其中的核膜由两层厚度约7～8nm的膜组成，两膜间夹着宽约10～50nm的空间，称核周间隙(perinuclear space)。核纤层位于核膜内侧，成分为核纤层蛋白(lamin)，厚度随细胞种类而异。核孔(nuclear pores)的数目很多，是细胞核与细胞质间进行物质交流的选择性通道。
2、染色质(chromatin)
当细胞处于分裂间期时，细胞内由DNA、组蛋白、其他蛋白和少量RNA组成的一种线形复合构造，其基本单位是核小体(nucleosomes)。因可被苏木精等碱性染料染色，故名染色质。在光学显微镜下观察染色后的染色质，可发现一种由或粗或细的长丝交织成的网状物，称为常染色质(euchromatin)，另外还可见到由常染色质紧缩而成的较粗大、染色较深、常附着在核被膜内侧的团块，称为异染色质(heterochromatin)。染色质中的蛋白质有组蛋白和非组蛋白两类。组蛋白富含碱性氨基酸，如赖氨酸和精氨酸，故是碱性蛋白质，易与带负电荷（磷酸基团）的DNA相结合。在染色质中，组蛋白与DNA的含量大致相等。已知构成核小体核心结构的组蛋白八聚体是由 H2A、H2B、H3、H4分子各一对所组成，在八聚体外有以左手方向盘绕两周（约200bp）的DNA，另有一个组蛋白分子H1与连接DNA（linker DNA）结合，锁住了核小体的进出口，以稳定它的结构。染色质中的非组蛋白部分包括一些与DNA的复制和转录有关的酶，如DNA聚合酶和RNA聚合酶等。有关核小体的构造及其上的DNA盘绕方式见图3-25。
3、核仁(nucleolus)
指细胞核中一个没有膜包裹的圆形或椭圆形小体。是细胞核中染色最深的部分，它依附于染色体的一定位置上，在细胞有丝分裂前期消失，后期又重新出现。每个核内有一至数个。富含蛋白质和RNA。其大小随细胞中蛋白质合成的强弱而相应变化。是真核细胞中合成rRNA（核糖体RNA）和装配核糖体的部位。
4、核基质(nuclear matrix)
旧称“核液”(nuclear sap)，是充满于细胞核空间由蛋白纤维组成的网状结构，具有支撑细胞核和提供染色质附着点的功能。
五、细胞质和细胞器
位于细胞质膜和细胞核间的透明、粘稠、不断流动并充满各种细胞器的溶胶，称为细胞质(cytoplasm)。组成真核生物细胞质的有细胞基质、细胞骨架和各种细胞器。
1、细胞基质和细胞骨架
在真核细胞质中，除可分辨的细胞器以外的胶体状溶液，称细胞基质(cytoplasmic matrix或cytometrix)或细胞溶胶（cytosol），它含有赋予其一定机械强度的细胞骨架和丰富的酶等蛋白质（占细胞总蛋白的25%～50%）、各种内含物以及中间代谢物等，故是细胞代谢活动的重要基地。
细胞骨架(cytoskeleton)是由微管、肌动蛋白丝和中间丝三种蛋白质纤维构成的细胞支架。其中的微管(microtubules)是直径为24nm的中空管状纤维，其成分是微管蛋白(tubulin)。它含有α和β两个十分相同的亚基，这种双体分子按螺旋方式盘绕成只有一层分子的微管壁。微管可分散或成束存在于细胞基质中，具有支持功能，有的还有运输功能。此外，还可构成细胞分裂时的纺锤体以及鞭毛和纤毛。肌动蛋白丝(actin filament)又称微丝，是一种宽约4～7nm、由肌动蛋白(actin)组成的实心纤维。其单体呈哑铃状，许多单体连成长串，两长串以右手螺旋方式缠绕成束后即为肌动蛋白丝，若对它提供ATP形式的能量，就能发生收缩。中间丝即中间纤维(intermediate filament)，是一种直径为8～10nm（介于微管与肌动蛋白丝之间）的蛋白纤维，具有支持和运动功能。
2、内质网和核糖体
内质网(endoplasmic reticulum)指细胞质中一个与细胞基质相隔离、但彼此相通的囊腔和细管系统，由脂质双分子层围成。其内侧与核被膜的外膜相通，核周间隙也是内质网腔的一部分。内质网分两类，它们间相互连通，其中之一是在膜上附有核糖体颗粒，称糙面内质网(rough ER)，具有合成和运送胞外分泌蛋白的功能；另一类为膜上不含核糖体的光面内质网(smooth ER)，它与脂类代谢和钙代谢等密切相关，主要存在于某些动物细胞中。
核糖体(ribosomes)又称核蛋白体，是存在于一切细胞中的无膜包裹的颗粒状细胞器，具有蛋白质合成功能。直径25nm，主要成分是蛋白质(约40%)和RNA（约60%），两者共价结合在一起。蛋白质分子分布在核糖体表面，RNA位于内层。每个细胞含大量核糖体，例如在一个生长旺盛的真核细胞——Hela细胞（人工培养的宫颈癌细胞）中，就含106～107个核糖体，连最简单的原核生物——枝原体细胞中也含有数百个核糖体。真核细胞的核糖体较原核细胞的大，其沉降系数为80S，它由60S和40S的两个小亚基组成。不同的真核生物，其核糖体的大小有10%左右的变化幅度。酵母菌是一典型的真核微生物，其核糖体的60S大亚基由28S、5.8S和5S三种rRNA和约40±5种r蛋白质（核糖体蛋白质）组成，而其小亚基则由一个18SrRNA和约30±5种r蛋白质组成。核糖体除分布在内质网和细胞基质中外，还分布于线粒体和叶绿体中，但它们都是与原核生物相同的70S核糖体。有关真核生物核糖体的细节及其与原核生物的比较，可见表3-8。
3、高尔基体(Golgi apparatus, Golgi body)
又称高尔基复合体(Golgi complex)，由意大利学者高尔基(C.Golgi)于1898年首先在神经细胞中发现，故名。这是一种由若干（一般4～8个）平行堆叠的扁平膜囊(saccules)和大小不等的囊泡所组成的膜聚合体，其上无核糖体颗粒附着。由糙面内质网合成的蛋白质输送到高尔基体中浓缩，并与其中合成的糖类或脂类结合，形成糖蛋白和脂蛋白的分泌泡，再通过外排作用而分泌到细胞外。因此，高尔基体是合成、分泌糖蛋白和脂蛋白以及对某些无生物活性的蛋白质原(proprotein)如胰岛素原、胰高血糖素原和血清白蛋白原等进行酶切加工的重要细胞器，也是对合成新细胞壁和质膜提供原材料的重要细胞器。总之，高尔基体是协调细胞生化功能和沟通细胞内外环境的一个重要细胞器，通过它的参与和对“膜流”的调控，就把细胞核被膜、内质网、高尔基体和分泌泡囊的功能联成了一体。在真菌中，目前发现高尔基体者仅限于根肿菌、前毛壶菌、卵菌和腐霉等少数低等真菌中。
4、溶酶体(lysosome)
是一种由单层膜包裹、内含多种酸性水解酶的囊泡状细胞器，其主要功能是细胞内的消化作用。动物、真菌和一些植物细胞中都存在着溶酶体。其中常含40种以上的酸性水解酶，它们的最适pH在5左右，因此只在溶酶体内部发挥作用。它可以水解外来蛋白质、多糖、脂类以及DNA和RNA等大分子。不同生物或是同一生物细胞内的溶酶体，其数目、大小和所含酶类变化很大，在不同生理条件下也有不同。一般为球形，直径约0.2～0.5μm。溶酶体的功能是进行细胞内消化，它与吞噬泡或胞饮泡结合后，可消化其中的颗粒状或水溶性有机物，也可消化自身细胞产生的碎渣。因而具有维持细胞营养及防止外来微生物或异体物质侵袭的作用。溶酶体的种类很多，根据其所结合对象的性质可分吞噬溶酶体（与吞噬泡结合）、多泡体（与胞饮泡结合）或自噬溶酶体（与内源性结构结合）等；根据溶酶体与吞噬泡结合程度又可分为初级溶酶体、次级溶酶体和后溶酶体等。当细胞坏死时，溶酶体膜破裂，其中的酶会导致细胞自溶(autolysis)。
5、微体(microbody)
是单层膜包裹的、与溶酶体相似的球形细胞器，内中所含的酶与溶酶体不同。分两种，其一称过氧化物酶体(peroxisome)，是一种由单层膜包裹的含一种或几种氧化酶类的细胞器。其中主要有两种酶，一是依赖于黄素（FAD）的氧化酶，另一是过氧化氢酶，它们共同作用可使细胞免受H2O2的毒害。在动、植物和真核微生物细胞中，普遍存在着过氧化物酶体。细胞中约有20%脂肪酸是在过氧化物酶体中被氧化分解的。与溶酶体相似，在不同生物、不同个体和不同的内外条件下，过氧化物酶体的数目、形态、大小和功能有所不同。例如，在糖液中生长的酵母菌，其过氧化物酶体很小，在甲醇溶液中较大，而当其生长在脂肪酸培养基中时，则它非常发达，并可迅速把脂肪酸分解成可供细胞很好利用的乙酰辅酶A。另一种微体称乙醛酸循环体(glyoxisome)，主要存在于植物细胞中，其功能是使细胞中的脂类转化为糖类，因此在种子萌发形成幼苗时特别活跃。
6、线粒体(mitochondria)
线粒体是一种进行氧化磷酸化反应的重要细胞器，其功能是把蕴藏在有机物中的化学潜能转化成生命活动所需能量（ATP），故是一切真核细胞的“动力车间”。在光学显微镜下，典型线粒体的外形和大小酷似一个杆菌，一般其直径为0.5～1.0μm，长度约1.5～3.0μm。不同细胞种类或在不同生理状态下，其形态和长度变化很大。每个细胞所含线粒体数量一般为数百至数千个，变化也很大，例如，有的鞭毛虫只有一个线粒体，而巨大变形虫则有50万个线粒体。
线粒体的构造较为复杂，外形囊状，由内外两层膜包裹，囊内充满液态的基质(matrix)。外膜平整，内膜则向基质内伸展，从而形成了大量由双层内膜构成的嵴(cristae)（见图3-26）。在真菌中，嵴的形状有两种，其一是与高等植物和藻类的线粒体相似的管状嵴，为含纤维质细胞壁和无壁的卵菌、前毛壶菌和粘菌等所具有；另一类为板状嵴，为一些具有几丁质细胞壁的壶菌、接合菌、子囊菌和担子菌等较高等的真菌所具有。嵴的存在，极大地扩展了内膜进行生物化学反应的面积。
在内膜的表面上着生有许多基粒(elementory particle)或F1颗粒，即ATP合成酶复合体，每个线粒体中约有104～105个（详见第五章图5-13）。
线粒体的功能是将底物通过电子传递链和氧化磷酸化反应的偶联而实现呼吸产能。在酵母菌的实验中，过去曾因电镜制片技术的缺陷而认为它在无氧条件下进行发酵时是没有线粒体的，后来采用冰冻刻蚀技术（freeze-etching）后发现，在无氧条件下，酵母菌形成的是只有外膜而无内膜和嵴的极其简单的线粒体，当把它转移到有氧条件下进行呼吸产能时，不是从无到有，而是从无功能的简单结构转变成有正常结构和功能的线粒体。
7、叶绿体（chloroplast）
一种由双层膜包裹、能转化光能为化学能的绿色颗粒状细胞器，只存在于绿色植物（包括藻类）的细胞中。具有进行光合作用即把CO2和H2O合成葡萄糖并放出O2的重要功能，可以说，叶绿体是真核细胞内的“食品车间”。叶绿体的外形多为扁平的圆形或椭圆形，略呈凸透镜状，但在藻类中叶绿体的形态变化很大，有的呈螺旋带状，如水绵属（Spirogyra），有的呈杯状，如衣藻属（Chlamydomonas），也有呈板状或星状的。叶绿体的平均直径约4～6μm，厚度约2～3μm。在高等植物的每个叶肉细胞中约含50～200个，而藻类中通常只有一个、两个或少数几个。叶绿体在细胞中的分布与光照有关，有光时，常分布在细胞的外围，黑暗时则流向内部。
叶绿体的构造由叶绿体膜（chloroplast membrane,或称外被outerenvelope）、类囊体（thylakoid）和基质（stroma）三部分组成，其膜又分外膜、内膜和类囊体膜三种，并由此使叶绿体内的空间分隔为膜间隙（在外膜与内膜间）、基质和类囊体腔三种彼此独立的区域（图3-27）。
叶绿体膜是控制代谢物质进出叶绿体的屏障。外膜的特点是通透性大，内膜是选择性强。基质是一种充满在叶绿体膜与类囊体之间的胶状物质，内含核糖体（70S）、双链环状DNA以及RNA、淀粉粒和核酮糖二磷酸羧化酶等蛋白质。
叶绿体的主要功能是进行光合作用。在组成光合作用光反应和暗反应的两个反应中，前者是在类囊体膜上进行的，由它完成吸收、传递和转换光能为化学能，即形成ATP、NADPH并释放O2，而后一反应则在叶绿体的基质中进行，它不需要光照，作用是利用光反应中产生的ATP和NADPH的化学能来固定CO2，使CO2还原成糖等有机物。
8、其他细胞器
（1）液泡（vacuole）
存在于真菌和藻类等植物细胞中的一种由单位膜分隔的细胞器，其形态、大小受细胞年龄和生理状态而变化，一般老龄细胞有大而明显的液泡。在真菌的液泡中，主要含有糖原、脂肪、多磷酸盐等贮藏物，精氨酸、鸟氨酸和谷氨酰胺等碱性氨基酸，以及蛋白酶、酸性和碱性磷酸酯酶、纤维素酶和核酸酶等各种酶类。液泡不仅有维持细胞渗透压、贮存营养物等功能，而且还有溶酶体的功能，因为它可以把蛋白酶等水解酶与细胞质隔离，防止细胞损伤。
（2）膜边体（lomasome）
又称边缘体、须边体或质膜外泡，为许多真菌细胞所特有。是一种位于菌丝细胞四周的质膜与细胞壁间、由单层膜包裹的细胞器。形态呈管状、囊状、球状、卵圆状或多层折叠膜状，其内含有泡状物或颗粒状物。膜边体可由高尔基体或内质网的特定部位形成，各个膜边体能互相结合，也可与别的细胞器或膜相结合。功能不甚清楚，可能与分泌水解酶或合成细胞壁有关。
（3）几丁质酶体（chitosome）
又称壳体。一种活跃于各种真菌菌丝顶端细胞中的微小泡囊，直径40～70nm，内含几丁质合成酶。在离体条件下，几丁质酶体可把UDP-N-乙酰葡糖胺合成几丁质微纤维。其功能是通过不断形成和向菌丝尖端移动，而把其中的几丁质合成酶源源不断地运送到细胞壁表面，通过该处几丁质微纤维的合成而使菌丝尖端不断向前延伸。
（4）氢化酶体（hydrogenosome）
一种由单层膜包裹的球状细胞器，内含氢化酶、氧化还原酶、铁氧还蛋白和丙酮酸。通常存在于鞭毛基体附近，可为其运动提供能量。氢化酶体只存在于厌氧性的真菌和原生动物细胞中，有类似线粒体的作用。近年来，在牛、羊等反刍动物的瘤胃中除发现存在许多厌氧性原生动物外，还发现了20余种厌氧性真菌，它们的分类地位接近壶菌属，多数产生游动孢子，例如Neocallimastix huricyensis等，在这类厌氧性真核生物的细胞中都有氢化酶体。又如，在原生动物毛滴虫属（Trichomonas）的氢化酶体中，含有各种铁硫蛋白和黄素蛋白，用作使丙酮酸氧化为乙酸、CO2和H2过程中的电子传递链组分（其最终电子受体为质子）。从阴道毛滴虫（T. vaginalis）中分离到的氢化酶体，可在厌氧条件下还原甲硝基羟乙唑（“灭滴灵”），并产生对细胞有毒的衍生物。在活体内，这一还原产物可损伤氢化酶体或其他靶体，因此，“灭滴灵”可治疗阴道滴虫病。
小 结
1、原核生物的细胞直径细小，共同特点是细胞核的结构原始、无核膜包裹，细胞壁含独特的肽聚糖，细胞内无细胞器的分化。通过革兰氏染色法不但可把所有的原核生物分成革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两个大类，而且还可揭示它们间在结构 、功能、生理、遗传和生态特性等方面的显著差别。
2、原核生物细胞的共同结构有细胞壁（枝原体例外）、细胞质膜、细胞质、核区和各种内含物等，部分种类的细胞壁外还具有糖被（荚膜或粘液层）、鞭毛、菌毛和性菌毛等特殊构造，少数细菌还可形成芽孢或孢囊等具有抵御不良环境条件功能的休眠构造，其中的芽孢高度耐热。
3、真核微生物细胞的直径较粗大，其特点为细胞核有核膜包裹，染色质由DNA和组蛋白构成，细胞以有丝分裂或减数分裂方式繁殖，细胞内有多种功能专一的细胞器的分化。细胞膜、细胞质、细胞核和细胞器为各种真核细胞所共有，而细胞壁则仅为真菌和藻类所有，此外在许多种类的细胞（包括性细胞）外还长有与原核生物截然不同的“9+2型”结构的运动细胞器——鞭毛或纤毛。
4、由细胞骨架等物质组成的细胞间质支撑着真核生物的细胞质，其内包含着各种执行重要生理功能的细胞器，例如内质网、高尔基体、溶酶体、微体、线粒体和叶绿体（仅存于光合生物中）等，其中的线粒体和叶绿体在结构和功能（能量转化和产生）上有着许多相似处，加之在它们的基质中都含有独特的环状DNA和部分蛋白质的合成机构，故属半自主性细胞器，这些均为真核生物起源于原核生物的内共生假说提供了有力的证据。
思 考 题
1、什么是缺壁细菌？试简述四类缺壁细菌的形成、特点和实践意义。
2、渗透调节皮层膨胀学说是如何解释芽孢耐热机制的？
3、试理顺染色质、DNA、组蛋白、核小体、螺线管、超螺旋环和染色体之间的关系。
4、试比较线粒体与叶绿体的结构和功能。
第四章 微生物的营养
计划学时：2
重点：微生物的营养物质及其功能，培养基的配制原则，各种培养基的定义及适用范围。
微生物的营养 (nutrition) 是微生物生理学的重要研究领域，阐明营养物质在微生物生命活动过程中的生理功能以及微生物细胞从外界环境摄取营养物质的具体机制是微生物营养的主要研究内容。为了生存，微生物必须从环境吸收营养物质，通过新陈代谢将这些营养物质转化成自身新的细胞物质或代谢物，并从中获取生命活动必需的能量，同时将代谢活动产生的废物排除体外。那些能够满足微生物机体生长、繁殖和完成各种生理活动所需的物质称为营养物质 (nutrient), 而微生物获得和利用营养物质的过程称为营养。营养物质是微生物生存的物质基础，而营养是微生物维持和延续其生命形式的一种生理过程。
第一节 微生物的营养要求
一、 微生物细胞的化学组成
1． 化学元素(chemical element)
构成微生物细胞的物质基础是各种化学元素。根据微生物生长时对各类化学元素需要量的大小，可将它们分为主要元素(macroelement)和微量元素(trace element)，主要元素包括碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、镁、钙、铁等，碳、氢、氧、氮、磷、硫这六种主要元素可占细菌细胞干重的97%（表4-1）。微量元素包括锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等。
组成微生物细胞的各类化学元素的比例常因微生物种类的不同而不同，例如细菌、酵母菌和真菌的碳、氢、氧、氮、磷、硫六种元素的含量就有差别（表4-1），而硫细菌(sulfur bacteria)、铁细菌(iron bacteria)和海洋细菌(marine bacteria)相对于其他细菌则含有较多的硫、铁和钠、氯等元素, 硅藻(Diatom)需要硅酸来构建富含(SiO2)n的细胞壁。不仅如此，微生物细胞的化学元素组成也常随菌龄及培养条件的不同而在一定范围内发生变化，幼龄的或在氮源(source of nitrogen)丰富的培养基(medium)上生长的细胞与老龄的或在氮源相对贫乏的培养基上生长的细胞相比，前者含氮量高，后者含氮量低。
2． 化学成分及其分析
各种化学元素主要以有机物、无机物和水的形式存在于细胞中。有机物主要包括蛋白质、糖、脂、核酸、维生素以及它们的降解产物和一些代谢产物等物质。细胞有机物成分的分析通常采取两种方式：一是用化学方法直接抽提细胞内的各种有机成分，然后加以定性和定量分析；另一种是先将细胞破碎，然后获得不同的亚显微结构，再分析这些结构的化学成分。无机物是指与有机物相结合或单独存在于细胞中的无机盐(inorganic salt)等物质。分析细胞无机成分时一般将干细胞在高温炉（550℃）中焚烧成灰，所得到的灰份物质是各种无机元素的氧化物，称为灰份(ash constituent)。采用无机化学常规分析法可定性定量分析出灰份中各种无机元素的含量。
水是细胞维持正常生命活动所必不可少的，一般可占细胞重量的70~90%。细胞湿重(wet weight)与干重(dry weight)之差为细胞含水量，常以百分率表示：湿重-干重/湿重×100% 。将细胞外表面所吸附的水份除去后称量所得重量即为湿重，一般以单位培养液中所含细胞重量表示（克/升或毫克/毫升），但在具体测量过程中，常由于细胞表面吸附水份除去程度的不同而导致测量结果有误差，聚集在一起的单细胞微生物表面吸附的水份难以除去，这些吸附的水份可占湿重的10% 。采用高温（105℃）烘干、低温真空干燥和红外线快速烘干等方法将细胞干燥至恒重即为干重。值得注意的是,采用高温烘干法会导致细胞物质分解，而利用后两种方法所得结果较为可靠。
二、营养物质及其生理功能
微生物同其它生物一样，需要不断地从它的外部环境中吸收所需要的各种物质,来合成本身的细胞物质和提供机体进行各种生理活动所需的能量，使机体能进行正常的生长与繁殖，才能保证生命能够维持与延续下去，保持生命的连续性。那些能够满足机体生长、繁殖和完成各种生理活动所需要的物质通常称为营养物质(nutrient)。这些营养物质在机体中的作用可以概括为参与细胞组成、构成酶的活性成分与物质运输系统和提供机体进行各种生理活动所需要的能量。微生物获得与利用营养物质的过程通常称为营养（nutrition）。营养物质是机体进行各种生理活动的物质基础。
根据微生物细胞化学成分分析，微生物细胞与其他高等动植物一样，也是由碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、钠、镁、钙、铁、锰、铜、钴、锌、钼等化学元素组成。其中碳、氢、氧、氮、磷、硫六种元素占细胞干重的97﹪（表6-1）。微生物细胞中的这些元素主要以水、有机物和无机盐的形式存在于细胞中。有机物主要是由蛋白质、糖、脂、核酸、维生素以及它们的降解产物与一些代谢产物等物质组成；无机物则是参与有机物组成或单独存在于细胞原生质内的无机盐等灰分物质中；水是细胞中的一种主要成分，一般可占细胞鲜重的90﹪以上。微生物细胞的化学组成并不是绝对不变的，它往往因微生物种类、培养条件、菌龄不同而在一定程度的范围内发生变化。
组成微生物细胞的化学元素分别来自微生物生存所需要的营养物质，即微生物生长所需的营养物质应该包含有组成细胞的各种化学元素。这些物质概括为提供构成细胞物质的碳素来源的碳源物质，构成细胞物质中氮素来源的氮源物质，和一些含有磷、镁、硫、钾、钠、钙、铁、锰、铜、钴、锌、钼等化学元素的无机盐。除有某些特殊需要的微生物外，只要提供碳源、氮源和无机盐，就可以满足一般微生物的正常生长与繁殖。
微生物生长所需要的元素主要是由相应的有机物与无机物的形式提供的，小部分可以由分子态的气体物质提供。营养物质按照它们在机体中的生理作用不同，可将它们区分成碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子、和水六大类。
碳源
凡是可以被微生物用来构成细胞物质或代谢产物中碳素来源的物质通称碳源(carbon source)。碳源通过机体内一系列复杂的化学变化被用来构成细胞物质和（或）为机体提供完成整个生理活动所需要的能量。因此，碳源通常也是机体生长的能源。能作为微生物生长的碳源的种类极其广泛，既有简单的无机含碳化合物CO2和碳酸盐等，也有复杂的天然的有机含碳化合物，它们是糖和糖的衍生物、脂类、醇类、有机酸、烃类、芳香族化合物以及各种含碳的化合物（表6-2）。但是微生物不同，利用这些含碳化合物的能力也不相同。有的微生物能广泛利用各种不同类型的含碳物质，如假单胞菌属中的某些种可利用90种以上的不同类型的碳源；有的微生物利用碳源物质的能力有限，只能利用少数几种碳源进行生长，例如某些甲基营养型细菌只能利用甲醇或甲烷等含碳化合物进行生长。在这些碳源物质中糖类物质是一般微生物最容易利用的良好碳源物质与能源物质。另外有些有毒的含碳物质如氰化物、酚等也能被某些细菌分解与利用，因而可以利用这类细菌来处理它们，以消除这些物质的毒害作用。
有一部分微生物能利用CO2作为生长的唯一碳源或主要碳源，它们将CO2逐步转化成菌体物质或代谢产物。由于CO2是一种被彻底氧化的含碳物质，将它转变成菌体物质或代谢产物的过程中所需要的能量或由光能转变而来，或从无机物氧化过程中获得，可以看出这类微生物生长所需要的碳源与能源分别来自不同类型的物质。
目前在微生物工业发酵中用于微生物生长的碳源主要是糖类物质，即单糖、饴糖、淀粉（玉米粉、山芋粉、野生植物淀粉等）、麸皮、各种米糠等，为了解决工业发酵用粮与人们日常食用粮、动物饲料用粮的矛盾，广泛开展了以纤维素、石油、CO2和H2等作为碳源与能源来培养微生物的代粮发酵的科学研究。目前已能利用石油或石油产品作为碳源来生产氨基酸、维生素、辅酶、有机酸、核苷酸、抗生素与酶制剂等各种有用产品。
(2)氮源
氮也是细胞中的一种主要组成元素，它来自环境中的含氮物质或分子氮。凡是能被微生物用来构成细胞物质中或代谢产物中氮素来源的营养物质通常称为氮源(nitrogen source)。这类物质主要是用来作为合成细胞物质中含氮物质的原料，一般不用作能源，只有少数自养细菌能利用铵盐、硝酸盐作为机体生长的氮源与能源，某些厌氧细菌在无养与糖类物质缺乏的条件下，也可以利用氮源氨基酸作为生长的能源物质。能够被微生物用作氮源的物质有蛋白质或它们不同程度的降解产物（如胨、肽、氨基酸等）、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐、以及分子态氮等（表6-3）。
在实验室或生产上常用的氮源有碳酸铵、硝酸盐、硫酸铵、尿素、氨等。许多腐生型细菌、肠道菌、动植物致病菌一般都能利用铵盐或硝酸盐作为氮源。例如大肠杆菌、产气杆菌、枯草杆菌、铜绿假单胞菌等都可以利用硫酸铵、硝酸铵作为氮源，放线菌可以利用硝酸钾作为氮源，霉菌可以利用硝酸钠作为氮源等。
在实验室里常用的有机氮源有牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、鱼粉、蚕蛹粉、黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆等。许多腐败细菌、寄生性细菌、霉菌、酵母菌等可以利用的氮源有蛋白质或蛋白质的降解产物。对于许多微生物来说，通常可以利用无机含氮化合物作为氮源，也可以利用有机含氮化合物作为氮源。例如土霉素产生菌在生长过程中既可以硫酸铵，也可以利用玉米浆、黄豆饼粉、花生饼粉作为氮源，而且它们利用硫酸铵与玉米浆的速度比利用黄豆饼粉与花生饼粉的速度快。这是因为硫酸铵中的氮以还原态氮的形式存在，可以直接被菌体吸收与利用，玉米浆中的氮主要是以蛋白质的降解产物和以蛋白质中的有机氮形式存在。而降解产物特别是氨基酸又直接可以通过转氨作用等方式被机体利用；在黄豆饼粉、花生饼粉里所含的氮则主要是以蛋白质的形式存在，这种蛋白质必须通过水解之后才能被机体利用。在土霉素发酵中硫酸铵与玉米浆通常是以速效氮源的形式加以利用，黄豆饼粉与花生饼粉则是以迟效氮源的类型进行利用。速效氮源通常是有利于机体的生长，迟效氮源有利于代谢产物的形成。在工业发酵过程中，往往是将速效氮源与迟效氮源按一定的比例制成混合氮源加到培养基里，以控制微生物的生长时期与代谢产物形成期的长短，达到提高产量的目的。固氮微生物在培养基里缺乏化合态氮源的条件下，可以利用分子态的氮气作为氮源进行生长。这类微生物有营非共生生活的好氧型自生固氮菌、兼性厌氧型的克氏肺炎杆菌和厌氧型的巴氏固氮梭菌等不同类型的机体，也有营共生生活的固氮菌，如与植物共生的根瘤菌等。这些固氮菌中有一些同时是光合细菌，例如某些蓝细菌既能进行光合作用又能行固氮作用。固氮菌在含有化合态氮的培养基里生长时就失去了固氮能力，而直接利用化合态氮源进行生长，它们只有在培养基里缺乏化合态氮时，才还原大气中的分子态氮，利用它们进行生长。
（3）能源
能为微生物生命活动提供能量来源的营养物或辐射能称为能源（energy source）。由于各种异养型微生物的能源就是碳源，因此微生物的能源比较简单，根据来源不同可以把能源分为两类：
一是化学物质，化能有机异养型微生物的能源为有机物，与它们的碳源相同。化能无机自养型微生物的能源为无机物，与它们的能源物质不同。二是辐射能，是光能自养型和光能异养型微生物的能源。
化能无机自养型微生物的能源都是一些还原态的无机物，例如NH4+、NO2-、S、H2S、H2和Fe2+等。能利用这种能源的微生物都是一些原核生物，包括亚硝酸细菌、硝酸细菌、硫化细菌、硫细菌、氢细菌和铁细菌等。
在微生物生长过程中，具体某一种营养物质可同时兼有几种营养要素的功能，如氨基酸即可以作为某些微生物的碳源和氮源，又是能源。
无机盐
无机盐（mineral salts）是微生物生长必不可少的一类营养物质，它们为机体生长提供必需的金属元素。这些金属元素在机体中的生理作用有参与酶的组成、控制细胞的氧化还原电位和作为某些微生物生长的能源物质等。一般微生物生长所需要的无机盐有硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钠、钾、镁、铁等金属的化合物。凡生长所需浓度在10-3~10-4mol/L范围内的元素可称为大量元素，如P、S、K、Mg、Na和Fe等，凡生长所需浓度在10-6~10-8mol/L范围内的元素则称为微量元素，如Cu、Zn、Mn、Mo、Co、Ni、Sn、Se等
磷 磷在微生物生长与繁殖过程中起着重要的作用。它既是合成核酸、核蛋白、磷脂与其它含磷化合物的重要元素，也是许多酶与辅酶如辅酶Ⅰ（NAD）、辅酶Ⅱ（NADP）、辅酶A、辅羧化酶等。各种核苷磷酸如ADP、ATP、CTP、UTP等在细胞物质合成与能量传递和储存过程中也起着重要作用。此外磷酸盐还是磷酸缓冲剂的组成成分，它对环境中pH起调节作用。
硫 硫是胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸的组成元素之一，因而它也是构成蛋白质的主要元素之一；另外硫也参与一些生理代谢活性物质的组成，例如在物质代谢过程中起重要作用的硫胺素、生物素、辅酶A等都含有硫，表明硫在机体内的物质代谢上起着重要作用。硫与硫化物也能作为某些微生物生长的能源物质。微生物生长所需要的硫主要是从含硫的无机盐和含硫的有机物中得到。
镁 微生物生长需要一定数量的镁元素。镁在生活机体内的作用有：1.构成某些酶的活性成分,例如己糖磷酸化酶、异柠檬酸脱氢酶、肽酶、羧化酶、核酸聚合酶等的酶活性和最大酶活性需要镁离子存在；2.它是光合微生物的光合色素——叶绿素或细菌叶绿素的组成元素，因而在光能转换上起重要作用；3.它在微生物细胞中某些细胞结构如核糖体、细胞膜等的稳定上起重要作用。不同的微生物对镁的需要量不同。一般来说，革兰氏阳性细菌对镁的需要量比革兰氏阴性细菌大。如果环境中缺少镁，微生物生长得不到足够的镁，会导致核糖体与细胞膜的稳定性降低，而影响机体的正常生长。微生物生长所需要的镁主要来自硫酸镁或其它镁盐。
铁 微生物生长需要铁。铁是微生物细胞内过氧化氢酶、过氧化物酶、细胞色素与细胞色素氧化酶的组成元素，同时铁还是某些铁细菌生长的能源物质，因此缺铁会使机体内的某些代谢活动降低或丧失，或使某些铁细菌生长得不到能量，从而使机体的生长受到影响或停止。例如大肠杆菌在缺铁的培养基里培养时，不能合成足够的甲酸脱氢酶，因而在发酵葡萄糖时不生成气体。另外培养基中铁含量高低会影响白喉杆菌形成白喉毒素的能力，在铁含量充足时，白喉杆菌基本上不形成白喉毒素，在铁含量不足或缺乏时，它们能大量合成白喉毒素，因此，可以通过控制培养基中铁的浓度变化来控制白喉杆菌形成白喉毒素的能力。微生物生长所需要的铁通常来自亚硫酸铁或其它铁盐。
钾 钾是细胞中的重要阳离子之一，它是许多酶的激活剂。另外，钾也参与细胞内许多物质的运输系统的组成。各种无机钾盐都可以用作微生物生长的钾源，其中磷酸的钾盐如磷酸二氢钾与磷酸氢二钾通常是组成缓冲剂的成分，因此它们除了用作钾源外，还在pH的调节上起重要作用。
钙 钙也是细胞内的一种重要阳离子，它一方面是某些酶如蛋白酶的激活剂，另一方面也是细菌芽孢的一种重要组成元素，根据资料表明钙的存在是构成芽孢抗热能力强的因素之一。各种水溶性钙盐通常是微生物的钙素来源。
除上述几种重要元素外，微生物的正常生长通常还需要其它某些重要元素（表6-4），这些元素一般是参与酶蛋白的组成，或者能使许多酶活化，它们的存在会大大提高机体的代谢能力，如果微生物在生长过程中，缺乏这些元素，会导致机体生理活性降低，或导致生长过程停止。由于机体对这些元素的需要量极其微小，一般称它们为微量元素。微量元素通常混杂存在其它营养物质中，如果没有特殊原因，在配制培养基的过程中没有必要另外加入。但需要指出的是，微量元素中许多是重金属元素，如果它们过量不仅不能提高机体的代谢活性，反而对机体的正常代谢过程会产生毒害作用，而且单独一种微量元素过量产生的毒害作用更大，因此，微生物生长所需要的微量元素一定要控制在正常的浓度范围内。
（5）生长因子 某些微生物在一般含有碳源、氮源、无机盐的培养基里培养时还不能生长或生长极差，但当在这种培养基里加进某种组织（或细胞）提取液时，这些微生物能生长得很好。说明这种组织（或细胞）里含有某些微生物生长所需要的因子。生长因子（growth factor）通常指那些微生物生长所必需而且需要量很小，但微生物自身不能合成或合成量不足以满足机体需要的有机化合物。各种微生物生长需要的生长因子的种类和数量是不同的（表6-5）。自养微生物和某些异养微生物（如大肠杆菌）不需外源生长因子也能生长。同种微生物对生长因子的需求也会随着环境条件的变化而变化，例如鲁氏毛霉（Mucor rouxii）在厌氧条件下生长时需要维生素B1与生物素，而在有氧的条件下生长时自身能合成这两种物质，不需外加这两种生长因子。有时对某些微生物生长所需的生长因子不清楚时，在配培养基时，一般可用生长因子含量丰富的天然物质作原料以保证微生物对它们的需要，例如酵母膏、玉米浆、牛肉浸膏、麦芽汁等新鲜动植物的汁液。
根据生长因子的化学结构与它们在机体内的生理作用，可将它们分成维生素(vitamin)、氨基酸与嘌呤（或嘧啶）碱基三大类。首先发现的生长因子的本质是维生素。目前已经发现许多维生素都能起生长因子的作用。表6-6 列出了一些在代谢过程中起重要作用的维生素，从表中可以看出它们中的大部分是构成酶的辅基或辅酶，它们是酶活性所需要的成分。
在微生物生长所需要的生长因子中，许多生长因子属于氨基酸。这是由于这些微生物本身缺乏合成这些氨基酸的能力，因此必须在它们的生长培养基里补充这些氨基酸或者补充含有这些氨基酸的小肽物质，机体才能生长，因而这些氨基酸就构成了这些微生物的生长因子。在某些情况下，由于小肽物质较易被微生物吸收与利用，因而生长好。另外在某些情况下，培养基中一种氨基酸的含量过高，也会导致其它所需氨基酸的吸收。因此，在配制培养基时必须注意所需氨基酸的含量要控制在一定的浓度范围内，避免氨基酸之间因浓度不协调所产生的不良作用。
嘌呤（或嘧啶）碱基通常也是某些微生物的生长因子。它们在机体内的作用一般是构成某些酶的辅酶或辅基或构成核酸的组成成分。
微生物不同所需要的生长因子也不同。例如克氏梭菌生长时需要生物素和对氨基苯甲酸作为生长因子，某些光合微生物需要尼克酸、硫胺素、对氨基苯甲酸、生物素、核黄素、或维生素 B12作为生长因子，肠膜状明串珠菌则需要17种氨基酸存在才能生长得好。另外有些微生物生长还需要特殊的成分，例如某些酵母菌和霉菌生长需要肌醇，某些肺炎球菌生长需要胆碱，支原体和酵母菌在厌氧条件下生长时需要甾醇等。
（6）水 水是微生物生长所需要的另外一种重要物质，它在微生物的生存中起着重要的作用。水在机体中的生理作用主要有：1.起到溶剂与运输介质的作用，营养物质的吸收与代谢产物的分泌必须以水为介质才能完成； 2.参与细胞内一系列化学反应；3.维持蛋白质、核酸等生物大分子稳定的天然构象； 4.由于水的比热高，又是热的良好导体，能有效地吸收代谢过程中放出的热并将吸收的热迅速地散发出去，从而有效地控制细胞内温度变化；5.水是维持细胞正常形态的重要因素；6.微生物通过水合作用与脱水作用控制由多亚基组成的结构，如酶、微管、鞭毛基病毒颗粒的组装与解离。
三． 微生物的营养类型(nutritional types)
由于微生物种类繁多,其营养类型比较复杂,人们常在不同层次和侧重点上对微生物营养类型进行划分(表4-8)。根据碳源、能源及电子供体性质的不同, 可将绝大部分微生物分为光能无机自养型(photolithoautotrophy)、光能有机异养型(photoorganoheterotrophy)、化能无机自养型(chemolithoautotrophy)及化能有机营养型(chemoorganoheterotrophy)四种类型(表4-9)。
光能无机自养型和光能有机异养型微生物可利用光能生长，在地球早期生态环境的演化过程中起重要作用；化能无机自养型微生物广泛分布于土壤及水环境中,参与地球物质循环；对化能有机异养型微生物而言,有机物通常既是碳源也是能源。目前已知的大多数细菌、真菌、原生动物都是化能有机异养型微生物。值得注意的是,已知的所有致病微生物都属于此种类型。根据化能有机异养型微生物利用的有机物性质的不同,又可将它们分为腐生型(metatrophy))和寄生型(paratrophy)两类,前者可利用无生命的有机物(如动植物尸体和残体)作为碳源,后者则寄生在活的寄主机体内吸取营养物质,离开寄主就不能生存。在腐生型和寄生型之间还存在一些中间类型,如兼性腐生型(facultive metatrophy)和兼性寄生型(facultive paratrophy)。 ?
某些菌株发生突变(自然突变或人工诱变)后,失去合成某种(或某些)对该菌株生长必不可少的物质(通常是生长因子如氨基酸、维生素)的能力,必须从外界环境获得该物质才能生长繁殖,这种突变型菌株称为营养缺陷型(auxotroph),相应的野生型菌株称为原养型(prototroph)。营养缺陷型菌株经常用来进行微生物遗传学方面的研究。
必须明确，无论那种分类方式,不同营养类型之间的界限并非绝对的,异养型微生物并非绝对不能利用CO2,只是不能以CO2为唯一或主要碳源进行生长,而且在有机物存在的情况下也可将CO2同化为细胞物质。同样,自养型微生物也并非不能利用有机物进行生长。另外,有些微生物在不同生长条件下生长时,其营养类型也会发生改变,例如紫色非硫细菌(purple nonsulphur bacteria)在没有有机物时可以同化CO2,它为自养型微生物,而当有机物存在时,它又可以利用有机物进行生长,此时它为异养型微生物。再如, 紫色非硫细菌在光照和厌氧条件下可利用光能生长,为光能营养型微生物,而在黑暗与好氧条件下,依靠有机物氧化产生的化学能生长,则为化能营养型微生物。微生物营养类型的可变性无疑有利于提高微生物对环境条件变化的适应能力。
第二节 培养基
培养基（medium）是人工配制的,适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。无论是以微生物为材料的研究,还是利用微生物生产生物制品,都必须进行培养基的配制，它是微生物学研究和微生物发酵工业的基础。
一、 配制培养基的原则
1. 选择适宜的营养物质
总体而言,所有微生物生长繁殖均需要培养基含有碳源、氮源、无机盐、生长因子、水及能源,但由于微生物营养类型复杂,不同微生物对营养物质的需求是不一样的,因此首先要根据不同微生物的营养需求配制针对性强的培养基。自养型微生物能从简单的无机物合成自身需要的糖、脂类、蛋白质、核酸、维生素等复杂的有机物,因此培养自养型微生物的培养基完全可以(或应该)由简单的无机物组成。例如,培养化能自养型的氧化硫硫杆菌 的培养基组成见表4-10。在该培养基配制过程中并未专门加入其他碳源物质,而是依靠空气中和溶于水中的CO2为氧化硫硫杆菌提供碳源。
培养其他化能自养型微生物与上述培养基成分基本类似,只是能源物质有所改变。对光能自养型微生物而言,除需要各类营养物质外,还需光照提供能源。培养异养型微生物需要在培养基中添加有机物,而且不同类型异养型微生物的营养要求差别很大,因此其培养基组成也相差很远。例如,培养大肠杆菌的培养基组成比较简单(表4-10),而有些异养型微生物的培养基的成份非常复杂,如肠膜明串珠菌需要生长因子,若配制培养它的合成培养基时,需要在培养基中添加的生长因子多达33种,因此通常采用天然有机物来为它提供生长所需的生长因子。
就微生物主要类型而言,有细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、原生动物、藻类及病毒之分,培养它们所需的培养基各不相同。在实验室中常用牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）培养细菌(表4-10);用高氏1号合成培养基培养放线菌(表4-10);培养酵母菌一般用麦芽汁培养基,它是将麦芽粉与4倍水混匀,在58~65℃条件下保温3~4小时至完全糖化,调整糖液浓度为10о巴林, 煮沸后用纱布过滤,调pH为6.0配制而成。麦芽粉组成复杂,能为酵母菌提供足够的营养物质;培养霉菌则一般用查氏合成培养基(表4-10)。
原生动物也可用培养基培养,有的原生动物需要较多的营养物质,例如梨型四膜虫(Tetrahymena pyriformis)的培养基含有10种氨基酸、7种维生素、鸟嘌呤、尿嘧啶及一些无机盐等,而有些变形虫可在较简单的蛋白胨肉汤(peptone broth)中生长。大多数藻类可以利用光能,只需要CO2、水和一些无机盐就可生长,而某些藻类如眼虫藻(Euglena)中的一些种可在黑暗条件下利用有机物质生长。有些藻类需要在培养基中补加土壤浸液,培养海洋藻类时可直接利用海水,但如果在特殊情况下需要用合成培养基培养海洋藻类时,则必需在培养基中加入海水中含有的各种盐。
2.营养物质浓度及配比合适
培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好,营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需,浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用,例如高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长,反而起到抑制或杀菌作用。另外，培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和(或)代谢产物的形成和积累,其中碳氮比(C/N)的影响较大。严格地讲，碳氮比指培养基中碳元素与氮元素的摩尔数比值,有时也指培养基中还原糖与粗蛋白之比。例如，在利用微生物发酵生产谷氨酸的过程中,培养基碳氮比为4/1时,菌体大量繁殖,谷氨酸积累少;当培养基碳氮比为3/1时,菌体繁殖受到抑制,谷氨酸产量则大量增加。再如,在抗生素发酵生产过程中,可以通过控制培养基中速效氮(或碳)源与迟效氮(或碳)源之间的比例来控制菌体生长与抗生素的合成。
3.控制pH条件
培养基的pH必须控制在一定的范围内,以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。各类微生物生长繁殖或产生代谢产物的最适pH条件各不相同,一般来讲,细菌与放线菌适于在pH7~7.5范围内生长,酵母菌和霉菌通常在pH4.5~6范围内生长。值得注意的是,在微生物生长繁殖和代谢过程中,由于营养物质被分解利用和代谢产物的形成与积累,会导致培养基pH发生变化,若不对培养基pH条件进行控制,往往导致微生物生长速度或(和)代谢产物产量降低。因此,为了维持培养基pH的相对恒定,通常在培养基中加入pH缓冲剂,常用的缓冲剂是一氢和二氢磷酸盐(如K2HPO4和KH2PO4)组成的混合物。K2HPO4溶液呈碱性, KH2PO4溶液呈酸性,两种物质的等克分子混合溶液的pH值为6.8。当培养基中酸性物质积累导致H+浓度增加时, H+与弱碱性盐结合形成弱酸性化合物,培养基pH不会过度降低;如果培养基中OH-浓度增加, OH-则与弱酸性盐结合形成弱碱性化合物,培养基pH也不会过度升高。
但K2HPO4/KH2PO4缓冲系统只能在一定的pH范围（pH6.4~7.2）内起调节作用。有些微生物，如乳酸菌能大量产酸,上述缓冲系统就难以起到缓冲作用,此时可在培养基中添加难溶的碳酸盐(如CaCO3)来进行调节, CaCO3难溶于水,不会使培养基pH过度升高,但它可以不断中和微生物产生的酸,同时释放出CO2,将培养基pH控制在一定范围内。
在培养基中还存在一些天然的缓冲系统,如氨基酸、肽、蛋白质都属于两性电解质,也可起到缓冲剂的作用。
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4. 控制氧化还原电位(redox potential)
不同类型微生物生长对氧化还原电位(Ф)的要求不一样,一般好氧性微生物在Ф值为+0.1伏以上时可正常生长,一般以+0.3～+0.4伏为宜,厌氧性微生物只能在Ф值低于+0.1伏条件下生长,兼性厌氧微生物在Ф值为+0.1伏以上时进行好氧呼吸,在+0.1伏以下时进行发酵。Ф值与氧分压和pH有关,也受某些微生物代谢产物的影响。在pH相对稳定的条件下,可通过增加通气量(如振荡培养、搅拌)提高培养基的氧分压,或加入氧化剂,从而增加Ф值;在培养基中加入抗坏血酸、硫化氢、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等还原性物质可降低Ф值。
5. 原料来源的选择
在配制培养基时应尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基成份,特别是在发酵工业中,培养基用量很大,利用低成本的原料更体现出其经济价值。例如，在微生物单细胞蛋白的工业生产过程中,常常利用糖蜜(制糖工业中含有蔗糖的废液)、乳清(乳制品工业中含有乳糖的废液)、豆制品工业废液及黑废液(造纸工业中含有戊糖和己糖的亚硫酸纸浆)等都可作为培养基的原料。再如,工业上的甲烷发酵主要利用废水、废渣作原料,而在我国农村，已推广利用人畜粪便及禾草为原料发酵生产甲烷作为燃料。另外,大量的农副产品或制品，如麸皮、米糠、玉米浆、酵母浸膏、酒糟、豆饼、花生饼、蛋白胨等都是常用的发酵工业原料。
6. 灭菌处理
要获得微生物纯培养，必须避免杂菌污染，因此对所用器材及工作场所进行消毒与灭菌。对培养基而言，更是要进行严格的灭菌。对培养基一般采取高压蒸汽灭菌，一般培养基用1.05kg/cm2,121.3℃15-30分钟可达到灭菌目的。在高压蒸汽灭菌过程中，长时间高温会使某些不耐热物质遭到破坏，如使糖类物质形成氨基糖、焦糖，因此含糖培养基常用0.56kg/cm2,112.6℃15-30分钟进行灭菌，对某些对糖要求较高的培养基，可先将糖进行过滤除菌或间歇灭菌，再与其他已灭菌的成份混合；长时间高温还会引起磷酸盐、碳酸盐与某些阳离子(特别是钙、镁、铁离子)结合形成难溶性复合物而产生沉淀，因此,在配制用于观察和定量测定微生物生长状况的合成培养基时,常需在培养基中加入少量螯合剂,避免培养基中产生沉淀而影响O.D.值的测定,常用的螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)。还可以将含钙、镁、铁等离子的成份与磷酸盐、碳酸盐分别进行灭菌，然后再混合，避免形成沉淀；高压蒸汽灭菌后，培养基pH会发生改变（一般使pH降低），可根据所培养微生物的要求，在培养基灭菌前后加以调整。 在配制培养基过程中,泡沫的存在对灭菌处理极不利,因为泡沫中的空气形成隔热层,使泡沫中微生物难以被杀死。因而有时需要在培养基中加入消泡沫剂以减少泡沫的产生，或适当提高灭菌温度，延长灭菌时间。
二、 培养基的类型及应用
培养基种类繁多,根据其成份、物理状态和用途可将培养基分成多种类型。
1．按成份不同划分
(1) 天然培养基(complex medium)
这类培养基主要以化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物组成,牛肉膏蛋白胨培养基和麦芽汁培养基就属于此类。基因克隆技术中常用的LB(Luria-Bertani)培养基也是一种复合培养基,其组成见表4-10。
常用的天然有机营养物质包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏(表4-11)、豆芽汁、玉米粉、土壤浸液、麸皮、牛奶、血清、稻草浸汁、羽毛浸汁、胡罗卜汁、椰子汁等,嗜粪微生物(coprophilous microorganisms)可以利用粪水作为营养物质。复合培养基成本较低,除在实验室经常使用外,也适于用来进行工业上大规模的微生物发酵生产。
? (2) 合成培养基(synthetic medium)
合成培养基是由化学成份完全了解的物质配制而成的培养基，也称化学限定培养基(chemically defined medium),高氏1号培养基和查氏培养基就属于此种类型。配制合成培养基时重复性强,但与天然培养基相比其成本较高,微生物在其中生长速度较慢,一般适于在实验室用来进行有关微生物营养需求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌种选育及遗传分析等方面的研究工作。
2．根据物理状态划分
根据培养基中凝固剂的有无及含量的多少,可将培养基划分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基三种类型。
(1) 固体培养基(solid medium)
在液体培养基中加入一定量凝固剂即为固体培养基。理想的凝固剂应具备以下条件:1.不被所培养的微生物分解利用;2.在微生物生长的温度范围内保持固体状态。在培养嗜热细菌时,由于高温容易引起培养基液化,通常在培养基中适当增加凝固剂来解决这一问题;3.凝固剂凝固点温度不能太低,否则将不利于微生物的生长;4.凝固剂对所培养的微生物无毒害作用;5.凝固剂在灭菌过程中不会被破坏;6.透明度好,粘着力强;7.配制方便且价格低廉。常用的凝固剂有琼脂(agar)、明胶(gelatin)和硅胶(silica gel)。表4-12列出琼脂和明胶的一些主要特征。
对绝大多数微生物而言,琼脂是最理想的凝固剂,琼脂是由藻类(海产石花菜)中提取的一种高度分支的复杂多糖；明胶是由胶原蛋白制备得到的产物,是最早用来作为凝固剂的物质,但由于其凝固点太低,而且某些细菌和许多真菌产生的非特异性胞外蛋白酶以及梭菌产生的特异性胶原酶都能液化明胶,目前已较少作为凝固剂；硅胶是由无机的硅酸钠(Na2SiO3)及硅酸钾(K2SiO3)被盐酸及硫酸中和时凝聚而成的胶体,它不含有机物,适合配制分离与培养自养型微生物的培养基。
除在液体培养基中加入凝固剂制备的固体培养基外,一些由天然固体基质制成的培养基也属于固体培养基。例如,由马铃薯块、胡罗卜条、小米、麸皮及米糠等制成固体状态的培养基就属于此类。如生产酒的酒曲，生产食用菌的棉子壳培养基。
在实验室中,固体培养基一般是加入平皿或试管中，制成培养微生物的平板或斜面。固体培养基为微生物提供一个营养表面,单个微生物细胞在这个营养表面进行生长繁殖,可以形成单个菌落。固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏等。
(2) 半固体培养基(semisolid medium)
半固体培养基中凝固剂的含量比固体培养基少,培养基中琼脂量一般为0.2~0.7%。半固体培养基常用来观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定等。
(3) 液体培养基(liquid medium)
液体培养基中未加任何凝固剂。在用液体培养基培养微生物时,通过振荡或搅拌可以增加培养基的通气量,同时使营养物质分布均匀。液体培养基常用于大规模工业生产以及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究。
3．按用途划分
(1) 基础培养基(minimum medium)
尽管不同微生物的营养需求各不相同,但大多数微生物所需的基本营养物质是相同的。基础培养基是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基。牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基。基础培养基也可以作为一些特殊培养基的基础成份,再根据某种微生物的特殊营养需求,在基础培养基中加入所需营养物质。
(2) 加富培养基(enrichment medium)
加富培养基也称营养培养基,即在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基,这些特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等。加富培养基一般用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物,如培养百日咳博德氏菌(Bordetella pertussis)需要含有血液的加富培养基。加富培养基还可以用来富集和分离某种微生物,这是因为加富培养基含有某种微生物所需的特殊营养物质,该种微生物在这种培养基中较其他微生物生长速度快,并逐渐富集而占优势,逐步淘汰其他微生物,从而容易达到分离该种微生物的目的。从某种意义上讲,加富培养基类似选择培养基,两者区别在于，加富培养基是用来增加所要分离的微生物的数量，使其形成生长优势，从而分离到该种微生物；选择培养基则一般是抑制不需要的微生物的生长，使所需要的微生物增殖，从而达到分离所需微生物的目的。
(3) 鉴别培养基(differential medium)
鉴别培养基是用于鉴别不同类型微生物的培养基。在培养基中加入某种特殊化学物质,某种微生物在培养基中生长后能产生某种代谢产物,而这种代谢产物可以与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应,产生明显的特征性变化,根据这种特征性变化,可将该种微生物与其他微生物区分开来。鉴别培养基主要用于微生物的快速分类鉴定，以及分离和筛选产生某种代谢产物的微生物菌种。常用的一些鉴别培养基见表4-13。
表4-13 一些鉴别培养基
培养基名称
加入化学物质
微生物代谢产物
培养基特征性变化
主要用途
酪素培养基
酪素
胞外蛋白酶
蛋白水解圈
鉴别产蛋白酶菌株
明胶培养基
明胶
胞外蛋白酶
明胶液化
鉴别产蛋白酶菌株
油脂培养基
食用油、土温、中性红指示剂
胞外脂肪酶
由淡红色变成深红色
鉴别产脂肪酶菌株
淀粉培养基
可溶性淀粉
胞外淀粉酶
淀粉水解圈
鉴别产淀粉酶菌株
H2S试验培养基
醋酸铅
H2S
产生黑色沉淀
鉴别产H2S菌株
糖发酵培养基
溴甲酚紫
乳酸、醋酸、丙酸等
由紫色变成黄色
鉴别肠道细菌
远藤氏培养基
碱性复红、亚硫酸钠
酸、乙醛
带金属光泽深红色菌落
鉴别水中大肠菌群
伊红美蓝培养基
伊红、美蓝
酸
带金属光泽深紫色菌落
鉴别水中大肠菌群
?
(4)选择培养基(selective medium)
选择培养基是用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同,在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质,抑制不需要的微生物的生长,有利于所需微生物的生长。
一种类型选择培养基是依据某些微生物的特殊营养需求设计的,例如，利用以纤维素或石蜡油作为唯一碳源的选择培养基，可以从混杂的微生物群体中分离出能分解纤维素或石蜡油的微生物;利用以蛋白质作为唯一氮源的选择培养基，可以分离产胞外蛋白酶的微生物;缺乏氮源的选择培养基可用来分离固氮微生物。另一类选择培养基是在培养基中加入某种化学物质,这种化学物质没有营养作用,对所需分离的微生物无害,但可以抑制或杀死其他微生物,例如,在培养基中加入数滴10%酚可以抑制细菌和霉菌的生长,从而由混杂的微生物群体中分离出放线菌;在培养基中加入亚硫酸铋,可以抑制革兰氏阳性细菌和绝大多数革兰氏阴性细菌的生长,而革兰氏阴性的伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)可以在这种培养基上生长; 在培养基中加入染料亮绿(brilliant green)或结晶紫(crystal violet),可以抑制革兰氏阳性细菌的生长,从而达到分离革兰氏阴性细菌的目的;在培养基中加入青霉素、四环素或链霉素,可以抑制细菌和放线菌生长,而将酵母菌和霉菌分离出来。现代基因克隆技术中也常用选择培养基,在筛选含有重组质粒的基因工程菌株过程中,利用质粒上具有的对某种(些)抗生素的抗性选择标记,在培养基中加入相应抗生素,就能比较方便地淘汰非重组菌株,以减少筛选目标菌株的工作量。
在实际应用中,有时需要配制既有选择作用又有鉴别作用的培养基。例如，当要分离金黄色葡萄球菌时,在培养基中加入7.5%NaCl、甘露糖醇和酸碱指示剂,金黄色葡萄球菌可耐高浓度NaCl,且能利用甘露糖醇产酸。因此，能在上述培养基生长，而且菌落周围培养基颜色发生变化，则该菌落有可能是金黄色葡萄球菌,再通过进一步鉴定加以确定。
(4) 其它
除上述四种主要类型外，培养基按用途划分还有很多种，比如：分析培养基(assay medium)常用来分析某些化学物质(抗生素、维生素)的浓度，还可用来分析微生物的营养需求；还原性培养基(reduced medium)专门用来培养厌氧型微生物；组织培养物培养基(tissue-culture midium)含有动、植物细胞,用来培养病毒、衣原体(chlamydia)、立克次氏体(rickettsia)及某些螺旋体(spirochete)等专性活细胞寄生的微生物。尽管如此,有些病毒和立克次氏体目前还不能利用人工培养基来培养, 需要接种在动植物体内、动植物组织中才能增殖。常用的培养病毒与立克次氏体的动物有小白鼠、家鼠和豚鼠,鸡胚也是培养某些病毒与立克次氏体的良好营养基质,鸡瘟病毒、牛痘病毒、天花病毒、狂犬病毒等十几种病毒也可用鸡胚培养。
第三节 营养物质进入细胞
营养物质能否被微生物利用的一个决定性因素是这些营养物质能否进入微生物细胞。只有营养物质进入细胞后才能被微生物细胞内的新陈代谢系统分解利用，进而使微生物正常生长繁殖。影响营养物质进入细胞的的因素主要有三个:
其一是营养物质本身的性质。分子量、溶解性、电负性、极性等都影响营养物质进入细胞的难易程度。
其二是微生物所处的环境。温度通过影响营养物质的溶解度、细胞膜的流动性及运输系统的活性来影响微生物的吸收能力；pH和离子强度通过影响营养物质的电离程度来影响其进入细胞的能力。例如，当环境pH比胞内pH高时，弱碱性的甲胺进入大肠杆菌后以带正电荷的形式存在，而这种状态的甲胺不容易分泌而导致细胞内甲胺浓度升高，当环境pH比胞内pH低时，甲胺以带正电荷的形式存在于环境中而难以进入细胞，导致细胞内甲胺浓度降低；当环境中存在诱导物质运输系统形成的物质时，有利于微生物吸收营养物质。而环境中存在的代谢过程抑制剂、解偶联剂以及能与原生质膜上的蛋白质或脂类物质等成份发生作用的物质（如巯基试剂、重金属离子等）都可以在不同程度上影响物质的运输速率。另外，环境中被运输物质的结构类似物也影响微生物细胞吸收被运输物质的速率，例如L-刀豆氨酸、L-赖氨酸或D-精氨酸都能降低酿酒酵母吸收L-精氨酸的能力。
其三是微生物细胞的透过屏障（permeability barrier）。所有微生物都具有一种保护机体完整性且能限制物质进出细胞的透过屏障,渗透屏障主要由原生质膜、细胞壁、荚膜及粘液层等组成的结构。荚膜与粘液层的结构较为疏松，对细胞吸收营养物质影响较小。革兰氏阳性细菌由于细胞壁结构较为紧密，对营养物质的吸收有一定的影响，分子量大于10000的葡聚糖难以通过这类细菌的细胞壁。真菌和酵母菌细胞壁只能允许分子量较小的物质通过。与细胞壁相比，原生质膜在控制物质进入细胞的过程中起着更为重要的作用，它对跨膜运输(transport across membrane)的物质具有选择性,营养物质的跨膜运输是本节着重探讨的问题。根据物质运输过程的特点，可将物质的运输方式分为扩散、促进扩散、主动运输与膜泡运输。
一、 扩散(diffusion)
原生质膜是一种半透膜，营养物质通过原生质膜上的含水小孔，由高浓度的胞外（内）环境向低浓度的胞内（外）进行扩散。扩散是非特异性的，但原生质膜上的含水小孔的大小和形状对参与扩散的营养物质分子有一定的选择性。物质在扩散过程中，既不与膜上的各类分子发生反应,自身分子结构也不发生变化。扩散是一种最简单的物质跨膜运输方式,为纯粹的物理学过程,在扩散过程中不消耗能量,物质扩散的动力来自参与扩散的物质在膜内外的浓度差,营养物质不能逆浓度运输。物质扩散的速率随原生质膜内外营养物质浓度差的降低而减小,直到膜内外营养物质浓度相同时才达到一个动态平衡。
由于原生质膜主要由磷脂双分子层和蛋白质组成,而且膜上分布有含水膜孔,膜内外表面为极性表面,中间为疏水层,因而物质跨膜扩散的能力和速率与该物质的性质有关,分子量小、脂溶性、极性小的物质易通过扩散进出细胞。另外,温度高时,原生质膜的流动性增加,有利于物质扩散进出细胞,而pH与离子强度通过影响物质的电离程度而影响物质的扩散速率。
扩散并不是微生物细胞吸收营养物质的主要方式,水是唯一可以通过扩散自由通过原生质膜的分子,脂肪酸、乙醇、甘油、苯、一些气体分子(O2、CO2)及某些氨基酸在一定程度上也可通过扩散进出细胞。
二、促进扩散(facilitated diffusion)
与扩散一样,促进扩散也是一种被动的物质跨膜运输方式,在这个过程中不消耗能量,参与运输的物质本身的分子结构不发生变化,不能进行逆浓度运输,运输速率与膜内外物质的浓度差成正比。
促进扩散与扩散的主要区别在于通过促进扩散进行跨膜运输的物质需要借助与载体(carrier)的作用才能进入细胞(图4-1),而且每种载体只运输相应的物质,具有较高的专一性。被运输物质与相应载体之间存在一种亲和力,而且这种亲和力在原生质膜内外的大小不同,当物质与相应载体在胞外亲和力大而在胞内亲和力小时,通过被运输物质与相应载体之间亲和力的大小变化, 使该物质与载体发生可逆性的结合与分离,导致物质穿过原生质膜进入细胞。被运输物质与载体之间亲和力大小变化是通过载体分子的构象变化而实现的。参与
促进扩散的载体主要是一些蛋白质,这些蛋白质能促进物质进行跨膜运输,自身在这个过程中不发生化学变化,而且在促进扩散中载体只影响物质的运输速率,并不改变该物质在膜内外形成的动态平衡状态,被运输物质在膜内外浓度差越大,促进扩散的速率越快,但是当被运输物质浓度过高而使载体蛋白饱和时,运输速率就不再增加,这些性质都类似于酶的作用特征,因此载体蛋白也称为透过酶(permease)。透过酶大都是诱导酶,只有在环境中存在机体生长所需的营养物质时,相应的透过酶才合成。
通过促进扩散进入细胞的营养物质主要有氨基酸、单糖、维生素及无机盐等。一般微生物通过专一的载体蛋白运输相应的物质,但同时微生物对同一物质的运输由一种以上的载体蛋白来完成,例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)利用四种不同载体蛋白运输组氨酸,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)有三种不同的载体蛋白来完成葡萄糖的运输。另外,某些载体蛋白可同时完成几种物质的运输,例如大肠杆菌可通过一种载体蛋白完成亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的运输,但这种载体蛋白对这三种氨基酸的运输能力有差别。 除以蛋白质载体介导的促进扩散外,一些抗菌素可以通过提高膜的离子通透性而促进离子进行跨膜运输。短杆菌肽A是由15个L型和D型氨基酸交替连接而成的短肽,两个短杆菌肽A分子可在膜上形成含水通道,离子可以穿过此通道进行跨膜运输;缬氨霉素是一种环状分子,K+可结合在环状分子中心,而环状分子外周的碳氢链使得该复合物能穿过膜的疏水性中心,从而促进K+的跨膜运输,在这个过程中, 缬氨霉素实际上起到载体的作用。
三、主动运输(active transport)
主动运输是广泛存在于微生物中的一种主要的物质运输方式。与扩散及促进扩散这两种被动运输(passive transport)方式相比,主动运输的一个重要特点是在物质运输过程中需要消耗能量,而且可以进行逆浓度运输。在主动运输过程中，运输物质所需能量来源因微生物不同而不同,好氧型微生物与兼性厌氧微生物直接利用呼吸能,厌氧型微生物利用化学能(ATP),光合微生物利用光能,嗜盐细菌通过紫膜(purple membrane)利用光能。主动运输与促进扩散类似之处在于物质运输过程中同样需要载体蛋白,载体蛋白通过构象变化而改变与被运输物质之间的亲和力大小,使两者之间发生可逆性结合与分离,从而完成相应物质的跨膜运输,区别在于主动运输过程中的载体蛋白构象变化需要消耗能量。主动运输的具体方式有多种,主要有初级主动运输、次级主动运输、基团转位、Na+,K+-ATP酶(Na+,K+-ATPase)系统及ATP偶联主动运输等。
1. 初级主动运输(primary active transport)
初级主动运输指由电子传递系统、ATP酶或细菌嗜紫红质引起的质子运输方式,从物质运输的角度考虑是一种质子的主动运输方式。呼吸能、化学能和光能的消耗，引起胞内质子(或其他离子)外排,导致原生质膜内外建立质子浓度差(或电势差),使膜处于充能状态(图4-2),即形成能化膜(energized membrane)。不同微生物的初级主动运输方式不同,好氧型微生物和兼性厌氧微生物在有氧条件下生长时,物质在胞内氧化释放的电子在位于原生质膜上的电子传递链上传递的过程中伴随质子外排;厌氧型微生物利用发酵过程中产生ATP,在位于原生质膜上的ATP酶的作用下,ATP水解生成ADP和磷酸,同时伴随质子向胞外分泌;光合微生物吸收光能后,光能激发产生的电子在电子传递过程中也伴随质子外排;嗜盐细菌紫膜上的细菌嗜紫红质吸收光能后,引起蛋白质分子中某些化学基团pK值发生变化,导致质子迅速转移,在膜内外建立质子浓度差。
2. 次级主动运输(secondary active transport)
通过初级主动运输建立的能化膜在质子浓度差(或电势差)消失的过程中，往往偶联其他物质的运输，包括以下三种方式：同向运输(symport)是指某种物质与质子通过同一载体按同一方向运输(图4-2a)。除质子外,其他带电荷离子(如钠离子)建立起来的电势差也可引起同向运输。在大肠杆菌中,通过这种方式运输的物质主要有丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酸、半乳糖、岩藻糖、蜜二糖、阿拉伯糖、乳酸、葡萄糖醛酸及某些阴离子(如HPO42-、HSO4-)等；逆向运输(antiport)是指某种物质(如Na+)与质子通过同一载体按相反方向进行运输(图4-2b)；单向运输(uniport)是指质子浓度差在消失过程中，可促使某些物质通过载体进出细胞(图4-2c),运输结果通常导致胞内阳离子(如K+)积累或阴离子浓度降低。
3. 基团转位(group translocation)
基团转位与其他主动运输方式的不同之处在于它有一个复杂的运输系统来完成物质的运输,而物质在运输过程中发生化学变化。基团转位主要存在于厌氧型和兼性厌氧型细菌中,主要用于糖的运输,脂肪酸、核苷、碱基等也可通过这种方式运输。目前尚未在好氧型细菌及真核生物中发现这种运输方式,也未发现氨基酸通过这种方式进行运输。
在研究大肠杆菌对葡萄糖和金黄色葡萄球菌对乳糖的吸收过程中,发现这些糖进入细胞后以磷酸糖的形式存在于细胞质中,表明这些糖在运输过程中发生了磷酸化作用,其中的磷酸基团来源于胞内的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP),因此也将基团转位称为磷酸烯醇式丙酮酸-磷酸糖转移酶运输系统(PTS),简称磷酸转移酶系统(图4-3)。PTS通常由五种蛋白质组成,包括酶Ⅰ、酶Ⅱ(包括a、b和c三个亚基)和一种低分子量的热稳定蛋白质(HPr)。酶Ⅰ和HPr是非特异性的细胞质蛋白,酶Ⅱa也是可溶性细胞质蛋白, 亲水性酶Ⅱb与位于细胞膜上的酶Ⅱc相 结合。在糖的运输过程中,PEP上的磷酸基团逐步通过酶Ⅰ、HPr的磷酸化与去磷酸化作用,最终在酶Ⅱ的作用下转移到糖,生成磷酸糖释放于细胞质中。
4.Na+,K+-ATP酶(Na+,K+-ATPase)系统
Na+,K+-ATP酶的功能是利用ATP的能量将Na+由细胞内"泵"出胞外,并将K+"泵"入胞内。该酶由大小两个亚基组成,大亚基可被磷酸化,其作用机制见图4-4。 E为非磷酸化酶,与Na+的结合位点朝向膜内,与Na+有较高的亲和力,而与K+的亲和力低。当E与Na+结合后,在Mg2+存在的情况下, ATP水解使E磷酸化,促使E构象发生变化而转变成E',并导致与Na+的结合位点朝向膜外, E'与Na+的亲和力降低,而与K+的亲和力高,此时胞外的K+将Na+置换下来, E'与K+结合后, K+的结合位点朝向膜内, E'去磷酸化,该酶构象再次发生变化,转变成E, Na+将K+置换下来。 Na+,K+-ATP酶作用的结果是使细胞内Na+浓度低而K+浓度高,这种状况并不因环境中Na+、K+浓度高低而改变,例如大肠杆菌K12在培养基中K+浓度非常低 (0.1μmol/L) 时,仍然可以从环境中吸收K+,导致胞内K+浓度达到100mmol/L。细胞内维持高浓度K+是保证许多酶的活性和蛋白质的合成所必需的。由于Na+,K+-ATP酶将Na+由细胞内"泵"出胞外,并将K+"泵"入胞内,因此常将该酶称为Na+,K+-泵。
除上述四种主要的主动运输方式外,在微生物中还存在一些其他的主动运输方式。其中有一种是ATP水解不建立膜内外质子浓度差,而是直接偶联物质的运输,L-谷氨酰胺、L-鸟氨酰胺、L-鸟氨酸和D-核糖可以通过这种方式运输;在大肠杆菌中,能量的消耗可以导致柠檬酸透过酶的构象变化而使之活化,促进柠檬酸进入细胞;在金黄色葡萄球菌中,在脱氢酶作用下,乳酸氧化偶联着载体蛋白分子构象变化,促使物质进入细胞。
四、膜泡运输(memberane vesicle transport)
膜泡运输主要存在于原生动物中，特别是变形虫(amoeba)，为这类微生物的一种营养物质的运输方式(图4-5)。变形虫通过趋向性运动靠近营养物质, 并将该物质吸附到膜表面,然后在该物质附近的细胞膜开始内陷,逐步将营养物质包围,最后形成一个含有该营养物质的膜泡,之后膜泡离开细胞膜而游离于细胞质中,营养物质通过这种运输方式由胞外进入胞内。如果膜泡中包含的是固体营养物质,则将这种营养物质运输方式称为胞吞作用(phagocytosis);如果膜泡中包含的是液体,则称之为胞饮作用(pinocytosis)。通过胞吞作用(或胞饮作用)进行的营养物质膜泡运输一般分为五个时期(图4-5)，即：吸附期、膜伸展期、膜泡迅速形成期、附着膜泡形成期和膜泡释放期。
小 结
1. 营养物质包括碳源、氮源、无机盐、生长因子和水五大类。
2. 根据碳源、能源及电子供体的不同可将微生物划分为光能无机自养型、光能有机异养型、化能无机自养型和化能有机异养型四类。
3. 培养基是满足微生物营养需求的营养物质基质。配制时要选择适宜营养物质并调整其浓度及配比、控制氧化还原电位和pH、利用廉价且容易获得的原料及灭菌处理。
4. 培养基主要类型有: 按化学成份不同分为复合和合成培养基; 按物理状态不同分为固体、半固体和液体培养基;按用途不同分为基础、加富、鉴别、选择、分析、还原和组织培养物培养基等。
5. 营养物质进入细胞主要有扩散、促进扩散、主动运输和膜泡运输几种方式。
思考题
1. 某学生利用酪素培养基(表4-18)平板筛选产胞外蛋白酶细菌,在酪素培养基平板上发现有许多菌的菌落周围有蛋白水解圈,是否能仅凭蛋白水解圈与菌落直径比大，就断定该菌株产胞外蛋白酶的能力就大，而将其选择为高产蛋白酶的菌种?为什么?
2. 为什么微生物的营养类型多种多样,而动、植物营养类型则相对单一?
3. 采取什么方法能分离到能分解并利用苯作为碳源和能源物质的细菌纯培养物?
4. 与促进扩散相比,微生物通过主动运输吸收营养物质的优点是什么?
第五章 微生物的代谢
计划学时：3
重点：微生物的产能代谢：发酵、有氧呼吸、无氧呼吸，酵母菌乙醇发酵，次级代谢初级代谢，代谢调节。
第一节 代谢概论
代谢（metalsolism）是细胞内发生的各种化学反应的总称，它主要由分解代谢(catabolism)和合成代谢(anabolism)两个过程组成。
分解代谢是指细胞将大分子物质降解成小分子物质，并在这个过程中产生能量。一般可将分解代谢分为三个阶段（图5-1）：第一阶段是将蛋白质、多糖及脂类等大分子营养物质降解成氨基酸、单糖及脂肪酸等小分子物质；第二阶段是将第一阶段产物进一步降解成更为简单的乙酰辅酶A、丙酮酸以及能进入三羧酸循环的某些中间产物，在这个阶段会产生一些ATP、NADH及FADH2；第三阶段是通过三羧酸循环将第二阶段产物完全降解生成CO2,并产生ATP、NADH及FADH2。第二和第三阶段产生的ATP、NADH及FADH2通过电子传递链被氧化，产生大量的ATP。
合成代谢是指细胞利用简单的小分子物质合成复杂大分子的过程，在这个过程中要消耗能量。合成代谢所利用的小分子物质来源于分解代谢过程中产生的中间产物（图5-2）或环境中的小分子营养物质。
在代谢过程中，微生物通过分解代谢产生化学能，光合微生物还可将光能转换成化学能，这些能量除用于合成代谢外，还可用于微生物的运动和运输，另有部分能量以热或光的形式释放到环境中去。微生物产生和利用能量及其与代谢的关系见图5-3。
无论是分解代谢还是合成代谢，代谢途径都是由一系列连续的酶促反应构成的，前一步反应的产物是后续反应的底物。细胞通过各种方式有效地调节相关的酶促反应，来保证整个代谢途径的协调性与完整性，从而使细胞 的生命活动得以正常进行。
某些微生物在代谢过程中除了产生其生命活动所必需的初级代谢产物和能量外，还会产生一些次级代谢产物，这些次级代谢产物除了有利于这些微生物的生存外，还与人类的生产与生活密切相关，也是微生物学的一个重要研究领域。
第二节 微生物产能代谢
一． 生物氧化
分解代谢实际上是物质在生物体内经过一系列连续的氧化还原反应，逐步分解并释放能量的过程，这个过程也称为生物氧化，是一个产能代谢过程。在生物氧化过程中释放的能量可被微生物直接利用，也可通过能量转换储存在高能化合物（如ATP）中，以便逐步被利用，还有部分能量以热的形式被释放到环境中。不同类型微生物进行生物氧化所利用的物质是不同的，异养微生物利用有机物，自养微生物则利用无机物，通过生物氧化来进行产能代谢。
二． 异养微生物的生物氧化
异养微生物将有机物氧化，根据氧化还原反应中电子受体的不同，可将微生物细胞内发生的生物氧化反应分成发酵和呼吸两种类型，而呼吸又可分为有氧呼吸和厌氧呼吸两种方式。
1. 发酵
发酵(fermentation)是指微生物细胞将有机物氧化释放的电子直接交给底物本身未完全氧化的某种中间产物，同时释放能量并产生各种不同的代谢产物。在发酵条件下有机化合物只是部分地被氧化，因此，只释放出一小部分的能量。发酵过程的氧化是与有机物的还原偶联在一起的。被还原的有机物来自于初始发酵的分解代谢，即不需要外界提供电子受体。?
发酵的种类有很多，可发酵的底物有碳水化合物、有机酸、氨基酸等，其中以微生物发酵葡萄糖最为重要。生物体内葡萄糖被降解成丙酮酸的过程称为糖酵解（glycolysis），主要分为四种途径：EMP途径、HMP途径、ED途径、磷酸解酮酶途径。
在糖酵解过程中生成的丙酮酸可被进一步代谢。在无氧条件下，不同的微生物分解丙酮酸后会积累不同的代谢产物。目前发现多种微生物可以发酵葡萄糖产生乙醇，能进行乙醇发酵的微生物包括酵母菌、根霉、曲霉和某些细菌。根据在不同条件下代谢产物的不同，可将酵母菌利用葡萄糖进行的发酵分为三种类型：在酵母菌的乙醇发酵中，酵母菌可将葡萄糖经EMP途径降解为两分子丙酮酸，然后丙酮酸脱羧生成乙醛，乙醛作为氢受体使NAD+再生，发酵终产物为乙醇，这种发酵类型称为酵母的一型发酵；但当环境中存在亚硫酸氢钠时，它可与乙醛反应生成难溶的磺化羟基乙醛。由于乙醛和亚硫酸盐结合而不能作为NADH2的受氢体，所以不能形成乙醇，迫使磷酸二羟丙酮代替乙醛作为受氢体，生成α-磷酸甘油。α-磷酸甘油进一步水解脱磷酸而生成甘油，称为酵母的二型发酵；在弱碱性条件下（pH 7.6），乙醛因得不到足够的氢而积累，两个乙醛分子间会发生歧化反应，一分子乙醛作为氧化剂被还原成乙醇，另一个则作为还原剂被氧化为乙酸。氢受体则由磷酸二羟丙酮担任。发酵终产物为甘油、乙醇和乙酸，称为酵母的三型发酵。这种发酵方式不能产生能量，只能在非生长的情况下才进行。
不同的细菌进行乙醇发酵时，其发酵途径也各不相同。如运动发酵单胞菌 和厌氧发酵单胞菌 是利用ED途径分解葡萄糖为丙酮酸，最后得到乙醇，对于某些生长在极端酸性条件下的严格厌氧菌，如胃八叠球菌 和肠杆菌 则是利用EMP途径进行乙醇发酵。
许多细菌能利用葡萄糖产生乳酸，这类细菌称为乳酸细菌。根据产物的不同，乳酸发酵有三种类型：同型乳酸发酵、异型乳酸发酵和双歧发酵。同型乳酸发酵的过程是：葡萄糖经EMP途径降解为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的作用下被NADH还原为乳酸。由于终产物只有乳酸一种，故称为同型乳酸发酵。在异型乳酸发酵中，葡萄糖首先经PK途径分解，发酵终产物除乳酸以外还有一部分乙醇或乙酸。在肠膜明串珠菌 中，利用HK途径分解葡萄糖，产生3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸，其中3-磷酸甘油醛进一步转化为乳酸，乙酰磷酸经两次还原变为乙醇，当发酵戊糖时，则是利用PK途径，磷酸解酮糖酶催化5-P木酮糖裂解生成乙酰磷酸和3-P-甘油醛。双歧发酵是两歧双歧杆菌发酵葡萄糖产生乳酸的一条途径。此反应中有两种磷酸酮糖酶参加反应，即6-磷酸果糖磷酸酮糖酶和5-磷酸木酮糖磷酸酮糖酶分别催化6-磷酸果糖和5-磷酸木酮糖裂解产生乙酰磷酸和4-磷酸丁糖，及3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸。
许多厌氧菌可进行丙酸发酵。葡萄糖经EMP途径分解为两个丙酮酸后，再被转化为丙酸。少数丙酸细菌还能将乳酸（或利用葡萄糖分解而产生的乳酸）转变为丙酸。
某些专性厌氧菌，如梭菌属 、丁酸弧菌属 、真杆菌属 和梭杆菌属（Fusobacterium），能进行丁酸与丙酮-丁醇发酵。在发酵过程中，葡萄糖经EMP途径降解为丙酮酸，接着在丙酮酸-铁氧还蛋白酶的参与下，将丙酮酸转化为乙酰辅酶A。乙酰辅酶A再经一系列反应生成丁酸或丁醇和丙酮。
某些肠杆菌，如埃希氏菌属 、沙门氏菌属 和志贺氏菌属 中的一些菌，能够利用葡萄糖进行混合酸发酵。先通过EMP途径先将葡萄糖分解为丙酮酸，然后由不同的酶系将丙酮酸转化成不同的产物，如乳酸、乙酸、甲酸、乙醇、CO2和氢气，还有一部分磷酸烯醇式丙酮酸用于生成琥珀酸；而肠杆菌、欧文氏菌属 中的一些细菌，能将丙酮酸转变成乙酰乳酸，乙酰乳酸经一系列反应生成丁二醇。由于这类肠道菌还具有丙酮酸-甲酸裂解酶，乳酸脱氢酶等，所以其终产物还有甲酸、乳酸、乙醇等。
2. 呼吸作用
我们已经在上面讨论了葡萄糖分子在没有外源电子受体时的代谢过程。在这个过程中，底物中所具有的能量只有一小部分被释放出来，并合成少量ATP。造成这种现象的原因有两个，一是底物的碳原子只被部分氧化，二是初始电子供体和最终电子受体的还原电势相差不大。然而，如果有氧或其它外源电子受体存在时，底物分子可被完全氧化为CO2，且在此过程中可合成的ATP的量大大多于发酵过程。微生物在降解底物的过程中，将释放出的电子交给NAD（P）+、FAD或FMN等电子载体，再经电子传递系统传给外源电子受体，从而生成水或其它还原型产物并释放出能量的过程，称为呼吸作用。其中，以分子氧作为最终电子受体的称为有氧呼吸（aerobic respiration），以氧化型化合物作为最终电子受体的称为无氧呼吸（anaerobic respiration）。呼吸作用与发酵作用的根本区别在于：电子载体不是将电子直接传递给底物降解的中间产物，而是交给电子传递系统，逐步释放出能量后再交给最终电子受体。
许多不能被发酵的有机化合物能够通过呼吸作用而被分解，这是因为在营呼吸作用的生物的电子传递系统中发生了NADH的再氧化和ATP的生成，因此只要生物体内有一种能将电子从该化合物转移给NAD+的酶存在，而且该化合物的氧化水平低于CO2即可。能通过呼吸作用分解的有机物包括某些碳氢化合物、脂肪酸和许多醇类。但某些人造化合物对于微生物的呼吸作用具显著抗性，可在环境中积累，造成有害的生态影响。
(1) 有氧呼吸
葡萄糖经过糖酵解作用形成丙酮酸，在发酵过程中，丙酮酸在厌氧条件下转变成不同的发酵产物；而在有氧呼吸过程中，丙酮酸进入三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，简称TCA循环），被彻底氧化生成CO2和水，同时释放大量能量（图5-9）。
在三羧酸循环过程中，丙酮酸完全氧化为三个分子的CO2，同时生成四分子的NADH和一分子的FADH2。NADH和FADH2可经电子传递系统重新被氧化，由此每氧化一分子NADH可生成三分子ATP，每氧化一分子FADH2可生成两分子ATP。另外，琥珀酰辅酶A在氧化成延胡索酸时，包含着底物水平磷酸化作用，由此产生一分子GTP，随后GTP可转化成ATP。因此每一次三羧酸循环可生成15分子ATP。此外，在糖酵解过程中产生的两分子NADH可经电子传递系统重新被氧化，产生6分子ATP。在葡萄糖转变为两分子丙酮酸时还可借底物水平磷酸化生成两分子的ATP。因此，需氧微生物在完全氧化葡萄糖的过程中总共可得到38分子的ATP。如果我们假设ATP中的高能磷酸键有31.8KJ/M的能量，那么每摩尔葡萄糖完全氧化成CO2和H2O时，就有1208KJ的能量转变为ATP中高能磷酸键的键能。因为完全氧化1摩尔葡萄糖可得到的总能量大约是2822KJ，因此呼吸作用的效率大约是43%，其余的能量以热的形式散失。
在糖酵解和三羧酸循环过程中形成的NADH和FADH2通过电子传递系统被氧化，最终形成ATP为微生物的生命活动提供能量。电子传递系统是由一系列氢和电子传递体组成的多酶氧化还原体系。NADH、FADH2以及其它还原型载体上的氢原子，以质子和电子的形式在其上进行定向传递；其组成酶系是定向有序的，又是不对称地排列在原核微生物的细胞质膜上或是在真核微生物的线粒体内膜上。这些系统具两种基本功能：一是从电子供体接受电子并将电子传递给电子受体；二是通过合成ATP把在电子传递过程中释放的一部分能量保存起来。电子传递系统中的氧化还原酶包括：NADH脱氢酶、黄素蛋白、铁硫蛋白、细胞色素、醌及其化合物。
（2）无氧呼吸
某些厌氧和兼性厌氧微生物在无氧条件下进行无氧呼吸。无氧呼吸的最终电子受体不是氧，而是像NO3-、NO2-、SO42-、S2O32-、CO2等这类外源受体。无氧呼吸也需要细胞色素等电子传递体，并在能量分级释放过程中伴随有磷酸化作用，也能产生较多的能量用于生命活动。但由于部分能量随电子转移传给最终电子受体，所以生成的能量不如有氧呼吸产生的多。
?三．自养微生物的生物氧化
一些微生物可以从氧化无机物获得能量，同化合成细胞物质，这类细菌称为化能自养微生物。它们在无机能源氧化过程中通过氧化磷酸化产生ATP。
1. 氨的氧化?
NH3同亚硝酸（NO2-）是可以用作能源的最普通的无机氮化合物，能被硝化细菌所氧化，硝化细菌可分为两个亚群：亚硝化细菌和硝化细菌。氨氧化为硝酸的过程可分为两个阶段，先由亚硝化细菌将氨氧化为亚硝酸，再由硝化细菌将亚硝氧化为硝酸。由氨氧化为硝酸是通过这两类细菌依次进行的。硝化细菌都是一些专性好氧的革兰氏阳性细菌，以分子氧为最终电子受体，且大多数是专性无机营养型。它们的细胞都具有复杂的膜内褶结构，这有利于增加细胞的代谢能力。硝化细菌无芽孢，多数为二分裂殖，生长缓慢，平均代时在10h以上，分布非常广泛。
2. 硫的氧化?
硫杆菌能够利用一种或多种还原态或部分还原态的硫化合物（包括硫化物、元素硫、硫代硫酸盐、多硫酸盐和亚硫酸盐）作能源。H2S首先被氧化成元素硫，随之被硫氧化酶和细胞色素系统氧化成亚硫酸盐，放出的电子在传递过程中可以偶联产生四个ATP。亚硫酸盐的氧化可分为两条途径，一是直接氧化成SO42-的途径，由亚硫酸盐-细胞色素C还原酶和末端细胞色素系统催化，产生一个ATP；二是经磷酸腺苷硫酸的氧化途径，每-氧化一分子SO42-产生2.5个ATP。
3. 铁的氧化?
从亚铁到高铁状态的铁的氧化，对于少数细菌来说也是一种产能反应，但从这种氧化中只有少量的能量可以被利用。亚铁的氧化仅在嗜酸性的氧化亚铁硫杆菌（Thiobacillus ferrooxidans）中进行了较为详细的研究。在低pH环境中这种菌能利用亚铁放出的能量生长。在该菌的呼吸链中发现了一种含铜蛋白质（rusticyanin），它与几种细胞色素c和一种细胞色素a1氧化酶构成电子传递链。虽然电子传递过程中的放能部位和放出有效能的多少还有待研究，但已知在电子传递到氧的过程中细胞质内有质子消耗，从而驱动ATP的合成。
4. 氢的氧化?
氢细菌都是一些呈革兰氏阴性的兼性化能自氧菌。它们能利用分子氢氧化产生的能量同化CO2，也能利用其它有机物生长。氢细菌的细胞膜上有泛醌、维生素K2及细胞色素等呼吸链组分。在该菌中，电子直接从氢传递给电子传递系统，电子在呼吸链传递过程中产生ATP。在多数氢细菌中有两种与氢的氧化有关的酶。一种是位于壁膜间隙或结合在细胞质膜上的不需NAD+的颗粒状氧化酶，它能够催化以下反应：
该酶在氧化氢并通过电子传递系统传递电子的过程中，可驱动质子的跨膜运输，形成跨膜质子梯度为ATP的合成提供动力；另一种是可溶性氢化酶，它能催化氢的氧化，而使NAD+还原的反应。所生成的NADH主要用于CO2的还原。
四．能量转换
在产能代谢过程中，微生物可通过底物水平磷酸化和氧化磷酸化将某种物质氧化而释放的能量储存于ATP等高能分子中，对光合微生物而言，则可通过光合磷酸化将光能转变为化学能储存于ATP中。
1．底物水平磷酸化（substrate level phosphorylation）
物质在生物氧化过程中，常生成一些含有高能键的化合物，而这些化合物可直接偶联ATP或GTP的合成，这种产生ATP等高能分子的方式称为底物水平磷酸化。底物水平磷酸化既存在于发酵过程中，也存在于呼吸作用过程中。例如，在EMP途径中（图5-4），1，3-二磷酸甘油酸转变为3-磷酸甘油酸以及磷酸烯醇式丙酮酸转变为丙酮酸的过程中都分别偶联着一分子ATP的形成；在三羧酸循环过程中（图5-8），琥珀酰辅酶A转变为琥珀酸时偶联着一分子GTP的形成。
2．氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）
物质在生物氧化过程中形成的NADH和FADH2可通过位于线粒体内膜和细菌质膜上的电子传递系统将电子氧或其他氧化型物质，在这个过程中偶联着ATP的合成（图5-10），这种产生ATP的方式称为氧化磷酸化。一分子NADH和FADH2可分别产生3个和2个ATP。
由于ATP在生命活动中所起的重要作用，阐明ATP合成的具体机制长期以来一直是人们的研究热点，并取得丰硕成果。英国学者米切尔(P.Mitchell)1961年提出化学渗透偶联假说(chemiosmotic-coupling hypothesis),该学说的中心思想是电子传递过程中导致建立膜内外质子浓度差,从而将能量蕴藏在质子势中,质子势推动质子由膜外进入胞内,在这个过程中通过存在于膜上的F1-F0ATP酶偶联ATP的形成(图5-11)。
3．光合磷酸化（photophosphorylation）
光合作用是自然界一个极其重要的生物学过程，其实质是通过光合磷酸化将光能转变成化学能，以用于从CO2合成细胞物质。行光合作用的生物体除了绿色植物外，还包括光合微生物，如藻类、蓝细菌和光合细菌（包括紫色细菌、绿色细菌、嗜盐菌等）。它们利用光能维持生命，同时也为其它生物（如动物和异养微生物）提供了赖以生存的有机物。
第三节 耗能代谢
在上一节中，我们讨论了微生物如何将光能和化学能转变为生物能的过程。本节将阐明微生物利用这些能量合成细胞物质及其它耗能代谢的过程（如运输、运动、生物发光等生理过程）。
一. 细胞物质的合成
微生物利用能量代谢所产生的能量、中间产物以及从外界吸收的小分子，合成复杂的细胞物质的过程称为合成代谢。合成代谢所需要的能量由ATP和质子动力提供。糖类、氨基酸、脂肪酸、嘌呤、嘧啶等主要的细胞成分的合成反应的生化途径中，合成代谢和分解代谢虽有共同的中间代谢物参加，例如，由分解代谢而产生的丙酮酸、乙酰辅酶A、草酰乙酸和三磷酸甘油醛等化合物可作为生物合成反应的起始物（图5-17）。 但在生物合成途径中，一个分子的生物合成化学途径与它的分解代谢途径通常是不同的。其中可能有相同的步骤，但导向一个分子合成的途径与从该分子开始的降解途径间至少有一个酶促反应步骤是不同的。另外，需能的生物合成途径与产能的ATP分解反应相偶联，因而生物合成方向是不可逆的。其次，调节生物合成的反应，与相应的分解代谢途径的调节机制无关，因为控制分解代谢途径速率的调节酶，并不参与生物合成途径。生物合成途径主要是被它们的末端产物的浓度所调节。
1. CO2的固定
2. 生物固氮
3. 二碳化合物的同化
4．糖类的合成
5．氨基酸的合成
二. 其它耗能反应：运输、运动、生物发光
由细菌细胞产能反应形成ATP和质子动力，被消耗在各种途径中。许多能量用于新的细胞组分的生物合成，另外溶质的运动性细胞器的活动、跨膜运输及生物发光也是重要的生物耗能过程。
1. 运动
很多细菌是运动的，而且这种独立运动的能力一般是由于其具有特殊的运动细胞器，如鞭毛等。还有某些细菌可以滑动的方式在固体表面运动，某些水生细菌还可通过一种称为气囊的细胞结构调节其在水中的位置。然而，大多数可运动的原核生物是利用鞭毛运动的。在真核微生物中，鞭毛和纤毛均具有ATP酶，水解ATP产生自由能，称为运动所需的动力。目前尚未在细菌鞭毛中发现有ATP酶。细菌鞭毛转动的能量可能来自于细胞内的的质子动力，也有人认为细菌鞭毛转动的能量来自细胞内的ATP的水解。鞭毛的基部起着能量转换器的作用，将能量从细胞质或细胞膜传送到鞭毛，推动鞭毛运动。
2. 运输
微生物细胞具有很大的表面积，可以很快地、大量的从外界吸收营养物质，满足自身代谢的需要。目前认为营养物质跨膜运输有四种机制：扩散、促进扩散、主动运输和膜泡运输。其中主动运输和膜泡运输需要消耗能量。
3. 生物发光
许多活的生物体，包括某些细菌、真菌和藻类都能够发光。尽管它们的发光机制不同，但在所有例子中，发光都包含着能量的转移。先形成一种分子的激活态，当这种激活态返回到基态时即发出光来。
细菌发光涉及到两种特殊成分：荧光色素酶和一种长链脂肪族醛。另外还有黄素单核苷酸和氧的参与。NADPH是主要的电子供体（如图5-28）。虽然酶的还原不需要这种醛，但当活化的酶返回到基态时，若无醛存在，光量就低。由于生物发光与普通的电子传递争夺NADPH的电子，因此当电子体系被抑制剂阻断时，发光的强度就见增大。????????????
第四节? 微生物代谢的调节
生命活动的基础在于新陈代谢。微生物细胞内各种代谢反应错综复杂，各个反应过程之间是相互制约，彼此协调的，可随环境条件的变化而迅速改变代谢反应的速度。微生物细胞代谢的调节主要是通过控制酶的作用来实现的，因为任何代谢途径都是一系列酶促反应构成的。微生物细胞的代谢调节主要有两种类型，一类是酶活性调节，调节的是已有酶分子的活性，是在酶化学水平上发生的；另一类是酶合成的调节，调节的是酶分子的合成量，这是在遗传学水平上发生的。在细胞内这两种方式协调进行。本节着重介绍酶活性的调节，有关酶合成的调节参见第九章。
一. 酶活性调节
酶活性调节是指一定数量的酶，通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率。这种调节方式可以使微生物细胞对环境变化作出迅速地反应。酶活性调节受多种因素影响，底物的性质和浓度，环境因子，以及其它酶的存在都有可能激活或控制酶的活性。酶活性调节的方式主要有两种：变构调节和酶分子的修饰调节。
1.变构调节
在某些重要的生化反应中，反应产物的积累往往会抑制催化这个反应的酶的活性，这是由于反应产物与酶的结合抑制了底物与酶活性中心的结合。在一个由多步反应组成的代谢途径中，末端产物通常会反馈抑制该途径的第一个酶，这种酶通常被称为变构酶（allosteric enzyme）。例如，合成异亮氨酸的第一个酶是苏氨酸脱氨酶，这种酶被其末端产物异亮氨酸反馈抑制。变构酶通常是某一代谢途径的第一个酶或是催化某一关键反应的酶。细菌细胞内的酵解和三羧酸循环的调控也是通过反馈抑制进行的。
2. 修饰调节
修饰调节是通过共价调节酶来实现的。共价调节酶通过修饰酶催化其多肽链上某些基团进行可逆的共价修饰，使之处于活性和非活性的互变状态，从而导致调节酶的活化或抑制，以控制代谢的速度和方向。
修饰调节是体内重要的调节方式，有许多处于分支代谢途径，对代谢流量起调节作用的关键酶属于共价调节酶（见表5-1）。
酶促共价修饰与酶的变构调节不同，酶促共价修饰对酶活性调节是酶分子共价键发生了改变，即酶的一级结构发生了变化。而在别构调节中，酶分子只是单纯的构象变化。 在酶分子发生磷酸化等修饰反应时，一般每个亚基消耗一分子ATP，比新合成一个酶分子所耗的能量要少得多。因此，这是一种体内较经济的代谢调节方式。另外，酶促共价修饰对调节信号具放大效应，其催化效率比别构酶调节要高。
二．分支合成途径调节
不分支的生物合成途径中的第一个酶受末端产物的抑制，而在有两种或两种以上的末端产物的分支代谢途径中，调节方式较为复杂。其共同特点是每个分支途径的末端产物控制分支点后的第一个酶，同时每个末端产物又对整个途径的第一个酶有部分的抑制作用，分支代谢的反馈调节方式有多种。
1.同功酶
同功酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。同功酶对分支途径的反馈调节模见图5-29a。其特点是：在分支途径中的第一个酶有几种结构不同的一组同功酶，每一种代谢终产物只对一种同功酶具有反馈抑制作用，只有当几种终产物同时过量时，才能完全阻止反应的进行。这种调节方式的著名的例子是大肠杆菌天门冬氨酸族氨基酸的合成。有三个天门冬氨酸激酶催化途径的第一个反应，分别受赖氨酸，苏氨酸，甲硫氨酸的调节。
2. 协同反馈抑制
在分支代谢途径中，几种末端产物同时都过量，才对途径中的第一个酶具有抑制作用。若某一末端产物单独过量则对途径中的第一个酶无抑制作用（如图5-29b）。例如，在多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）合成赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸的途径中，终点产物苏氨酸和赖氨酸协同抑制天门冬氨酸激酶。
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图 5-29 酶的反馈调节模式。
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3. 累积反馈抑制
在分支代谢途径中，任何一种末端产物过量时都能对共同途径中的第一个酶起抑制作用，而且各种末端产物的抑制作用互不干扰。当各种末端产物同时过量时，它们的抑制作用是累加的（如图5-29c）。如果末端产物H单独过量时，抑制AB酶活性的40%，剩余酶活性为60%，如果末端产物Z单独过量时抑制AB酶活性的30%，当HZ同时过量时，其抑制活性为：40%+（1-40%）×30%=58%。累积反馈抑制最早是在大肠杆菌的谷氨酰胺合成酶的调节过程中发现的，该酶受8个最终产物的积累反馈抑制。8个最终产物同时存在时，酶活力完全被抑制。
? 4. 顺序反馈抑制
分支代谢途径中的两个末端产物，不能直接抑制代谢途径中的第一个酶，而是分别抑制分支点后的反应步骤，造成分支点上中间产物的积累，这种高浓度的中间产物再反馈抑制第一个酶的活性。因此，只有当两个末端产物都过量时，才能对途径中的第一个酶起到抑制作用（如图5-29d）。枯草芽孢杆菌合成芳香族氨基酸的代谢途径就采取这种方式进行调节。
第五节? 微生物次级代谢与次级代谢产物
?一. 次级代谢与次级代谢产物
一般将微生物与外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和能量的过程，称为初级代谢。次级代谢是相对于初级代谢而提出的一个概念。一般认为，次级代谢是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程。这一过程的产物，即为次级代谢产物。有人把超出生理需求的过量初级代谢产物也看作是次级代谢产物。次级代谢产物大多是分子结构比较复杂的化合物。根据其作用，可将其分为抗生素、激素、生物碱、毒素及维生素等类型。
次级代谢与初级代谢关系密切，初级代谢的关键性中间产物往往是次级代谢的前体，比如糖降解过程中的乙酰CoA是合成四环素、红霉素的前体；次级代谢一般在菌体对数生长后期或稳定期间进行，但会受到环境条件的影响；某些催化次级代谢的酶的专一性不高；次级代谢产物的合成，因菌株不同而异，但与分类地位无关；质粒与次级代谢的关系密切，控制着多种抗生素的合成。
次级代谢不象初级代谢那样有明确的生理功能，因为次级代谢途径即使被阻断，也不会影响菌体生长繁殖。次级代谢产物通常都是限定在某些特定微生物中生成，因此它们没有一般性的生理功能，也不是生物体生长繁殖的必需物质，虽然对它们本身可能是重要的。关于次级代谢的生理功能，目前尚无一致的看法。
二. 次级代谢的调节?
1. 初级代谢对次级代谢的调节
与初级代谢类似，次级代谢的调节过程中也有酶活性的激活和抑制及酶合成的诱导和阻遏。由于次级代谢一般以初级代谢产物为前体，因此次级代谢必然会受到初级代谢的调节。例如青霉素的合成会受到赖氨酸的强烈抑制，而赖氨酸合成的前体α-氨基己二酸可以缓解赖氨酸的抑制作用，并能刺激青霉素的合成。这是因为α-氨基己二酸是合成青霉素和赖氨酸的共同前体。如果赖氨酸过量，它就会抑制这个反应途径中的第一个酶，减少α-氨基己二酸的产量，从而进一步影响青霉素的合成。
2. 碳、氮代谢物的调节作用
次级代谢产物一般在菌体对数生长后期或稳定期间合成，这是因为在菌体生长阶段，被快速利用的碳源的分解物阻遏了次级代谢酶系的合成。因此，只有在对数后期或稳定期，这类碳源被消耗完之后，解除阻遏作用，次级代谢产物才能得以合成。
高浓度的NH4+可以降低谷氨酰胺合成酶的活性，而后者的比活力与抗生素的合成呈正相关性，因此高浓度的NH4+对抗生素的生产有不利影响。而另一种含氮化合物-硝酸盐却可以大幅度地促进利福霉素的合成，因其可以促进糖代谢和TCA循环酶系的活力，以及琥珀酰CoA转化为甲基丙二酰CoA的酶活力，从而为利福霉素的合成提供了更多的前体，同时它可以抑制脂肪合成，使部分用于合成脂肪的前体乙酰CoA转为合成利福霉素脂肪环的前体，另外硝酸盐还可提高菌体中谷氨酰胺合成酶的比活力。
3．诱导作用及产物的反馈抑制
在次级代谢中也存在着诱导作用，例如，巴比妥虽不是利福霉素的前体，也不掺入利福霉素，但能促进将利福霉素SV转化为利福霉素B的能力。同时，次级代谢产物的过量积累也能象初级代谢那样，反馈抑制其合成酶系（表5-2）。
此外，培养基中的磷酸盐、溶解氧、金属离子及细胞膜透性也会对次级代谢产生或多或少的影响。
小???? 结
1.?????? 微生物的代谢可分为合成代谢和分解代谢，但它是一个整体过程，保证生命活动得以正常进行。
2.?????? 微生物代谢类型多种多样。异养微生物在有氧或无氧的条件下，以有机物为生物氧化基质，氧和其它无机物为最终电子受体，通过有氧呼吸或无氧呼吸产生能量和合成细胞的前体物质。有些异养微生物在无氧的条件下以有机物为生物氧化基质和最终氢受体，产生少量能量和乳酸、乙醇、乙酸、甲酸、丁酸等发酵产物。自养微生物通过光合作用和化能合成作用，获得能量并通过同化二氧化碳和其它无机盐合成细胞物质。
3.?????? 微生物将化学能和光能转变为生物能，将这些能量用于合成细胞物质及其他耗能过程，如：运动、营养物质运输及发光等。
4.?????? 微生物的代谢受着严格的调节。微生物的代谢调节主要通过对酶的调节，包括酶合成的调节和酶活性的调节。
5.?????? 微生物次级代谢途径多样，受多种因素影响。次级代谢物种类繁多，多种具重要经济意义。
思? 考? 题
1．? 胃八叠球菌和运动发酵单孢菌产生乙醇的方式有什么不同？
2．一酵母突变株的糖酵解途径中，从乙醛到乙醇的路径被阻断，它不能在无氧条件下的葡萄糖平板上生长，但可在有氧条件下的葡萄糖平板上存活。试解释这一现象。
3．与高等动、植物相比，微生物代谢的多样性表现在哪些方面？
4．如何利用代谢调控提高微生物发酵产物的产量？
第六章 微生物的生长繁殖及其控制
计划学时：5
重点：细菌生长曲线的定义、各时期的特点、应用及生产指导意义。控制微生物生长繁殖及控制微生物生长的条件及原理。
微生物生长是细胞物质有规律地、不可逆增加，导致细胞体积扩大的生物学过程，这是个体生长的定义。繁殖是微生物生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。可以看出微生物的生长与繁殖是两个不同，但又相互联系的概念。生长是一个逐步发生的量变过程，繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。在高等生物里这两个过程可以明显分开，但在低等特别是在单细 胞的生物里，由于细胞小这两个过程是紧密联系又很难划分的过程。因此在讨论微生物生长时，往往将这两个过程放在一起讨论，这样微生物生长又可以定义为在一定时间和条件下细胞数量的增加，这是微生物群体生长的定义。
第一节 细菌的个体生长
细菌的个体生长包括细胞结构的复制与再生、细胞的分裂与控制，本节主要介绍细菌部分结构的复制和细菌分裂与控制等有关内容：
一、染色体DNA的复制和分离
细菌的染色体为环形的双链DNA分子。在细菌个体细胞增长的过程中，染色体以双向的方式进行连续的复制，在细胞分裂之前不仅完成了染色体的复制，而且也开始了二个子细胞DNA分子的复制，例如在迅速生长的细菌里就存在这种情况。也就是说，当细胞的一个世代即将结束时，不仅为即将形成的二个子细胞各备有一份完整的亲本的遗传信息，而且也具有已经按亲本的方式开始复制的基因组(图6-1)。其复制起点附着在细胞膜上随着膜的生长和细胞的分裂，二个未来的子体基因组不断地分离开来， 最后到达2个子细胞中。细菌在个体生长过程中通过染色体DNA的复制，使其遗传特性能保持高度的连续性和稳定性。
二、细胞壁扩增
细胞壁是细胞外的一种"硬"性结构。细胞在生长过程中，细胞壁只有通过扩增，才能使细胞体积扩大。在细胞壁扩增过程中，细胞壁在什么位点扩增，以及它如何扩增这是两个主要问题，根据研究结果表明：杆菌在生长过程中，新合成的肽聚糖在细胞壁中是新老细胞壁呈间隔分布，证明新合成的肽聚糖不是在一个位点而是在多个位点插入；而球菌在生长过程中，新合成的肽聚糖是固定在赤道板附近插入，导致新老细胞壁能明 显地分开，原来的细胞壁被推向两端。
新合成的细胞壁成分肽聚糖如何插入到原来的细胞壁上肽聚糖短肽中第三个氨基酸是含二个氨基的氨基酸，它通过本身的氨基与另一个肽聚扩短肽中第四个氨基酸的羧基相连接形成肽键，使之形成一个完整的整体。新合成的肽聚糖可以通过本身的二氨基氨基酸的氨基连到原来的细胞壁肽聚糖短肽中第四个氨基酸的羧基上，或通过新合成肽聚糖短肽中第四个氨基酸的羧基连到原来细胞壁肽聚糖短肽中第三位的二氨基氨基酸的游离氨基上，导致细胞壁肽聚糖链的扩增。地衣芽孢杆菌的肽聚糖是以前面一种方式扩增。这样从分子水平上说明了细胞壁扩增的方式。
三、细菌的分裂与调节
当细菌的各种结构复制完成之后就进入分裂时期。此时在细菌长度的中间位置，通过细胞质膜内陷并伴随新合成的肽聚糖插入，导致横隔壁向心生长，最后在中心会合，完成一次分裂，将一个细菌分裂成两个大小相等的子细菌。
细胞在生长和分裂过程中都伴随有细胞壁的裂解和闭合两个过程，前者将细胞壁打开，有利于合成的细胞壁物质插入；后者则是在新合成的细胞壁物质插入后的开口处重新闭合形成一个完整的细胞壁，以利于机体生存。目前已知作用于细胞壁肽聚糖的酶，有作用于双糖链的N-乙酰葡萄糖胺酶和N-乙酰胞壁酸酰胺酶；作用于肽聚糖短肽链的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸酰胺酶，D.D-羧肽酶，转肽酶，内肽酶和L.D-羧肽酶。它们在细菌细胞壁的打开和闭合中起着重要作用。
细菌的生长和分裂是两个重要过程，这两个过程如何协调，其机理不完全了解，根据目前的某些资料认为转肽酶和D.D-羧肽酶的活性比在生长和分裂两个过程中起着重要作用。转肽酶可以催化两个肽聚糖短肽链的连接，D.D-羧肽酶则是催化肽聚糖的五肽转变成四肽并放出一个丙氨酸。在某些细菌里，肽聚糖的五肽在转肽反应中主要是作为另一个短肽的羧基供体， 即通过本身第四个氨基酸的羧基与另一个短肽中第三个氨基酸的游离氨基相连接；肽聚糖中的四肽在转肽反应中主要是作为另一个短肽链的羧基受体，即通过本身第三个氨基酸的游离氨基与另一短肽上第四个氨基酸的羧基相连接。转肽酶活性比羧肽酶活性高，新合成的肽聚糖中四肽单位比五肽单位的比率低，有利于细胞壁扩增，导致细菌生长；转肽酶活性比羧 肽酶活性低，新合成的肽聚糖四肽单位比五肽单位的比率高，细胞壁合成部位中四肽单位数量多，可以接受更多新合成的肽聚糖，有利于横隔壁形成，导致细胞分裂。对不同生长阶段的细胞内这两种酶的活性变化进行分析的结果也说明了这点，例如分裂前的细胞内羧肽酶的活性高，而在刚完成分裂产生的子细胞内转肽酶的活性高。
第二节 细菌的群体生长繁殖
除真菌外，我们肉眼看到或接触到的微生物已不是单个，而是成千上万个单个的微生物组成的群体。微生物接种是群体接种，接种后的生长是微生物群体繁殖生长。本节扼要介绍细菌群体生长的特点与一般规律。
一、细菌群体生长规律
细菌接种到均匀的液体培养基后，当细菌以二分裂法繁殖，分裂后的子细胞都具有生活能力 ，并且不补充营养物质或移去培养物，保持整个培养液体积不变时，以时间为横座标，以菌数为纵座标，那么根据不同培养时间里细菌数量的变化，可以作出一条反映细菌在整个培养 期间菌数变化规律的曲线，这种曲线称为生长曲线(Growth Curve)。一条典型的生长曲线至少可以分为迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期等四个生长时期(图6-2)。
图6-2 细菌生长曲线
1、迟缓期(Lag phase)
细菌接种到新鲜培养基而处于一个新的生长环境，因此在一段时间里并不马上分裂，细菌的数量维持恒定，或增加很少。此时胞内的RNA、蛋白质等物质含量有所增加，相对地此时的细胞体积最大，说明细菌并不是处于完全静止的状态。产生迟缓期的原因，认为是微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏足够的能量和必需的生长因子，种子老化(即处于非对数生长期)或未充分活化，接种时造成的损伤等。在工业发酵和科研中迟缓期会增加生产周期而产生不利的影响，但是迟缓期无疑也是必需的，因为细胞分裂之前，细胞各成分的复制与装配等也需要时间，因此应该采取一定的措施，如(1)通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；(2)利用对数生长期的细胞作为种子；(3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；(4)适当扩大接种量等方式缩短迟缓期，克服不良的影响 。
2、对数生长期(Log phase)
又称指数生长期(Exponential phase)。细菌经过迟缓期进入对数生长期，并以最大的速率生长和分裂，导致细菌数量呈对数增加，而且细菌内各成分按比例有规律地增加，很明显此时期内的细菌生长是平衡生长。对数生长期细菌的代谢活性、酶活性高而稳定，大小比较一致，生活力强，因而它广泛地在生产上用作种子和在科研上作为理想的实验材料。
3、稳定生长期(Stationary phase)
由于营养物质消耗，代谢产物积累和PH等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零(即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数)，结束对数生长期，进入稳定生长期。稳定生长期的活细菌数最高并维持稳定。如果及时采取措施，补充营养物质或取走代谢产物或改善培养条件，如对好氧菌进行通气、搅拌或振荡等可 以延长稳定生长期，获得更多的菌体物质或代谢产物。
4、衰亡期(Decline或Death phase)
营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率逐步增加和活细菌逐步减少，标志进入衰亡期。该时期细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶。该时期死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低。
此外，不同的微生物，甚至同一种微生物对不同物质的利用能力是不同的。有的物质可直接被利用(例如葡萄糖或NH4+等)；有的需要经过一定的适应期后才能获得利用能力(例如 乳糖或NO3-等)。前者通常称为速效碳源(或氮源)，后者称为迟效碳源(或氮源)。当培养基中同时含有这两类碳源(或氮源)时，微生物在生长过程中会形成二次生长现象。
二、生长的数学模型
任何一数学公式所表示的数学关系，只要能反映客观物质的运动规律，都可视其为数学模型 。利用数学公式来表达微生物系统的某些定量关系，该数学公式便是此系统的数学模型。现代生物学研究的特点之一是从定性逐步走向定量，用数学模型能较明确地表达生命现象的动 态过程，数学模型在现代微生物学中的应用越来越重要。
对数生长期中微生物生长速率变化规律的研究有助于推动微生物生理学与生态学基础研究和解决工业发酵等应用中的问题。对数生长期中微生物生长是平衡生长，即微生物细胞数量呈对数增加和细胞各成分按比例增加。因此对数生长期中微生物的生长可用数学模型(Mathema tics for growth)表示。
dN/dt＝μN(或dM/dt＝μM或dE/dt＝μE) (1)
N：每毫升培养液中细胞的数量；
M：每毫升培养液中细胞物质的量；
E：每毫升培养液中其他细胞物质的量；
μ：比生长速率(Specific growth rate)，即每单位数量的细菌或物质在单位时间(小时)内增加的量；
t：培养时间(小时)。
对dN/dt＝μN积分，得
lnNt－lnN0＝μ(t1－t0) (2)
将上式转换成以10为底的对数：
logNt－logN0＝μ(t1－t0)/2.303(3)
Nt与N0分别代表时间t和t0时的细胞数量。因此只要测定从N0增加到Nt所用的时间和N0与Nt的量，就可以由上式求出该条件下的μ。例如t0时每毫升培养液中细胞数的为104，经过4小时后该培养液中细胞数量增加到每毫升108(Nt)，则此条件该菌的比生长速率为 ：
μ＝(logNt－logNo)×2.303/t－t0＝(8－4)×2.303/4/小时＝2.303/小时。
说明该菌在此条件下，每个细菌以每小时增加2.303个细菌的速度增加。
在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间为代时(Generation time)，在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间称为倍增时间(Doubling time)代时通常以G表示。根据公式(2)可以求代时与比生长速率之间的关系：
∵Ｇ＝t－t0 Nt＝2N0 ∴G＝（lnNt－lnN0）／μ＝ln（Nt／N0）／μ ＝ln2／μ＝0.693／μ
如果仍以上述例子的数量为依据，就可以求出该细菌在此条件下的代时为0.3小时：
G＝0.693／μ＝0.693／2.303＝0.3(小时)
也可以用一般常用的先求出细菌繁殖的世代数(n)，然后再求G，即n=（lgNt-lgN0）／lg2=（lgNt-lgN0）／0.301
G=（t1-t0）／n=（t1-t0）／3.322（lnNt－lnN0）
代时在微生物中变化很大，一般为一小时左右，但生长快的微生物在条件适宜时还不到10分钟。
三、主要生长参数
微生物生长过程中，迟缓时间、比生长速率和总生长量三个主要参数在生产实践中有着重要的参考意义。
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1. 迟缓时间(T)
微生物在生长过程中，在实际条件下达到对数生长期所需时间与理想条件(即无迟缓期)下达 到对数生长期所需时间之差。迟缓时间还可以用作图方法求出，例如菌数由N0增加到Nt，实际上所用的时间为Tp；如果不存在迟缓时间，则所需要的时间为Ti ，这时Tp与Ti之间的差，即为该菌在此生长条件下的迟缓时间(图6-3)。在曲线上从Tp作平行纵坐标的直线与理想生长曲线相交，该交点为不存在迟缓时间时所应达到的菌数( Ni)，这时Ni与Np之间的差值为迟缓生长量，即为迟缓期存在所未能达得理想数量的那部分生长量。
迟缓时间长短客观反映了细菌生长条件适合程度。在生产实践中，这个时间越短越好。迟缓生长量则反映了迟缓期给细胞物质的工业化生产所造成的损失。
2.比生长速率
比生长速率与微生物的生长基质浓度密切相关。目前一般用莫诺(Monod)经验公式表示比生长速率与生长基质浓度之间的关系：
μ＝μm·(S／（Ks+S）)
μm:最大比生长速率 ；
S:生长的基质浓度；
Ks：比生长速率为最大比生长速率一半时的基质浓度。在同种基质里它是一个常数，Ks通常很小；根据莫诺经验公式，当基质浓度很高时，Ks可以忽略不计，Ks+S＝S此时，μ＝μm ，细菌以最大比生长速率生长。对数生长期细菌的生长就属于这种情况；当基质浓度很低时 ，Ks+S＝Ks，则μ＝（μm／Ks）·S，此时，比生长速率与基质浓度成正比，基质浓度变化引起比生长速率迅速变化。
3.总生长量
总生长量代表在某一时间里，通过培养所获得的微生物总量与原来接种的微生物量之差值，总生长量大小客观上也反映了培养基与生长条件是否适合于菌的生长。与总生长量相关的另一个参数--产量常数(K)，它代表了在培养过程中所获得的总生长量与获得这总生长量所消耗基质总量之比，即：
K＝总生长量／所消耗基质的总量
K值大小代表微生物对基质同化的效率，反映了微生物利用某种基质生长的效果，因此在生产实践中应采取有效措施，提高K值以创造更大的经济效益。
四、同步培养
微生物个体生长是微生物群体生长的基础。但群体中每个个体可能分别是处于个体生长的不同阶段，因而它们的生长、生理与代谢活性等特性不一致，出现生长与分裂不同步的现象。 同步培养(Synchronous culture)是一种培养方法，它能使群体中不同步的细胞转变成 能同时进行生长或分裂的群体细胞。以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长方式称为同步生长。通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物。同步培养物常被用 来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。
用一般培养方法获得的细胞通常是不完全同步的细胞，就是同步培养方法获得的同步细胞经几次传代之后，也会出现不同步的现象。如何使不同步转变为同步，以及如何使用同步细胞能较长时间地保持同步，这是同步培养中要研究的课题。
同步培养方法很多，可归纳为机械法与环境条件控制两类。
1. 机械方法
这是一类根据微生物细胞在不同生长阶段的细胞体积与质量或根据它们同某种材料结合能力不同的原理设计出来的方法。其中常用的有：
(1)离心方法
将不同步的细胞培养物悬浮在不被这种细菌利用的糖或葡聚糖的不同梯度溶液里，通过密度一梯度离心将不同细胞分布成不同的细胞带，每一细胞带的细胞大致是处于同一生长期的细胞，分别将它们取出进行培养，就可以获得同步细胞(图6-4)。
(2)过滤分离法
将不同步的细胞培养物通过孔径大小不同微孔滤器，从而将大小不同的细胞分开，分别将滤液中的细胞取出进行培养，获得同步细胞。
(3)硝酸纤维素滤膜法
根据细菌能紧紧结合到硝酸纤维素滤膜上的特点，将细菌悬液通过垫有硝酸纤维素滤膜的过过滤器，然后将滤器颠倒过来，再将培养基流过滤器，以洗去未结合的细菌，然后将滤器放入适宜条件下培养一段时间，其后仍将培养基流过滤器，这时新分裂产生的细菌被洗下，分部收集并通过培养获得同化细胞(图6-4)。
2. 环境条件控制技术
这类技术是根据细菌生长与分裂对环境因子要求不同的原理设计的一类获得同步细菌的方法。
(1)温度
最适生长温度有利于细菌生长与分裂，不适宜温度如低温不利于细菌生长与分裂。通过适宜与不适宜温度的交替处理之后，通过培养可获得同步细胞。
(2)培养基成份控制
培养基中的碳、氮源或生长因子不足，可导致细菌缓慢生长直至生长停止。因此将不同步的细菌在营养不足的条件下培养一段时间，然后转移到营养丰富的培养基里培养，能获得同步细胞。另外也可以将不同步的细胞转接到含有一定浓度的，能抑制蛋白质等生物大分子合成的化学物质如抗生素等的培养基里，培养一段时间后，再转接到完全培养基里培养也能获得同步细胞。
(3)其他
对于光合细菌可以将不同步的细菌经光照培养后再转到黑暗中培养，这样通过光照和黑暗交替培养的方式可获得同步细胞；对于不同步的芽孢杆菌培养至绝大部分芽孢形成，然后经加热处理，杀死营养细胞，然后转接到新的培养基里，经培养可获得同步细胞。
环境条件控制获得同步细胞的机理不完全了解。这种处理可能是导致胞内某些物质合成，它合成和积累可导致细胞分裂，从而获得同步细胞。
五、连续培养
连续培养(Continous culture of microorganisms)是在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并 能持续生长下去的一种培养方法。根据生长曲线，营养物质的消耗和代谢产物的积累是导致微生物生长停止的主要原因。因此在微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移 出培养物是实现微生物连续培养的基本原则。
在连续培养里，培养容器中细菌的数量一方面以比生长速率的数量增加，同时又在以稀释率的数量减少。它们分别是：
菌数增加速率：dN/dt＝μN
菌数减少速率：dN/dt＝(f/V)·N＝DN
N：培养容器中的细菌数；
f:培养液流出的速率(或称为流加速率)(L/h)
V：培养容器中的有效体积；
D：稀释率，即培养基每小时流过培养容器的体积数。
稀释率的例数(1/D)表示流入的培养基在培养容器中停留的时间。例如当 D=2时，则表示流入的培养基在培养容器中停留时间为半小时。
当连续培养未达到平衡状时，培养容器中净增加的细菌数为：
dN＝μN－DN＝(μ－D)N (4)
该式反映了连续培养中菌数变化的规律：当μ＞D时，培养容器中细菌数会不断增加，因此在培养过程中营养物质不断消耗和代谢产物不断积累，导致细菌生长停止；当μ＜D时，培养容器中细菌数会因不断稀释而减少，直至全部被稀释掉，当μ＝D时，培养容器中细菌数可以维持在一定水平上，表明连续培养达到平衡状态，此时公式μ＝μm·(S/（Ks+S）)可以改为D＝μm·(S/（Ks+S）)解方式得：
S＝Ks·（D/（μm－D）） (5)
该方程表示了连续培养平衡状态中营养物质浓度变化与稀释率之间的关系。在平衡生长状态时，培养液内某营养物质浓度保持恒定，因此加到培养容器的某种营养物质浓度(DSi)等于机体生长所消耗的营养物质(dS/dt)与稀释时流出营养物质(DS0)之和。
DSi＝（dS/dt）+DS0 (6)
Si：流入培养基中某营养产物质的浓度；
S0：流出培养液中同种营养物质的浓度；
dS/dt：培养过程中，同种营养物质利用的速率。
连续培养有两种类型，恒化器连续培养和恒浊器连续培养(图6-5)。前者是在整个培养过程 中通过控制培养基中某种营养物质的浓度基本恒定的方式，保持细菌的比生长速率恒定，使生长"不断"进行。培养基中的某种营养物质通常是作为细菌比生长速率的控制因子，这类因子一般是氨基酸和氨等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，生长因子等物质。恒化器连续培养通常用于微生物学的研究，筛选不同的变种。后者主要是通过连续培养装置中的光电系统控制培养基中菌体浓度恒定、使细菌生长连续进行的一种培养方式。菌液浓度大小通过光电系统调节稀释率来维持菌数恒定，此种培养方式一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业，从而获得更好的经济效益。
第三节 真菌的生长与繁殖
真菌的生长繁殖，除与细菌有的方面相同外，有其独特的一面。分别介绍如后。 一、丝状真菌的生长繁殖 丝状真菌的生长与繁殖的能力很强，而且方式各种各样，菌丝的断片可以生长繁殖，发育成新个体，一般称此为断裂增殖，而自然界，主要靠形成各种无性和(或)有性孢子生长繁殖。 1.断裂增殖
菌丝的生长是顶端生长，菌丝各个部分都有极性之分，即位于前端的为幼龄菌丝，位于后面的为老龄菌丝。菌丝断片也有前后之分，它被接种到新鲜培养基里和在培养过程中，在菌丝断片的幼龄端会重新形成新的生长点，通过顶端生长使菌丝延长。这条菌丝又可以产生分支菌丝。在生长过程中，菌丝分支的密度同营养状况密切相关，营养丰富，分支点与菌丝生长顶端的距离短，即分支多而频繁，营养贫乏分支点同菌丝生长顶端距离长，即分支少。菌丝如果断裂成断片，这些断片又可长成新的菌丝，菌丝在固体培养基或在液体培养基中静止培养时形成菌落，在液体培养基中振荡培养时则形成菌丝球。一般菌丝生长到一定阶段先行生无性孢子，进行无性繁殖，到后期，在同一菌丝体上产生有性繁殖结构，形成有性孢子，进行有性繁殖。 2.无性孢子繁殖
无性繁殖是指不经过两性细胞的结合，只是营养细胞的分裂或营养菌丝的分化(切割)而形成同种新个体的过程。菌丝断片和无性孢子的生长繁殖，都属于无性繁殖。丝状真菌的无性孢子及其特征如表6-1和图6-6。
以孢子开始的生长包括有孢子肿胀、萌发管形成和菌丝生长三个阶段。孢子肿胀是孢子在适宜条件下，通过吸水和代谢等过程使孢子体积扩大，但仍呈球形。根据在孢子肿胀过程中是否需要外源提供营养物质，可以将肿胀分为两个时期，即内源肿胀期与外源肿胀期，前者只吸收水不需外源提供营养物质，而是利用孢子本身的营养物质合成细胞壁等物质插入到孢子壁上导致孢子体积扩大；后者则是在内源肿胀期基础上进行的，并需要外源提供营养物质才能完成的肿胀过程。在肿胀期新合成的细胞壁物质不是固定在一个部位、而是均匀地在孢子壁的多个部位插入，这是一个非极性的孢子生长的过程。孢子经过肿胀期进入萌发期，此阶段孢子继续吸收营养物质和合成新的细胞壁物质，并固定在孢子壁的一个位置即萌发孔插入，形成萌发管。很明显细胞壁物质插入孢子壁形成萌发管是一个极性的生长过程。萌发管继续生长最后发育成菌丝。菌丝生长是在菌丝顶端完成的，即菌丝的生长点在顶端，因此菌丝的生长又称为顶端生长。 菌丝生长到一定阶段，新合成的壁物质除用于顶端生长外，还有一部分能在距离顶端的一定位置插入，导致产生分支的菌丝。原来的菌丝与分支菌丝通过顶端生长使之延长，它们在生长过程中各自以类似的方式又会产生新的分支，重复这个过程可以产生更多的分支。菌丝生长到一定阶段则产生孢子，又进行新一轮生长繁殖。
3.有性孢子繁殖
经过两个性细胞结合而产生新个体的过程为有性生殖。丝状真菌有性繁殖复杂而多种多样，但一般都分为三个阶段：第一阶段是质配(plasmogamy)。两个性细胞接触后结合在一起，细胞质融合，但两个核暂不融合，称为双核细胞，每个核的染色体数目都是单倍的，可用n+n表示；第二阶段为核配(karyogamy)。质配后，两个核融合(或结合)，产生二倍体接合子核，可用2n表示。在低等真菌中，质配后立即核配，而高等真菌中，质配后并不立即核配，常有双核阶段。在此期间，双核在细胞中甚至又可同时分裂；第三阶段是减数分裂(meiosis)。大多数真菌核配后立即减数分裂，核中的染色体数目又恢复到单倍体状态。 有性繁殖方式因菌不同而异。有的丝状真菌两条营养菌丝就可以直接接合，如毛霉目中的一些种。但多数丝状真菌，则由菌丝分化形成特殊的性细胞(器官)，如配子囊，它们相互交配，然后形成有性孢子。丝状真菌主要有性孢子的特征如表6-2。这些特征，常作为丝状真菌分类的依据。 4.丝状真菌的生活史
丝状真菌从一种孢子开始，经过一定的生长殖繁，其中包括无性繁殖和有性繁殖两个阶段，最后又产生同一种孢子，这一循环称为丝状真菌的生活史。真菌的生活史多种多样，差异也较大。较典型的是：丝状真菌的菌丝体(营养体)在适宜条件下产生无性孢子，无性孢子萌发形成新的菌丝状，如此重复多次，此为生活史中的无性繁殖阶段，当菌生活繁殖一定时间后，在一定条件下，开始有性繁殖，即从菌丝体上分化出特殊的性细胞(器官)，或两条异性营养菌丝进行接合，经过质配、核配，形成双倍体细胞核，最后经过减数分裂形成单倍体孢子，这类孢子萌发再形成新的菌丝体。这就是一般丝状真菌生活史的一个循环周期。图6-7和6-8为两种丝状真菌的生活史。
二、酵母的生长繁殖
大多数酵母菌为单细胞，呈卵园形，其细胞直径常是细菌的10倍左右，宽约1-5μm，长约5-20μm。但各种酵母的形态、大小差别很大，同种酵母也因菌龄及环境的不同而有差异。有些酵母与其子代细胞连在一起成为链状，称为假丝酵母，如解脂假丝酵母(Candida lipolytica)。酵母菌的细胞结构、功能与其它真核生物基本相同(图6-9)。在第三章中已叙述。本节介绍其生长繁殖。
?酵母菌的繁殖方式多种多样，主要的方式归结为：
无性繁殖： 芽殖(budding)：酵母菌的主要繁殖方式，各属酵母菌
裂殖(fission)、少数酵母，如裂殖酵母属酵母
产生无性孢子：掷孢子(掷孢酵母属)；节孢子(地霉属)；厚垣孢子(白假丝酵母)
有性繁殖： 形成子囊孢子(ascospore)进行有性繁殖。
酿酒酵母在营养丰富和适宜条件下生长时，新合成的细胞壁物质通常在细胞的顶部插入，导致细胞壁的扩增，以容纳更多的原生质。当生长达到细胞的同等大小时，细胞向外凸起，形成一个芽，随之新合成的细胞壁物质不断地在芽与细胞之间的部位插入，导致芽不断长大，同时复制的核与原生质被导入芽内，最后在芽与细胞之间形成横隔壁，并与原来的细胞(母细胞)分离，产生一个新的酵母细胞，此时在母细胞表面上留下一个园形突起的芽痕，在新产生的酵母细胞上留下一个蒂痕。母细胞继续生长再次向外凸起形成新的芽，但新的芽决不会在芽痕上产生。电镜观察可以看到母细胞上有多达23个以上的芽痕，按酵母菌细胞的平均体积计算，每个细胞表面可容纳100个左右的芽痕，但一个酵母细胞不可能无限地进行芽殖，因此，可以通过细胞表面芽痕的数量大约可以估计细胞的年龄。根据酵母菌每次芽殖的部位与数量不同，又有单极，双极和多极芽殖之分，单极芽殖是酵母菌在细胞一端形成一个芽，其代表是瓶球酵母；双极芽殖是酵母菌在每次芽殖时，在细胞的两极可以各形成一个芽，如汉逊氏酵母；多极芽殖则是能在细胞的多个位点上产生多个芽，酿酒酵母就是以这种方式进行繁殖的。
除了芽殖外，裂殖酵母和内孢霉等生长到一定阶段，可以通过裂殖，即细胞长到一定大小后，核分裂，细胞中产生一隔膜被一分为二，经断裂产生新的子细胞。还有少数酵母菌产生无性孢子进行繁殖，如掷孢酵母产生的掷孢子，孢子被弹射出而得以繁殖。不论是芽殖、裂殖还是无性孢子，细胞核没有经过减数分裂，这属于无性繁殖。
由于酵母菌的生长与无性繁殖，营养物质的大量消耗和代谢产物的积累，酵母菌停止芽殖，此时通过细胞核的减数分裂等过程，在细胞内产生两种性质不同的四个单倍体细胞--子囊孢子，即两个a细胞和两个α细胞，这种含有四个子囊孢子的酵母菌细胞又称为子囊。子囊孢子各自可以通过出芽产生更多的子囊孢子。a细胞和α细胞分别可以产生a因子和α因子，它们分泌出来分别可以使对方的生长停止在染色体复制开始之前的阶段，这类因子被称为外激素(Pheromone)。这两类子囊孢子在营养等条件适宜时，通过a因子与α因子的相互识别，使a细胞与α细胞相互接触，经质配、核配，最后融合成一个2倍体的合子细胞，进行生长并以芽殖的方式继续生长繁殖，这是酿酒酵母一类酵母的生活史(图6-10)，酵母还有其它类型的生活史，使酵母菌在自然界能很好地适应环境，得以生存。?
第四节 环境对生长的影响及生长的测定
生长是微生物同环境相互作用的结果。在分批培养中生长曲线是在正常培养条件下，反映微生物接种后的培养过程中菌数变化同培养时间之间的关系。微生物在培养过程中，环境的变化会对微生物生长产生很大的影响。这种影响通常通过培养一定时期的生长量变化反映出来，因此生长量的测定成为衡量环境影响的一个重要内容。
一、环境对微生物生长的影响
影响微生物生长的主要因素有营养物质，水的活性，温度，pH和氧等。
1. 营养物质
营养物质不足导致微生物生长所需要的能量、碳、氮源、无机盐等成分不足，此时机体一方面降低或停止细胞物质合成，避免能量的消耗，或者通过诱导合成特定的运输系统，充分吸收环境中微量的营养物质以维持机体的生存；另一方面机体对胞内某些非必要成分或失效的成分进行降解以重新利用，这些非必需成分是指胞内贮存的物质、无意义的蛋白质与酶、mRNA等。例如在氮、碳源缺乏时，机体内蛋白质降解速率比正常条件下的细胞增加了七倍，同时减少tRNA合成和降低DNA复制的速率，导致生长停止。
2. 水的活性(Water activity, aw.)
水是机体中的重要组成成分，它是一种起着溶剂和运输介质作用的物质，参与机体内水解、缩合、氧化与还原等反应在内的整个化学反应，并在维持蛋白质等大分子物质的稳定的天然状态上起着重要作用。微生物在生长过程中，对培养基的aw有一定的要求，每种微生物生长都有最适的aw，高于或低于所要求的aw值，都会通过影响培养基的渗透压力变化而影响微生物的生长速率。微生物不同，生长所需要的最适aw值也不同(表4-7)。
从表中可以看出一般细菌生长所需要的aw值高，真菌生长所需aw值较低。
3. 温度
根据微生物生长的最适温度不同，可以将微生物分为嗜冷、兼性嗜冷、嗜温 、嗜热和嗜高温等五种不同的类型。它们都有各自的最低、最适和最高生长温度范围 (表6-3)
表6-4列出五种类型微生物中的一些典型例子。温度的变化都会对每种类型微生物的代谢过程产生影响，通过改变它们的生长速率，以适应温度的变化而生存。
温度对微生物生长的影响具体表现在：
①对酶活性的影响
微生物生长过程中所发生的一系列化学反应绝大多数是在特定酶催化下完成的，每种酶都有最适的酶促反应温度，温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞物质合成；
②影响细胞质膜组分的流动性
温度高组分流动性大，有利于物质的运输，温度低流动性降低，不利于物质运输。因此温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌；
③影响物质的溶解度
物质只有溶于水才能被机体吸收或分泌，除气体物质以外，温度上升物质的溶解度增加，温度降低物质的溶解度降低，最终影响微生物的生长。
4. pH
微生物生长过程中机体内发生的绝大多数的反应是酶促反应，而酶促反应都有一个最适pH范围，在此范围内只要条件适合，酶促反应速率最高，微生物生长速率最大，因此微生物生长也有一个最适生长的pH范围。此外微生物生长还有一个最低与最高的pH范围，低于或高出这个范围，微生物的生长就被抑制，微生物不同生长的最适、最低与最高的pH范围也不同(表6-5)
表6-5 一般微生物生长的pH范围
微生物
最低pH
最适pH
最高pH
细菌
3-5
6.5-7.5
8-10
酵母菌
2-3
4.5-5.5
7-8
霉菌
1-3
4.5-5.5
7-8
pH通过影响细胞质膜的透性、膜结构的稳定性和物质的溶解性或电离性来影响营养物质的吸收，从而影响微生物的生长速率。质子是一种唯一不带电子的阳离子，它在溶液里能迅速地与水结合成水合氢离子(H3O+等)。在偏碱性条件下，OH-占优势，水合氢离子和OH-对营养物质 的溶解度和离解状态，细胞表面电荷平衡和细胞的胶体性质等方面均会产生重大影响；在酸性条件下， H+可以与营养物质结合，并能从可交换的结合物或细胞表面置换出某些阳离子，从而影响细胞结构的稳定性；同时由于pH值较低，CO2溶解度降低，某些金属离子如Mn2+、Ca2+、Mo2+等溶解度增加，导致它们在溶液中的浓度增加，从而对机体产生不利的作用。
5. 氧
根据氧与微生物生长的关系可将微生物分为好氧，微好氧、氧的忍耐型、兼性厌氧 和专性厌氧五种类型(表6-6)，它们在液体试管中的生长特征见图6-11。?
因此，在培养不同类型的微生物时，一定要采取相应的措施保证不同类型的微生物能正常生长。例如培养好氧微生物可以通过振荡或通气等方式使之有充足的氧气供它们生长；培养专性厌氧微生物则要排除环境中的氧，同时通过在培养基中添加还原剂的方式降低培养基的氧化还原电势；培养兼性厌氧或氧的忍耐型微生物，可以用深层静止培养的方式等。
表6-6 微生物与氧的关系
微生物类型
最适生长的O2浓度的(V/V)
好氧
等于或大于20%
微好氧
2-10%
氧的忍耐型
2%以下
兼性厌氧
有氧或无氧
专性厌氧
不需要氧、有氧时死亡
?
氧对于好氧微生物生长虽然可以通过好氧呼吸产生更多的能量，满足机体的生长，但另一方面氧对一切生物都会使其产生有毒害作用的代谢产物如超氧基化合物与H2O2，这两种代谢产物互相作用还会产生毒性很强的自由基OH·：
自由基是一种强氧化剂，它与生物大分子互相作用，可导致产生生物大分子自由基， 从而对机体产生损伤或突变作用，直至死亡。氧之所以对专性厌氧微生物以外的其他四种类型微生物不产生致死作用，是因为它们具有超氧物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)可催化O2-·分解成H2O2，然后在H2O2酶(Catalase)作用下生长水。
H2O2的毒性比O2-·弱，它可使细胞内的其他代谢产物氧化而降低其毒性，目前所 H2O2酶不存于氧忍型和专性厌氧两类微生物(表6-7)。
表6-6 超氧物歧化酶与过氧化氢酶在微生物中的分布
微生物
超氧物歧化酶
(U/mg)
过氧化氢酶
(U/mg)
好氧与兼性厌氧微生物：
大肠杆菌
1.8
6.1
鼠伤寒沙门氏菌
1.4
2.4
大豆根瘤菌
2.6
0.7
耐辐射微球菌
7.0
289.0
假单胞菌
2.0
22.5
氧忍耐型细菌：
粘液真杆菌
1.6
0
粪链球菌
0.8
0
乳链球菌
1.4
0
乳清酸核菌
0.6
0
严格厌氧菌：
产碱韦荣氏球菌
0
0
巴氏梭菌
0
0
斯氏梭菌
0
0
巴氏芽孢梭菌
0
0
溶纤维丁酸孤菌
0
0
?
二、微生物生长的测定
微生物生长情况可以通过测定单位时间里微生物数量或生物量(Biomass)的变化来评价。通过微生物生长的测定可以客观地评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响，或评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果，或客观地反映微生物生长的规律。因此微生物生长的测量在理论上和实践上有着重要的意义。
微生物生长的测定有计数、重量和生理指标等方法。
1. 计数法
此法通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物的数量。计数法又分为直接计数和间接计数两类。
(1)直接计数
这类方法是利用特定的细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点不能区分死菌与活菌。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积1mm2和高0.1mm的计数室，在1mm2的面积里又被刻划成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，但计数室都是由400个小格组成(图6-12)。
将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计算4-5个中格的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按下面公式求出每毫升样品所含的细菌数。
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×1000×稀释倍数
(2)间接计数法
此法又称活菌计数法，其原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。将待测样品经一系列十倍释释，直至每个平皿含菌落数在30-150个之间。然后选择三个稀释度的菌液，分别取0.2ml放入无菌平皿，再倒入适量的已溶化并冷至45℃左右的培养基，与菌液混匀，冷却、待凝固后，放入适宜温度的培养箱或温室培养，长出菌落后，计数，按下面公式计算出原菌液的含菌数：
每毫升原菌液活菌数＝同一稀释度三个以上重复平皿菌落平均数×稀释倍数×5
图6-13是活菌计数的一般过程。此法还可以将稀释的菌液取0.2ml加到已凝固的固体培养基平皿上，然后用无菌涂棒将菌液涂布整个平皿表面，然后放入适宜温度下培养，计算菌落数，再按上式计算出每毫升原菌液的所含活菌总数。
此法可因操作不熟练或造成污染、或培养基温度过高损伤细胞等原因造成结果不稳定。尽管如此，由于该方法能测出样品中微量的菌数，仍是教学、科研和生产上常用的一种测定细菌数的有效方法。土壤、水、牛奶、食品或其他材料中所含细菌、酵母、芽孢等的数量均可用此法测定。但不适于测定样品中丝状体微生物，例如放线菌或丝状真菌或丝状篮细菌等的营养体等。
除上述两种常用的计数方法外，还有膜过滤法、比浊法和多种多样的快速、简易、自动化的仪器和装置等方法。膜过滤法是当样品中菌数很低(低于106/ml)时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上(或一定面积中)的细菌数；比浊法是利用已知浓度的小颗粒溶液作对照，让已稀释的样品与不同浓度的小颗粒溶液进行对比，找出样品中所含的细菌数；电子计数器法是利用细菌通过小孔时，电解质溶液发生导电性降低，电阻增加形成脉冲电流，反映到记录标尺上，求出一定体积样品中所含的细菌数。很明显比浊法与电子仪器计数法不适用于样品中含有颗粒物培养物悬液的细菌计数。
2.重量法
此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤，再离心后直接称重，求出湿重，如果是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水，再称重求出湿重。不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于105℃烘干至恒重，取出放入干燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。
如果要测定固体培养基上生长的放线菌或丝状真菌，可先加热至50℃，使琼脂溶化，过滤得菌丝体，再用50℃的生理盐水洗涤菌丝，然后按上述方法求出菌丝体的湿重或干重。
除了干重、湿重反映细胞物质重量外，还可以通过测定细胞中蛋白质或DNA的含量反映细胞物质的量。蛋白质是细胞的主要成分，含量也比较稳定，其中氮是蛋白质的重要组成元素。从一定体积的样品中分离出细胞，洗涤后，按凯氏定氮法测出总氮量。蛋白质含氮量为16%，细菌中蛋白质含量占细菌固形物的50-80%，一般以65%为代表，有些细菌则只占13-14%，这种变化是由菌令和培养条件不同所产生的。因此总含氮量与蛋白质总量之间的关系可按下列公式计算：
蛋白质总量＝含氮量×6.25
细胞总量＝蛋白质总量÷(50-80%(或65%))=蛋白质总量×1.54
核酸DNA是微生物的重要遗传物质，每个细菌的DNA含量相当恒定，平均为8.4×10-5纳克。因此从一定体积的细菌悬液中所含的细菌中提取DNA，求得DNA含量，再计算出这一定体积的细菌悬液所含的细菌总数。
3. 生理指标法
对于一些非真溶液的样品，要测定微生物数量除了用活菌计数法外，还可以用生理指标测定法进行测定。生理指标包括微生物的呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等。这是根据微生物在生长过程中伴随出现的这些指标，样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、热力计等设备来测定相应的指标。这类测定方法主要用于科学研究，分析微生物生理活性等。
第五节 微生物生长的控制
在适宜条件下，对数生长期的微生物能以最大的比生长速率进行生长繁殖，产生大量的新个体，例如每个E.coli细胞的重量虽然大约只有1/1012克即百万个百万分之一克，但是，如果一个E.coli在肉汤培养基和在适宜条件下，培养48小时，产生的新个体的总重量可超过地球重量的4000倍! 实际上生长是微生物与环境相互作用的结果。自然界电离辐射、太阳、温度、湿度、营养物质消耗和代谢产物积累等环境影响，E.coli不可能以最大比生长速率无限制地生长下去；另一方面微生物中有不少是动物、植物和人类的病原菌，也必须对这类病原菌进行控制。因此，如何控制微生物的生长速率或消灭不需要的微生物，在实际应用中具有重要的意义。
有关的术语
抑制(Inhibition)：抑制是在亚致死剂量因子作用下导致微生物生长停止，但在移去这种因子后生长仍可以恢复的生物学现象。
死亡(Death)：死亡是在致死剂量因子或在亚致死剂量因子长时间作用下，导致微生物生长能力不可逆丧失，即使这种因子移去后生长仍不能恢复的生物学现象。
防腐(Antiseptsis)：防腐是在某些化学物质或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生长的一种措施，它能防止食物腐败或防止其他物质霉变。例如日常生活中以干燥、低温、盐腌或糖渍等防腐方法是保藏食品(物)的主要方式。具有防腐作用的化学物质称为防腐剂。
消毒(Disinfection)：消毒是利用某种方法杀死或灭活物质或物体中所有病原微生物的一种措施，它可以起到防止感染或传播的作用。具有消毒作用的化学物质称为消毒剂(Disinfectant)，一般消毒剂在常用浓度下只能杀死微生物的营养体，对芽孢则无杀灭作用。
灭菌(Sterilization)：灭菌是指利用某种方法杀死物体中包括芽孢在内的所有微生物的一种措施。灭菌后的物体不再有可存活的微生物。
化疗(Chemotherapy)：化疗是指利用具有选择毒性的化学物质如磺胺、抗生素等对生物体内部被微生物感染的组织进行治疗，以杀死组织内的病原微生物，但对机体本身无毒害作用的治疗措施。?
理化因子对微生物生长是起抑菌作用还是杀菌作用并不是很严格分开的。因为理化因子的强度或浓度不同作用效果也不同，例如有些化学物质低浓度有抑菌作用，高浓度则起杀菌作用，就是同一浓度作用时间长短不同，效果也不一样；不同微生物对理化因子作用的敏感性不同，就是同一种微生物，所处的生长时期不同，对理化因子作用的敏感性也不同。
一、控制微生物生长的化学物质
1. 抗微生物剂
抗微生物剂(Antimicrobial agent)是一类能够杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质，这类物质可以是人工合成的，也可以是生物合成的天然产物。根据它们抗微生物的特性可分为：
(1)抑菌剂(Bacteriostatic agent)
它们能抑制微生物生长，但不能杀死它们，作用机理是这类物质结合到核糖体上抑制蛋白质合成，导致生长停止。由于它们同核糖体结合不紧，它们在浓度降低时又会游离出来，核糖体合成蛋白质的能力恢复，使生长恢复；
(2)杀菌剂(Bactericide)
它们能杀死细胞，但不能使细胞裂解，由于它们是紧紧地结合到细胞的作用靶上，即使在浓度降低时也不能游离出来，因此生长不能恢复；
(3)溶菌剂(Bacteriolysis)
它们能通过诱导细胞裂解的方式杀死细胞，将这类物质加到生长的细胞悬液里以后会导致细胞数量或细胞悬液的混浊度降低。能抑制细胞壁合成或损伤细胞质膜的抗生素就属于溶菌剂。
抗微生物剂又称杀菌剂(Germicide),通常又将它们分为消毒剂(Disinfectant)和防腐剂(Antisepsis)，前者通常用来杀死非生物材料上的微生物，后者具有杀死微生物或抑制微生物生长的能力，但对于动物或人体的组织无毒害作用。杀菌剂广泛用于热敏感的其他物质或用具如温度计、带有透镜的仪器设备、聚乙烯管或导管等的灭菌，在食品，发酵工业，自来水厂等部门常用杀菌剂杀死墙壁、楼板与仪器设备等表面和自来水中的微生物；对于空气中的微生物则用甲醛、石碳酸(酚)、高锰酸钾等化学试剂进行薰、蒸、喷雾等方式杀死它们。表6-8列出了与健康有关的一些常用的消毒剂与防腐剂及其作用的机理。
2. 抗代谢物
在微生物生长过程中常常需要一些生长因子才能正常生长，那么可以利用生长因子的结构类似物干扰机体的正常代谢，以达到抑制微生物生长的目的。例如磺胺类药物是叶酸组成部分对氨基苯甲酸的结构类似物，磺胺类药物被微生物吸收后取代对氨基苯甲酸，干扰叶酸的合成，抑制了转甲基反应，导致代谢的紊乱，从而抑制生长。同样对氟苯丙氨酸、5-氟尿嘧啶和5-溴胸腺嘧啶，分别是苯丙氨酸、尿嘧啶和胸腺嘧啶的结构类似物，由这些结构类似物取代正常成分之后造成代谢紊乱，以抑制机体的生长。因此生长因子的结构类似物又称为抗代谢物(antimetabolite)，它在治疗由病毒和微生物引起的疾病上起着重要作用。
3. 抗生素
抗生素(antibiotic)是由某些生物合成或半合成的一类次级代谢产物或衍生物，它们能抑制微生物生长或杀死它们的化合物，它们主要是通过抑制细菌细胞壁合成、破坏细胞质膜、作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化、抑制蛋白质和核酸合成等方式来抑制微生物的生长或杀死它们。图6-14扼要说明了作用于细菌的一些抗生素及其它们作用的主要部位。在这些抗生素中每种都可以起到抑制细菌的生长或杀死它们的目的。?
抗生素与其他一些抗代谢药物如磺胺类药物通常是临床上广泛使用的化学治疗剂，但多次重复使用，使一些微生物变得对它们不敏感，作用效果也越来越差。根据对某些抗生素不敏感的抗性菌株的研究表明，抗性菌株具有以下特点：
(1)细胞质膜透性改变
如抗四环素的委内瑞拉链霉菌的细胞质膜透性改变，阻止四环素进入细胞；
(2)药物作用靶改变
二氢叶酸合成酶是磺胺类药物作用的靶，抗磺胺药物的菌株改变了二氢叶酸合成酶基因的性质，合成了一种对磺胺药物不敏感的二氢叶酸合成酶；链霉素是通过结合到核糖体30S亚基的一种蛋白质上，干扰蛋白质合成，以达到抑制生长的目的，抗链霉素的抗性菌株合成了一种蛋白质不能结合链霉素，由这种蛋白质组建的30S亚基就不能结合链霉素，因此对链霉素产生抗性；又如通过23S rRNA上甲基化，即在核糖上的甲基化或在嘌呤第六位上的甲基化，或在16S rRNA的3'-未端发生的甲基化作用等都可以使抗生素作用失去应用的效果；
(3)合成了修饰抗生素的酶
这些酶有转乙酰酶，转磷酸酶或腺苷酸转移酶等，在这些酶的作用下，分别使氯霉素乙酰化，链霉素与卡那霉素磷酸化或链霉素腺苷酸化，这些被修饰的抗生素也失去了抗菌活性；
(4)抗性菌株发生遗传变异
发生变异的菌株导致合成新的多聚体，以取代或部分取代原来的多聚体，如有些抗青霉素的菌株细胞壁中肽聚糖含量降低，但合成了另外的细胞壁多聚体等。抗性菌株所具特征，表明了它们耐药性的机理。
抗生素在临床上用来治疗由细菌引起的疾病时，为了避免出现细菌的耐药性，使用时一定要注意：
(1)第一次使用的药物剂量要足；
(2)避免在一个时期或长期多次使用同种抗生素；
(3)不同的抗生素(或与其他药物)混合使用；
(4)对现有抗生素进行改造或
(5)筛选新的更有效的抗生素，这样既可以提高治疗效果，又不会使细菌产生抗药性。
二、控制微生物的物理因素
控制微生物的物理因素主要有温度，辐射作用、过滤、渗透压、干燥和超声波等，它们对微生物生长能起抑制作用或杀灭作用。
1. 高温灭菌
当温度超过微生物生长的最高温度或低于生长的最低温度都会对微生物产生杀灭作用或抑制作用。高压蒸汽灭菌的温度越高，微生物死亡越快。衡量灭菌效果的指标之一是十倍致死时间(Decimal reduction time，D)，即在一定的温度条件下，微生物数量十倍减少所需要的时间。温度愈高，十倍致死时间愈短(图6-15)。另外D值大小还随微生物的种类、生长时期、检测培养基的性质等因素有关。测量某种微生物在某个温度下的十倍致死时间是一个很复杂的过程，因为这种方法要测定活菌的数量。另一种比较容易测定的指标是热致死时间(Thermal death time)，即在一定温度下杀死所有某一浓度微生物所需要的时间。这样只要在一定温度下将待测样品加热处理不同时间后，分别与培养基混匀，然后培养，当所有细菌被杀死时，被培养的样品中没有细菌生长。待测样品中的微生物数量大(即浓度高)，杀死所有微生物所需的时间比杀死微生物浓度低的样品所需的时间长。因此当微生物的浓度一致时，可以通过比较热致死时间长短来衡量不同微生物的热敏感性。?
来自同一种微生物的营养体与孢子对热的抗性不同，孢子的抗热性远远大于营养体的抗热性。例如在高压蒸汽灭菌(121℃)时，内生孢子的十倍减少时间需要4-5分钟，而营养体在65℃的十倍减少时间只需0.1-0.5分钟。
培养基经高压蒸汽灭菌时，灭菌的效果同培养基的性质有关，酸性培养基灭菌时，培养基里的微生物死亡快，例如酸性食品土豆、果汁、泡菜等比中性食品大米、豆制品等更容易灭菌。高浓度的糖、蛋白质和脂类能降低热穿透性，因而它们常是增加机体对热的抗性，而盐浓度高不是增加就是减少机体的抗热性，这主要取决于微生物的状态。干细胞比湿细胞有更大的抗热性，它们的灭菌需要更高的灭菌温度或更长的时间。
高压蒸汽灭菌是在特定的设备灭菌锅里完成的。图6-16是典型的设备示意图，它由特定的钢材制成，并能承受一定压力的双层设备，蒸汽通过双层进入锅内，通过仪表与阀门控制一定的温度与压力，以对不同类型的微生物进行灭菌。?
另一种杀菌方法是煮沸消毒，即将待消毒物品如注射器、金属用具、解剖用具等在水中煮沸15分钟或更长时间，以杀死细菌或其他微生物的营养体和少部分的芽孢或孢子。如果在水中适当加1%碳酸钠或2～5%的石炭酸则杀菌效果更好。
对于某些培养基，由于高压蒸汽灭菌会破坏某些营养成分，可用间隙灭菌法灭菌，即流通蒸汽(或蒸煮)反复灭菌几次，例如第一次蒸煮后杀死微生物营养体，冷却，培养过夜，孢子萌发，又第二次蒸煮，杀死营养体。这样反复2～3次就可以完全杀死营养体和芽孢，也可保持某些营养物质不被破坏。
对于一些玻璃器皿、金属用具等耐热物品还可以用干热灭菌法进行灭菌，但干热灭菌所需时间比湿热灭菌温度高和时间长。例如171℃需要1小时，160℃需2小时，121℃需16小时等。
高压蒸汽灭菌适用于耐热材料的灭菌，对于牛奶及其热敏感物质不适宜，因为高热破坏了食品的营养与风味。现在，牛奶或其它液态食品一般都采用超高温灭菌，即135-150℃，灭菌2-6秒，既可达杀菌和保质，缩短了时间，又提高了经济效益。
2. 辐射作用
辐射灭菌(radiation sterilization)是利用电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法。用于灭菌的电磁波有微波，紫外线(UV)、X-射线和γ-射线等，它们都能通过特定的方式控制微生物生长或杀死它们。例如微波可以通过热产生抗微生物作用； 紫外线(UV)使DNA分子中相邻的嘧啶形成嘧啶二聚体，抑制DNA复制与转录等功能，杀死微生物；x-和r-射线能使其它物质氧化或产生自由基(OH·、H·)再作用于生物分子，或者直接作用于生物分子，打断氢键、使双键氧化、破坏环状结构、或使某些分子聚合等方式，破坏和改变生物大分子的结构，以抑制或杀死微生物。即使可见光在长时间照射后，也能损害微生物或杀死它们，因为所有光合生物含有叶绿素(或细菌叶绿素)、细胞色素、黄素蛋白等光敏感色素，它所吸收光能变成激发态或被活化，并将吸收的能量转移到氧，产生氧自由基作用于细胞，导致机体突变或死亡。辐射灭菌的效果受其他因子制约，例如光可使嘧啶二聚体解体，降低紫外线作用效果，氧可提高X-或γ-射线作用的效果等。
3. 过滤作用
高压蒸汽灭菌可以除去液体培养基中的微生物，但对于空气和不耐热的液体培养基的灭菌是不适宜的，为此设计了一种过滤除菌的方法。过滤除菌有三种类型：一种最早使用的是在一个灭菌容器的两层滤板中间填充棉花、玻璃纤维或石棉，空气通过它就可以达到除菌的目的。为了缩小这种滤器的体积，后来改进为在两层滤板之间放入多层滤纸，灭菌后使用也可以达到除菌的作用，这种除菌方式主要用于发酵工业；第二种是膜滤器，它是由醋酸纤维素或硝酸纤维素制成的比较坚韧的具有细孔(0.22-0.45μm)的膜，灭菌后使用，液体培养基通过它就可将细菌除去，由于这种滤器处理量比较少，主要用科研；第三种是核孔(Nucleopore)滤器，它是由用核辐射处理的很簿的聚碳酸胶片(厚10μm)再经化学蚀刻而制成。辐射使胶片局部破坏，化学蚀刻使被破坏的部位成孔，而孔的大小则由蚀刻溶液的强度和蚀刻的时间来控制。溶液通过这种滤器就可以将微生物除去，这种滤器也主要用于科学研究。
4. 高渗作用
细胞质膜是一种半透膜，它将细胞内的原生质与环境中的溶液(培养基等)分开，如果溶液中水的浓度高于细胞原生质中水的浓度，那么水就会从溶液中通过细胞质膜进入原生质，使原生质和溶液中水的浓度达到平衡，这种现象为渗透作用，即水或其它溶剂经过半透性膜而进行扩散的现象称为渗透(Osmosis)。在渗透时溶剂通过半透膜时受到的阻力称为渗透压(Osmotic pressure)。渗透压的大小与溶液浓度成正比。如纯水的aw值为1，溶液中的溶质趋向于降低aw值，溶液中含的溶质愈多，溶液中的aw值愈低，即溶液的渗透压力愈高。细菌接种到培养基里以后，细胞通过渗透作用使细胞质与培养基的渗透压力达到平衡。如果培养基的渗透压力高(即aw值低)，原生质中的水向培养基扩散，这样会导致细胞发生质壁分离使生长受到抑制。因此提高环境的渗透压力即降低aw值，就可以达到控制微生物生长的目的。例如用盐(浓度通常为10-15%)腌制的鱼、肉、食品就是通过加盐使新鲜鱼肉脱水，降低它们的水活性，使微生物不能在它们上面生长；新鲜水果通过加糖(浓度一般为50-70%)制成果脯、蜜饯也是降低水果的aw值，抑制微生物生长与繁殖，起到防止腐败变质的效果。 微生物生长对环境的渗透压力有一定的要求，使微生物细胞质膜所承受的压力在允许的范围之内，当微生物接种在渗透压力低的培养基里时，细胞吸水肿胀，细胞质膜受到一种向外的压力即肿胀力。正常条件下，G+细菌的肿胀压力大约为15-20个大气压，G-细菌的肿胀压力约为0.8-5个大气压，由于细胞壁的保护作用，这种肿胀压力不会影响细菌的正常生理活动。当培养基的渗透压力高时，细胞质失水，发生质壁分离，导致生长停止。大多数微生物能通过胞内积累某些能调整胞内渗透压力的相容溶质(Compatible solutes)来适应培养基的渗透压力变化，这类相容溶质可以是某些阳离子如K+；氨基酸如谷氨酸，脯氨酸；氨基酸衍生物如甜菜碱(甘氨酸的衍生物)；或糖如海藻糖等，这类物质被称为渗透保护剂或渗透调节剂或渗透稳定剂。
5. 干燥
水是微生物细胞的重要成分，占生活细胞的90%以上，它参与细胞内的各种生理活动，因此说没有水就没有生命。降低物质的含水量直至干燥，就可以抑制微生物生长，防止食品、衣物等物质的腐败与霉变。因此干燥是保存各种物质的重要手段之一。
6. 超声波
超声波处理微生物悬液可以达到消灭它们的目的。超声波处理微生物悬液时由于超声波探头的高频率振动，引起探头周围水溶液的高频率振动，当探头和水溶液两者的高频率振动不同步时能在溶液内产生空档即空穴，空穴内处于真空状态，只要悬液中的细菌接近或进入空穴区，由于细胞内外压力差，导致细胞裂解，达到灭菌的目的，超声波的这种作用称为空穴作用；另一方面，由于超声波振动，机械能转变成热能，导致溶液温度升高，使细胞产生热变性以抑制或杀死微生物。目前超声波处理技术广泛用于实验室研究中的破细胞和灭菌。
小结
1.微生物个体生长是细胞物质按比例不可逆的增加，使细胞体积增加的生物学过程；繁殖是生长到一定阶段后，通过特定方式产生新的生命个体，使机体数量增加的生物学过程。微生物特别是细菌生长与繁殖两个过程很难绝然分开，同时接种时往往是接种成千上万的群体数量，因此它们的生长一般是指群体生长。群体生长是细胞数量或细胞物质量的增加。
2.单细胞微生物在适宜的液体培养基中，在适宜的温度、通气等条件下培养，微生物群体生长可分为迟缓期、对数生长期、稳定生长期和衰亡期。生长的数学模型和参数对于微生物的理论研究和实际应用都越来越重要。
3.采用机械方法和环境条件控制可以获得同步培养，通过及时补充营养物质和及时取出培养物降低代谢产物，导致对数生长期或稳定生长期相应延长达到连续培养。
4.微生物生长分别可以用单细胞计数、细胞物质的重量和代谢活性等三类方法进行测量。
5.微生物可以通过各种各样的无性或有性的方式进行繁殖。例如细菌主要以等二分裂法、酵母菌以出芽或裂殖方式、丝状真菌以无性或有性孢子或以菌丝断裂片进行繁殖。
6.每种微生物的生长都有各自的最适条件、营养物质的种类和浓度、温度、pH、氧、水活性(或渗透压)等，高于或低于最适要求都会对微生物生长产生影响。利用各种化学物质和物理因素可以对微生物生长、繁殖进行有效地控制，能够对微生物进行兴利除害方面发挥重要作用。
思 考 题
1.细菌的生长繁殖与高等动、植物的有哪些异同?与丝状真菌又有哪些异同?
2.试分析影响微生物生长的主要因素及它们影响微生物生长繁殖的机理。]
3.说明测定微生物生长的意义、微生物生长测定方法的原理及比较各测定方法的优缺点。
4.控制微生物生长繁殖的主要方法及原理有哪些?
5.细菌耐药性机理是哪些?如何避免抗药性的产生?
6.试举例说明日常生活中防腐、消毒和灭菌的实例，及其原理。
7.细菌肥料是由相关的不同微生物组成的一个菌群并通过混合培养得到的一种产品。活菌数的多少是质量好坏的一个重要指标之一。但在质量检查中，有时数据相差很大。请分析产生这种现象的原因及如何克服。
第七章 病毒
计划学时：2
重点：病毒的特点，病毒的形态结构，病毒的繁殖方式和病毒的检测。
自19世纪末，Ivanovski和Beijerinck分别发现烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV ）以来，研究病毒（virus）的本质及其与宿主的相互作用的病毒学（virulogy）得到飞速发展 ，并成为微生物学重要分支。病毒学研究极大地丰富了微生物学，乃至现代生物学的理论与技术，同时，病毒学研究对于有效地控制和消灭人及有益生物的病毒病害，利用病毒对有害生物、特别是害虫进行生物防治，保护人类的健康和人类的经济活动，以及人类赖以生存的环境，发展以基因工程为中心的生物高新技术产业具有特别重要的意义。
第一节 概述
同所有其他生物一样，病毒是一类具有基因、复制、进化、并占据着一定的生态学地位的生物实体，是一类体积非常微小、结构极其简单、性质十分特殊的生命形式。
一、病毒的特点和定义
病毒在细胞外环境以形态成熟的颗粒形式，即毒粒（virion）存在。毒粒具有一定的大小、形态、化学组成和理化性质，甚至可以结晶纯化，如同化学大分子一般而不表现任何生命特征。但是毒粒具有感染性，即具有在一定条件下进入宿主细胞的能力。一旦病毒进入细胞，毒粒便会解体，释放出的病毒基因组具有繁殖性，能利用宿主细胞的大分子合成装置进行复制表达，从而导致病毒的繁殖，并随之表现出遗传、变异等一系列生命特征。由此可见 ，病毒是一类既具有化学大分子属性，又具有生物体基本特征；既具有细胞外的感染性颗粒形式，又具有细胞内的繁殖性基因形式的独特生物类群。病毒以其结构简单、特殊的繁殖方 式以及绝对的细胞内寄生显著区别于其它生物（表7-1） 。
病毒不具有细胞结构，一些简单的病毒仅由核酸和蛋白质外壳（coat）构成，故可把它们视为核蛋白分子。一种病毒的毒粒内只含有一种核酸，DNA或者RNA，而且病毒不具有完整的酶 系统和能量合成系统，也不具有核糖体。病毒没有生长，也不能以分裂方式进行繁殖。病毒感染敏感宿主细胞后，病毒核酸进入细胞，通过其复制与表达产生子代病毒基因组和新的蛋白质，然后由这些新合成的病毒组分装配（assembly）成子代毒粒，并以一定方式释放到细胞外。病毒的这种特殊繁殖方式称做复制（replication）。病毒是严格的细胞内寄生物。在生活的细胞内，病毒核酸提供遗传信息，利用宿主细胞的酶、能量合成系统、核糖体、细胞因子以及大分子合成的前体来完成自身的生命活动，病毒的寄生是基因水平的寄生。
为概括病毒的本质，病毒学工作者一直试图给"病毒"一个科学而严谨的定义，但迄今仍无定论。Luria等（1968）指出：病毒是一种生物实体，其基因组是能利用细胞的合成系统在活细胞内复制，并合成能将病毒基因组转移到其它细胞中去的特殊颗粒的核酸分子（DNA或RNA）。Fields等则于1990年定义病毒为具有独立于其宿主的进化史的绝对细胞内寄生物，它 的DNA或RNA基因组被其所编码的蛋白质壳体化（encapsidation）。在病毒学研究工作中， 还发现类病毒（viroid）、卫星RNA（satellite RNA）和朊病毒（prion）等更为简单的感染性因子，并将之归在亚病毒因子（subviral agent）之列，因此， 现在病毒有真病毒（euvirus）与亚病毒之分，真病毒系前所指经典意义的病毒。
二、病毒的宿主范围
病毒的宿主范围是病毒能够感染并在其中复制的宿主种类和组织细胞种类。病毒几乎可以感染所有的细胞生物。另一方面，病毒又具有宿主特异性，即就某一种病毒而言，它仅能感染一定种类的微生物、植物或动物。因此，根据病毒的宿主范围可将之分为噬菌体（phage）、植物病毒（plant viruses）和动物病毒（animal viruses）等。 从原核生物中分离到的病毒统称噬菌体，它们包括感染细菌的噬菌体（bacteriophage），感染兰绿藻的噬兰（绿）藻体（cyanophage）以及感染柔膜细菌(支原体和螺旋体)的支原体噬菌体（mycoplasmaphage）等。 已经鉴定的植物病毒达1000多种，其中以种子植物为宿主的植物病毒最为普遍。在藻类植物和真菌中都发现在有病毒存在，它们分别称做噬藻体（phycophage）和真菌噬菌体（mycophage）或称真菌病毒（mycoviruses）。广义的动物病毒包括原生动物病毒（protozoal viruses）、无脊椎动物病毒（invertebrate viruses）和脊椎动物病毒（vertebrate viruses）。无脊椎动物病毒以昆虫病毒（insect viruses）最为常见。在脊椎动物病毒中，能感染人并引起人类疾病的病毒被归为医学病毒（medicine viruses）范畴。有些病毒有较宽的宿主谱，如虫谋病毒（arboviruses）能在吸血的蚊、蠓、白蛉等节肢动物中繁殖，并以它们为介体在哺乳类和禽类等脊椎动物中广泛传播。
?第二节 病毒学研究的基本方法
同微生物学其他学科分支一样，病毒学的进步完全得益于研究方法和技术手段的发展。
一、病毒的分离与纯化
通过病毒的分离与纯化获得纯化的、有感染性的病毒制备物是病毒学研究和实践的基本技术 。
1． 病毒的分离
病毒的分离是将疑有病毒而待分离的标本（如微生物发酵的倒罐液，可疑病毒感染患者的体液、血液、粪便等临床标本）经处理后，接种于敏感的实验宿主、鸡胚或细胞培养，经过一段时间孵育后，通过检查病毒特异性病理表现或用其它方法来肯定病毒的存在。
（1）标本的采集与处理
用于分离病毒的标本应含有足够量的活病毒，因此必须根据病毒的生物学性质、病毒感染的特征、流行病学规律以及机体的免疫保护机制，来选择所需要采集标本的种类、确定最适采集时间和标本处理的方法。为了避免细菌污染，标本一般都应加入抗菌素除菌，亦可用离心和过滤方法处理。为了使细胞内的病毒充分释放出来，往往还须以研磨或超声波处理破碎细胞。由于大多数病毒对热不稳定，所以标本经处理后一般都应立即接种。若需运送或保存，数小时内可置50%中性甘油内4℃保存，对于较长时间冻存标本最好置20℃以下或干冰保存 。
（2）标本接种与感染表现
标本接种于何种实验宿主（动物、植物、细菌）、鸡胚或细胞以及选择何种接种途径主要取决于病毒的宿主范围和组织嗜性；同时考虑操作简单、易于培养、所产生的感染结果容易判定等要求。噬菌体标本可接种于生长在培养液或营养琼脂平板中的细菌培养物。噬菌体的存在表现为细菌培养液变清亮或细菌平板成为残迹平板。若是噬菌体标本经过适当稀释再接种细菌平板，经过一定时间培养，在细菌菌苔上可形成圆形局部透明区域，即噬斑（plague）。动物病毒标本可接种于实验动物、鸡胚和多种细胞培养。嗜神经病毒主要采取脑内接种；嗜呼吸道病毒可进行鼻腔接种、或鸡胚的尿囊腔或羊膜腔接种；嗜皮肤病毒可接种动物皮下、 皮内或鸡胚绒毛尿囊膜。由于组织培养生长的细胞对病毒的敏感性较体内成熟细胞为高，没有特异性抗体和一些非特异性病毒抑制物的影响，培养和接种方法简单，条件易于控制，成本低，所以现在多数动物病毒都利用细胞培养进行分离。 接种于细胞培养的标本主要以细胞病变为病毒感染的指标。大多数动物病毒感染敏感细胞培养能引起其显微表现的改变，即产生致细胞病变效应（cytopathic effect,CPE），例如细胞聚集成团、肿大、圆缩、脱落，细胞融合形成多核细胞，细胞内出现包涵体（inclusion body），乃至细胞裂解等。若标本经过适当稀释进行接种并辅以染色处理，病毒可在培养的细胞单层上形成肉眼可见的局部病损区域，即蚀斑（plaque）或称空斑。与之类似，植物病毒接种敏感植物叶片可产生坏死斑，或称枯斑。
若经第一次接种而未出现症状时，往往需要进行重复接种，进行盲传（blind passage），即将取自经接种而未出现感染症状的宿主或细胞培养的材料，再接种传递给新的宿主或细胞培养，以提高病毒的毒力（virulence）或效价。如果标本中有病毒存在，经重复传代，其效价或毒力提高，必定会在新的宿主或细胞培养中产生感染症状。相反，在盲传二代后若仍无感染症状出现，便可否定标本中有病毒存在。
2． 病毒纯化
由于病毒只能在活细胞内繁殖，所以用于病毒制备的起始材料只能是病毒感染的宿主机体，组织或细胞经破碎后的抽提物，或病毒感染的宿主的体液，血液和分泌物，或病毒感染的细胞培养物的培养液等。在这些材料中不可避免地混杂有大量的组织或细胞成分、培养基成分、 可能污染的其他微生物与杂质。为了得到纯净的病毒材料，必须利用一切可能的方法将这些杂质成分除去，这就是病毒的纯化。
（1）病毒纯化的标准
病毒纯化有如下二个标准：
第一、由于病毒是有感染性的生物体，所以纯化的病毒制备物应保持其感染性。纯化过程中的各种纯化方法对病毒感染性的影响，以及最终获得的纯化制备物是否符合标准，都可利用病毒的感染性测定进行定量分析。
第二、由于病毒具有化学大分子的属性，病毒毒粒具有均一的理化性质，所以纯化的病毒制备物的毒粒大小、形态、密度、化学组成及抗原性质应当具有均一性表现。
（2）病毒纯化的方法
用于病毒纯化的方法很多。不同的病毒有不同的纯化方法，即使同一种病毒，若在不同的宿主系统中其纯化方法也可能不同。但无论是哪种纯化方法，都是根据病毒的基本理化性质建立：
第一、毒粒的主要化学组成是蛋白质，鉴于病毒的高蛋白含量，故可利用蛋白质提纯方法来纯化病毒，例如盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、凝胶层析、离子交换等；
第二、毒粒具有一定的大小、形状和密度，一般可在10,000~100,000g的离心场中1～2小时沉降，特别是由于毒粒是由许多大分子（蛋白质、核酸等）组成，离心时它们比细胞蛋白沉降更快，而且许多病毒都有较高的浮密度，所以超速离心技术广泛地用于病毒纯化。
二、病毒的测定
病毒的测定（assay of viruses）是病毒的定量分析。病毒既能根据其理化性质或免疫学性质进行定量，亦能够根据它们与宿主或宿主细胞的相互作用进行测定。运用不同的方法所进行的测定，具有迥然不同的意义。
1． 病毒的物理颗粒计数
血细胞凝集试验：利用一定方法，可以在电镜下直接计算病毒颗粒数目。在动物病毒中，一些裸露病毒的壳体蛋白，特别是许多有包膜病毒的包膜蛋白能够凝集一定种类的的脊椎动物红血球细胞，并且所能凝集血细胞的量与病毒浓度成正比。根据这一原理所设计的血细胞凝集试验亦能用于病毒定量。此外，根据病毒的抗原性质，可以用免疫沉淀试验、酶联免疫吸附试验等方法对病毒进行定量。利用分光光度法也可对病毒定量。这些方法灵敏性相对较低，多在一些特殊情况使用。 以上所有方法测定的是病毒物理颗粒的数目，即有活力的病毒与无活力病毒数量的总和。而且除电镜计数外，其他方法所测定的是样品中病毒颗粒的相对数量。
2． 病毒的感染性测定
有感染性病毒颗粒数量的测定称做病毒感染性测定（assay of infectivity），它测定的是因感染所引起宿主或细胞培养某一特异性病理反应的病毒数量。由于病毒的繁殖所引起的宿主反应扩增，以至无论最初接种病毒量的多少，最终所产生的症状可能完全相似，所以用任何感染性测定方法所测得的都不是有感染性病毒颗粒的绝对数量，而是能够引起宿主或宿主细胞一定特异反应的病毒最小剂量，即病毒的感染单位（infectious units, IU）。待测样品中所含病毒的数量，通常以单位体积（亳升）病毒悬液的感染单位数目来表示（IU/ml），称做病毒的效价。例如，鼠经鼻孔滴注流感病毒悬液会患肺炎，如果使鼠患肺炎的病毒最小剂量是0.1毫升10-6病毒悬液，那未这种流感病毒悬液的感染效价为107，即每毫升病毒悬液中有107个感染单位的病毒。
（1）噬（蚀）斑测定
噬斑测定方法最先为噬菌体的感染性测定所建立，以后为动物病毒与植物病毒的测定所借鉴。噬菌体的噬斑测定一般采用琼脂叠层法（agar layer method）。一定量的经系列稀释的噬菌体悬液分别与高浓度的敏感细菌悬液以及半固体营养琼脂均匀混合后，涂布在已铺有较高浓度的营养琼脂的平板上成为上层，经过孵育后，在延伸成片的细菌菌苔上出现分散的单个噬斑。因噬斑数目与加入样品中的有感染性的噬菌体颗粒数量成正比，统计噬斑数目后 可计算出噬菌体悬液效价，并以噬斑形成单位（plague forming units, PFU）/毫升表示。动物病毒的蚀斑测定方法与噬菌体的噬斑计数类似。不同的是以生长在固体支持物（培养容器）上的单层细胞代替了生长在营养琼脂平板上的细菌。由于动物病毒在单层细胞培养上所产生的蚀斑表现不同，故有空斑测定、合胞体计数、转化测定和吸附蚀斑测定等不同方法。通过这些方法测定的动物病毒效价以蚀斑形成单位(DFU)表示。植物病毒最为简单的感染性测定方法是坏死斑测定，亦称枯斑测定。即用如金刚砂之类能破 坏植物表皮与细胞壁的粉末状物质与一定量的植物病毒混合磨擦植物叶片进行接种，以产生坏死斑的数目来测定病毒样品的效价。
（2） 终点法
对于那些不能用蚀斑法或坏死斑法测定的动、植物病毒可用终点法（end point method ）定量。其方法是：取等体积的经10倍或2倍稀释的病毒系列稀释液分别接种同样的实验单元（如某种动物或植物、鸡胚或细胞培养），经过一致时间孵育后，以试验单元群体中的半数（50%）个体出现某一感染反应所需的病毒剂量来确定病毒样品的效价，称做半数效应剂量，并以使50%试验单元出现感染反应的病毒稀释液的稀释度的倒数的对数值表示。根据试验单元的性质及感染反应的性质，半数效应剂量也有不同的表示：如使半数试验宿主死亡的病毒剂量称做半数致死剂量（50% lethal dose，LD50）;使半数试验宿主发生感染的剂量称做半数感染剂量（50% infective dose,ID50）；使半数组织培养物遭受感染，发生细胞病变的病毒剂量称做半数组织培养感染剂量（50% tissue culture infective dose,TCID50）等。
目前，诸如竞争性聚合酶链反应（cPCR）或是竞争性逆转录聚合酶链反应（cRT-PCR）等分子生物学定量方法亦广泛用于病毒研究中。这些方法对于那些体外培养困难的病毒或者病毒含量极微的样品定量分析具有特别的意义。
第三节 毒粒的性质
毒粒是病毒的细胞外颗粒形式，也是病毒的感染性形式。Dulbacco等（1985）指出：病毒颗粒或毒粒是一团能够自主复制的遗传物质，它们被蛋白质外壳所包围，有的还具有包膜，以保护遗传物质免遭环境破坏，并作为将遗传物质从一个宿主细胞传递给另一个宿主细胞的载体。本节将着重介绍毒粒的形态结构，化学组成以及理化性质。
一、毒粒的形态结构
毒粒具有一定的大小，形状和结构组成。这些特征为病毒的分离纯化、分类鉴定，病毒的进化和遗传功能研究提供了可靠的依据。
1．病毒的大小和形状
不同病毒的毒粒大小差别很大，最小者如植物的双粒病毒（Geminiviruses）直经仅18～20nm，最大者如动物的痘病毒（Poxviruses）的大小达300~450nm×170～260nm。 尽管已发现的病毒达数千种。但毒粒的形状大致可分球形颗粒(或称拟球形颗粒)、杆状颗粒和复杂形状颗粒（如蝌蚪状，卵形）等少数几类。另外有的病毒毒粒呈多形性（pleomorphic）,如流感病毒（Influenza virus）新分离的毒株常呈丝状，在细胞内稳定传代后则为直经约100nm的拟球形颗粒。
2．毒粒的壳体结构
病毒毒粒的基本结构是包围着病毒核酸的蛋白质外壳，即壳体（capsid）或称衣壳。壳体是由大量的同一的壳体蛋白单体分子，即蛋白质亚基（protein subunit）以次级键结合形成的，蛋白质亚基又称原体(protomer)。根据相对简单的几何学原理，病毒的壳体主要有两种结构类型。
（1）螺旋对称壳体
病毒壳体呈螺旋对称（helical symmetry），即亚基有规律地沿着中心轴呈螺旋排列，进而形成高度有序、对称的稳定结构（图7-1）。 病毒的螺旋壳体的特征可以用以下参数描述：螺旋长度、螺旋直径、轴孔直径、螺距及每一螺转上的蛋白质亚基数目等。螺旋壳体的直径是由蛋白质亚基的特征决定的，其长度则是由与壳体结合的病毒核酸分子的长度所决定。在螺旋对称壳体中，病毒核酸以多个弱键与蛋白质亚基相结合，不仅可能控制螺旋排列的形式、壳体的长度，而且核酸与壳体的相互作用还增加了壳体结构的稳定性。
（2）二十面体对称壳体
构成对称结构壳体的第二种方式是蛋白质亚基围绕具立方对称的 正多面体的角或边排列，进而形成一个封闭的蛋白质的鞘。几何学中的立方对称结构实体包括正四面体、正六面体、正八面体、正十二面体和正二十面体。在这些拓朴等价多面体中，若以一定数目的亚基排列成具有一定表面积的立方对称实体，以二十面体容积为最大，能包装更多的病毒核酸，所以病毒壳体多取二十面体对称（icosahedral symmetry）结构。
在病毒的二十面体壳体构成中，一定数目的蛋白质亚基以特殊方式聚集形成在电镜下可见的壳粒（capsomer），壳粒也称形态学单位（morphological unit）。在二十面体壳体形成时，若干个蛋白质亚基聚集形成壳粒，若干个壳粒结合构成壳体。壳粒通常都是由5个或6个蛋白质亚基聚集形成（图7-2），因而它的分别称做五聚体（pentamers）和六聚体（hexmers）。因为五聚体和六聚体各与5个和6个其它的壳粒相邻，所以又分别称做五邻体（penton ）和六邻体（hexon）。二十面体壳体也存在其它的构成方式，如SV40(Simian virus 40) 的二十面壳体仅由72个中心凹陷的圆筒状的五聚体构成。12个五聚体占据二十面体的顶并分别与5个相邻的五聚体结合，60个非顶五聚体分别与6个相邻的五聚体结合。在二十面体壳体中，病毒核酸盘绕折叠在壳体的有限空间内。在病毒二十面体壳体制备物中，常发现不具有核酸的空壳体（empty capsid）存在。这表明核酸对于二十面体壳体的形成并非必需。然而空壳体较完整的病毒颗粒更容易降解，所以核酸的结合有助于增加二十面壳体的稳定性。
（3）双对称结构
病毒壳体除螺旋对称和二十面体对称两种主要结构类型外，亦有少数病毒壳体为双对称（ bisymmetry）结构。具有双对称结构的典型例子是有尾噬菌体（tailed phage）, 其壳体由头部和尾部组成。包装有病毒核酸的头部通常呈二十面体对称，尾部呈螺旋对称。 图7-3所示的是T4噬菌体的壳体结构。
3． 病毒的包膜结构
病毒的壳体与核心一起构成的复合物为核壳（nucleocapsid）。一些简单的病毒，如烟草花叶病毒、脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）等的毒粒就是一个核壳结构。这类毒粒也称做裸露毒粒（naked virion）。而一些复杂的病毒的核壳外还覆盖着一层称做包膜的脂蛋白膜。包膜是病毒以出芽（budding）方式成熟时，由细胞膜衍生而来的。 病毒包膜的基本结构与生物膜相似，是脂双层膜。在包膜形成时，细胞膜蛋白被病毒的包膜糖蛋白取代。包膜糖蛋白靠一跨膜固着肽附着于脂双层，其主要的结构域凸出在包膜外侧，形成在电镜下可识别的包膜突起（peplomer），另有一较小的结构域在包膜内侧。一些无包膜的病毒表面也有一些向外凸出的突起，如腺病毒（Adenoviruses）二十面体核壳 的顶上的五邻体纤维，这些突起与病毒的包膜突起一起称做刺突（spike）。病毒包膜有维系毒粒结构，保护病毒核壳的作用。特别是病毒的包膜糖蛋白，具有多种生物学活性，是启动病毒感染所必需的。
4． 毒粒的结构类型
根据病毒毒粒有无包膜以及壳体的对称形式，可以将毒粒分为四种主要结构类型（图7-4） ：裸露的二十面体毒粒，裸露的螺旋毒粒；有包膜的二十面体毒粒；有包膜的螺旋毒粒。 在以上4种结构类型中，不同病毒的毒粒结构复杂程度有很大的区别。还有些病毒，如有尾 噬菌体、痘病毒等结构更为复杂，不能包括在这些结构类型之内。
二、毒粒的化学组成
? 毒粒的基本化学组成是核酸和蛋白质。有包膜的病毒和某些无包膜的病毒除核酸和蛋白质外，还含有脂类和碳水化合物。有的病毒还含有聚胺类化合物，无机阳离子等组分。
1． 病毒的核酸
核酸是病毒的遗传物质。一种病毒的毒粒只含有一种核酸，DNA或是RNA。除逆转录病毒（Retroviruses）基因组为二倍体外，其他病毒的基因组都是单倍体。
(1)病毒核酸的类型
病毒核酸存在单链DNA（ssDNA）、双链DNA（dsDNA）、单链RNA（ssRNA）和双链RNA（dsRNA）4种主要类型。除双链RNA外，其它各类核酸又有线状形式和环状形式，表7-3列举了病毒的主要核酸类型。单链病毒核酸（主要是RNA）能够按照它的极性（polarity）或意义（sense）进行分类。如果病毒ssRNA可以作为mRNA直接进行翻译，则规定它为正极性（+意义），称为正链RNA（+RNA）。如果病毒ssRNA核苷酸序列与其mRNA序列互补，即规定它为负极性（-意义），称为负链RNA（-RNA）。也有某些病毒的RNA是双意（ambisense），即部分为正极性、部分为 负极性。对于病毒的单链DNA，如果与其mRNA序列相同，即为正极性，称正链DNA（+DNA）。 如果其核苷酸序列与mRNA互补，即为负极性，即负链DNA（-DNA）。根据病毒核酸转染（transfection）的结果，即将从病毒毒粒或病毒感染的细胞抽提分离的病毒核酸实验性地导入细胞，若能启动病毒复制循环，产生子代毒粒，则此种病毒核酸为感染性核酸（infectious nucleic acid），否则为非感染性核酸。
? (2)核酸的结构特征
不同病毒的核酸均可能具有各自不同的结构特征，主要包括：粘性末端、末端重复序列。分段基因组(segemented genome)即有些病毒基因组是由数个不同的核酸分子构成。许多真核生物的正链RNA病毒的基因组同真核细胞mRNA一样，5′末端有帽子结构，3′末端有聚腺苷酸即poly(A)结构。
2、病毒的蛋白质
病毒蛋白质根据其是否存在于毒粒中分为结构蛋白（structure protein）和非结构蛋 白（nonstructure protein）两类：前者系指构成一个形态成熟的有感染性的病毒颗粒所必需的蛋白质，包括壳体蛋白、包膜蛋白和存在于毒粒中的酶等；后者系指由病毒基因组编码的，在病毒复制过程中产生并具有一定功能，但并不结合于毒粒中的蛋白质。在此主要介绍病毒的结构蛋白。
(1)壳体蛋白
壳体蛋白是构成病毒壳体结构的蛋白质。由一条或多条多肽链折叠形成的蛋白质亚基是构成壳体蛋白的最小单位。一些简单的病毒的壳体蛋白仅由一种或少数几种蛋白质构成，而一些复杂病毒则可多达20余种。亚基的组成和数目的不同是区别不同的壳体蛋白的标志。壳体蛋白的功能是构成病毒的壳体，保护病毒的核酸。无包膜病毒的壳体蛋白参与病毒的吸附、进入、决定病毒的宿主嗜性，同时它们还是病毒的表面抗原，并还可能有其他的功能活性 。
（2）包膜蛋白
构成病毒包膜结构的病毒蛋白质包括包膜糖蛋白和基质蛋白（matrix protein）两类。包膜糖蛋白是由多肽链骨架与寡糖侧链，通过β-N-糖苷键将糖链的N-乙酰葡萄糖胺与肽链的天冬酰胺残基连结形成。根据寡糖链中单糖残基组成的区别，包膜糖蛋白又分为简单型糖糖蛋白和复合型糖蛋白两类。除通常的N-糖苷键外，有的病毒包膜糖蛋白，如鼠冠 状病毒E1糖蛋白的是通过O-糖苷键，在丝氨酸或苏氨酸残基糖基化。 包膜糖蛋白是病毒的主要表面抗原。包膜糖蛋白多为病毒吸附蛋白，它们与细胞受体的的相互作用启动病毒感染发生。有些病毒的包膜糖蛋白还介导了病毒的进入。此外它们还可能具有凝集脊椎动物红血球细胞、细胞融合以及酶等活性。有些有包膜病毒，如正粘病毒（Orthomyxoviruses）、副粘病毒（Paramyxoviruses）等的包膜结构中，还含有一种非糖基化的基质蛋白或称内膜蛋白。基质蛋白构成膜脂双层与核壳之间的亚膜结构。具有支撑包膜，维持病毒结构的作用。更重要的是它介导核壳与包膜糖蛋白之间的识别，在病毒芽出成熟过程中发挥重要作用。
（3）毒粒酶
参与病毒感染复制的酶有三个来源：一是宿主细胞酶或经病毒修饰改变了的宿主细胞酶； 二是病毒的一些非结构蛋白，例如正链RNA病毒在复制时产生的依赖于RNA的RNA聚合酶；三是存在于毒粒内的酶即毒粒酶。 毒粒酶根据其功能大致可分为两类：一类是参与病毒进入，释放等过程的酶，如T4噬菌体的溶菌酶、流感病毒的神经氨酸酶等；另一类是参与病毒的大分子合成的酶，如逆转录病毒、嗜肝DNA病毒的逆转录酶，所有dsRNA病毒，负链RNA病毒以及一些dsDNA病毒毒粒中存在的转录酶等。一些复杂的病毒，如在细胞质内复制的痘病毒还具有许多参与RNA转录物加工和DNA复制的酶。
除以上所述结构蛋白外，在某些病毒的毒粒中还有其他病毒蛋白质，甚至有宿主的蛋白质。例如，腺病毒基因组dsDNA和脊髓灰质炎病毒基因组+RNA 5′端都结合有蛋白质。在乳多空病毒（Papovaviruses）中有细胞组蛋白与病毒DNA结合形成染色体样复合物。
3、病毒的脂类
有包膜病毒的包膜内含有来源于细胞的脂类化合物。其中50~60%为磷脂，余下的多为胆固酵。由于病毒包膜的脂类来源于细胞，所以其种类与含量均具有宿主细胞特异性。脂类构成了病毒包膜的脂双层结构。此外，在少数无包膜病毒，如T系噬菌体、λ噬菌体以及虹彩病毒科（Iridoviridae）的某些成员的毒粒中也发现脂类的存在。
4、病毒的碳水化合物
有些病毒、其中绝大多数是有包膜病毒含有少量的糖类。它们主要是以寡糖侧链存在于病毒糖蛋白和糖脂中，或以粘多糖形式存在。除了有包膜病毒的糖蛋白突起外，某些复杂病毒的毒粒还含有内部糖蛋白或者糖基化的壳体蛋白。由于这些糖类通常是由细胞合成的，所以它们的组成与宿主细胞相关。
5、其它组成
在一些动物病毒、植物病毒和噬菌体的毒粒内，存在一些如丁二胺、亚精胺、精胺等阳离子化合物。在某些植物病毒中还发现有金属阳离子存在。这些含量极微的有机阳离子或无机阳离子与病毒核酸呈无规则的结合，并对核酸的构形产生一定的影响。它们的结合量仅与环境中相关离子浓度有关，是病毒装配时从环境中获得的不恒定成分。
第四节 病毒的复制
病毒是严格细胞内寄生物，它只能在活细胞内繁殖。病毒进入细胞后，具有感染性的毒粒消失，存在于细胞内的是有繁殖性的病毒基因组。病毒的繁殖是病毒基因组复制与表达的结果，这是一种完全不同于其他生物的繁殖方式。
一、病毒的复制周期
1．一步生长曲线（onestep growth curve）
一步生长曲线是研究病毒复制的一个经典试验，最初是为研究噬菌体的复制而建立，以后推广到动物病毒和植物病毒的复制研究中。基本方法是以适量的病毒接种于标准培养的高浓度的敏感细胞，待病毒吸附(attachment)后，或高倍稀释病毒细胞培养物，或以抗病毒抗血清处理病毒-细胞培养物，以建立同步感染，然后继续培养并定时取样测定培养物中的病毒效价，并以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线，即一步生长曲线（图7-5）。 从一步生长曲线中，可以获得病毒繁殖的两个特征性数据：潜伏期（latent period）和裂解量（burst s ize）。 潜伏期是毒粒吸附于细胞到受染细胞释放出子代毒粒所需的最短时间。不同病毒的潜伏期长短不同，噬菌体以分钟计，动物病毒和植物病毒以小时或天计。裂解量是每个受染细胞所产生的子代病毒颗粒的平均数目。其值等于潜伏期受染细胞的数目除以稳定期受染细胞所释放的全部子代病毒数目，即等于稳定期病毒效价与潜伏期病毒效价之比。通过一步生长曲线测定，噬菌体的裂解量一般为几十到上百个，植物病毒和动物病毒可达数百乃至上万个。
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2．隐蔽期（eclipse period）
一步生长曲线反映了病毒在细胞培养物中复制的动力学性质。运用成熟前裂解方法，研究病毒在细胞内的复制动态发现，在潜伏期的前一段，受染细胞内检测不到感染性病毒，后一阶段，感染性病毒在受染细胞内的数量急剧增加，自病毒在受染细胞内消失到细胞内出现新的感染性病毒的时间为为隐蔽期。不同病毒的隐蔽期长短不同，例如，DNA动物病毒的隐蔽期为5～20小时，RNA动物病毒为2～10小时。隐蔽期病毒在细胞内存在的动力学曲线呈线性函数，而非指数关系，从而证明子代病毒颗粒是由新合成的病毒基因组与蛋白质经装配成熟，而不是通过双分裂方式产生的。
? 3．病毒的复制周期
病毒的复制过程概括于图7-6中。病毒感染敏感的宿主细胞，首先是毒粒表面的吸附蛋白与细胞表面的病毒受体结合，病毒以一定方式进入细胞。经过脱壳（uncoating），释放出病毒基因组。然后病毒基因组在细胞核和/或细胞质中，进行病毒大分子的生物合成：一方面病毒基因组进行表达，产生①参与病毒基因组复制的蛋白质；②包装病毒基因组成为病毒颗粒的蛋白质；③改变受染细胞结构和/或功能的蛋白质。另一方面病毒基因组进行复制产生 子代核酸，并装配成病毒核壳。若是无包膜病毒，装配成熟的核壳就是子代毒粒，并以一定方式成释放到细胞外；若是有包膜病毒，核壳通过与细胞膜的相互作用以出芽方式释放，并在此过程中获得包膜。这样一个自病毒吸附于细胞开始，到子代病毒从感染细胞释放到细胞外的病毒复制过程称为病毒的复制周期（replicative circle）或称复制循环。病毒的复制周期依其所发生的事件顺序分为以下五个阶段：①吸附；②侵入（penetrat ion）；③脱壳；④病毒大分子的合成，包括病毒基因组的表达与复制；⑤装配与释放。病毒的吸附、侵入和脱壳又称做病毒感染的起始。
二、病毒感染的起始
病毒感染细胞，毒粒必须吸附于细胞表面，并进入细胞，经脱壳释放病毒基因组。
1．吸附
吸附是病毒表面蛋白与细胞受体特异性的结合，导致病毒附着于细胞表面，这是启动病毒感染的第一阶段。
（1）病毒吸附蛋白
病毒吸附蛋白(viral attachment protein, VAP)是能够特异性地识别细胞受体并与之结合的毒粒表面的结构蛋白分子，亦称做反受体（antireceptor）。无包膜毒粒的VAP往往是核壳的组成部分，有包膜病毒的VAP为包膜糖蛋白，如T偶数噬菌体的尾丝蛋白，流感病毒包膜表面的血凝素糖蛋白等。一些复杂的病毒，如痘苗病毒(Vaccinia virus)，单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus，HSV）有数种反受体分子，而且反受体可能有几个功能结构域，各与不同的受体作用。编码反受体的基因的突变，能够灭活或破坏反受体的蛋白水解酶、β-糖苷酶及中和抗体等均可导致反受体与受体相互作用能力的丧失，进而影响病毒的感染性。
（2）细胞受体
病毒的细胞受体亦称病毒受体，系指能被病毒吸附蛋白特异性地识别，并与之结合介导病毒进入细胞，启动感染发生的细胞表面组分。现在已知病毒受体是细胞的功能性物质，为细胞正常生长代谢所必需，而非病毒专一性的成份，例如狂犬病毒(Rabies virus)的受体是细胞表面的乙酰胆碱受体，单纯疱疹病毒的受体是硫酸乙酰肝素。不同种系的细胞具有不同病毒的细胞受体，病毒受体的细胞种系特异性决定了病毒的宿主范围。最近还发现人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV) 等的感染需要辅助受体（coreceptor）的参与。这种稍后与病毒结合并引发病毒穿入或膜融合的细胞组分又称为第二受体。但至今仍未发现植物病毒的细胞受体存在。
? （3）病毒的吸附过程
病毒吸附蛋白与细胞受体间的结合力来源于空间结构的互补性，相互间的电荷、氢键、疏水性相互作用及范得华力。不同病毒的吸附速率常数有很大差别。而且影响细胞受体和病毒吸附蛋白的活性的因素，如细胞代谢抑制物、蛋白酶、糖苷酶、脂溶剂，抗体等，以及包括温度，离子浓度和pH在内的环境因素均可影响病毒的吸附反应。
2．侵入
侵入又称病毒内化，它是一个病毒吸附后几乎立即发生，依赖于能量的感染步骤。不同的病毒宿主系统的病毒侵入机制不同。有伸缩尾的T偶数噬菌体采取注射方式将噬菌体核酸注入细胞，其过程如图7-7所示。
动物病毒能以下列不同的机制进入细胞：
①完整病毒穿过细胞膜的移位（translocation）方式；
②利用细胞的内吞（endocytosis）功能进入细胞，这种侵入方式又称病毒入胞（viropexis），以内容方式进入的病毒颗粒还累积在细胞质小泡内，还须以一定方式释放到细胞质中；
③毒粒包膜与细胞质膜的融合，病毒的内部组分释放到细胞质中。无包膜病毒以前两种机制侵入细胞。以内吞方式进入的有包膜病毒亦需要通过包膜与小泡膜的融合将内部组分释放入细胞质中。病毒包膜与细胞膜的融合皆需要病毒包膜中有融合活性的包膜蛋白与细胞膜中特定的蛋白组分相互作用。
植物有角质化或腊质化的表皮和坚硬的细胞壁，所以植物病毒只能通过因人为地或自然的机械损伤所形成的微伤口进入细胞；或者靠携带有病毒的媒介，主要靠是有吮吸式口器的昆虫取食 将病毒带 入细胞。植物病毒一旦进入细胞后，增殖产生的子代病毒或病毒核酸可通过病毒编码的运 动蛋白（movement protein）与胞间连丝的相互作用从受染细胞进入邻近细胞。
3．脱壳
脱壳是病毒侵入后，病毒的包膜和/或壳体除去而释放出病毒核酸的过程。它是病毒基因组进行功能表达所必需的感染事件。至今对于病毒脱壳的机制和细节仍缺乏了解，但病毒与细胞受体的作用对于病毒脱壳是至关重要的。T偶数噬菌体脱壳与侵入是一起发生的，仅有核酸病毒及结合蛋白进入细胞，壳体留在细胞外。动物病毒存在不同的结构类型和不同的侵入方式，其脱壳过程也较复杂。许多病毒（如正粘病毒、副粘病毒、小RNA病毒）的保护性包膜或壳体在病毒进入受染细胞时除去。疱疹病毒、乳多空病毒和腺病毒感染时，壳体沿着细胞骨架从进入位点移到核孔，很可能因细胞因子激活病毒功能，释放病毒DNA或DNA蛋白质复合物进入核内，空壳最后降解。呼肠孤病毒的壳体仅部分除去。而所有负链RNA病毒的基因组都不完全从壳体释放。痘病毒分两阶段脱壳：首先外壳由宿主细胞酶除去，然后在感染后合成的病毒脱壳酶的作用下，病毒DNA从核心中释放。
三、病毒大分子的合成
病毒大分子的合成是通过病毒基因组的表达与复制完成的，在这一过程中所发生的各种病毒复制事件存在着强烈的时序性。病毒复制的时序性主要表现为基因组转录的时间组织(temporal organization)，即病毒基因组的转录是分期进行的。发生在病毒核酸复制以前的转录为早期转录，所转录的基因称做早期基因，早期基因编码的早期蛋白主要是参与病毒核酸复制、调节病毒基因组表达，以及改变或抑制宿主细胞大分子合成的蛋白质。在病毒核酸复制开始或复制后所进行的转录为晚期转录，所转录的基因称做晚期基因，晚期基因编码的晚期蛋白主要是构成子代毒粒所需的结构蛋白。一些复杂的病毒基因组转录的时间组织分得更细，如T4噬菌体的转录分为立即早期、迟早期、中期和晚期。根据病毒大分子合成过程中所发生事件的时间顺序，可以将此过程划分为三个连续的阶段：
①病毒早期基因的表达；
②病毒基因组的复制；
③病毒晚期基因的表达。
1.噬菌体的大分子合成
除光滑噬菌体科等少数例外，绝大多数噬菌体都是DNA噬菌体，且除微噬菌体科和丝杆噬菌体科外，其余的都是双链DNA噬菌体。
(1)dsDNA噬菌体
研究得最为充分的T4噬菌体的大分子合成如图7-8所示。T4噬菌体早期mRNA由大肠杆菌RNA多聚酶完成，早期基因编码的蛋白质参与宿主控制，病毒DNA复制和晚期基因表达的调节，某些早期病毒特异性酶也能降解宿主DNA，从而停止宿主基因表达并为病毒DNA合成提供前体。噬菌体编码的某些早期蛋白质还可取代σ因子与宿主转录酶结合，从而改变了转录酶的启动子特异性 ，使之自噬菌体晚期启动子起始转录。同时，晚期转录也需要噬菌体DNA的复制，只有正在复制、结构发生改变的病毒DNA才能作为晚期转录的模板。早期基因与晚期基因定位于不同的DNA链上，它们的转录分别以不同方向进行。与T4噬菌体不同，T7噬菌体的晚期转录由病毒早期基因编码的转录酶完成，且其所有的mRNA都是从右向链转录。图7-9表示T7噬 菌体的基因组和基因合成蛋白质的顺序。T4DNA复制有两个特点：一是由于T4DNA中胞嘧啶被羟甲基胞嘧啶取代，所以在其DNA复制开始前，必须由噬菌体编码的酶合成羟甲基胞嘧啶，并且在T4DNA合成后，羟甲基胞嘧啶被葡萄糖基化，以保护T4DNA免遭大肠杆菌核酸酶降解。类似的例子亦见于其它的噬菌体DNA，如λ噬菌体DNA合成后腺嘌呤和胞嘧啶被甲基化；二是在T4DNA复制过程中，由6～8个DNA拷贝结合形成非常长的DNA链，这些由数个单位长度DNA以相同方向连结形成的DNA复制分子称做多连体(concatemers)。T7噬菌体DNA和λ噬菌体DNA复制时也有多连体形成。
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(2)ssDNA噬菌体
属干微噬菌体科的噬菌体φX174基因组为正链DNA。φX174DNA进入细胞后，在宿主的DNA多聚酶作用下形成双链DNA，这种病毒单链核酸复制产生的双链复制分子称做复制型(replicative form, RF)。然后以复制型为模板进行复制和转录、产生更多的复制型、mRNA和子代+DNA 基因组(图7-10)。
(3)RNA噬菌体
大多数RNA噬菌体都是正链RNA噬菌体，属光滑噬菌体科，如噬菌体Qβ、MS2、R17等。其基 因组RNA可作为mRNA指导噬菌体蛋白质的合成，其中一种蛋白质产物是病毒的依赖于RNA的RN A聚合酶。
在此复制酶作用下，以基因组+RNA为模板产生双链复制型，然后复制酶利用复制型的负链为模板，合成数千个+RNA拷贝。这些+RNA或是作为模板合成RF，以进一步复制更多的+RNA；或是作为mRNA进行病毒蛋白质合成。最后新合成的+RNA基因组结合于壳体中，产生成熟的病毒颗粒(图7-11)。
2.动物病毒的大分子合成
动物病毒基因组的结构类型多种多样，每一种都有其独特的复制方式和表达策略(图7-12)。 此外，不同病毒的大分子合成位点亦有所不同。DNA病毒的基因组复制与转录在细胞核中进 行，但嗜肝DNA病毒(Hepadnaviruses)的基因组复制以及痘病毒的基因组复制与转录是在细胞质中进行。RNA病毒基因组的复制与转录都在细胞质中进行，而正粘病毒基因组的复制在细胞核内进行，逆转录病毒基因组的复制在细胞质和细胞核中进行。
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图7-12 动物病毒基因复制方式和表达策略
(1)DNA动物病毒
与真核细胞相同，DNA动物病毒的转录与翻译不互相偶联，因此，转录和转录后的加工、修饰以及转运是病毒mRNA合成的突出特征。动物病毒基因组DNA转录产生的初始转录物要经过包括：①3′末端腺苷化；②5′末端加上帽子结构；③甲基化；④拼接等加工修饰才能成熟为功能性mRNA。大多数DNA动物病毒至少早期基因的转录是利用宿主转录酶进行的，但痘病毒早期mRNA由结合于毒粒核心的病毒转录酶合成。动物病毒DNA的复制也和噬菌体一样，依赖于病毒早期蛋白的功能。一些小型DNA病毒依靠宿主细胞DNA聚合酶进行DNA复制，如细小病毒DNA仅能在处于S期的细胞核内复制，而像疱疹病毒和痘病毒等大型DNA病毒的DNA复制都需要病毒编码的DNA聚合酶。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)DNA在受染细胞的核内利用宿主RNA聚合酶进行转录并产生几种mRNA，其中最大的3.4kb RNA称做前基因组(progenome)。然后RNA前基因组与DNA聚合酶和核心蛋白结合形成未成熟的核心壳粒，继而逆转录酶利用蛋白质为引物，以前基因组+RNA为模极转录产生-DNA，前基因组RNA几乎全部被RNaseH降解，余下的RNA片段再作为DNA聚合酶的引物拷贝-DNA，产生子代dsDNA。
(2)RNA动物病毒
与DNA动物病毒相比较，RNA动物病毒之间的复制策略存在更大的差别。基于它的基因组复制和转录的模式，可将其分为4个主要类型。
正链RNA病毒：
如小RNA病毒、黄病毒之类的正链RNA病毒的基因组RNA具有mRNA活性，可直接翻译成聚蛋白( polyprotein)，再经宿主和病毒编码的蛋白酶切割产生不同的病毒蛋白质。病毒RNA复制是由新合成的病毒复制酶以基因组+RNA为模板合成-RNA，再以-RNA为模板合成新的+RNA病毒基因组。在复制过程中，有双链形式的复制分子产生。
负链RNA病毒：
由干负链RNA病毒基因组与其mRNA序列互补，所以它们必须利用结合于毒粒的病毒转录酶合成mRNA。病毒RNA的复制与正链RNA病毒类似。
双链RNA病毒：
呼肠孤病毒的分段双链RNA基因组的每个节段编码一种mRNA，mRNA的合成是在部分脱壳的颗粒中利用毒粒携带的转录酶转录基因组的负链完成。
二倍体正链RNA病毒：逆转录病毒的+RNA基因组由毒粒携带的逆转录酶以细胞的tRNA为引物，逆转录产生-DNA，形成RNA-DNA杂交体。然后+RNA被逆转录酶的RNaseH组分降解，逆转录酶以余下的-DNA为模板复制产生称做前病毒(provirus)的双链DNA。前病毒DNA环化后整合于宿主染色体，并在宿主的RNA聚合酶作用下转录产生mRNA和新的+RNA基因组。
另外，布尼亚病毒科白蛉热病毒属(Phlebovirus)成员和沙粒病毒科的成员基因组的S节段是双意RNA，其中的正意部分可直接进翻译，负意部分则须由毒粒携带的转录酶转录。
3.植物病毒的大分子合成
以TMV为代表的大多数植物病毒都含有正链RNA基因组。病毒基因组正链RNA的复制与其它的 正 链RNA病毒类似，包括利用亲代RNA为模板复制负链，然后再以负链为模板合成子代正链这两 个步骤。大多数植物都含有依赖RNA的RNA聚合酶，并且这些正常的细胞酶可能参与病毒RN A复制，然而已有证据表明芜菁黄化病毒(Turnip yellow virus， TYV)、豇豆花叶病毒(Cow pea mosaic viurs, CMV)，烟草花叶病毒等可能都是依靠病毒特异性的RNA复制酶进行复制 。 正链RNA植物病毒亦与其他正链RNA病毒类似，其基因组RNA具有mRNA活性，可直接进行翻译 。但是不同的植物正链RNA病毒发展了不同的基因组策略来促进和/或调节基因的表达。这些 策略包括合成亚基因组mRNA，翻译的通读(read through)和读框移动(frameshif t)，产生聚蛋白以及多分基因组等。例如许多植物正链RNA病毒，无论是单分基因组还是 多分基因组，定位在基因组RNA3′端的壳体蛋白基因往往不能直接表达，壳体蛋白多是通 过与基因组3′端序列相同的亚基因组mRNA翻译产生。
四、病毒的装配与释放
在病毒感染的细胞内，新合成的毒粒结构组分以一定的方式结合，组装成完整的病毒颗粒，这一过程称做病毒的装配，亦称成熟(maturation)或形态发生(morphogenesis)。成熟的子代 病毒颗粒然后依一定途径释放到细胞外。病毒的释放标志病毒复制周期结束。对于有些病毒，特别是有包膜病毒而言，这两个过程有着十分密切的联系。
1.噬菌体的装配与释放
T4噬菌体的装配过程已作详细研究，这是一个极为复杂的自我装配的过程(图7-13)。这一过程包括4个完全独立的亚装配途径：无尾丝的尾部装配；头部的装配；尾部与头部自发结合；单独装配的尾丝与前已装配好的颗粒相连。以上各个装配步骤通过一系列绝对有序的装配反应进行，其中每一种结构蛋白在装配时都发生了构型的改变，为后一种蛋白质的结合提供了可识别位点。而且前壳体的装配还需脚手架蛋白(scaffolding protein)的参与，这些蛋白质在结构完成后被除去。包括T4噬菌体、单链DNA噬菌体φX174等大多数噬菌体都是以裂解细胞方式释放。丝杆噬菌体不杀死细胞，子代毒粒以分泌方式不断从受染细胞中释放，这是一种病毒与宿主细菌的共生关系。
2.动物病毒的装配与释放
裸露的、有包膜的和复杂的动物病毒的形态结构都不相同，它们的成熟和释放过程也各有特点，而且，病毒形态发生的部位也因病毒而异。与噬菌体一样，动物病毒晚期基因编码的壳体蛋白自我装配形成壳体。裸露的二十面体病毒首先装配成空的前壳体，然后与核酸结合成熟为完整的病毒颗粒。有包膜动物病毒包括所有具螺旋对称壳体和某些具二十面体壳体的病毒。这些病毒的装配首先是形成核壳，然后再包装上包膜。有的是在从宿主细胞核芽出的过程中从核膜上获得包膜而形成包膜病毒(图7-14a)，如疱疹病毒；有的则是在从宿主细胞质膜芽出的过程中裹上包膜而形成包膜病毒(图7-14b)，如流感病毒。而且这一过程往往与病毒释放同时发生。
3.植物病毒的装配与释放
烟草花叶病毒的装配是病毒自我装配的经典范例。TMV壳体蛋白质亚基首先形成20S的双层园盘，然后园盘与靠近TMV RNA基因组3′端的特异性装配起始部分结合，RNA穿过螺旋的中心孔并在生长端形成一个可移动的环。随着蛋白质亚基不断加入，螺旋壳体首先的RNA5′端生长，5′端包装完成后，再问3′端延伸至核壳成熟。植物病毒通过植物的维管进行长距离运动，它们在细胞之间的运动则通过胞间连丝进行，这 一过程需要病毒编码的运动蛋白的参与。有些植物病毒的运动蛋白与胞间连丝结合可增大胞间连丝的孔径，以允许病毒颗粒或病毒核酸通过胞间连丝在细胞间扩散；有的植物病毒的运动蛋白可取代胞间连丝，形成利于病毒在细胞间扩散的管状结构。
第五节 病毒的非增殖性感染
病毒对敏感细胞的感染并不一定都能导致病毒繁殖，产生有感染性的病毒子代。因最终的感染结果，敏感细胞的感染可分为两类：一类是增殖性感染（productive infection），这类感染发生在病毒能在其内完成复制循环的允许细胞（permissive cell）内，并以有感染性病毒 子代产生为特征；另一类是非增殖性感染（nonproductive infection），这类感染由于病毒、或是细胞的原因，致使病毒的复制在病毒进入敏感细胞后的某一阶段受阻，结果导致病毒感染的不完全循环（incomplete circle）。在此过程中，由于病毒与细胞的相互作用，虽然亦可能导致细胞发生某些变化，甚至产生细胞病变，但在受染细胞内，不产生有感染性的病毒子代。
?一、 非增殖性感染的类型
病毒的非增殖性感染有三种类型：流产感染（abortive infection）、限制性感染（restrictive infection）和潜伏感染（latent infection）。
1.流产感染
这是一类普遍发生的非增殖性感染。依其发生原因，可以将之分为依赖于细胞的流产感染和依赖于病毒流产感染两类。
(1) 依赖于细胞的流产感染
如果病毒感染的细胞是病毒不能复制的非允许细胞（nonpermissive cell）,将导致流产感染。在非允许细胞内，往往仅有少数病毒基因表达，病毒不能完成复制循环。其原因至今还不十分了解，可能与这些细胞缺失某些参与病毒复制的酶，tRNA或细胞因子有关。允许细胞与非允许细胞的划分是相对于某一特定的病毒而言的。一种病毒的允许细胞可能是另一种病毒的非允许细胞，反之亦然。例如猴肾细胞是SV40的允许细胞，但人腺病毒感染猴肾细胞则会导致流产感染发生。
(2) 依赖于病毒的流产感染
这类流产感染系由基因组不完整的缺损病毒（defective viruses）引起。这类病毒因一个或多个病毒复制必需基因有缺损，丧失了其功能，所以它们无论是感染允许细胞不是非允许细胞，都不能完成复制循环。
2.限制性感染
这类感染系因细胞的瞬时允许性产生。其结果或是病毒持续存在于受染细胞内不能复制，直到细胞成为允许性细胞，病毒才能繁殖；或是一个细胞群体中仅有少数细胞产生病毒子代。 例如人乳头瘤病毒可感染上皮细胞，并且其早期基因的转录可在受染的各分化期的上皮细胞 中进行。但是由于晚期基因转录仅能在分化成熟的鳞状上皮细胞中进行，所以只有进入终末 分化的鳞状上皮细胞才有病毒增殖。
3.潜伏感染
这类感染的显著特征是在受染细胞内有病毒基因组持续存在，但并无感染性病毒颗粒产生，而且受染细胞也不会破坏。这种携带有病毒基因组但不产生有感染性病毒的细胞称做病毒基因性细胞（virogenic cells）。潜伏感染的另一个极端情况是由于病毒基因的功能表达导致宿主基因表达的改变，以致正常细胞转化为恶性细胞。
二、缺损病毒
从某种意义而言，所有的病毒都是缺损的，因为它们都只能寄生于活细胞内进行复制。然而缺损病毒的复制还需要其他病毒基因组或病毒基因的辅助活性，否则即使在活细胞内也不能复制。不同的缺损病毒的来源和基因组的缺损表现都不相同，而且病毒基因组往往可能因严重缺损而丧失全部生物学功能。 有生物活性的缺损病毒包括四类：干扰缺损病毒或称干扰缺损颗粒（defective interfering particles,DI颗粒）、卫星病毒（satellite viruses）、条件缺损病毒（conditionally defective viruses）和整合的病毒基因组。
1.干扰缺损颗粒
DI颗粒是病毒复制时产生的一类亚基因组的缺失突变体（subgenomic delation mutants）。现在已知无论是动物病毒，还是植物病毒和噬菌体在自然感染或实验感染时，都可能产生各自相关的DI颗粒。特别是在高感染复数(multiplicity of infection, m.o.i)时，DI颗粒能以较高的频率产生。由于DI颗粒基因组有缺损，故不能完成复制循环，而必须依赖于其同源的完全病毒才能复制。同时，由于DI基因组较其完全病毒小、复制更为迅速，在与其完全病毒共感染时更易占据优势，从而干扰其复制。在病毒感染时普遍产生的DI颗粒能污染病毒制备物，并给病毒的生物学活性带来深刻且通常是有害的影响。DI颗粒干扰标准病毒的复制可能是某些病毒分离，培养困难的原因之一。 DI颗粒在病毒持续性感染的形成中可能起着重要作用。
2.卫星病毒
卫星病毒是寄生于与之无关的辅助病毒（helper viruses）的基因产物的病毒。与DI颗粒类似，卫星病毒的基因组是缺损的，它必须依赖于辅助病毒才能复制。与DI颗粒不同的是，它们不是由其辅助病毒的基因缺失产生的，而是存在于自然界中的一种绝对缺损病毒。而且它们的 形态结构和抗原性都与辅助病毒不同。其基因组与辅助病毒的基因组也很少有同源性。细小病毒科中的腺联病毒（Adenoassociated virus, AAV）是一种人的卫星病毒。这种小型的二十面体病毒含单链DNA基因组。AAV只能在同时有腺病毒或疱疹病毒感染的细胞核内复制，并且它还可干扰腺病毒的复制以及腺病毒引起的细胞转化。若是AAV单独感染细胞，则会导致流产感染发生，并且AAV的基因组整合在宿主细胞DNA中。 大肠杆菌噬菌体P4是一种更为复杂的卫星病毒，属肌尾噬菌体科。若无非缺损的辅助病毒大肠杆菌噬菌体P2的同时感染，它不能复制产生成熟的噬菌体颗粒。其原因是P4缺乏编码壳体蛋白的结构基因，它必须依赖P2合成的壳体蛋白装配成仅有P2壳体大小1/3的P4壳体，这样的壳体适于包装较小的P4DNA。 除腺联病毒和P4噬菌体外，卫星烟草坏死病毒，丁型肝炎病毒（Hepatitis delta virus，HDV）这些原来未归属于相应的病毒科或属的卫星病毒现在划归在亚病毒因子的卫星病毒之中。
3. 条件缺损病毒
条件缺损病毒是一类基因组发生了突变的病毒条件致死突变体，它们在允许条件下能够正常繁殖，在非允许条件或称限制条件下导致流产感染发生。某些条件缺损病毒也能干扰野生型病毒复制，它们的许多生物学行学与DI颗粒相似。
4. 整合的病毒基因组
某些温和噬菌体（temperate phage）和肿瘤病毒感染宿主细胞后，因病毒与细胞的性质， 病毒基因组整合于宿主染色体，并随细胞分裂传递给子代细胞，这类感染称之为整合感染 。除非缺损的外源性RNA肿瘤病毒外，整合感染的细胞没有感染性的病毒产生。只有在一定条件下，整合在宿主染色体的病毒基因组才能转入复制循环，产生有感染性的病毒颗粒。
(1)温和噬菌体的溶源性反应
大多数噬菌体感染宿主细胞，都能在细胞内正常复制并最终杀死细胞，这类噬菌体的裂解循环（lytic cycle）一般都是由烈性噬菌体（virulent phage）引起。而另有一些噬菌体除能以裂解循环在宿主细胞内生长外，还能以溶源状态（lysogenic state）存在。以溶源状态存在的噬菌体不能完成复制循环，噬菌体基因组长期存在于宿主细胞内，没有成熟噬菌体产生，这一现象称做溶源性（lysogeny）现象。能够导致溶源性发生的噬菌体称做温和噬菌体或称溶源性噬菌体（lysogenic phage）。在大多数情况下，温和噬菌体的基因组都整合于宿主染色体中（如λ噬菌体），亦有少数是以质粒形成存在（如P1噬菌体）。整合于细菌染色体或以质粒形成存在的温和噬菌体基因组称做原噬菌体（prophage）。在原噬菌体阶段，噬菌体的复制被抑制，宿主细胞正常地生长繁殖，而噬菌体基因组与宿主细菌染色体同步复制，并随细胞分裂而传递给子代细胞。细胞中含有以原噬菌体状态存在的温和噬菌体基因组的细菌称做溶源性细菌（lysogenic bacteria）。处于溶源性细菌细胞中的噬菌体DNA在一定条件下亦可启动裂解循环，产生成熟的病毒颗粒。自然情况下的溶源性菌裂解称为自发裂解(spontaneous lysis)，但裂解量较少，若经紫外线、氮芥、环氧化物等理化因子处理，可产生大量的裂解，此称为诱发裂解(inductive lysis)。溶源性反应是一种比裂解反应更有利于病毒持续和传播的病毒生存方式。处于这种最适应于它们所处环境中的噬菌体不会迅速杀死细胞，从而丧失传播的机会，所以，这也被认为一种原始的分化方式。
(2) 动物病毒的整合感染
在动物病毒中，许多DNA肿瘤病毒（如腺病毒、SV40、乙型肝炎病毒等）和RNA肿瘤病毒都能引起整合感染。在这些病毒感染的细胞中，病毒的基因组DNA或前病毒（provirus）DNA整合入宿主细胞染色体中。除慢性RNA肿瘤病毒和非复制缺损型的急性RNA肿瘤病毒外，受染细胞内没有病毒繁殖。只有在一定条件下，整合在细胞染色体上的病毒基因组才能转入复制循环，产生子代病毒颗粒。
属于逆转录病毒科的RNA肿瘤病毒的基因组通过逆转录产生DNA中间体，然后整合入宿主染色体。这一过程是病毒复制的必经阶段。整合入宿主染色体的病毒dsDNA中间体称做前病毒 。 RNA肿瘤病毒感染细胞后能否繁殖和引起细胞转化取决于病毒和受染细胞的性质。除Rous肉瘤病毒（Rous sarcoma virus，RSV）外，所有的急性RNA肿瘤病毒都是缺损病毒，由于其复制必需基因缺损，所以都不能独立复制。另外还有一类内源性病毒（endogenious viruses ），这类RNA肿瘤病毒的基因组普遍存在于许多动物的DNA中，但不转化细胞，也不产生病毒。内源性前病毒与原噬菌体类似，亦可自发地或经诱导转入复制循环，产生有感染性的病毒。
第七节 亚病毒因子
? 亚病毒因子包括卫星病毒、卫星RNA、类病毒和朊病毒。在亚病毒因子中，仅有类病毒和朊 病毒能独立复制；朊病毒颗粒不具有基因组核酸；卫星病毒与卫星RNA都具有核酸基因组， 它们与DI颗粒类似，必须依赖辅助病毒进行复制，与DI颗粒不同的是，它们与其辅助病毒没 有核酸序列同源性。卫星病毒、卫星RNA、类病毒和DI颗粒的性质比较于表7-4中。
一、卫星病毒
除前已述及的AAV和P4噬菌体外，另有一些卫星病毒被归在亚病毒之列，如卫星烟草坏死病毒、卫星烟草花叶病毒(Satellite tobacco moscire virus, STMV)、丁型肝炎病毒(Hepatitis D virus, HDV)等。
1.植物卫星病毒
卫星病毒首先是在植物中发现，已知的植物卫星病毒包括STNV、STMV、卫星稷子花叶病毒(Satellite panicum mosaic virus,SPMV)和卫星玉米白线花叶病毒(Satellite maize white line mosaic virus, SMWLMV)等。它们都依赖辅助病毒提供复制酶进行复制，并且都编码有壳体蛋白。植物卫星病毒对辅助病毒的依赖性相当专一。除烟草坏死病毒(Tobacco neorosis virus, TNV)外，其它的植物病毒都不能辅助STNV的复制，而且STNV的不同毒株必须依赖一定的TNV毒株进行复制。
2. 丁型肝炎病毒
丁型肝炎病毒(HDV)是亚病毒感染因子中的δ病毒属(Deltavirus)的代表成员，1977年在意大利的乙型肝炎病毒携带者中发现。HDV是一种缺损病毒，它必须利用乙型肝炎病毒的包膜蛋白才能完成自身的复制循环，而且土拨鼠肝炎病毒亦能辅助其复制。HDV的单链环状RNA基因组与植物类病毒类似、呈杆状二级结构，但其大小与类病毒不同，而且它具有编码蛋白能力。HDV的反基因组(antigenome)RNA含有一个开放阅读框(ORF)，依靠特异性的RNA编辑(RNA editing)功能可产生称之为"δ抗原"的两种RNA结合蛋白，它们分别参与基因组复制和颗粒装配。HDV和类病毒一样，利用宿主的依赖DNA的RNA聚合酶以正意和负意RNA为模板，通过滚环机制复制，产生的多聚体RNA链经过自我位点特异性的切割和连接(核酶活性)形成子代共价闭合环状分子。
二、卫星RNA
卫星RNA(sat RNA)是指一些必须依赖辅助病毒进行复制的小分子单链RNA片段，它们被包装在辅助病毒的壳体中，本身对于辅助病毒的复制不是必需的，且它们与辅助病毒的基因组无明显的同源性。
1.基因组结构
卫星RNA大小可分为两类，大者如番茄黑环病毒(Tomato black ring virus, TobRV) 的卫星RNA长1372～1376个核苷酸，大小与卫星病毒基因组类似，但多数都在300个核苷酸左右，如烟草环斑病毒(Tobacco ring spot virus, TobRSV)的卫星RNA、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)的卫星RNA。许多卫星RNA的5′端有帽子结构，3′端无poly (A)，而是类似tRNA的结构，并且卫星RNA通过分子内部碱基配对形成复杂的二级结构。较大的卫星RNA具有长开放阅读框并能够表达，而较小的卫星RNA似不具有mRNA功能。许多卫星RNA都能以线状和环状两种形式存在于被感染的组织中，但是在辅助病毒颗粒中仅有线状形式存在。
2.复制
除了大小和蛋白质编码能力的区别外，不同的卫星RNA的复制方式也不同。一些较小的卫星RNA，如绒毛烟斑驳病毒(Velvet tobacco mottle virus, VTMoV)卫星RNA是以对称的滚环方式复制(图7-15)。复制过程中产生的正链和复链的RNA多聚体都要经过自发的自我切割产生线状的单体分子，线状的负链RNA环化后作为合成子代正链的模板。正链和负链的切割都与其内部的核酶(ribozyme)活性结构有关。包括一些较小的和大的另一类卫星RNA复制时不能自我切割，复制方式与其辅助病毒一致。
3.卫星RNA的生物活性
许多卫星RNA能显著影响其辅助病毒在宿主中所产生的症状，如南介菜花叶病毒(Arabis mosaic virus, ArMV)卫星RNA能加重ArMV所引起的花叶和褪绿症状，但TobRSV卫星RNA能明显减轻TobRSV在烟草上所引起的环斑症状。有的病毒的不同毒株的卫星RNA对辅助病毒在宿主上引起的症状有不同的影响，而且同一种卫星RNA在不同宿主内对辅助病毒引起的症状的影响也不相同。卫星RNA对辅助病毒所引起的症状的修饰作用，与卫星RNA的核苷酸序列、空间结构和复制特征有关。由于很多卫星RNA能减轻辅助病毒所引起的宿主症状，所以它们已被用来防治植物病毒病害，将卫星RNA的cDNA转入植物所构建的抗病毒的转基因植物亦早已获得成功。
三、类病毒
1971年Diener首次报道，引起马铃薯纺锤形块茎病的病原体是一种低分子量RNA，它没有蛋白质外壳，在其感染的植物组织中也未发现病毒样颗粒。这种小分子RNA能在敏感细胞内自我复制，并不需要辅助病毒。由于其结构和性质都与已知的病毒不同，故Diener等把它称做类病毒。 迄今已鉴定的类病毒达20多种，根据它们是否含有中央保守区和核酶结构分为两个科，马铃薯纺锤形块茎类病毒科(Pospiviroidae)含中央保守区，不含核酶保守序列；而鳄梨白斑类病毒科(Avsunviroidae)没有中央保守区，但有核酶保守序列、能够自成切割。
? 1.类病毒的分子结构
类病毒为含246～375个核苷酸的单链环状RNA分子。所有的类病毒RNA均无mRNA活性，不能编码蛋白质。大多数类病毒RNA都呈高度碱基配对的双链区与单链环状区相间排列的杆状构型，各种类病毒之间序列有较大的同源性。有几种病毒，如唇膏蔓蔷薇隐性类病毒(Columnea latent viroid, CLVd)等可能是相关的类病毒之间重组产生的嵌合分子。
2.类病毒的复制
由于类病毒RNA没有编码功能，其复制必然是完全利用宿主细胞酶，包括依赖DNA的RNA聚合酶Ⅱ等。由于类病毒为环状单链RNA分子，对称或非对称的滚环复制机制均适合于类病毒(图 7-15)。鳄梨白斑类病毒(Avocado sunblotch viroid, ASBVd)可能是利用对称的滚环复制方式复制，而马铃薯纺锤形块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid, PSTVd)及其相关的类病毒则可能是以非对称的滚环复制方式复制，即由滚环复制产生的多聚体负链RNA直接拷贝出多聚体正链RNA，然后经剪切环化，形成子代类病毒。
3.类病毒的致病性
类病毒的致病性与其RNA内部的致病变结构域(P区)的序列与构型有关，不同的PSTVd分离株其P区几个碱基的变化，可分别引起宿主植物温和症状、严重症状和死亡。类病毒变异最为频繁的可变区(V区)亦与致病性有关。柑桔裂皮类病毒(Citus exocortis viroid, CEVd)A株在蕃茄上引起严重的矮化及偏上生长，而其DE26株仅引起温和症状，二者仅有27个核苷酸的差别，其中大部分在P区和V区。但是，有些类病毒，如ASBVd并不存在明显的致病区，它们的致病机理还有待阐明。
四、朊病毒
朊病毒是一类能引起哺乳动物的亚急性海绵样脑病的病原因子，这些疾病包括人的库鲁病(kuru)、克雅氏病(CreutzfeldtJakob disease, CJD)、格史氏综合症(GerstmannStraussler syndrome，GSS)和致死性家族失眼病(Fatal familial insomnia, FFI)，发生于动物中的羊搔痒症(scrapie)、貂的传染性脑病(transmissible mink encephalopathy，TME)、黑尾鹿与糜鹿的慢性消耗病(Chronic wasting disease)以及牛海绵状脑病(spongiform ence phalopathy)。由于这类病原因子能引起人与动物的致死性中枢神经系统疾病，并且它们具有不同于病毒的生物学性质和理化性质，故一直引起人的极大的兴趣，并以羊搔痒病为模型进行了大量的研究。
1.朊病毒的理化性质
羊搔痒病因子无免疫原性；对紫外线、幅射、非离子型去污剂、蛋白酶等能使病毒灭活的理化因子有较强的抗性；高温、核酸酶，如羟胺、亚硝酸之类的核酸变性剂都不能破坏其感染性；如SDS、尿素、苯酚之类的蛋白质变性剂都能使之失活。由于迄今未能证明它含有核酸，故多数人认为羊搔痒病因子的化学本质是蛋白质。Prusiner (1982)提出它们是一种蛋白质侵染颗粒(proteinaceous infectious particle)，并将之称做Prion或Virino，即朊病毒。
2.朊病毒的结构
从羊搔痒病因子实验感染的仓鼠脑组织中分离到一种分子量为27～30kD的蛋白质。由于这种蛋白质可与搔痒病因子共纯化；其浓度与搔痒病因子的传染性正相关；这种蛋白纯化后具有传染性；并且其感染性可被中和抗体中和，故将这种蛋白称做朊病毒蛋白(Prion p rotein, PrP)。由于该蛋白来源于羊搔痒病，故以prpsc表示。 根据prpsc的氨基末端的序列合成寡核苷酸探针进行检测的结果发现，在正常的人和动物的细胞DNA中有编码PrP的基因，且无论感染搔痒病因子与否，宿主细胞PrP mRNA水平无变化，说明PrP是细胞组成型基因表达的产物。这种细胞的PrP称做prpc，为33～35kD的膜糖蛋白。正常细胞表达的prpc与羊搔痒病的prpsc为同分异构体。它们的一级结构相同，但prpc具有43%的α螺旋和3%的β折叠，prpsc约有34%的α螺旋和43%的β折叠。多个β折叠使prpsc溶解度降低，对蛋白酶抗性增强。关于prpsc的来源， Prusiner等认为，prpsc来源于prpc，并且prpsc的形成是翻译后的加工过程，而不是蛋白内共价键的修饰。
3.朊病毒的增殖
关于PrPc如何转变为prpsc尚待阐明。有人认为prpsc进入细胞后与prpc结合，形成prpsc-prpc复合体，导致prpc构型发生改变，转变为prpsc，这样产生的两个prpsc分子，再分别与prpc分子结合，产生4个prpsc。如此周而复始，导致prpsc数目呈指数增加。
朊病毒的研究已取得很大进展，大量证据都支持Prusiner等提出的朊病毒仅由蛋白质组成，且系由细胞蛋白prpc经翻译后修饰而转变为折叠异常的病理形态prpsc这一假说。 但迄今为止仍有人认为朊病毒含有很少量的核酸，所以对朊病毒的本质，朊病毒的繁殖，朊病毒的传播方式及其致病机理等问题还有待进一步阐明。
小 结
病毒是一类结构极其简单，具有特殊的繁殖方式的绝对细胞内寄生物。病毒具有细胞外相和细胞内相两种生命形态，前者以感染性毒粒形态存在，后者以繁殖性基因形式存在。
毒粒具有确定的形态结构、生物学特性和理化性质。毒粒的基本结构是核壳、壳体的基本对称形式是螺旋对称和二十面体对称，有的病毒核壳外还有包膜。 毒粒的基本化学组成是核酸和蛋白质。核酸是病毒的遗传物质，病毒基因组核酸有dsDNA、ssDNA、dsRNA和ssRNA四种基本类型，病毒DNA基因组有线状形式和环状形式，单链RNA基因组有正意和负意之分。构成毒粒的病毒结构蛋白分为壳体蛋白、包膜蛋白和毒粒酶，它们各具不同的功能。
病毒的繁殖是以复制方式进行。病毒的复制循环包括吸附、侵入、脱壳、病毒大分子的合成和装配与释放等阶段。不同病毒的毒粒形态结构、基因组核酸类型和结构特征各不相同，因此它们各具不同的复制策略。
病毒感染非允许细胞或者缺损病毒感染允许细胞和非允许细胞都可能导致非增殖性感染发生。处于非增殖性感染的病毒能以协同感染或共同培养的方法进行拯救。
病毒感染宿主细胞，通过病毒与宿主的相互作用，一方面病毒得以繁衍、进化，另一方面病毒给宿主细胞和机体带来种种不同的影响，这些影响不仅具有重要的生物学意义，而且可能具有重要的医学意义或经济意义。
包括卫星因子(卫星病毒和卫星RNA)、类病毒和朊病毒在内的亚病毒因子是一些比经典意义病毒更为简单的病原因子。亚病毒具有许多不同于病毒的特征，亚病毒研究不仅扩展了病毒学研究范围，而且可能更新病毒的定义，深化人们对病毒的起源与进化，乃至生命本质的认识。
思 考 题
1.病毒区别于其他生物的特点是什么? 根据你的理解，病毒应如何定义?
2.病毒学研究的基本方法有哪些，这些方法的基本原理分别是什么?
3.病毒壳体结构有哪几种对称形式? 毒粒的主要结构类型有哪些?
4.病毒核酸有哪些类型和结构特征?各类病毒基因组的复制策略有何区别?
5.病毒复制循环可分为哪几个阶段? 各个阶段的主要过程如何?
6.病毒的非增殖性感染有哪几类?引起病毒非增殖性感染的原因是什么?
7.噬菌体是如何感染宿主细胞的，叙述它与宿主细胞间的相互关系。
8.某发酵工厂生产菌株经常因噬菌体"感染"而不能正常生产，在排除了外部感染的可能性 后有人认为是由于溶源性菌裂解所致，你的看法如何? 并请设计一实验证明之。
9.亚病毒有哪几类? 各自有何特点?
第八章 微生物遗传
计划学时：5
重点：遗传变异的物质基础，突变的类型，诱变育种的基本过程，营养缺陷型的筛选方法及原理。
第一节 遗传的物质基础
遗传的物质基础是蛋白质还是核酸，曾是生物学中激烈争论的重大问题之一。1944年Avery等人以微生物为研究对象进行的实验，无可辨驳地证 实遗传的物质基础不是蛋白质而是核酸，并且随着对DNA特性(结构的多样性，自体复制特性等)的了解，“核酸是遗传物质的基础”这一生物学中的重大理论才真正得以突破。下面分别介绍以DNA和RNA为遗传物质基础的微生物学实验证据。
一 DNA作为遗传物质
1.Griffith的转化实验
1928年英国的一位细菌学家F.Griffith将能使小鼠致死的SⅢ型菌株加热杀死，并注入小鼠体内后，小鼠不死，而且也不能从小鼠体内重新分离到肺炎球菌。但是当他们进一步将加热杀死，已无致病性的SⅢ菌和小量活的非致病的R型菌(由SⅡ型突变而来)一起注入小鼠体内后，意外地发现小鼠死了， 而且从死的小鼠中分离到活的SⅢ型菌株(注意不是SⅡ型)。显然，小鼠致死的原因正是由于这些SⅢ型菌的毒性作用，那么这些SⅢ菌从何而来呢?实验不难证明注入小鼠体内的SⅢ菌已全部被杀死，因此不可能是SⅢ的残留者，同时，也不可能是R型回复突变所致，因为来自SⅡ型的R型的回复突变应为SⅡ型而不是SⅢ型。唯一合理的解释是：活的、非致病性的R型从 已被杀死的SⅢ型中获得了遗传物质，使其产生荚膜成为致病性的SⅢ型。Griffith将这种现 象称为转化(transformation)。几年后，这一现象在离体条件下进一步得到证实，并将引起转化的遗传物质称为转化因子(transforming factor)。Griffith是第一个发现转化现象的 ，虽然当时还不知道称之为转化因子的本质是什么，但是他的工作为后来Avery等人进一步 揭示转化因子的实质，确立DNA为遗传物质奠定了重要基础。
2.DNA作为遗传物质的第一个实验证据
Avery和他的合作者C.M.Macleod和M.J.McCarty为了弄清楚Griffith实验中的转化因子的实质，他们分别用降解DNA、RNA或蛋白质的酶作用于有毒的S型细胞抽提物，选择性地破坏这些细胞成份，然后分别与无毒的R型细胞混合，观察转化现象的发生。结果发现，只有DNA被酶解而遭到破坏的抽提物无转化作用，说明DNA是转化所必须的转化因子，并在1944 年发表了他们的实验结果，为Griffith的转化因子是DNA而不是蛋白质提供了第一证据。为了消除“蛋白质论”者的怀疑，Avery等人将DNA抽提出来，进行不断的纯化，直到1949年，作为转化因子的DNA已纯化到所含蛋白质只有0.02%，这时的转化效果非但不减少反而增加，并随DNA浓度的增加而增加。DNA作为遗传信息的载体已充分获得证实。
3.T2噬菌体的感染实验
1952年，Alfred D.Hershey和Martha Chase为了证实T2噬菌体的DNA是遗传物质，他们用P32标记病毒的DNA，用S35标记病毒的蛋白质外壳。然后将这两种不同标记的 病毒分别与其宿主大肠杆菌混合。结果发现，用含有S35蛋白质的T2噬菌体感染大肠杆菌时，大多数放射活性留在宿主细胞的外边，而用含有P32DNA的T2噬菌体与宿 主细菌混合时，则发现P32DNA注入宿主细胞，并产生噬菌体后代，这些T2噬菌体后代的蛋白质外壳的组成、形状大小等特性均与留在细胞外的蛋白质外壳一模一样，说明决定蛋白质外壳的遗传信息是在DNA上，DNA携带有T2的全部遗传信息(图8-1)。
图8-1 T2噬菌体的实验
二、RNA作为遗传物质
有些生物只由RNA和蛋白质组成，例如某些动物和植物病毒以及某些噬菌体(见第七章)。1956年，H.FraenkelConrat用含RNA的烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus，简称TMV) 所进行的拆分与重建实验证明RNA也是遗传物质的基础。图8-2显示其实验的过程：
(1)用表面活性剂处理标准TMV，得到它的蛋白质；
(2)从TMV的变种HR(外壳蛋白的氨基酸组成与标准株存在2-3个氨基酸的差别)通过弱碱处理得到它的RNA；
(3)通过重建获得杂种病毒；
(4)标准TMV抗血清使杂种病毒失活，HR抗血清不使它失活，证实杂种病毒的蛋白质外壳是来自TMV标准株。
(5)杂种病毒感染烟草产生HR所特有的病斑，说明杂种病毒的感染特性是由HR的RNA 所决定，而不是二者的融合特征；
(6)从病斑中一再分离得到的子病毒的蛋白质外壳是HR蛋白质，而不是标准株的蛋白质外壳。以上实验结果说明杂种病毒的感染特征和蛋白质的特性 是由它的RNA所决定，而不是由蛋白质所决定，遗传物质是RNA。
图8-2 TMV病毒拆分重建实验
三、朊病毒的发现和思考
无论是DNA还是RNA作为遗传物质的基础已是无可辨驳的事实。但朊病毒(prion)的发现对“ 蛋白质不是遗传物质”的定论也带来一些疑云。prpsc(见第七章)是具有传染性的蛋 白质致病因子，迄今未发现该蛋白内有核酸。但已知的传染性疾病的传播因子必须含有核酸 (DNA或RNA)组成的遗传物质，才能感染宿主并在宿主体内自然繁殖。那么这是生命界的又一特例呢? 还是因为目前人们的认识和技术所限而尚未揭示的生命之谜呢? (如有人坚持认为prpsc中可能含有极微量的核酸)还有待生命科学家去认识和探索。但prpsc的致病性是由于prpc改变折叠状态所致，这一广为证实的事实，已是当今分子生物学研究的热点之一——由蛋白质的折叠与生物功能之间的关系的研究延伸至与疾病的致病因子之间的关系的研究，为治疗和根除prpsc引起的疾病(有人称为构象病)开辟新的途径。
第二节 微生物的基因组结构
基因组(genome)是指存在于细胞或病毒中的所有基因。细菌在一般情况下是一套基因，即单倍体(hoploid)；真核微生物通常是有二套基因又称二倍体(diploid)。基因组通常是指全部一套基因。由于现在发现许多非编码序列具有重要的功能，因此目前基因组的含义实际上是指细胞中基因以及非基因的DNA序列组成的总称，包括编码蛋白质的结构基因、调控序列以及目前功能还尚不清楚的DNA序列。但无论是原核还是真核微生物，其基因组一 般都比较小(表8-1)，其中最小的大肠杆菌噬菌体MS2只有3000bp，含3个基因。一般来说这些依赖于宿主生活的病毒基因组都很小。近年来对微生物基因组序列的测定表明，能进行独立生活的最小基因组是一种生殖道枝原体，只含473个基因，通过与流感嗜血菌序列比较研究，提出了256个基因可能是维持细胞生命活动所必需的最低数量的假说。
微生物基因组随不同类型(真细菌、古生菌、真核微生物)表现出多样性，下面分别以大肠杆菌和啤酒酵母为代表说明。
一、大肠杆菌的基因组
大肠杆菌基因组为双链环状的DNA分子*，在细 胞中以紧密缠绕成的较致密的不规则小体形式存在于细胞中，该小体称为拟核(nucliod)， 其上结合有类组蛋白蛋白质和少量RNA分子，使其压缩成一种手脚架形的(scaffold)致密结 构(大肠杆菌DNA分子长度是其菌体长度的1000倍，所以必须以一定的形式压缩进细胞中) 。大肠杆菌及其它原核细胞就是以这种拟核形式在细胞中执行着诸如复制、重组、转录、 翻译以及复杂的调节过程。基因组全序列测定于1997年由Wisconsin大学的Blattner等人完成，其基因组结构特点如下：
1.遗传信息的连续性
从表8-1可以看出，大肠杆菌和其它原核生物中基因数基本接近由它 的基因组大小所估计的基因数(通常以1000bp～1500bp为一个基因计，说明这些微生物基因 组DNA 绝大部分用来编码蛋白质、RNA；用作为复制起点、启动子、终止子和一些由调节蛋白识别 和结合的位点等信号序列。除在个别细菌(鼠伤寒沙门氏菌和犬螺杆菌)和古生菌的rRNA和tR NA中发现有内含子或间插序列外，其它绝大部分原核生物不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。
2.功能相关的结构基因组成操纵子结构 大肠杆菌总共有2584个操纵子，基因组测序推测出2192个操纵子。其中73%只含一个基因，16.6%含有2个基因，4.6%含有3个基因，6%含有4个或4个以上的基因。大肠杆菌有如此多的操纵子结构，可能与原核基因表达多采用转录调控有关，因为组成操纵子有其方便的一面。 此外有些功能相关的RNA基因也串联在一起，如构成核糖核蛋白体的三种RNA基因转录在同一个转录产物中，它们依次是16SrRNA23SrRNA5SrRNA。这三种RNA除了组建核糖体外，别无他用，而在核糖体中的比例又是1∶1∶1，倘若它们不在同一个转录产物中，则或者造成 这三种RNA比例失调，影响细胞功能；或者造成浪费；或者需要一个极其复杂、耗费巨大的调节机构来保持正常的1∶1∶1。
3.结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝 在大多数情况下结构基因在基因组中是单拷贝的，但是编码rRNA的基因rrn往往是多拷贝的，大肠杆菌有7个rRNA操纵子，其特征都与基因组的复制方向有关，即按复制方向表达。7个rrn操纵子中就有6个分布在大肠杆菌DNA的双向复制起点oric(83分钟处)附近，而不是在复制终点(33分钟)附近，可以设想，在一个细胞周期中，复制起点处的基因的表达量几乎相当于处于复制终点的同样基因 的两倍，有利于核糖体的快速组装，便于在急需蛋白质合成时，细胞可以在短时间内有大量核糖体生成。大肠杆菌及其它原核生物(如枯草杆菌的rrn有10个拷贝)rrn多拷贝及结构基因的单拷贝，也反映了它们基因组经济而有效的结构。
4.基因组的重复序列少而短
原核生物基因组存在一定数量的重复序列，但比真核生物少得多，而且重复的序列比较短，一般为4～40个碱基，重复的程度有的是十多次，有的可达上千次**。
二、啤酒酵母的基因组
啤酒酵母是单细胞真核生物，1996年，由欧洲、美国、加拿大和日本共96个实验室的633位科学家的艰苦努力完成了全基因组的测序工作，这是第一个完成测序的真核生物基因组。该基因大小为13.5×106bp，分布在16个不连续的染色体中(表8-2)。象所有其它的真核细胞 一样，酵母菌的DNA也是与四种主要的组蛋白(H2A、H2B、H3和H4)结合构成染色质(chromatin)的14bp核小体核心DNA；染色体DNA上有着丝粒(centromere)和端粒(telomere)，没有明显的操纵子结构，有间隔区或内含子序列。酵母菌基因组最显著的特点是高度重复， 从表8-2可看出tRNA基因在每个染色体上至少是4个，多则30多个，总共约有250个拷贝(大肠 杆菌约60个拷贝)。rRNA基因只位于ⅩⅠⅠ号染色体的近端粒处，每个长9137bp，有100～200个拷贝。酵母基因组全序列测定完成后，在其基因组上还发现了许多较高同源性的DNA重复序 列，并称之为遗传丰余(genetic redundancy)。酵母基因组的高度重复或遗传丰余是一种浪费和多余呢?还是一种进化的策略呢?显然应该是后者，所有现存的生物在自然的不断选择下 ，总是以合适的结构特征来完成其生命过程。也许是在份数这么多的丰余基因中，如果有少数基因突变而失去功能的话，可不影响生命的生存；也许是为了适应复杂多变的环境，多余的基因可使生物体能够在不同的环境中分别使用多个功能相同或者相似的基因产物，做到有备无患。因此从这个意义上讲酵母确实比细菌和病毒“进步”且“富有”，而细菌和病毒( 许多病毒基因组上的基因是重叠的)似乎更“聪明”，知道如何尽量经济和有效地利用其有限的遗传资源。
第三节 质粒和转座因子
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质粒(plasmid)和转座因子(transposable element)都是细胞中除染色体以外的另外二类遗传因子。前者是一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中；后者是位于染色体或质粒上的一段能改变自身位置的DNA序列，广泛分布于原核和真核细胞中。目前对细菌中的质粒和转座因子已研究得比较详细，本节将以细菌为例介绍这两种遗传因子。
一、质粒的分子结构
质粒通常以共价闭合环状(covalently closed circle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中(图8-3)，但从细胞中分离的质粒大多是三种构型，即CCC型、OC型(open circular form)和L型(linear form)(图8-4)。近年来在疏螺旋体、链霉菌和酵母菌中也发现了线型双链DNA质粒和RNA质粒。质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb。
根据质粒的分子大小和结构特征，通过超离心或琼脂糖凝胶电泳可将质粒与染色体DNA分开，从而分离得到质粒。这是因为虽然染色体DNA也是以超螺旋结构存在于细胞中，但其分子大小远远超过质粒(例如：大肠杆菌染色体是4100kb，而ColE1质粒只有9kb)，因此在分离过程中染色体DNA总是会断裂成线状，其两端可以自由转动而使分子内的紧张态完成松弛。而小分子的质粒绝大多数是CCC或OC结构，共价闭环的质粒DNA分子无自由末端，分子是紧密的缠结状态，因此在含溴化乙锭(Ethidium bromide，简称EB，可与DNA和RNA分子结合，使其在紫外光照射下显现荧光，便于观察或分离)的氯化铯梯度中，松弛的染色体DNA结合的EB分子比质粒多，其密度也比质粒小，经高速密度梯度离心后，就可将二者分开，从而可分离得到质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳则是根据分子量大小和电泳呈现的带型将染色体DNA与质粒分开。前者也是因随机断裂成线状，且分子量大，所以泳动速度慢，带型也不整齐；而后者分子量小，大小均一，泳动速度快，带型整齐，很容易将二者区分并进而达到分离质粒DNA。
二、质粒的主要类型
染色体DNA作为细胞中的主要遗传因子，携带有在所有生长条件下所必需的基因，这些基因有时称之为“持家基因”(housekeeping gene)，而质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的，只是在某些特殊条件下，质粒能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。例如抗药性质粒和降解性质粒能使宿主细胞在具有相应药物或化学毒物的环境中生存，而且在细胞分裂时恒定的传递给子代细胞。
根据质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应，可将其分为各种不同的类型：
1.致育因子(Fertility factor，F因子)
又称F质粒，其大小约100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象(接合作用)有关的质粒。携带F质粒的菌株称为F+菌株(相当 于雄性)，无F质粒的菌株称为F-菌株(相当于雌性)。F质粒整合到宿主细胞染色体上的菌株称之为高频重组菌株(high frequence recombination, 简称Hfr)。由于F因子能以游离状态(F+)和以与染色体相结合的状态(Hfr)存在于细胞中，所以又称之为附加体(episome)。 F质粒在大肠杆菌的接合作用(conjugation)中起主要作用。当Hfr菌株上的F因子通过重组回复成自主状态时，有时可将其相邻的染色体基因一起切割下来，而成为携带某一染色体基因的F因子，例如F-lac、F-gal、F-pro等。因此将这些携带不同基因的F因子统称为F′，带有这些F′因子的菌株也常用F′表示。
2.抗性因子(Resistance factor，R因子)
这是另一类普遍而重要的质粒，主要包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。带有抗药性因子的细菌有时对于几种抗生素或其他药物呈现抗性。例如R1质粒(94kb)可使宿主对下列五种药物具有抗性：氯霉素(Chlorampenicol, Cm)、链霉素(Streptomycin, Sm)、磺胺(Sulfonamide, Su)、氨苄青霉素(Ampicillin, Ap)和卡那霉素(Kanamycin, Km)，并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于R1抗性质粒上。
许多R质粒能使宿主细胞对许多金属离子呈现抗性，包括碲(Te6+)、砷(As3+) 、汞(Hg2+)、镍(Ni2+)、钴(Co2+)、银(Ag+)、镉(Cd2+)等。 在肠道细菌中发现的R质粒，约有25%是抗汞离子的，而铜绿假单胞菌中约占75%。
3.Col质粒
因这类质粒首先发现于大肠杆菌中而得名，该质粒含有编码大肠菌素的基因，大肠菌素是一种细菌蛋白，只杀死近缘且不含Col质粒的菌株，而宿主不受其产生的细菌素的影响。由G+细菌产生的细菌素通常也是由质粒基因编码，有些甚至有商业价值，例如一种乳酸细菌产生的细菌素NisinA能强烈抑制某些G+细菌的生长，而被用于食品工业的保藏。
4.毒性质粒(virulence plasmid)
现在越来越多的证据表明，许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因，例如产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病原菌之一，其中许多菌株含有为一种或多种肠毒素编码的质粒。有些使昆虫 致病乃至死亡的细菌毒素也是由质粒编码的，苏云金杆菌产生的毒素是这种类型的典型例子 。研究表明，苏云金杆菌含有编码δ内毒素(伴孢晶体中)的质粒，伴孢晶体的结构基因及调节基因位于质粒上。
5.代谢质粒(Metabolic plasmid)
这类质粒上携带有能降解某些基质的酶的基因，含有这类质粒的细菌，特别是假单胞菌，能将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式。尤其是对一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯)、农药(2,4-dichlorophenox yacetic acid)、辛烷和樟脑等的降解，在环境保护方面具有重要的意义(见第十一章)。因此这类质粒也常被称为降解质粒，每一种具体的质粒常以其降解的底物而命名。如樟脑质粒 (camphor, CAM)、辛烷质粒(octadecane, OCT)、二甲苯质粒(xylene, XYL)等。
此外，代谢质粒中还包括一些能编码固氮功能的质粒。例如根瘤菌中与结瘤(nod)和固氮(fix)有关的所有基因均位于共生质粒中。放线菌中也已发现许多大的线型质粒(～500kb以上) 含有抗生素合成的基因。
6.隐秘质粒(cryptic plasmid)
以上所讨论的质粒类型均具有某种可检测的遗传表型，但隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。他们存在的生物学意义，目前几乎不了解。酵母的2μm质粒不授予宿主任何表型效应，也属于隐秘型质粒。
除了根据质粒赋予宿主的遗传表型将质粒分成不同类型外，还可根据质粒的拷贝数、宿主范围等将质粒分成不同类型。例如：有些质粒在每个宿主细胞中可以有10-100个拷贝，称为高拷贝数(high copy number)质粒，另一些质粒在每个细胞中只有1-4个拷贝，为低拷贝数(Low copy number)质粒。前者又称松弛型质粒(relaxed plasmid)，后者又称严谨型质粒(stringent plasmid)。此外，还有一些质粒的复制起始点(origin of replication)较特异，只能在一种特定的宿主细胞中复制，称为窄宿主范围质粒(narrow host range plasmid)；复制起始点不太特异，可以在许多种细菌中复制，称为广宿主范围质粒(broad host range plasmid)。能整合进染色体而随染色体的复制而进行复制的质粒又称附加体(episome)。
三、质粒的不亲和性
细菌通常含有一种或多种稳定遗传的质粒，这些质粒可认为是彼此亲和的(compatible)。但是如果将一种类型的质粒通过接合或其它方式(如转化)导入某一合适的但已含一种质粒的宿主细胞，只经少数几代后，大多数子细胞只含有其中一种质粒，那么这二种质粒便是不亲和的(incompatible)，它们不能共存于同一细胞中。质粒的这种特性称为不亲和性(incompatibility)。根据某些质粒在同一细菌中能否并存的情况，可将质粒分成许多不亲和群(incompatibility group)，能在同一细菌中并存的质粒属于不同的不亲和群，而在同一细菌中不 能并存的质粒属于同一不亲和群。这是因为质粒的不亲和性现象主要与复制和分配有关，所以不能在同一细胞共存的质粒是因为它们共享一个或多个共同的复制因子或相同的分配系统 ，因此它们便属于同一不亲和群。只有那些具有不同的复制因子或不同分配系统的质粒才能共存于同一细胞中，所以它们必然属于不同的不亲和群。因此到目前为止，可以说这是一种接近质粒本质的一种分类方法，目前已在大肠杆菌中发现了30多种不同的不亲和群。
当二种同一不亲和群的质粒共处同一细胞时，其中一种由于不能复制因而在细胞的不断分裂过程中被稀释掉(diluted out)，或被消除(curing)。所谓消除是指细胞中由于质粒的复制受到抑制而染色体的复制并未明显受到影响，细胞可继续分裂的情况下发生的质粒丢失。质粒消除可自发产生，也可通过人工处理提高消除率，例如，用一定浓度的吖啶橙染料(acrid ine dyes)或其它能干扰质粒复制而对染色体复制影响较小的理化因子处理细胞，可消除质粒。
四、转座因子的类型和分子结构
转座因子是细胞中能改变自身位置(例如从染色体或质粒的一个位点转到另一个位点，或者在二个复制子之间转移)的一段DNA序列。广泛存在于原核和真核细胞中（表8-3），由美国遗传学家Barbara MeClintock首先在玉米中发现，并荣获1983年度诺贝尔奖。原核生物中的转座因子有三种类型：插入顺序（insertion sequence, IS）、转座子（transposon, Tn）和某些特殊病毒（如Mu、D108）。IS和Tn有二个重要的共同特征：它们都携带有编码转座酶（trans posase）的基因，该酶是转移位置，即转座（transposition）所必需的；另一共同特征是它们的二端都有反向末端重复序列（inverted terminal repeat, ITR），该序列的长度为40bp（主要是IS）到1000bp以上（某些Tn）。图8-5显示IS2和Tn5的遗传图谱。
IS是最简单的转座因子，分子大小范围在250～1600bp左右，只含有编码转座所必须的转座酶的基因。它们分布在细菌的染色体、质粒以及某些噬菌体DNA上。
转座子(Tn)比IS分子大，与IS的主要差别是Tn携带有授予宿主某些遗传特性的基因，主要是抗生素和某些毒物(如汞离子)抗性基因，也有其它基因，如：Tn951携带有负责乳糖发酵的基因。根据转座子二端结构的组成可将其分为二种类型。第一种类型是转座子二端为顺向或反向重复的IS，药物抗性基因位于中间，IS提供转座功能，连同抗性基因一起转座，Tn5(图8-5)是这一类型的代表，称为复合转座子(compound transposon)或类型Ⅰ转座子。这一类型的转座子实际上是IS因子的延伸。第二种类型的转座子的两端为短的反向重复序列 (IR)，其长度一般为30-50bp，在二个IR之间是编码转座功能和药物抗性的基因(或其它基因 )，这类转座子称为类型Ⅱ或称复杂转座子(complex transposon)，Tn3(图8-6)是这一类型的典型代表。
Mu噬菌体是一种以大肠杆菌为宿主的温和噬菌体，以裂解生长和溶源生长两种方式交替繁衍自己。其基因组上除含有为噬菌体生长繁殖所必需的基因外，还有为转座所必需的基因， 因此它也是最大的转座因子，全长约39kb，图8-7显示Mu噬菌体的遗传图谱。从图谱中可看出Mu基因组的实际长度只有37.2kb，因为该DNA分子的两端并不是像IS和Tn那样的反向重复序列，而是宿主DNA序列。左端的宿主DNA约为50-150bp，右端是1-2kb，这也是Mu噬菌体不同于其它噬菌体的独特之处。两端的宿主DNA是由于进入裂解循环的MuDNA进行外壳装配时，是从随机插入的Mu基因组C端及其相邻的50-150bp的宿主DNA开始一直到与S端相邻接的1-2kb的 宿主DNA为止，也就是C端50-150bp的宿主DNA加37.2kb的Mu基因组和1-2kb的S端宿主DNA被包装进外壳蛋白，而且由于Mu插入的位点不同，所以几乎每一个噬菌体颗粒结合着不同的宿主 DNA序列。
五、转座的遗传学效应
转座因子的转座可引发多种遗传学效应。这些效应不仅在生物进化上有重要的意义，而且已成为遗传学研究中的一种重要的工具。这些遗传变化主要包括：
(1)插入突变
当各种IS、Tn等转座因子插入到某一基因中后，此基因的功能丧失，发生突变。如果插入位于某操纵子的前半部分，就可能造成极性突变，导致该操纵子后半部分结构基因表达失活。如果插入的是带有抗性(或其它)基因的转座子，则可获得带有新的基因标记的插入突变。
(2)产生染色体畸变
由于复制性转座是转座子一个拷贝的转座，处在同一染色体上不同位置的二个拷贝之间可能发生同源重组，这种重组过程可导致DNA的缺失或倒位，即染色体畸变。
(3)基因的移动和重排由于转座作用
可能使一些原来在染色体上相距甚远的基因组合到一起，构建成一个操纵子或表达单元，也可能产生一些具有新的生物学功能的基因和新的蛋白质分子，具有生物进化上的重要意义。
第四节 基因突变及修复
一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变，包括一对或少数几对碱基的缺失、插入或置换，而导致的遗传变化称为基因突变(gene mutation)，其发生变化的范围很小，所以又称点突变(point mutati on)或狭义的突变。广义的突变又称染色体畸变(chromosomal aberration)，包括大段染色体的缺失、重复、倒位。基因突变是重要的生物学现象，它是一切生物变化的根源，连同基因转移、重组一起提供了推动生物进化的遗传多变性。也是我们用来获得优良菌株的重要途径之一。DNA损伤的修复和基因突变有着密切的关系，当DNA的某一位置的结构发生改变(称为前突)时，并不意味着一定会产生突变，因为细胞内存在一系列的修复系统 ，能清除或纠正不正常的DNA分子结构和损伤，从而阻止突变的发生，因此前突可以通过DNA复制而成为真正的突变，也可以重新变为原来的结构，这取决于修复作用和其它多种因素。本节将对基因突变、修复及二者的相关性进行讨论。
一、基因突变的类型及其分离?
1.碱基变化与遗传信息的改变
不同的碱基变化对遗传信息的改变是不同的，可分为四种类型(图8-8)。
(1)同义突变(same-sense mutation)
这是指某个碱基的变化没有改变产物氨基酸序列的密码子变化，显然，这是与密码子的简并性相关的。
(2)错义突变(mis-sense mutation)
是指碱基序列的改变引起了产物氨基酸的改变。有些错义突变严重影响到蛋白质活性甚至使之完全无活性，从而影响了表型。如果该基因是必需基因，则该突变为致死突变(lethal mutation)。
(3)无义突变(nonsense mutation)
是指某个碱基的改变，使代表某种氨基酸的密码子变为蛋白质合成的终止密码子(UAA，UAG，UGA)。蛋白质的合成提前终止，产生截短的蛋白质。
(4)移码突变(frameshift mutation)
由于DNA序列中发生1-2个核苷酸的缺失式插入，使翻译的阅读框发生改变，从而导致从改变位置以后的氨基序列的完全变化。
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2.表型变化
表型(phenotype)和基因型(genotype)是遗传学中常用的二个概念，前者是指可观察或可检测到的个体性状或特征，是特定的基因型在一定环境条件下的表现；后者是指贮存在遗传物质中的信息，也就是它的DNA碱基顺序。上述四种类型的突变，除了同义突变外，其它三种类型都可能导致表型的变化。下面主要介绍几种常用的表型变化的突变型及其分离。
(1)营养缺陷型(auxotroph)
一种缺乏合成其生存所必须的营养物的突变型，只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物(precursor)才能生长。它的基因型常用所需营养物 的前三个英文小写斜体字母表示，例如hisC、lacZ分别代表组氨酸缺陷型和乳糖发酵缺陷型，其中的大写字母C和Z则表示同一表型中不同基因的突变。相应的表型则用HisC和LacZ(第一个字母大写)表示。在容易引起误解的情况下，则用hisA-和hisA+，lacZ-和lacZ+分别表示缺陷型和野生型(Wildtype gene,没有发生突变的基因)。
营养缺陷型是微生物遗传学研究中重要的选择标记和育种的重要手段，由于这类突变型在选 择培养基( 或基本培养基)上不生长，所以是一种负选择标记，需采用影印平板(Replica plating)的方法进行分离，步骤如下：
①将待分离突变株的原始菌株以合适的稀释度涂布到野生型菌株和突变株均能生长的主平板(含完全培养基)上，经培养后形成单菌落(图8-9a)；
②通过一消毒的“印章”(直径略小于培养皿底，表面包有丝绒布，使其尽量平整，图8-9b)将A平板的菌落分别原位转移(或印迹)到C平板(含有与A平板相同的营养成份)和D平板(不含缺陷型所 需的营养因子，即基本培养基)；
③经培养后对照观察c和d平板上形成的单菌落，如果在c平板上长而在d平板上不长的，则为所需分离的突变型；
④在c平板上挑取d平板上不长的相应位置的单菌落，并进一步在完全培养基上划线分离纯化。
(2)抗药性突变型(resistant mutant)
由于基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性的一种突变，普遍存在于各类细菌中，也是用来筛选重组子和进行其它遗传学研究的重要正选择标记(见第十章)。这类突变类型常用所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示，如：strr和strs分别表示对链霉素的抗性和敏感性(sensitivity)。在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。
(3)条件致死突变型(conditional lethal mutant)
是指在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。这类突变型常被用来分离生长繁殖必需的突变基因。因为这类基因一旦发生突变是致死的(例如为DNA复制所必需的基因)，因而也就不可能得到这些基因的突变。常用的条件致死突变是温度敏感突变，用ts(temperaturesensitive)表示，这类突变在高温下(如42℃)是致死的，但可以在低温(如25-30℃)下得到这种突变。筛选ts 突变型的方法也是采用影印平板法，所不同的是图8-9中的三个平板上培养基相同，均可生长。只是将C和D平板分别置低温(30℃)和高温(42℃)下培养，然后在C平板上挑取相应于D平板上未生长的菌落。
(4)形态突变型(morphological mutant)
是指造成形态改变的突变型，包括影响细胞和菌落形态、颜色以及影响噬菌体的噬菌斑形态的突变型，这是一类非选择性突变，因为在一定条件下，它既没有像抗性突变那样的生长优势，也没有像营养缺陷性和条件致死突变那样的 生长劣势，形态突变和非突变型均同样生长在平板上，只能靠看得见的形态变化进行筛选。其中以颜色变化较易筛选，例如：用携带有β-半乳糖苷酶的Mu转座因子引起的插入突变，在含有x-gal(5-bromo-r-chloro-3-indolyl-β-Dgalactoside)的平板上可显示兰色菌落或噬菌斑，使易于鉴别和分离。DNA重组技术中常用的pUC载体系列和受体系统是通过β-半乳糖苷酶基因的插入失活，使重组子菌落为白色而与兰色的非重组子分开。
二、基因突变的分子基础
1.自发突变
(1)特性
不经诱变剂处理而自然发生的突变称自发突变。具有如下特性：
①非对应性：突变的发生与环境因子无对应性。即抗药性突变并非由于接触了药物所引起，抗噬菌体的突变也不是由于接触了噬菌体所引起。突变在接触它们之前就已自发地随机地产生了，噬菌体或药物只是起着选择作用。不过，近年来也有人提出突变具有对应性，即定向或适应性突变的例子*。
②稀有性：自发突变的频率(突变率)很低，一般在10-6～10-9。所谓突变率是指每一个细胞在每一世代中发生某一特定突变的机率，也用每单位群体在繁殖一代过程中所形成突变体的数目表示。例如10-9的突变率即意味着109个细胞在分裂成2×109个细胞的过程中，平均形成一个突变体。
③规律性：特定微生物的某一特定性状的突变率具有一定的规律性，例如大肠杆菌总是以 3×10-8的频率产生抗噬菌体T1的突变，以1×10-9的频率产生抗链霉素突变；而金黄色葡萄球菌总是以1×10-7产生抗青霉素突变等。
④独立性：引起各种性状改变的基因突变彼此是独立的，即某种细菌均可以一定的突变率产生不同的突变，一般互不干扰。
⑤遗传和回复性：突变是遗传物质结构的改变，因此是可以稳定遗传的。但同样的原因也可以导致突变的回复，使表型回复到野生型状态。
⑥可诱变性：通过理化因子等诱变剂的诱变作用可提高自发突变的频率，但不改变突变的本质。
(2)分子基础
引起自发突变的原因很多，包括DNA复制过程中，由DNA聚合酶产生的错误，DNA的物理损伤，重组和转座等。但是这些错误和损伤将会被细胞内大量的修复系统修复，使突变率降到最低限度。自然突变的一个最主要的原因是碱基能以称之为互变异构体(taumer)的不同形式存在，互变异构体能够形成不同的碱基配对，因此在DNA复制时，当腺嘌呤以正常的氨基形式出现时，便与胸腺嘌呤进行正确配对(A-T)；如果以亚氨基(imino)形式(互变异构)出现时，则与胞嘧啶配对，这意味着C代替T插入到DNA分子中，如果在下一轮复制之前未被修复，那么DNA分子中的A-T碱基对就变成了G-C(图8-10)。
同样，胸腺嘧啶也可因为由酮式到烯醇式的异构作用而将碱基配对由原来的A-T变成了G-T，即鸟嘌呤取代了腺嘌呤，经复制后便导致AT→GT的转换。所谓转换(transition)是嘌呤到嘌呤(如图8-10中的AT→GT)或嘧啶到嘧啶的碱基置换，如果是嘌呤到嘧啶(如AT→CG)或嘧啶到嘌呤的变化则称之为颠换(transversion)。
此外，在DNA复制时，由于在短的重复核苷酸序列发生的DNA链的滑动(slippage)而导致一小段DNA的插入或缺失也是产生自发突变的原因。碱基偶尔会从核苷酸移出而留下一个称之为脱嘌呤(apurinic)或脱嘧啶(apyrimidinic)的缺口，该缺口在下一轮复制时不能进行正常的碱基配对，其原因被认为是胞嘧啶的自然脱氨基(deamination)而形成了尿嘧定所致，因为尿嘧啶不是DNA的正常碱基而将被DNA修复系统识别而被除去，结果留下一个脱嘧啶位点。最后，自发突变还有一个很重要的原因就是由能够随机插入基因组的转座因子引起的。而且如果在基因组上存在二个或多个拷贝，则会发生同源重组，进而导致缺失，重复和倒位。
(3)RNA基因组的突变
虽然所有细胞是DNA作为遗传物质，但是一些病毒是RNA基因组，这类基因组也能发生突变，而且RNA基因组的突变率比DNA基因组高1000倍。其部分原因是由于RNA复制酶没有像DNA聚合酶那样的纠错活性，其次是没有类似的RNA修复机制。RNA病毒中这种很高的突变率不仅是引起学术上的兴趣，而且引起疾病的病毒RNA基因组能够很迅速地突变，表明病毒将不断地出现新的类群。因此对RNA病毒的研究十分重视。
2.诱变突变
自发突变的频率是很低的，一般为10-6-10-10。许多化学、物理和生物因子能够提高其突变频率，将这些能使突变率提高到自发突变水平以上的物理、化学和生物因子称为诱变剂(mutagen)。所谓诱发突变并非是用诱变剂产生新的突变，而是通过不同的方式提高突变率。常用的诱变剂有：
(1)碱基类似物(Base analog)
例如：5-溴尿嘧啶(胸腺嘧啶结构类似物)和2-氨基嘌呤(腺嘌呤结构类似物)，在DNA复制过程中能够整合进DNA分子，但由于它们比正常碱基产生异构体的频率高，因此出现图8-10所示的碱基错配的机率也高，从而提高突变频率。
(2)插入染料(intercalating dye)
这是一类扁平的具有三个苯环结构的化合物，在分子形态上类似于碱基对的扁平分子。所以它们是通过插入DNA分子的碱基对之间，使其分开，从而导致DNA在复制过程中的滑动，这种滑动增加了一小段DNA插入和缺失的机率，导致突变率的增加，常引起移码突变。溴化乙锭和吖啶橙是这类诱变剂的代表。
(3)直接与DNA碱基起化学反应的诱变剂
最常见的有亚硝酸、羟胺和烷化剂。亚硝酸能引起含NH2基的碱基(A.G.C)产生氧化脱氨反应，使氨基变为酮基，从而改变配对性质造成碱基置换突变。羟胺(NH2OH)几乎只和胞嘧啶发生反应，因此只引起GC→AT的转换。甲磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)和亚硝基胍(nitrosoguanidine, NTG)都属于烷基化试剂，其烷基化位点主要在鸟嘌呤的N-7位和腺嘌呤N-3位上。但这两个碱基的其它位置以及其它碱基的许多位置也能被烷化，烷化后的碱基也像碱基结构类似物一样能引起碱基配对的错误。亚硝基胍是一种诱变作用特别强的诱变剂，因而有超诱变剂之称，它可以使一个群体中任何一个基因的突变率高达1%，而且能引起多位点突点，主要集中在复制叉附近，随复制叉的移动其作用位置也移动。此外，硫酸二乙酯(diethyl sulfate,DES)、乙基磺酸乙酯(ethyl ethane sulfonate,EES)以及二乙基亚硝酸胺(diethyl nitrosamine,DEN)等也都是常用的诱变烷化剂。
(4)辐射和热
紫外线(ultraviolet,简称UV)是实验室中常用的非电离辐射诱变因子，其作用机制也了解得比较清楚，由UV引起的主要损伤是相邻碱基形成二聚体(dimer)，阻碍碱基的正常配对而导致碱基置换突变。另方面当细胞用一种称之为SOS的倾向错误(errorprone )的修复系统(见后面)来修复损伤时，还会导致高频率的突变。 x-射线、r-射线，快中子等属于电离辐射，作用机理尚不十分清楚，与UV不同的是电离辐 射可通过玻璃和其它物质，穿透力强，能达到生殖细胞，因此常用于动物和植物的诱变育种。
短时间的热处理也可诱发突变，据认为热的作用是使胞嘧啶脱氨基而成为尿嘧啶，从而导致GC→AT的转换，另外，热也可以引起鸟嘌呤脱氧核糖键的移动，从而在DNA复制过程中出现包括二个鸟嘌呤的碱基配对，在再一次复制中这一对碱基错配就会造成GC→CG颠换。 (5)生物诱变因子
转座因子也是实验室中常用的一种诱变因子，它们在基因组的任何部位插入，一旦插入某基因的编码序列，就引起该基因的失活而导致中断突变，而且由于转座因 子Tn、Mu带有可选择标记(抗生素抗性等)，因此可容易地分离到所需的突变基因。
3.诱变剂与致癌物质——Ames试验
现已发现许多化学诱变剂能够引起动物和人的癌症，因此利用细菌突变来检测环境中存在的致癌物质是一种简便、快速、灵敏的方法。该方法是由美国加利福尼亚大学的Ames教授首先发明，因此又称Ames试验，该试验是利用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhmurium)的组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变性能来进行的。所谓回复突变(reverse mutation或back mutation)是指突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变。his-菌株在不含组氨酸的培养基中不能生长，或只有极少数的自发回复突变子生长，如果回复突变率因某种化学诱变剂(或待测 物)的作用而增加，那么这种化学药物可判断为具有致癌性。 但由于许多潜在的致癌剂在体外试验中可能不显示诱变作用，但进入人体后可转变成致癌活性，这种转变主要是由于肝脏内的混合功能氧化酶系的作用。因此为了使体外试验更接近于人体内代谢条件，Ames等采用了在体外加入哺乳动物(如大鼠)微粒体酶系统，使待测物活化，使Ames试验的准确率达80-90%。
第五节 细菌基因转移和重组
自然界的微生物可通过多种途径进行水平方向的基因转移，并通过基因的重新组合以适应随时改变的环境以求生存，这种转移不仅发生在不同的微生物细胞之间，而且也发生在微生物与高等动植物之间，例如最近发现的引起人体结核病的结核分枝杆菌基因组上有8个人的基因，获得这些基因可以使该菌抵抗人体的免疫防御系统，而得以生存。因此基因的转移和交换是普遍存在的，是生物进化的重要动力之一。
一、细菌的接合作用(conjugation)
1.实验证据
接合作用是指通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程。该过程是在1946年由Joshua Lederberg和Edward L.Taturm通过使用细菌的多重营养缺陷型(避免回复突变的干扰)，进行的杂交实验得到证实的。从图8-14可以看出，二株多重营养缺陷型菌株只 有在混合培养后才能在基本培养基上长出原养型菌落，而未混合的二亲菌均不能在基本培养基上生长，说明长出的原养型菌落(由营养缺陷型恢复野生型表型的菌株形成的菌落)是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致。
Lederberg等人的实验第一次证实了细菌之间可发生遗传交换和重组，但这一过程是否需要细胞间的直接接触则是由Davis的“U”型管实验证实的(图8-15)。U型管中间隔有滤板，只允许培养基通过而细菌不能通过。其二臂盛有完全培养基，当将两株营养缺陷型分别接种到U型管二臂进行“混合”培养后，没有发现基因交换和重组(基本培养基上无原养型菌落生长 )，从而证明了Lederberg等观察到的重组现象是需要细胞的直接接触的。
2.F+×F-杂交
细菌的接合作用是由F因子介导的，图8-16显示大肠杆菌F因子的遗传图谱，其突出的特征是与转移有关的基因(tra)占了整个图谱的1/3，包括编码F-性菌毛、稳定接合配对、转移的起始(oriT)和调节等20多个基因。
在F+×F-的接合作用中，是F因子向F-细胞转移，含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般不被转移。杂交的结果是给体细胞和受体细胞均成为F+细胞。接合过程分两步进行，即接合配对的形成和DNA的转移：当由F因子编码的性菌毛(位于细胞表面)的游离端与受体细胞接触，使供体细胞和受体细胞连接到一块以后(图17a)，性菌毛可能通过给体或受体细胞膜中的解聚作用(disaggregation)和再溶解作用(redissolution)进行收缩，从而使给体和受体细胞紧密相连。紧接着便开始接合过程的第二步——DNA转移(图8-17b)。起动这一步的关键位点是OriT，该位点具有被trayⅠ编码的缺刻螺旋酶(nickasehelicase)识别的序列，该酶将其中一条链(图8-17中粗线所示)切断，并结合于被切断的5′末端，通过由并列在一起的给体和受体细胞之间形成的小孔进行单向转移，此转移链到达受体细菌后，在宿主细胞编码的酶(包 括DNA聚合酶Ⅲ)的作用下开始复制，留在供体细胞内的单链(图8-17中细线表示)也在DNA聚合酶Ⅲ的作用下进行复制，因此接合过程结束后，给、受体各含有一个F因子。
3.Hfr×F-杂交
Hfr是由F因子插入到染色体DNA后形成的高频重组菌株，因为这类菌株在F因子转移过程中可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组而得名。Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与FF-细胞进行接合。所不同的是，当OriT序列被trayⅠ编码的酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(le ading region,见图8-16)结合着染色体DNA向受体细胞转移(图8-18)，F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中，故Hfr×F-杂交后的受体细胞(或接合子)仍然是F-。
4.F′转导(F′ transduction)
F′是携带有宿主染色体基因的F因子，F′×F-的杂交与F+×F-不同的是给体的部分染色体基因随F′一起转入受体细胞，并且不需要整合就可以表达，实际上是形成一种部分二倍体，此时的受体细胞也就变成了F′。细胞基因的这种转移过程又常称为性导(sexduction)。
二、细菌的转导(transduction)
转导是由病毒介导的细胞间进行遗传交换的一种方式。其具体含义是指一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。能将一个细菌宿主的部分染色体和质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体。转导可分为普遍性转导和局限性转导二种类型。在普遍性转导中，噬菌体可以转导给体染色体的任何部分到受体细胞中；而在局限性转导中，噬菌体总是携带同样的片段到受体细胞中。
1.普遍性转导(generalized transduction)
(1)意外的发现
1951年，Joshua Lederberg和Norton Zinder为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验，他们发现二株营养缺陷型混合培养后确实产生了约10-5的重组子，又一次成功地证实了该菌中存在的重组现象。但当他们沿着发现接合作用的思路继续用“U”型管进行同样的实验时，惊奇地发现：在给体和受体细胞不接触的情况下，同样出现原养型细菌。幸运的是他们的混合实验中，所用的沙门氏菌LT22A是携带P22噬菌体的溶源性细菌，另一株是非溶源性细菌，因此结果的解释必然集中到可透过“U”型管滤板的P22噬菌体，推测是它们进行着基因的传递。 经过后来进一步的对可过滤因子的研究和比较获得证实，从而发现了普遍性转导这一重要的基因转移途径。这是一个表面看起来的常规研究却导致一个惊奇和十分重要发现的重要例证之一。
(2)转导模型
图8-19显示P22介导的普遍性转导的基本过程。从图中可以看到，由给体细胞可产生二种类型的子代病毒，其中一种(右边，约10-6-10-8)病毒颗粒内包含的不是病毒DNA而是给体细胞的染色体DNA，这种病毒称转导颗粒或转导噬菌体，由它们感染受体细胞后，将给体的DNA导入受体细胞，通过同源重组形成转导子。那么转导噬菌体为什么“错”将 宿主的DNA包裹进去了呢?研究表明，这与噬菌体的包装机制有关，图8-20表示P22噬菌体DNA的包装机制：进入细胞的P22DNA经环化(冗余末端之间重组)和滚环复制形成一个多联体(co ncatemer)分子。DNA的包装从基因组的一个特殊位点(pac,package)开始，用噬菌体编码的酶按顺序进行切割，并以“headful”的长度进行包装，如此同时，该酶也能识别染色体DNA上类似pac的位点并进行切割，以“headful”的包装机制包装进P22噬菌体外壳，形成只含宿主DNA的转导噬菌体颗粒。但这种“错装”机率很小(10-6-10-8)，因为染色 体上的pac与P22 DNA的pac序列不完全相同，利用效率较低。形成转导颗粒的噬菌体可以是温和的也可以是烈性的，主要的要求是具有能偶尔识别宿主DNA的包装机制并在宿主基因组完全降解以前进行包装。?
2.局限性转导(specialized transduction)
局限性转导与普遍性转导的主要区别在于：第一，被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一起进行复制、包装以及被导入受体细胞中。第二，局限性转导颗粒携带特殊的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导。温和噬菌体λ是局限性转导的典型代表，该噬菌体含有一个线状的双链DNA分子，其二端为互补的12个核苷酸单链(即粘性末端cos位点)，当λ感染细胞时通过其粘性末端形成环状分子，然后通过二种调节蛋白CI和Cro的调控(见第九章)进入二种生命循环的选择。
当整合的λ原噬菌体从细菌染色体上不准确地切除时，便可形成局限性转导颗粒。在这个过程中的断裂和连接不是发生在attP/attB处，而是在原噬菌体邻近的其它位点以低频率(约10-6)发生“异常”重组的结果。位于原噬菌体左、右二边的细菌染色体基因均可被转导。“异常”重组形成的环形DNA分子携带了一段细菌染色体的片段，同时也失去了原噬菌体另一端相应长度的DNA片段。这样形成的杂合DNA分子能够象正常的λDNA分 子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒。感染受体细胞后，通过DNA整合进宿主染色体而形成稳定的转导子(图8-21)。
三、细菌的遗传转化(genetic transformation)
遗传转化是指同源或异源的游离DNA分子(质粒和染色体DNA)被自然或人工感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程。根据感受态建立方式，可以分为自然遗传转化(natural genetic transformation)和人工转化(artificial transformation)，前者感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性；后者则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。
1. 自然遗传转化(简称自然转化)
(1)转化模型
自然转化的第一步是受体细胞要处于感受态，即能从周围环境中吸取DNA的一种生理状态，然后是DNA在细胞表面的结合和进入，进入细胞内的DNA分子一般以单链形式整合进染色体DNA，并获得遗传特性的表达。这一系列过程涉及到细菌染色体上10多个基因编码的功能。图8-22显示细菌对线型染色体DNA进行转化的模型。图中(a)表示感受态的出现过程：细菌生长到一定的阶段分泌一种小分子的蛋白质，称为感受态因子，其分子量为5000到10000道尔顿。这种感受态因子又与细胞表面受体(图8-22中的M)相互作用，诱导一些感受态一特异蛋白质(competence specific protein)表达，其中一种是自溶素(autolysin)，它的表达使细胞表面的DNA结合蛋白及核酸酶裸露出来，使其具有与DNA结合的活性。图中(b) 表示线型DNA分子的结合和进入细胞：DNA以双链形式在细胞表面的几个位点上结合并遭到酶的切割，核酸内切酶首先切断DNA双链中的一条链，被切断的链遭到核酸酶降解，成为寡核苷酸释放到培养基中，另一条链与感受态一特异蛋白质结合，以这种形式进入细胞，并通过 同源重组以置换的方式整合进受体染色体DNA，经复制和细胞分裂后形成重组体(图8-23)。
自然感受态除了对线型染色体DNA分子的摄取外，也能摄取质粒DNA和噬菌体DNA，后者又称为转染(transfection)*。
(2)环境中发生的自然转化
自然转化现象首先是在肺炎链球菌中发现的(1928年，见第一节)，70多年来已经发现许多细菌属中的某些种或某些株有自然转化的能力。近十多年来的研究已表明，通过自然转化进行的基因转移过程已不只是一种“实验室现象”，而是广泛存在于自然界，可能是自然界进行基因交换的重要途径。环境中(土壤、水体、沙粒等)是否能发生自然转化，主要取决于环境中是否存在具有转化活性的DNA分子及可吸收DNA的感受态细胞。研究表明，几乎所有的生活细菌都可向环境中主动 分泌或细胞死亡裂解而释放DNA，这些DNA分子可与固型物(土粒、沙粒子)结合而得到保护，免受DNase的降解，从而能长时间存留于环境中并具有转化活性，另一方面，自然感受态作为许多细菌应付不利生活条件的一种调节机制，在自然环境中的存在具有普遍性，有实验表明，在有些环境中感受态细胞在其群落中的比例可高达16%。图8-24概括了环境中发生的自然转化，即给体、受体和DNA分子的相互关系。
2.人工转化
这是在实验室中用多种不同的技术完成的转化，包括用CaCl2处理细胞，电穿孔等。为许多不具有自然转化能力的细菌(如大肠杆菌)提供了一条获取外源DNA的途径， 也是基因工程的基础技术之一。
用高浓度的Ca2+诱导细胞使其成为能摄取外源DNA的感受态状态是1970年由Mandel和Higa首先发现的，30年来已广泛用于以大肠杆菌为受体的重组质粒的转化(见第十章)，但根据有关实验表明，线状的细菌DNA片段却难以转化，其原因可能是线状DNA在进入细胞溶质之前被细胞周质内的DNA酶消化，缺乏这种DNA酶的大肠杆菌株能高效地转化外源线型DNA片段的事实证实了这一点。有关Ca2+诱导的机制目前还不十分清楚，一般认为可能与增加细胞的通透性有关。
电穿孔法(electroporation)对真核生物和原核生物均适用。现在已用这种技术对许多不能导入DNA的G-和G+细菌成功的实现了转化。所谓电穿孔法是用高压脉冲电流击破细胞膜 或击成小孔，使各种大分子(包括DNA)能通过这些小孔进入细胞，所以又称电转化，该方法最初用于将DNA导入真核细胞，后来也逐渐用于转化包括大肠杆菌在内的原核细胞。在大肠杆菌中，通过优化各个参数(电场强度、电泳冲长度和DNA浓度等)，每微克DNA可以得到109-1010转化体。但由于Ca2+诱导法简便，价廉，因此仍为实验室中大肠杆菌转化的常用方法。
* 现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染
第六节 真核微生物的遗传学特性
真核微生物可进行有性繁殖，所以DNA的转移和重组在许多方面是不同于原核生物的。真核生物具有复杂的核，其基因组也是由许多染色体组成并且是线型的，因此在基因的分配和分离方面具有更复杂的调节机制。由于啤酒酵母在实验室条件下容易培养，结构简单，遗传分析容易进行，因此是研究真核遗传现象的最好材料，已成为研究真核遗传的模式系统。加之 酵母本身的商业价值，故有关酵母的遗传学特性是真核微生物中了解得最清楚的。丝状真菌虽然不如酵母菌研究得清楚，但也有其独特的遗传学特性。本节将以啤酒酵母菌和构巢曲霉为代表，讨论真核微生物的遗传学特性。
一、酵母菌的接合型遗传
酿酒酵母是以单倍体或二倍体状态存在，单倍体分别是两种接合型，称之为α和a，α和a细胞的融合便产生了二倍体细胞(α/a)。一个单倍体酵母细胞是α型还是a型是由其本身的遗传特性所决定的，是稳定的遗传特征。但发现，一种接合型的单倍体细胞有时会发生转变，即由α型变成a型或再回到α型。这种转变现象经近年来通过基因的克隆和其结构功能的研究已逐步了解清楚。图8-30中表示目前已知的机制。从图中可看出，一个称为MAT的活性区具有重要的调控作用，在这个座位上α或a基因 都能被插入，并受MAT启动子的控制，因此如果是基因α插入该座位，那么细胞就是接合型α；如果是a基因插入则是a型。在酵母基因组的其它位置有α和a基因的拷贝，它们是不表达的沉默基因，只在发生接合型转变时用作α或a基因插入的来源。当转变发生，合适的基因α或a从它们的沉默位点拷贝，然后插入MAT座位，取代原来的基因，因此原来的基因从 此座位被删除并丢弃，新的基因被插入。这个机制被称为"cassette mechanism"。
二、酵母菌的质粒
大多数酵母菌株含有一种称之为2μm的质粒，这是目前研究得比较深入且具有广泛应用价值的酵母质粒。虽然在不同的酵母菌株中观察到2μm DNA有不同的限制性图谱，但它们的基本结构都具有以下特点：
(1)它们是封闭环状的双链DNA分子，周长约2μm(6kb左右)，以高拷贝数存在于酵母细胞中，每个单倍体基因组含60-100个拷贝，约占酵母细胞总DNA的30%；
(2)各含约600bp长的一对反向重复顺序；
(3)由于反向重复顺序之间的相互重组，使2μm质粒 在细胞内以两种异构体(A和B)形式存在。
(4)该质粒只携带与复制和重组有关的4个蛋白质基因(REP1、REP2、REP3和FLP)，不赋予宿主任何遗传表型，属隐秘性质粒。
2μm质粒是酵母菌中进行分子克隆和基因工程的重要载体，因此以它为基础进行改建的克隆和表达载体已得到广泛的应用。另一方面，该质粒也是研究真核基因调控和染色体复制的一个十分有用的模型，因而对该质粒的研究日益重视。
三、酵母菌的线粒体
线粒体(mitochondrion)是真核细胞内重要的细胞器，是能量生成的场所，还参与脂肪酸和某些蛋白质的合成，由于线粒体遗传特征的遗传发生在核外和有丝分裂和减数分裂过程以外，因此它是一种细胞质遗传(cytoplasmic inheritance)，有时也称之为非孟德尔遗传(nonMendelian inheritance)。
1.线粒体基因组
酿酒酵母的线粒体基因组是双链环状分子，长约25μm(约75Kb)，其大小约为人的线粒体基因组的5倍(人的线粒体大小约为16Kb)。像大多数线粒体DNA(简称mtDNA)一样，酵母mtDNA也只编码少数几种最基本的线粒体成分：细胞色素b、细胞色素c氧化酶、ATPase以及一种核糖体蛋白。此外，许多tRNA分子也由酵母mtRNA编码。酵母的mtRNA上存在大量的非编码A+T丰富区，其功能目前不清楚，但是已知这些区域含有酵母线粒体基因组的多个复制原点。此外，酵母的mtDNA上还存在大量的间插顺序或内含子，许多内含子被证明是非必须的，因此酵母的mtDNA的利用率比高等动物低，在高等动物中，除与DNA复制起始有关的区域外，整个mtDNA基因组上基因之间无间隔区或内含子，甚至有基因重叠现象。酵母mtDNA基因组上所含的基因数与高等动物基本相同，但是因为它有很多非编码DNA和含有内含子，所以酵母的线粒体基因组相当大。
2.线粒体的密码系统和蛋白质合成
在蛋白质合成时，mRNA上的密码和tRNA上的反密码是对应的。已知20种氨基酸有61种对应的密码子，按照摆动学说，最少需要32种tRNA才能完全识别mRNA中的61个密码子。但在线粒体中，tRNA的种类显然小于此数(如人的mtRNA只有22种)，而且已有实验证明，无细胞质tRNA 进入线粒体参入其蛋白质的合成过程。这些事实表明，在线粒体基因表达过程中的密码系统与通用密码系统不一样。密码的非通用性首先是在线粒体中发现的，但是现在已知在一些细胞基因组中已被应用。例如有些原核生物用GUG为起始密码而不是通用的AUG。
虽然线粒体基因组可编码一些为线粒体呼吸链所需要的蛋白质，但是大多数线粒体蛋白质不是线粒体基因编码的，而是由细胞核编码的大量的蛋白质通过至今尚不完全了解的途径进入线粒体的，已知人的线粒体中有300-400种已知的蛋白质，只有13种是其线粒体基因编码的 ，不到线粒体总蛋白质含量的10%。
线粒体的核糖体在大小上类似于原核生物的核糖体，但是前者核糖体的一个重要特征是对影响细菌中蛋白质合成的抗生素敏感，所以线粒体中蛋白质的合成受氯霉素的抑制，这一现象表明，线粒体与细菌之间的近缘关系，也是支持真核的细胞器(线粒体、叶绿体)是由内共生细菌演化出来的假设的重要证据之一。
四、丝状真菌的准性生殖
丝状真菌遗传学研究主要是借助有性过程和准性生殖过程，并通过遗传分析进行的，而且是以粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)为模式菌。虽然近年来发展了DNA转化系统，但转化频率很低，一般每微克转化DNA产生100个以下的转化子。而准性生殖是丝状真菌，特别是不产生有性孢子的丝状真菌特有的遗传现象，下面作简要介绍。
所谓准性生殖(parasexual reproduction)是指不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程。在该过程中染色体的交换和染色体的减少不像有性生殖那样有规律，而且也是不协调的 。
准性生殖过程包括异核体的形成、二倍体的形成以及体细胞交换和单元化。所谓异核体(heterocaryon)是指同时具有二种或二种以上不同基因型核的细胞，这种现象又又称为异核现象。真菌的菌丝相互接触时，通过菌丝间的连接，细胞核可混合在一起而形成异核体，并可以百万分之一的机率发生核融合而形成二倍体(或杂合二倍体)。二倍体细胞在有丝分裂过程中也会偶尔发生同源染色体之间的交换(即体细胞重组)，导致部分隐性基因的纯合化，而获得新的遗传性状。所谓单元化过程是指在一系列有丝分裂过程中一再发生的个别染色体减半，直至最后形成单倍体的过程，不像减数分裂那样染色体的减半一次完成。
从准性生殖的过程可以看出，该过程可出现很多新的基因组合，因此可成为遗传育种的重要手段，其次，在遗传分析上也是十分有用的，例如可利用有丝分裂过程中，染色体发生交换导致的基因纯合化与着丝粒的距离的关系进行有丝分裂定位等。
第七节 微生物育种
在生物进化过程中，微生物形成了愈来愈完善的代谢调节机制，使细胞内复杂的生物化学反应能高度有序地进行和对外界环境条件的改变迅速作出反应。因此，处于平衡生长，进行正常代谢的微生物不会有代谢产物的积累。而微生物育种的目的就是要人为地使某种代谢产物过量积累，把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导，或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状，实现人为控制微生物，获得我们所需要的高产、优质和低耗的菌种。为了实现这一目的必须设法解除或突破微生物的代谢调节控制，进行优良性状的组合，或者利用基因工程的方法人为改造或构建我们所需要的菌株(见第十章)，本节主要讨论解除或突破微生物的代谢调节和体内基因重组的途径和策略，得到所需的优良菌株。
一、诱变育种
诱变育种是指利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随机突变频率，通过一定的筛选方法(或特定的筛子)获得所需要的高产优质菌株。
? 1.常用诱变剂的使用方法
以紫外线和5-溴尿密啶分别代表物理和化学诱变剂进行简要介绍。
(1)紫外线
这是一种使用方便、诱变效果很好的常用诱变剂。在诱变处理前，先开紫外灯预热20分钟，使光波稳定。然后，将3～5ml细胞悬浮液置6cm培养皿中，置于诱变箱内的电磁搅拌器上，照射3～5分钟进行表面杀菌。打开培养皿盖，开启电磁搅拌器，边照射边搅拌。处理一定时间后，在红光灯下，吸取一定量菌液经稀释后，取0.2ml涂平板，或经暗培养一段时间后再涂平板。
(2)5-溴尿嘧啶(5BU)
称取5-BU，加入无菌生理盐水微热溶解，使浓度为2mg/ml。将细胞培养至对数期并重悬浮于缓冲液或生理盐水中过夜，使其尽量消耗自身营养物质。将5BU加入培养基内，使其终浓度一般为10～20μg/Ml，混匀后倒平板，涂布菌液，使其在生长过程中诱变，然后挑单菌落进行测定。
处理孢子悬浮液时，可采用较高浓度的5BU(100～1000μg/ml)与孢子悬浮液混合后振荡培养 ，经一定时间后适当稀涂平板。
其它化学诱变剂的处理方式大体相同，但在浓度、时间、缓冲液等方面随不同的诱变剂有所不同，可参阅有关的实验手册和资料。
为了提高诱变效率，常用物理、化学二种诱变剂交替使用，待诱变的菌株或孢子悬液一定要混匀，使其能均匀接触诱变剂。此外菌株的生长状态及对诱变剂的敏感性也是重要的参数。 一般选用菌株的对数生长期效果较好。
2.筛选策略
虽然微生物可产生大量十分有价值的产物，但是它们完善的调节机制限制细胞只产生够它们自身需要的少量产物，它们是十分"节约"的。微生物学家必须设法使它们变成"浪费型" ，才能从它们那儿得到我们所需要的代谢产物。长期实践的结果表明，通过选育各种突变株是达到这一目的的重要策略。
(1)营养缺陷型突变株
利用营养缺陷型突变株来生产氨基酸和核苷酸是典型的例子。由于在营养缺陷型中，生物合成途径中某一步发生酶缺陷，合成反应不能完成。通过外加限量的所要求的营养物，克服生长的障碍，而又使最终产物不致于积累到引起反馈调节的浓度，从而有利于中间产物或某种最终产物的积累。
图8-32显示，在分枝代谢途径中，利用营养缺陷型突变株，通过解除协同反馈调节，可以有效地使另一分枝途径中的终产物积累。棒状杆菌L-赖氨酸生物合成途径及其调节作用是一个分枝代谢途径。从图中可以看到天冬氨酸激酶(AK)被赖氨酸及苏氨酸协同反馈所抑制。通过诱变处理，获得了产L-赖氨酸的不同营养缺陷型突变株，其中以高丝氨酸缺陷型突变产L-赖氨酸的能力最强，该突变型不能产生苏氨酸。在限量高丝氨酸的培养基中缺陷型菌株能够正常生长，并且因为消除了反馈抑制，突变型能过量生产L-赖氨酸。
(2)抗阻遏和抗反馈突变型
抗阻遏和抗反馈突变型都是由于代谢失调所造成的，它们都有共同的表型，即在细胞中已经有大量最终代谢产物时仍然继续不断地合成这一产物。如果这一终产物是我们所需要的某种氨基酸或核苷酸，那么这种突变型必然大大提高其产量。如何获得这二种突变型呢? 一般常用的方法是通过诱变处理后，选育结构类似物抗性突变株，这些抗性突变株就包括了抗阻遏和抗反馈二种类型突变。所谓结构类似物是指一些和细菌体内氨基酸、嘌呤、维生素等代谢产物结构相类似的物质。当把细菌培养在含有结构类似物的培养基上时，例如苯丙氨酸的结构类似物对氟苯丙氨酸，细菌的生长就受到抑制，即在不加苯丙氨酸的基本培养基上细菌不能生长，这是因为这些结构类似物和代谢产物结构相似，因此它也能和阻遏蛋白或变构酶相结合，阻遏或抑制了苯丙氨酸的合成，而且由于这些结构类似物往往不能代替氨基酸合成蛋白质，它们在细胞内的浓度不会降低，因此它们和阻遏物或变构酶的结合是不可逆的，这就使得有关的酶不可逆地停止了合成或是酶的催化活性不可逆的被抑制，因此细菌不能合成苯丙氨酸而受到抑制。所谓结构类似物抗性菌株，即是那些在含有类似物的环境中，其生长不被抑制的菌株这种抗性菌株是由于变构酶结构基因或调节基因发生突变的结果，使结构类似物不能与结构发生了变化的阻遏蛋白或变构酶结合，细菌也照样合成终产物，生长不受抑制。例如对氟苯丙氨酸是苯丙氨酸的结构类似物，因此对氟苯丙氨酸抗性菌株所产生的苯丙氨酸也不能与阻遏蛋白或变构酶结合，这样必然会在有苯丙氨酸存在的情况下，细胞仍然不断地合成苯丙氨酸，使其得到过量积累，这就是抗阻遏或抗反馈突变株。
3.抗性突变型
筛选各种抗性突变型也是生产上常用来提高某些代谢产物的重要途径。
(1)抗生素抗性突变株
在抗生素产生菌选育中，通过筛选抗生素抗性突变可提高抗生素产量。例如解烃棒状菌(C .h ydrocarbaclastus)可以产生棒杆菌素(Carynecin)，它是氯霉素的类似物。抗氯霉素的解烃棒杆菌突变株能产生4倍于亲株的棒杆菌素。抗生素抗性突变株除能提高抗生素的产量外，还能提高其它代谢产物的量。例如衣霉素可抑制细胞膜糖蛋白的产生，枯草杆菌的衣霉素抗性突变株的α-淀粉酶的产量较亲本提高了5倍。这是由于分泌机制改变的结果。抗利福平的蜡状芽孢杆菌的无芽孢突变株的β-淀粉酶产量提高了7倍，这是由于芽孢形成的延迟利于β-淀粉酶的形成，而抗利 福平突变往往失去了形成芽孢的能力。
(2)条件抗性突变
因环境不同，能表现为"野生型"菌株的特性和突变型菌株特性的突变称为条件抗性突变或称为条件致死突变。其中温度敏感突变常用于提高代谢产物产量。适于在中温条件下（如37℃左右）生长的细胞，经诱变后可得到在较低温度下生长而在较高温度（37℃以上）不能生长的突变株，即温度敏感性突变株。这是由于某一酶蛋白结构改变后，在高温条件下活力丧失的缘故。如此酶为某蛋白质、核苷酸合成途径中所需的酶，则此突变株在高温条件下的表型就是营养缺陷型。诱变处理谷氨酸产生菌乳糖发酵短杆菌2256，得到的温度敏感突变株Ts88，在30℃培养时能正常生长，40℃时死亡，但能在富含生物素的培养基中积累谷氨酸，而野生型菌却受生物素的反馈抑制。在富含生物素的天然培养基中进行发 酵时，可先在30℃（容许条件）中进行培养以得到大量菌株，适当时间后提高温度（40℃，非容许条件），就能获得谷氨酸的过量生产。
二、体内基因重组育种
体内基因重组是指重组过程发生在细胞内。这是相对于体外DNA重组技术(或基因工程技术)而言。体内基因重组育种是指采用接合、转化、转导和原生质体融合等遗传学方法和技术使微生物细胞内发生基因重组，以增加优良性状的组合，或者导致多倍体的出现，从而获得优良菌株的一种育种方法。该方法在微生物育种中占有重要地位。尤其是70年代以来发展起来的原生质体融合技术为微生物育种开辟了一条新的途径，成为重要的育种手段之一。
1.原生质体融合
原生质体融合技术是将遗传性状不同的两种菌(包括种间、种内及属间)融合为一个新细胞的技术。主要包括原生质体的制备、原生质体的融合、原生质体再生和融合子选择等步骤。
(1)原生质体制备
将两亲株分别用酶处理，使细胞壁全部消化或使薄弱部分破裂，原生质体即可从细胞内逸出 。为了防止原生质体的破裂，要把原生质体释放到高渗缓冲液或培养基中。各种微生物的原生质体制备过程中，所用来破璧的酶也不同，细菌主要用溶菌酶，酵母菌和霉菌一般用蜗牛 酶或纤维素酶。
(2)原生质体融合和再生
制备好的二亲本原生质体可通过化学因子诱导或电场诱导进行融合。化学因子诱导的原生质体融合，最成功并且至今为人们所经常使用的是以PEG(polyethyeneglycol，聚乙二醇)作为融合剂。PEG具有促进原生质体融合的作用。加入PEG后，再加入Ca2+和Mg2+等阳性离子。原生质体的融合受各种阳离子和浓度的影响，与融合液的pH也有关，例如，在钙离子存在下，pH9，可得到高的融合频度，而缺乏钙离子时，低pH，融合频度也高。
电融合技术是一项有效促成原生质体融合的手段。融合过程首先是原生质体在电场中极化成偶极子，并沿电力线方向排列成串，然后，在加直流脉冲后，原生质体膜被击穿，从而导致融合的发生。电融合的独到之处在于，融合过程可以在显微镜的监视下进行，并可以在镜下挑出融合的原生质体；电融合为一个空间定向、时间同步的可控过程，对细胞无任何毒害作用。
原生质体已经失去细胞壁，仅有一层厚约10nm的细胞膜。它具有生物活性，但不是正常的细胞，在普通培养基上不能生长。两个原生质体融合后，必须涂布于再生培养基上，使其再生 。所谓"再生"就是恢复细胞原来面貌，能够再生长。再生率常为百分之零点几至百分之几十。再生培养基以高渗培养基为主，增加高渗培养基的渗透压或添加高于0.3mol/L的蔗糖溶液均可增加再生率。
(3)融合子的选择
在各菌落中选择融合子是很繁锁的，主要是依靠在选择培养基上的遗传标记，有二个遗传标记互补，就可确定其为融合子。营养缺陷型标记选择是常规而准确的选择手段。因为只有营养缺陷型得到互补后才可恢复正常生长。但应用原生质体融合技术改良一些具有重要商品价值的菌种时，利用营养缺陷型标记，往往会造成一些优良性状的丢失，和所需代谢产量的下降，营养缺陷型的获得繁锁费时，实践中人们采用了一些其它的方法。灭活原生质方法便是其中的一种。灭活原生质体融合可以在很少或没有标记下进行，实验表明灭活亲株(单亲株或双亲株)原生质体融合可以形成有生物活性的融合子，如在枯草芽孢杆菌中，用链霉素灭活，在巨大芽孢杆菌中用热灭活，在天蓝链霉菌中用紫外线灭活，都获得了成功。其重组率有的可接近或超过活亲株融合。此外，利用荧光染色也是一种重要的方法，该方法是在双亲原生质体制备过程中，向酶解液中加入荧光色素使其形成带有荧光色素的原生质体。
将融合的原生质体悬浮液置于带有显微操作器和落射荧光装置的立体型显微镜下，挑选出融合的原生质体。个体上同时观察到双亲染色的两种荧光色素，即可判断为融合子。
原生质体融合技术的实际应用，其关键环节是准确地选出具优良性能的融合子，而这个选择往往是上述几种方法相互配合使用。
2.杂交育种
进行体内基因重组育种的其它方法包括接合、转化、转导等。但由于许多重要的具生产价值的微生物的杂交、有性世代等尚未揭示，在很大程度上妨碍了杂交育种手段的实际应用，因此在原生质体融合技术发现以前，用杂交育种的手段尚不普遍。但仍有许多很好的尝试和成功的例子，尤其在酵母菌的育种中广泛应用。酵母菌中具有单倍体和二倍体的生活史， 存在孟德尔式分离现象，以及α和a交配型。因此有条件通过杂交来达到基因重组的目的。 例如，我国华北和东北各省生产大量甜菜蜜糖，其中大部分供生产酒精。由于这种糖蜜中含有1%～2%的棉子糖，现今生产用酵母只能利用其中1/3的糖，剩下的蜜二糖作为不利用糖而 弃掉。通过将生产菌Я系酵母和stole酵母分别和卡尔斯伯酵母及小椭圆酵母交配，将后两种菌的密二糖基因转移到前二者中，再进行复合杂交。获得的杂种生长快，发酵力强，并全部利用棉子糖，提高了产酒率。
在有些真菌中常用准性生殖获得优良菌株，即将具有不同优良性状的二种菌株进行杂交，首先获得异核体，然后通过诱变剂(如UV、亚硝酸等)处理提高其形成杂合二倍体的频率，并进而用低浓度的对氟苯丙氨酸或多菌灵等处理，促进单元化过程，最后在平板中挑取扇形角变的菌落孢子，即为单倍体分离子，经进一步筛选，从中获得所需要的优良菌株。
三、DNA Shuffling技术
随着PCR技术的发展和应用，1994年美国的Stemmer提出了一个全新的人工分子进化技术--DNA Shuffling(又称洗牌技术)，该技术能模拟生物在数百万年间发生的分子进化过程，并可在短的实验循环中定向筛选出特定基因编码的酶蛋白活性提高几百倍甚至上万倍的功能性突变基因。其基本原理是先将来源不同但功能相同的一组同源基因，用DNA核酸酶I进行消化产生随机小片段，由这些随机小片段组成一个文库，使之互为引物和模板，进行PCR扩增，当一个基因拷贝片段作为另一基因拷贝的引物时，引起模板转换，重组因而发生，导入体内后，选择正突变体作新一轮的体外重组。一般通过2-3次循环，可获得产物大幅度提高的重组突变体。例如，1998年Andreas等用4个不同来源的先锋霉素基因混合进行DNA shuffling，仅单一循环获得的该抗生素，最低抑制活性(MIC)就提高了270～540倍。
基本步骤如图8-33所示：
(1)用DNase I消化功能相同的一组基因片段(A)，从而产生随机小片段(B)。
(2)经提纯后，用无引物(经变性后可互为引物)的类似PCR反应重新装配这些小片段成完整长度的重组基因片段(C)，在装记过程中被证明有低水平点突变产生。
(3)克隆并选择正突变体(D)，并将正突变体的重组基因片段作新一轮的体外重组。
小 结
1.三个典型的微生物学实验证实了DNA和RNA是遗传的物质基础。
2.基因组是指细胞中基因以及非基因的DNA序列组成的总称。微生物基因组一般比较小，最小的只含3个基因。真核生物、真细菌和古生菌基因组有明显的不同，但古生菌既具有前二者的某些特征，又具有自己独特的特征。
3.质粒和转座因子都是细胞中除染色体以外的另外二类遗传因子，具有重要的生物学功能。
4.基因突变分自发突变和诱发突变，后者只提高突变频率，并不改变突变的本质。突变率与修复系统密切相关并有自身的规律性。细菌以接合、转导和转化三种主要的途径进行基因水平方向的转移和重组，并且是基因定位(或作图)的重要手段。近年来实验证明转化可以在自然环境中发生。
5.用"全基因组鸟枪测序方法"获得了第一个独立生活的生命体(流感嗜血杆菌)的全基因组序列，这对进一步认识和揭示生命的本质、相互关系、发现重要的基因并开发其功能等具有重要的划时代意义。
6.酵母菌的单倍体具二种接合型a和α，这是稳定的遗传学特征，但有时会发生互变。现已查明，这是受MAT启动子控制的。酵母菌含有2μm质粒，是其进行基因克隆和分子生物学研究的重要载体。酵母菌的mtDNA利用率较低，但密码子的非通用性首先在此发现。丝状真菌的准性生殖是育种和进行遗传分析的重要手段。
7.微生物育种可采用诱变、原生质体融合、杂交(含准性生殖)，DNA shuffling 等技术进行 。用DNA重组、体外诱变等体外分子水平的育种技术见第十章。
思 考 题
1.你对朊病毒了解多少? 谈谈你自己的理解和看法。
2.在人类基因组计划的执行中，为什么要进行以微生物为主体的模式生物的全基因组序列测定? 哪几种生物分别是已完成全基因组测序的第一个独立生活的生物? 第一个真核生物? 第一个自养生活的生物?
3.在细菌细胞中，均以环状形式存在的染色体DNA和质粒DNA，在质粒提取过程中发生了什么变化? 这种变化对质粒的检测和分离有什么利用价值?
4.请说明下列二株不同遗传表型的大肠杆菌是否都是营养缺陷型?并作解释。 E.coli(His-)和E.coli(Lac-)
5.根据你所学的关于诱发突变的知识，你认为能否找到一种仅对某一基因具有特异性诱变作用的化学诱变剂?为什么?
6.根据突变的光复活修复作用、原理，你认为在进行紫外线诱变处理时，应注意什么? 为了使被诱变的细胞能均匀地受到紫外线照射，你将如何做?
7.请设计一个实验来决定在一种特定的细菌中发生的遗传转移过程是转化、转导还是接合? 说明每一种的预期结果。设想有下列条件和材料可以利用：(1)合适的突变株和选择培养基；(2)DNase(一种降解裸露 DNA分子的酶)；(3)二种滤板：一种能够持留细菌和细菌病毒，但不能持留游离的DNA分子；另一种滤板只能持留细菌；(4)一种可以插入滤板使其分隔成二个空间的玻璃容器。
8.假如你接到一项任务，要求你对一种具有工业应用价值的细菌建立遗传转导系统，你手头上已有大量可供选择的菌株，但是没有噬菌体，你将如何进行? 请写出简要步骤。(提示：你不仅要获得转导噬菌体而且要选择具有遗传标记的突变菌株)
9.Hfr×F-和F+×F-杂交得到的接合子都有性菌毛产生吗?它们是否都能被M13噬菌体 感染呢?
第九章 微生物与基因工程
计划学时：2
重点：基因工程的基本操作过程，基因工程的应用。
基因工程（genetic engineering）或重组DNA技术(recombinant DNA technology) 是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状。基因工程这个术语可以用来表示特定基因操作，也可泛指它所涉及的技术系统，其核心是构建重组体DNA的技术。因此，基因工程和重组DNA技术有时也就成为同义词。
基因工程是在现代生物学、化学和化学工程学以及其他数理科学的基础上产生和发展起来的，并有赖于微生物学的理论和技术的发展和运用，微生物在基因工程的兴起和发展过程中起着不可替代的作用。基因工程的出现是本世纪生物科学具有划时代意义的巨大事件，它使得生物科学获得迅猛发展，并带动了生物技术产业的兴起。它的出现标志着人类已经能够按照自己意愿进行各种基因操作，大规模生产基因产物，并且去设计和创建新的基因、新的蛋白质和新的生物物种，这也是当今新技术革命的重要组成部分。
第一节 基因工程概述
一、基因工程的发展历史
? 基因工程是在本世纪70年代初开始出现的。三项关键技术的建立为基因工程奠定了基础，这三项技术是：DNA的特异切割、DNA的分子克隆和DNA的快速测序。
早在50年代，阿尔伯（Arber）的实验室就已发现大肠杆菌能够限制侵染的噬菌体，60年代末进而证明大肠杆菌细胞内存在修饰–限制系统，即给宿主自身DNA打上甲基化标记并切割入侵的噬菌体DNA。1970年史密斯（Smith）等人从流感嗜血杆菌（Hemophilus influenzae）中分离出特异切割DNA的限制酶。次年，内森斯（Nathans）等人用该酶切割猴病毒SV40 DNA，最先绘制出DNA的限制图谱（restriction map）。1973年史密斯和内森斯提出修饰–限制酶的命名法。限制性核酸内切酶可用以在特定位点切割DNA，限制酶的发现使分离基因成为可能。为表彰上述科学家在发现和使用限制酶中的功绩，1978年的诺贝尔医学奖被授予阿尔伯、内森斯和史密斯。
1973年，科恩（Cohen）和博耶（Boyer）等将pSC101质粒作为载体与R质粒的四环素和卡那霉素的抗性基因相融合，并将重组体DNA转化大肠杆菌，首次实现了DNA的分子克隆。
1975年桑格（Sanger）实验室建立了酶法快速测定DNA序列的技术。1977年吉尔伯特（Gilbert）实验室又建立了化学测定DNA序列的技术。分子克隆和测序方法的建立，使重组DNA技术系统得以产生。1980年诺贝尔化学奖被授予伯格、吉尔伯特和桑格，以肯定他们在发展DNA重组与测序技术中的贡献。
1977年板仓（Itakura）和博耶用人工合成的生长激素释放抑制素（Somatostatin, SMT）基因构建表达载体，并在大肠杆菌细胞内表达成功，得到第一个基因工程的产品。1982年，在建立转基因植物和转基因动物的技术上均获得重大突破。借助土壤农杆菌Ti质粒可将外源基因导入双子叶植物细胞内并发生整合，从而使植株获得新的遗传性状。同年通过基因工程方法把大鼠生长激素基因注射到小鼠受精卵的雄核中，然后移植到母鼠子宫内，由此培育出巨型小鼠。仅仅10年时间，基因工程在实践中迅速成熟，日趋完善。
二、基因工程的基本过程
生物的遗传性状是由基因（即一段DNA分子序列）所编码的遗传信息决定的。基因工程操作首先要获得基因，才能在体外用酶进行“剪切”和“拼接”，然后插入由病毒、质粒或染色体DNA片段构建成的载体，并将重组体DNA转入微生物或动、植物细胞，使其复制（无性繁殖），由此获得基因克隆（clone，无性繁殖系的意思）。基因还可通过DNA聚合酶链式反应（PCR）在体外进行扩增，借助合成的寡核苷酸在体外对基因进行定位诱变和改造。克隆的基因需要进行鉴定或测序。控制适当的条件，使转入的基因在细胞内得到表达，即能产生出人们所需要的产品，或使生物体获得新的性状。这种获得新功能的微生物称为“工程菌”，新类型的动、植物分别称为“工程动物”和“工程植物”，或“转基因动物”和“转基因植物”。基因工程操作过程大致可归纳为以下主要步骤：
①分离或合成基因；
②通过体外重组将基因插入载体；
③将重组DNA导入细胞；
④扩增克隆的基因；
⑤筛选重组体克隆；
⑥对克隆的基因进行鉴定或测序；
⑦控制外源基因的表达；
⑧得到基因产物或转基因动物、转基因植物。上述步骤可用图10-1来表示。
?
图10-1 基因工程基本操作过程示意图
三、微生物学与基因工程的关系
微生物和微生物学在基因工程的产生和发展中占据了十分重要的地位，可以说一切基因工程操作都离不开微生物。从以下六个方面可以说明：
①基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成；
②基因工程所用千余种工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的；
③微生物细胞是基因克隆的宿主，即使植物基因工程和动物基因工程也要先构建穿梭载体，使外源基因或重组体DNA在大肠杆菌中得到克隆并进行拼接和改造，才能再转移到植物和动物细胞中；
④为大规模表达各种基因产物，从事商品化生产，通常都是将外源基因表达载体导入大肠杆菌或是酵母菌中以构建成工程菌，利用工厂发酵来实现的；
⑤微生物的多样性，尤其是抗高温、高盐、高碱、低温等基因，为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源；
⑥有关基因结构、性质和表达调控的理论主要也是来自对微生物的研究中取得的，或者是将动、植物基因转移到微生物中后进行研究而取得的，因此微生物学不仅为基因工程提供了操作技术，同时也提供了理论指导。
第二节 微生物与克隆载体
外源DNA片段进行克隆，需要一个合适的载体，将其运送到细胞中并进行复制与扩增。这种以扩增外源DNA为目的载体，称为克隆载体（cloning vector）。作为克隆载体的基本要求是：
（1）载体在细胞中必须能够进行独立自主地复制。因此载体应是一个独立的复制子（replicon），具有复制起始序列，可在细胞中进行有效扩增。
（2）载体必须具有若干限制酶的单一切割位点，便于外源DNA的插入。并且由于这些酶切位点位于载体复制的非必需区，故插入适当大小外源DNA片段后载体仍然能够进行正常的复制。
（3）载体必须具有可供选择的遗传标记，例如具有抗生素的抗性基因，便于对阳性克隆的鉴别和筛选。
（4）载体DNA须易于生长和操作。
到目前为止，基因工程中使用的载体基本上均来自微生物，主要包括六大类：质粒载体；λ噬菌体载体；柯斯质粒载体；M13噬菌体载体；真核细胞的克隆载体；人工染色体等。
一、质粒克隆载体
1.质粒克隆载体的特性
当前分子克隆中所用的克隆载体，绝大多数是利用细菌的质粒，经人工修饰改造而成。质粒作为克隆载体，具有十分有利的特性：
（1）具有独立复制起点作为克隆载体的质粒，通常都含有一个复制起点，这是质粒在宿主细胞中进行扩增的必要条件。
（2）具有较小的分子量 质粒是染色体外DNA，通常由环形双链DNA构成，其分子大小约为1～200Kb。低分子量有利于DNA的分离和操作，但也限制其克隆外源DNA片段的大小，一般不超过15Kb。
（3）具有较高拷贝数每个细胞可含有10～200个拷贝的松弛型复制质粒。当加入蛋白质合成抑制剂（如氯霉素等），还可大大增加细胞中质粒的拷贝数，每个细胞可含有高达数千个拷贝的质粒，使外源DNA得以大量扩增。
（4）具有便于选择的标记 某些质粒中存在着抗生素的抗生基因，便于对克隆基因的检测和筛选。
（5）易于导入细胞 质粒可通过转化或电穿孔等方法极易被导入细胞。
（6）具有安全性 作为载体的质粒不具有转移功能，防止带有外源DNA的重组质粒扩散至实验室外，以免造成危害。
2．质粒pBR322的结构特点
大肠杆菌质粒pBR322是基因工程中最常用和最具代表性的质粒（图10－2），它是由博利瓦（Bolivar）等人于1977年构建而成的，是一个典型的人工质粒载体。
质粒pBR322是环状双链DNA分子，由4361bp组成。可插入外源DNA大小为5kb左右，外源DNA若超过10kb，质粒在复制时就会变得不稳定。它具有一个复制起点，是松弛型质粒，故细胞中具有较高的拷具数，每个细胞含有20～30个拷贝。当加入氯霉素扩增之后，每个细胞可含有1000～3000个拷贝，大大有利于重组质粒在细胞中的扩增。此外，pBR322还具有两种抗生素的抗性基因，一个是四环素抗性基因（Tetr）另一个是氨苄青霉素抗性基因（Ampr）。已知有24种主要限制酶在pBR322上都只有一个切点，其中有7种限制酶（EcoRV、NheI、BamHI、SphI、SalI、 XmaIII、 NruI）的切点位于四环素抗性基因之内，还有3种限制酶（ScaI 、PvuI和PstI）的切点位于氨苄青霉素抗性基因之内。外源DNA片段插入这些位点之中任一位点时，将导致相应的抗性基因的失活。这种因外源DNA的插入而导致基因失活的现象，称为插入失活（insertional inactivation）。
图10-2 质粒pBR322结构图
插入失活常被用于检测含有外源DNA的重组体（图10－3），例如若在质粒pBR322的BamHI的位点插入外源DNA，然后转化大肠杆菌（Tets、Amps ）。含有重组质粒（即带有外源DNA的质粒）的宿主细胞失去对四环素的抗性，所以不能在含有四环素培养基的平板上生长，但仍能在含有氨苄青霉素培养基的平板上生长。而那些含有不带外源基因的质粒的宿主细胞，则可以在含有四环素或氨苄青霉素培养基的平板上生长，这样就很容易筛选到含有目的基因的细菌，从而淘汰不含目的基因的细菌。
图10-3 插入失活示意图
二、λ噬菌体克隆载体
λ噬菌体是基因工程中一类很有价值的克隆载体，具有很多优点：
①它的分子遗传学背景十分清楚。
②λ噬菌体载体的容量较大。一般质粒载体只能容纳10多个kb。而λ噬菌体载体却能容纳大约23kb的外源DNA片段。
③具有较高的感染效率。其感染宿主细胞的效率几乎可达100％，而质粒DNA的转化率却只有0.1％。以上优点为克隆较大片段的外源DNA提供了有利条件，并可大大增加构建基因库的效率。
1.λ噬菌体载体的构建
野生型λ噬菌体DNA不适于作为克隆载体，因为它的DNA分子很大，基因组结构复杂，限制酶有很多切点，并且这些切点多数位于必需基因之中等等。为了避免上述问题，需经一系列改造。
构建λ噬菌体克隆载体的基本原则是：
①删除基因组中非必需区，使基因组变小，有利于克隆大的DNA片段。
②除去多余的限制位点。现已构建了各种各样的λ载体。这些载体可分为两类：一类称为插入型载体（insert vector）其限制酶位点可用于外源DNA的插入；另一类称为取代型载体（replacement vector）具有成对限制酶位点，外源DNA可取代两个限制位点上的DNA区段。重组DNA与包装蛋白混合，可在体外包装成有感染力的重组噬菌颗粒。
虽然λ噬菌体载体是一类极为有用的克隆载体，但是由于λ噬菌体头部组装时容纳DNA 的量是固定的，因此插入外源DNA的长度必须控制在使重组DNA为野生型λDNA长度的78％～105％之间，否则不能正常组装。
三、柯斯质粒载体
柯斯质粒载体（cosmid vector）即粘粒载体，是由λ噬菌体的粘性末端和质粒构建而成。cosmid一词的意思是带有cos位点的质粒。柯斯质粒载体含有来自质粒的一个复制起点、抗药性标记、一个或多个限制酶单一位点，以及来自λ噬菌体粘性末端的DNA片段，即cos位点。它对于将DNA包装成λ噬菌体粒子是必需的。
柯斯质粒载体的优点：
①具有噬菌体的高效感染力。而在进入宿主细胞后不形成子代噬菌体仅以质粒形式存在。
②具有质粒DNA的复制方式。重组DNA注入宿主细胞后，两个cos位点连接形成环状DNA分子，如同质粒一样进行复制。
③具有克隆大片段外源DNA的能力。这是柯斯质粒的最大优点。柯斯质粒本身一般只有5～7kb左右，而它克隆外源DNA片段的极限值竟高达45kb，远远超过质粒载体及λ噬菌体载体的克隆能力。
四、M13噬菌体载体
M13是大肠杆菌丝状噬菌体，其基因组为环状ssDNA，大小为6407bp。感染雄性（F+或Hfr）大肠杆菌并进入细胞后，转变成复制型 (RF) dsDNA，然后以滚环方式复制出ssDNA。每当复制出单位长度正链，即被切出和环化，并被立即组装成子代噬菌体和以出芽方式（即宿主细胞不被裂解）被释放至胞外。
野生型M13不适于作为克隆载体，因此人们对野生型M13进行了改造，构建了一系列M13克隆载体（图10-4）。在M13基因组中，除基因间隔区（IG）外，其他均为复制和组装所必需的基因。外源DNA插入IG区，可不影响M13活动，因此对野生型M13的改造主要在IG区中进行。
（1） 插入β–半乳糖苷酶选择标记 在IG区中插入β–半乳糖苷酶N端一小段编码序列及其调控序列，该序列编码β–半乳糖苷酶的α肽，α肽可与大肠杆菌LacZ突变基因M15进行α互补，产生具有活性的β–半乳糖苷酶。若将M13和宿主细胞涂布在含有异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和呈色物质5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X–gal)培养基的平板上时，可形成蓝色噬菌斑。
（2） 插入一小段多克隆位点区 在α肽的编码区内插入一小段密集限制酶单一位点的DNA片段，当外源DNA插入到这一区段，则会破坏α互补作用。这时若将M13（含外源DNA）和宿主细胞涂布在含有IPTG和X–gal培养基的平板上，则形成无色噬菌斑。
M13载体克隆外源DNA的能力较小，一般只适于克隆300～400bp的外源DNA片段，它的突出优点是，特别适合用于制备克隆基因的单链DNA。因此，它主要被用于制备测序用单链DNA模板、特异的单链DNA探针，定位诱变等。也可用于噬菌体展示（phage display）。
五、噬菌质粒载体
噬菌质粒（phagemid 或phasmid）是由丝状噬菌体和质粒载体DNA融合而成，兼有两者优点，这类载体具有来自M13或f1噬菌体的基因间隔区（内含M13或f1噬菌体复制起点）和来自质粒的复制起点，抗药性标记，一个多克隆位点区等。例如pUC118噬菌质粒载体就是在野生型M13的基因间隔区插入质粒载体pUC18构建而成的。
噬菌质粒在寄主细胞内以质粒形式存在，复制产生双链DNA。当用辅助噬菌体M13感染宿主细胞后，噬菌质粒的复制就转变成如同M13噬菌体一样的滚环复制，产生单链DNA并被包装成噬菌体粒子， 以出芽方式释放至胞外。
噬菌质粒载体在应用上具有许多优点：
①载体本身分子小，约为3000bp，便于分离和操作。
②克隆外源DNA的容量较M13噬菌体载体大，可克隆10kb外源DNA片段。
③可用于制备单链或双链DNA，克隆和表达外源基因。
现将上述几类大肠杆菌克隆载体的克隆能力及其主要用途列表比较（表10-1）
六、真核生物的克隆载体
以上主要讨论了原核生物的克隆载体。但是关于真核生物基因调控以及真核基因产物转录及翻译后的加工等问题，是原核生物载体所无法解决问题。因此为了适应真核生物基因工程的需要，现已构建了一系列真核生物载体，主要有以下几大类：
1.酵母质粒载体
酵母质粒载体都是利用其2?m质粒与细菌质粒pBR322构建而成的，主要有以下三种(图10-5)：
图10-5 酵母质粒载体
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（1）附加体质粒（episomal plasmid）
该质粒载体含有来自细菌质粒pBR322的复制起点并携带作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（Ampr）。此外还有来自酵母2m m质粒的复制起点以及一个作为酵母选择标记的URA3基因（尿嘧啶核苷酸合成酶基因3），这种质粒既可在大肠杆菌中也可在酵母细胞中复制，当重组质粒导入酵母细胞中可进行自主复制，且具有较高拷贝数。
（2）复制质粒（replicating plasmid）
该质粒含有来自细菌质粒pBR322的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr）。还有来自酵母染色体的自主复制序列（ARS），以及作为酵母选择标记的URA3基因和TRP1基因（色氨酸合成酶基因1），故这种质粒是穿梭质粒，能在大肠杆菌或酵母细胞中复制，重组质粒导入酵母细胞中可获得中等拷贝数的质粒。
（3）整合质粒（integrating plasmid）
该质粒含有来自大肠杆菌质粒pBR322的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（Ampr）、四环素抗性基因（Tetr）。以及来自酵母的URA3基因，它既可以作为酵母细胞的选择标记，也可与酵母染色体DNA进行同源重组。这种质粒可在大肠杆菌中复制，但不能在酵母细胞中进行自主复制。一旦导入酵母细胞，可整合到酵母染色体上，成为染色体DNA的一个片段。
第三节 微生物与基因工程工具酶
基因工程操作需要用到一些基本的工具酶。例如在分离目的基因或切割载体时，需利用特异的限制性核酸内切酶对DNA进行准确切割。在构建重组DNA时，需在DNA连接酶的催化下，使目的DNA片段与载体DNA进行连接。此外，重组DNA技术还需要一些其他的工具酶。值得注意的是，基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化而获得的。
一、限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）或简称为限制性酶（restrition enzyme）是指能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类内切酶。在细菌细胞内限制性酶与DNA甲基化酶共同构成细菌的限制–修饰系统，利用限制酶降解进入细胞内的外源DNA，同时用甲基化酶修饰细菌本身DNA，以避免被酶降解。
1.限制性内切酶的命名与分类
限制性酶的命名是根据分离出此酶的微生物学名而定的。即取微生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成三个斜体字母加以表示，遇有株名，再加在后面。如果同一菌株先后发现几个不同的酶，则用罗马数字加以表示。例如EcoRI中的E表示大肠杆菌属名第一个字母，co表示种名头两个字母，R表示株名，I表示该菌中第一个被分离出来的酶。如限制酶是来自同一属的细菌，而且种名的头两个字母完全相同，这时其中一个菌的酶命名的第三个字母可用种名的词头后的另一个字母代替。例如副流感嗜血杆菌 的酶表示为HpaI 和HpaII；而副溶血嗜血杆菌 的酶表示为HphI。
根据限制酶识别和切割DNA的特点，可将限制酶分为I、II、III三种类型，I型和III型由于无切割特异性或特异性不强故不用于基因工程，II型限制酶的限制修饰系统分别由限制酶和修饰酶两种不同的酶组成，仅需Mg2+作为辅助因子，切割位点位于识别位点之内或在附近，特异性最强，用处最大，是基因工程重要工具酶，通常所说的限制性核酸内切酶，即指此类酶。
2.限制性核酸内切酶的基本特性
II型限制酶的识别序列通常由4～8个碱基对组成，他们具有二重旋转对称轴，这些碱基对的序列呈回文结构（palindromic structure）。所有限制酶切割DNA后，均产生含5，磷酸基和3，羟基的末端。限制酶作用所产生的DNA片段有以下两种形式：
(1) 形成粘性末端（cohesive end）
有些限制酶不在识别序列的对称轴上切割，而是交错切割结果形成的DNA限制片段具有粘性末端。例如HindIII切割结果形成5，单链突出的粘性末端；而PstI切割结果却形成3￠ 单链突出的粘性末端。
（2）形成平末端（blunt end）
有些限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的DNA片段具有平末端。例如HpaI切割结果形成平末端。
HindIII的识别序列是： HpaI的识别序列是：
不同的限制性核酸内切酶识别DNA中的碱基对序列长短不同。在随机排列的DNA序列中，识别位点序列长的限制酶，在酶切后所得到的DNA片段长，相反识别位点序列短的限制酶，酶切后所得到DNA片段短。
同裂酶（Isoschizomers） 有些来源不同的限制酶却识别和切割相同的序列，这类限制酶称为同裂酶。同裂酶产生同样切割，形成同样的末端，酶切后所得到的DNA片段经连接后所形成重组序列，仍可能被原来的限制酶所切割。同裂酶之间的性质有所不同（如对离子强度、反应温度以及对甲基化碱基的敏感性等方面可能有所差别）。
同尾酶(Isocaudomers) 有些来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但却能产生出相同的粘性末端，这类限制酶称为同尾酶。但两种同尾酶切割形成的DNA片段经连接后所形成的重组序列，不能被原来的限制酶所识别和切割。EcoRI 和MunI属于同尾酶。
MunI的识别序列是： EcoRI的识别序列和切割位点：
表10-2介绍一些常用限制酶的识别序列及其产生菌。
二、DNA连接酶（DNA ligase）
DNA连接酶与限制性内切酶一样，也是由微生物产生。主要来自T4噬菌体和大肠杆菌，也是重组DNA技术中具有头等重要的工具酶，重组DNA技术核心步骤是在体外利用DNA连接酶将目的基因和载体共价连接构成重组DNA分子。目前常用的三种体外DNA连接方法为： 用T4或E.coli DNA连接酶可连接具有互补粘性末端的DNA片段； 用T4 DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段； 先在DNA片段末端加上人工接头，使其形成粘性末端，然后再行连接。
DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻的5,端磷酸与3,端羟基之间形成磷酸二酯键。它既能催化双链DNA中单链切口的封闭，也能催化两个双链DNA片段进行连接。DNA连接酶主要有两种：一种是T4 DNA连接酶，另一种是大肠杆菌DNA连接酶。T4 DNA连接酶由一条多肽链组成，分子量为6800，通常催化粘性末端间的连接效率要比催化平末端连接效率为高。催化反应需要Mg2+和ATP，ATP作为反应的能量来源。T4 DNA连接酶在基因工程操作中被广泛应用。大肠杆菌DNA连接酶的分子量为7500，连接反应的能量来源是NAD＋，此酶催化DNA连接反应与T4 DNA连接酶大致相同，但不能催化DNA分子的平端连接。
除上述二种工具酶以外，还有其它重要的工具酶也是来自微生物，如DNA聚合酶I（DNA ploymerase I）、Klenow聚合酶，以及逆转录酶（reverse transcriptase）等。
第四节 微生物作为克隆载体的宿主
为了保证外源基因在细胞中的大量扩增和表达，选择合适的克隆载体宿主就成为基因工程重要问题之一。
一、宿主的基本要求与性质
对于克隆基因而讲，一个理想宿主的基本要求是：
①能够高效吸收外源DNA；
②具有使外源DNA进行高效复制的酶系统；
③不具有限制修饰系统（hsd system），故不会使导入宿主细胞内未经修饰的外源DNA发生降解；
④不具有DNA重组系统，常用重组缺陷型（RecA-）菌株，使克隆载体DNA与宿主染色体DNA之间不发生同源重组；
⑤便于进行基因操作和筛选；
⑥具有安全性。宿主细胞应该对人、畜、农作物无害或无致病性等。
某些工程微生物，如原核生物的大肠杆菌及真核生物的酿酒酵母，由于他们具有一些突出优点如生长迅速、极易培养、能在廉价培养基中生长，其遗传学及分子生物学背景十分清楚等，因此他们已成为当前基因工程被广泛应用的重要克隆载体宿主。
二、原核生物宿主
在选择原核微生物作为克隆载体宿主时，还应考虑下列一些问题：首先应根据克隆载体性质以及它们导入细胞的方式选择相应的宿主细胞。例如当选择质粒DNA作为载体并通过转化方式进入细胞，最好选择易于形成感受态细胞的细菌作为宿主，以利于宿主细胞有效吸收外源DNA；又如若选择经体外包装的l 噬菌体载体或柯斯质粒作为克隆载体，并以感染方式进入细胞，则应选择l 的敏感宿主(E.coli k12菌株)作为克隆载体宿主；当用M13衍生物作为克隆载体，则应选择含有F因子的雄性大肠杆菌作为宿主。其次为了便于阳性克隆的筛选，作为克隆宿主的基因型应与载体基因相对应。例如若载体携带氨苄青霉素抗性基因，则相应宿主应该是对氨苄青霉素敏感细菌；若载体携带β-半乳糖苷酶α-肽的编码序列，那么应选择该基因N端部分编码序列缺失的突变株(Lac Z△M15)作为宿主；最后为了安全目的，需严格限制载体的宿主范围，以达到尽量避免重组体从实验室逃逸出去。例如构建的载体中某一重要基因编码序列发生琥珀突变，这时必需选择具有强琥珀突变抑制基因的宿主，重组载体离开该宿主即无法存在。
目前几乎所有的有关重组DNA的研究工作均利用大肠杆菌作为克隆基因的宿主，但是存在一些不利之处。首先由于它是条件致病菌，故存在潜在的致病性，即使非致病的菌株仍能产生内毒素，有可能污染表达产物。再有，外源基因的表达产物，易被蛋白水解酶降解或不能正确加工折叠。目前上述多数问题已有办法加以解决。
其他细菌，如枯草芽孢杆菌，也已发展成为克隆载体的宿主。它不存在潜在致病性，不产生内毒素，可将蛋白质分泌到培养基中，并且已有合适的质粒载体用于转化。但是枯草芽孢杆菌作为克隆载体也存在不足之处是，它的质粒往往不稳定，经多次传代后，很难保持质粒继续复制，外源DNA不能很好保留在细胞内甚至发生突然丢失。因此，使枯草芽孢杆菌作为克隆宿主的应用受到一定的限制。
三、真核生物宿主
利用真核生物作为克隆载体宿主具有两个重要意义。第一它促进了对真核生物复杂基因组及其基因调控的研究；第二它有利于真核基因产物的翻译后加工。
酿酒酵母是一种理想的真核生物克隆载体宿主。这是由于对其遗传学有较深入的了解；其基因的表达调控以及蛋白质的翻译后加工比较接近高等真核生物；此外它具有较高的安全性，用它表达生物药物时，不需进行大量宿主安全试验。目前已构建了一系列酵母质粒载体及酵母人工染色体。通过转化，可将大片段的外源DNA导入酵母细胞，并得到正确的克隆和表达。它对于高等真核生物基因组及其转录、翻译系统研究提供了一个良好基础。
利用哺乳动物细胞进行基因克隆极为重要，有关人类遗传学、肿瘤、感染性疾病和生理学的许多研究均赖以进行。但是哺乳动物细胞作为宿主不利之处是，若要进行大规模细胞培养，则费用过于昂贵和难于操作，同时克隆基因的表达水平也常常是极低的。现在已开发昆虫细胞系作为一种昆虫DNA病毒（杆状病毒）载体的克隆宿主，较易进行大规模的细胞培养。
四、外源DNA导入宿主细胞?
将外源DNA导入宿主细胞是分子克隆关键步骤之一。其导入方式是多种多样的：
1. 外源DNA导入原核细胞 外源DNA可通过转化、转染以及感染等方式被导入原核细胞
(1) 转化或感染
如果外源DNA以重组质粒载体形式存在，则可通过转化导入原核细胞；如果外源DNA被构建成重组噬菌体DNA或重组噬菌质粒，则可通过转染方式进入宿主细胞。无论转化或转染都需用氯化钙处理宿主细胞,使细胞变得易于吸收外源DNA，这种细胞称为感受态细胞。大肠杆菌转化程序：一般先用一定浓度冰冷的CaCl2溶液处理对数期的大肠杆菌细胞，然后加入外源DNA并短暂给予42℃热休克处理约90s，使感受态细胞有效吸收外源DNA。一般转化效率可达到每微克DNA转化107~108个细胞。
(2) λ噬菌体的体外包装与感染
如果外源DNA被包装成λ噬菌体颗粒，则可通过噬菌体感染机制导入宿主细胞。λ噬菌体DNA体外包装技术是贝克勒(Beckler)和戈尔德(Gold)于1975年最先建立的。体外包装是将重组DNA分子与λ的头部、尾部以及有关包装蛋白混合，从而组装成完整具有感染力的λ噬菌体粒子。
体外包装的λ噬菌体用以感染宿主细胞，每微克DNA可产生109的噬菌斑。而如果仅用重组λDNA分子通过转染进入大肠杆菌的感受态细胞。则每微克DNA仅能产生104~105的噬菌斑，说明感染效率比转染效率要高出104~105倍，从而大大提高基因文库的库容量。
2. 外源DNA导入真核细胞 外源DNA导入真核细胞方法可因真核细胞种类不同而有所不同
(1) 外源DNA导入酵母细胞
一般利用蜗牛酶除去酵母细胞壁形成原生质体，再用CaCl2和聚乙二醇处理，重组DNA以转化方式导入酵母细胞的原生质体，最后将转化后的原生质体置于再生培养基的平板中培养，使原生质体再生出细胞壁形成完整酵母细胞。
(2) 外源DNA导入哺乳动物细胞
其中最简便的是微量注射法和电穿孔法。由于有些动物细胞体积较大，如受精卵用微量注射器可将外源DNA注入细胞内。电穿孔(electroporation)法是把宿主细胞与外源DNA混合并置于电击槽中。在高压电脉冲作用下，使细胞膜瞬时击穿出现微孔，外源DNA通过微孔进入细胞。电穿孔法十分成功用于哺乳动物细胞和植物细胞，而且也可用于通常不能进行转化的细菌。大肠杆菌应用电穿孔法也可提高转化率。
此外还有磷酸钙共沉淀转染法，DEAE-葡聚糖转染法、聚阳离子转染法、原生质体融合法、脂质体法等。
(3) 外源DNA导入植物细胞
除了通过微量注射法及电穿孔法可将外源DNA导入植物细胞外。还有两种方法，一种是将含有重组Ti质粒的土壤农杆菌与植物原生质体共培养（即共培养法）或与植物叶片共培养（即叶片培养法），多数双子叶植物转化常用此法；另一种是基因枪法或称微弹枪（particle guan）法，利用微弹把表面吸附有外源DNA的金属微粒高速射进植物的细胞或组织，可直接将外源基因导入幼苗，此法简便、有效。故颇受欢迎和被广为应用。
五、基因文库与cDNA文库的构建
利用重组DNA技术，可将某一原核生物或真核生物染色体基因组的全部遗传信息，贮存在由重组体群体（如重组噬菌体群体）构成的基因文库(genomic library)或cDNA文库(cDNA library)之中，就好像将文献资料贮存于图书库一样。以供长期贮存和随时钓取克隆基因使用。
1. 基因文库的构建
由于高等生物染色体基因组结构复杂，分子庞大，而单个基因却只占染色体DNA的很小部分。若要从巨大染色体基因组中分离某一目的基因，通常需经过两个步骤：首先构建一个基因文库，然后根据目的基因的性质或序列从基因文库中筛选出来。
所谓基因文库是指生物染色体基因组各DNA片段的克隆总体。文库中的每一个克隆只含基因组中某一特定的DNA片段。一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗传信息（即全部DNA序列）。
基因文库构建的简单步骤（图10-7）：
①从组织或细胞提取基因组DNA。
②用限制性酶部分水解或机械剪切成适当长度的DNA片段，经分级分离选出一定大小合适克隆的DNA片段。
③选择容载量较大的克隆载体，通常采用l 噬菌体或柯斯质粒载体，在适当位点将载体切开。
④将基因组DNA片段与载体进行体外连接。
⑤重组体DNA直接转化细菌或用体外包装的重组l 噬菌体颗粒感染敏感细菌细胞。最后得到携带重组DNA的细菌群体或噬菌体群体即构成基因文库。
2. cDNA文库构建
所谓cDNA文库是指生物体全部mRNA的cDNA克隆总体。cDNA文库中的每一个克隆只含一种mRNA信息。
如上所述由于真核生物基因组十分庞大，因此要求构建基因文库的库容量要足够大，才能筛选到某一目的基因。但基于这样一个事实，即细胞中的mRNA分子数要比基因组的基因数小得多（通常大约仅有15%左右基因被表达），因而若由mRNA逆转录为cDNA，那么所构建的cDNA文库的库容量相应比基因文库小。
构建cDNA文库的主要步骤（图10-8）：
①从生物体或细胞中提取mRNA。
②利用逆转录酶以寡聚(dT)或随机寡聚核苷酸为引物合成cDNA的第一条链。
③利用DNA聚合酶I，以cDNA第一条链作为模板，用适当引物合成cDNA第二条链。常用RNA酶H在杂交分子的mRNA链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物；或是除去杂交分子的mRNA后，加入随机引物，即可合成第二条链。
④cDNA与载体的体外连接。
⑤噬菌体的体外包装及感染或质粒的转化。由于cDNA不含基因的启动子和内含子，因而序列比基因短，其克隆载体可选用质粒或病毒载体。
cDNA文库对克隆和表达真核生物基因更加重要。因为真核生物的基因含有内含子，在原核生物细胞中不能表达，但筛选到的cDNA克隆只要附上原核生物的调节和控制序列，就能在原核细胞内表达。此外，cDNA还代表了基因组表达的遗传信息。
六、重组体的筛选与鉴定
在构建文库之后，就需要从众多的克隆中，筛选出含有目的基因的重组体，并鉴定其正确性。概括起来通常有三类鉴定方法，一是重组体表型特徵的鉴定。二是重组DNA分子结构特徵的鉴定。三是外源基因表达产物的鉴定。
1. 重组体表型特征的鉴定
(1) 抗生素平板法
如果外源DNA片段插入载体的位点位于抗生素抗性基因之外，将转化后的重组体细胞置于含有该抗生素的培养基平板上进行培养，仍可长出菌落。此外，还有一些自身环化的载体和未被酶解的载体，他们的转化细胞也能在含该抗生素平板上生长并形成菌落，而只有作为对照的受体细胞不能生长。此法缺点是假阳性率高。
(2) 插入失活法
见第二节图10-3。
(3) 插入表达法
在某些载体的标记基因前面连接一段负控制序列，当外源DNA片段插入该负控制序列中，使负控制序列失活，因而位于下游的标记基因因解除阻遏而得到表达。例如质粒pTR262有一个负调控的cI基因，当外源DNA片段插入cI基因中的BcII或Hind III位点，造成cI基因失活，位于cI基因下游的Tet基因（受cI基因控制）因解除阻遏而被表达，转化后的重组体细胞，在含有四环素的平板中可形成菌落；而未被酶解的质粒，自身环化质粒的转化细胞及未转化受体细胞均不能形成菌落。
(4) β-半乳糖苷酶显色反应法
在某些载体如M13噬菌体载体，pUC质粒系列、pGEM质粒系列，它们的载体上都携带lac z'基因一段序列，它编码β-半乳糖苷酶的α肽，而宿主细胞为lac z△M15的突变株。当将上述载体的转化细胞培养在含有X-gal和IPTG平板中，由于基因内互补作用，产生有生物活性的β-半乳糖苷酶，把培养基中的无色X-gal分解成半乳糖和呈蓝色的5-溴-4氯-靛蓝，使菌落呈蓝色。
若将外源DNA插入到载体上lac z￠ 序列中，使α-肽基因失活，失去α－互补作用，将重组体转化细胞培养在含有X-gal-IPTG平板上，菌落无色。利用β-半乳糖苷酶显色反应即可挑选出含有外源DNA重组体的阳性克隆。
第六节 DNA的合成、体外扩增和定位诱变
DNA的化学合成、体外扩增和定位诱变是按照设计获得基因分子序列和对基因改造的关键技术。DNA的化学合成方法是科拉纳（Khorana）于50年代建立的，其后作了改进并最先合成了基因片段。因此而于1968年获得诺贝尔医学奖。1984年穆利斯（Mullis）建立聚合酶链式反应（PCR）技术，为基因的体外扩增提供了十分简便的方法，1985年史密斯（Smith）建立了寡核苷酸指导的定位诱变技术，率先实现了对基因的定向改造。 为表彰穆利斯和史密斯对基因操作技术的重大贡献，他们两人共获1993年诺贝尔化学奖。现在，DNA的合成、测序和PCR扩增都有自动化的仪器，定位诱变也可用PCR方法来完成，这标志着基因工程技术上的逐步成熟和完善。
一、DNA的合成
如果已知某种基因的核苷酸序列，或某种蛋白质的氨基酸序列，就可通过化学法合成这一基因。1977年板仓敬一首先用化学法合成了14肽的生长激素释放抑制因子的基因，并获得克隆和表达成功。化学合成法自DNA合成仪问世后，已实现完全自动化，在几个小时内可合成30～35个碱基的寡核苷酸。目前化学合成寡核苷酸片段能力约为150～200个核苷酸左右。基因的化学合成是先合成许多寡核苷酸，彼此交错互补，然后再将它们连接起来。
合成的DNA分子被广泛用于基因工程的不同目的：
①作为合成基因的元件。通过寡核苷酸片段连接，现已能构建长达2000bp的基因序列。
②作为核酸分子杂交的探针，通过核酸杂交用于检测和分离特殊的DNA序列。
③合成引物，用于测序、定位诱变和PCR扩增等。
二、PCR扩增技术的原理和应用
穆利斯发明了聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）,这是一种在体外快速扩增特定DNA序列的新技术。过去人们为了得到某一特定DNA序列，按传统方法需将目的基因插入到载体中，再将此重组DNA导入宿主细胞中，经过筛选和鉴定等操作获得目的基因的克隆。而PCR技术只需数小时，就可在体外将该特定基因扩增百万倍，从而免除基因重组和分子克隆等一系列繁琐操作。
穆利斯发明了聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）,这是一种在体外快速扩增特定DNA序列的新技术。过去人们为了得到某一特定DNA序列，按传统方法需将目的基因插入到载体中，再将此重组DNA导入宿主细胞中，经过筛选和鉴定等操作获得目的基因的克隆。而PCR技术只需数小时，就可在体外将该特定基因扩增百万倍，从而免除基因重组和分子克隆等一系列繁琐操作。
?1．PCR扩增技术原理
如果DNA片段两端的序列是已知的，那么采用聚合酶链式反应（PCR）就可很容易将此DNA片段扩增出来。进行PCR需要合成一对寡聚核苷酸作为引物，它们各自与所要扩增的靶DNA片段的末端互补。引物与模板DNA相结合并沿模板DNA延伸，以扩增靶DNA序列。PCR由3个基本反应组成（图10-11）。
图10-11聚合酶链式反应（PCR）
?
（1）变性（denaturation）
加热，模板DNA经热变性，双链被解开，成为两条单链。
（2）退火（annealing）
使温度下降，寡核苷酸引物即与模板DNA中所要扩增序列两端的碱基配对。
（3）延伸（extension）
在适宜条件下，引物3￠ 端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的DNA链。
这样，变性、退火和延伸构成一个循环，新合成的DNA链又可作为模板进行下一个循环的复制。重复变性、退火和延伸三步操作，DNA片段呈2的指数增长，在1－2小时内重复25－30次循环，扩增的DNA片段拷贝数可增加至106～107倍。
值得指出的是，最初PCR技术，使用Klenow聚合酶，此酶主要的缺点是不耐热，在PCR过程中，高温使酶变性，因此反应中每个循环都需添加酶；此外，该酶的最适反应温度是37℃，在此温度下增加了引物与DNA之间非特异碱基配对，从而降低PCR产物特异性。
1988年萨奇（R.K.SaiKi）等人从水生栖热菌（Thermus aquaticus）中成功分离到一种耐热的DNA聚合酶，称为Taq DNA聚合酶，一次加酶即可满足PCR全过程需求；同时简化操作并提高了PCR产物特异性。此酶在PCR技术中被广泛应用。缺点是该酶缺乏校正功能。
最近已陆续发现一些既耐热且具有校正功能的DNA聚合酶，一种是从火球菌（Pyrococcus Furiosus）中分离到的，称为pfu DNA聚合酶；另一种从Thermococcus litoralis中分离到的，称为Vent DNA聚合酶。这些酶已被用于PCR反应。
3. PCR技术的应用
PCR技术具有十分广泛的实际用途：
（1）可用于DNA的扩增和克隆：制备单链或双链DNA探针；也可用于定位诱变和DNA测序。
（2）在临床医学上可用于检测病原体，诊断遗传病，以及对癌基因的分析确定。
（3）用于法医，以鉴别个体和判定亲缘关系。当用多对引物进行PCR时，可得到对个体特定的条带图谱，称为指纹图谱（DNA fingerpinting）。从作案现场得到的痕量血液、体液、毛发、皮屑等。经PCR得到指纹图谱即可用来指证嫌犯。DNA指纹图谱还能确定个体间的血缘关系。
由于PCR技术操作简单、实用性强、灵敏度高，并可自动化，因而在分子生物学、基因工程研究，以及临床医学、法医和检疫等实践领域得到日益广泛的应用。
三、DNA的定位诱变
随着分子生物学的进步，尤其是基因克隆技术的广泛应用，人们不仅能将外源基因导入生物体内，改变生物性状，而且已有可能通过体外定位诱变（site-directed mutagenesis）方法，特异改变克隆基因或DNA序列。与传统方法用诱变剂随机发生作用不同，定位诱变用合成的DNA和重组DNA技术在基因精确限定的位点引入突变，包括删除、插入和置换特定的碱基序列。定位诱变技术具有重要应用价值，它不仅用于基因结构与功能研究，而且还能进行分子设计改造天然蛋白质，即通过有目的的改变蛋白质分子中的特异氨基酸，从而获得有益的蛋白质突变体。现将几种主要的定位诱变技术介绍如下：
1. 寡核苷酸指导的诱变
该方法的基本原理是，合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，其中含有所需要改变的碱基，使与带有目的基因的单链DNA配对。合成的寡核苷酸除短的错配区外与目的基因完全互补。然后用DNA聚合酶使寡核苷酸引物延伸，完成单链DNA的复制。由此产生的双链DNA，一条链为野生型亲代链，另一条链为突变型子代链。将获得的双链分子通过转染导入宿主细胞，并筛选出突变体，其中基因已被定向修改。
寡核苷酸指导的定位诱变过程由的示意图（图10–12），用于定位诱变的常用载体是噬菌体M13 DNA。在克隆外源基因时，需要从已感染M13的大肠杆菌细胞中提取M13双链复制型DNA，外源基因才得以插入；而在定位诱变时，则需从培养液中分离出M13的重组噬菌体，并从中提取出携带外源基因M13的单链重组DNA。然后再进行体外定位诱变，获得含有错配碱基完整双链M13DNA，转染大肠杆菌，M13在大肠杆菌中扩增，形成噬菌斑。理论上一半是野生型，另一半则含突变基因。用诱变的寡核苷酸引物作为探针，通过杂交即可鉴定出突变体。现在已有一些改进的方法，可用来提高寡核苷酸指导的诱变效率。
图10-12 寡核苷酸指导的定位诱变
?
2. 盒式诱变
当今的DNA合成技术已经能够对任意的变异基因予以全合成。但全合成耗费太大，实际上只要在变异区附近找两个限制位点，将两者之间的DNA序列切掉，并由一段带有变异序列的双链DNA所取代，就能达到诱变目的。所谓盒式诱变（cassette mutagenesis）就是用一段人工合成具有突变序列的DNA片段，取代野生型基因中的相应序列。这就好象用各种不同的盒式磁带插入收录机中一样，故而称合成的片段为“盒”，这种诱变方式为盒式诱变。然而，并非所有变异区附近都能找到合适的限制位点，如果不存在限制位点，就要用寡核苷酸指导的定位诱变引入限制位点。
3. PCR诱变
在最初所建立的PCR方法中就可看出只要引物带有错配碱基，便可使PCR产物的末端引入突变。例如，为了克隆PCR产物，常在引物5′端设计一个限制酶的位点，结果就使该限制位点引入PCR产物的末端。但是，诱变部位并不总在DNA片段的末端，有时也希望对靶DNA的中间部分进行诱变。1988年希古契（Higuchi）等人提出一种借助重组PCR（recombinant PCR）进行定位诱变的方法，可以在DNA片段的任意部位产生定位突变。 它在需要诱变的位置合成两个带有变异碱基的互补引物，然后分别与5′引物和3￠ 引物作PCR，这样得到的两个PCR产物分别带有变异碱基，并且彼此重叠，在重叠部位经重组PCR就能得到诱变的PCR产物（见图10－13）。
任何基因，只要两端及需要变异部位的序列已知，就可用PCR诱变去改造该基因的序列。方法简便易行，结果准确、高效，因此已成为最常用的定位诱变方法，PCR诱变方法已有许多改进和发展，即使很大的基因，也能用该法定点引入变异。
第七节 基因工程的应用及展望
70年代兴起的基因工程，标志着人类改造生物进入一个新的历史时期。由于基因工程的迅速发展和广泛应用，它不仅对生命科学的理论研究产生深刻的影响，而且也为工农业生产和临床医学等实践领域开创一个广阔的应用前景。
基因工程正在或即将使人们的某些梦想和希望变为现实。基因工程被广泛应用于生产实践，带动了生物技术产生高速发展。现就基因工程一些重要的应用简略叙述如下：
一、基因工程药物
基因工程药物包括一些在生物体内含量甚微但却具有重要生理功能的蛋白质，如激素、酶和抑制剂、细胞因子、抗原和抗体、反义核酸和疫苗等。此外，还可利用重组DNA技术改造蛋白质，设计和生产出自然界不存在的新型蛋白质药物。表10-3列出一些具有重要临床应用价值的重组蛋白质药物。其中，重组胰岛素是作为商品于1982年最早投放市场的基因工程药物；重组疫苗是目前最普遍使用的基因工程药物。这里仅对这两类药物作一介绍。
表10-3 利用基因工程生产的人类蛋白质药物
1. 重组胰岛素 (recombinant insulin)
胰岛素是在胰脏的胰岛中产生的一种小分子蛋白质，它能提高组织摄取葡萄糖的能力，具有降低血糖的作用，可用于治疗人的糖尿病，现在已能在细菌中克隆人胰岛素基因并用于大规模生产。基因工程生产人胰岛素有两种技术路线。
其一，首先分别化学合成编码胰岛素A链和B链的基因序列，两条链的5′端各加甲硫氨酸密码子ATG，以便表达后加工。然后将合成的A、B链DNA序列分别插入到质粒载体的β-半乳糖苷酶基因中，克隆基因受β-半乳糖苷酶基因启动子控制。重组质粒转化E.coli，分别表达A链或B链和β-半乳糖苷酶的融合蛋白。由于甲硫氨酸位于融合蛋白的连接处，在体外用溴化氰裂解甲硫氨酸，即可使A链或B链与β-半乳糖苷酶片段分开。然后A链和B链通过二硫键连接，形成具有活性的胰岛素。
其二，先生产胰岛素原，并用酶切和化学裂解将其转变成胰岛素。具体过程是：将胰岛素原的mRNA经逆转录酶合成cDNA，并在cDNA的5′端加上甲硫氨酸密码子ATG。然后将cDNA插入表达载体中，转化E.coli并表达N端为甲硫氨酸的胰岛素原。将表达产物分离纯化，用胰蛋白酶和羧基肽酶B消化，切去C肽；再用溴化氰处理，除去N-端的甲硫氨酸，即得到胰岛素。
2. 重组疫苗（recombinant vaccines）
基因工程已成功开发出一系列重组疫苗，这是一类更有效更安全的新型疫苗。所谓重组疫苗是指利用重组DNA技术，克隆并表达抗原基因的编码序列，并将表达产物用作疫苗。
第一个被批准在人类中使用的重组疫苗是用酵母生产的乙肝表面抗原（HBsAg），它是由乙肝病毒表面蛋白抗原基因在酵母细胞中克隆和表达得到的HBsAg，实际上是中空的病毒颗粒（只含表面抗原蛋白和磷脂），经纯化后可作为乙型肝炎疫苗。
除用酵母外，昆虫细胞、哺乳动物细胞也被作为宿主，甚至植物也能产生重组疫苗。现在世界上许多实验室正在试验制备HIV的重组疫苗。
二、转基因植物(transgenic plant)
近年来，随着DNA重组技术的深入发展，科学家们已能将重组DNA导入植物细胞，并成功培育了许多具有新的优良性状的转基因植物。主要包括抗病虫害、抗逆（抗盐、碱等）、耐除草剂、延长水果蔬菜的贮存期等，此外还可用转基因植物生产药物（如人的干扰素）、抗体、疫苗等。转基因植物的构建主要通过Ti质粒，因此这里将主要介绍Ti质粒的改建和应用。由于Ti质粒能整合到植物染色体中的T-DNA片段，使它能够成为植物基因工程的载体。T-DNA从土壤农杆菌转移到植物细胞核内是由T-DNA两侧25个碱基对的重复序列所介导，同时还需要在Ti质粒毒性区（vir）某些基因产物（vir蛋白）的作用。其中virE2和virD2两种蛋白，可以保护T-DNA，使其免受植物细胞中核酸酶的降解，并引导T-DNA进入植物细胞核，使其整合到受体植物的基因组中。转移T-DNA进入植物基因组的这一细菌系统被用来转移重组DNA。但由于Ti质粒太大，不便于操作，因此人们构建了许多Ti质粒衍生物作为植物的克隆载体。主要有两种类型：
1.二元载体系统(binary vector system)（图10-14b）
由2个质粒组成，一个是克隆载体，另一个是辅助质粒。克隆载体通常是由E.coli的一个小质粒构成，便于进行遗传操作。其中含有T-DNA两个末端序列，它对于T-DNA的整合是必需的；还含有DNA复制起点（既有E.coli的复制起点也有根癌土壤杆菌的复制起点），使其可在E.coli和根癌土壤杆菌之间进行穿梭转移。它常含有两个选择标记基因（一个用于在植物细胞中表达，另一个用于在E.coli中表达）；此外还含有多克隆位点，便于外源DNA的插入。辅助质粒（helper plasmid）是由经修饰的Ti质粒所构成，该质粒缺失或部分缺失T-DNA区，但却含有一整套的vir基因。当外源DNA被插到克隆载体后，载体被导入E.coli中。然后通过接合转移进入土壤农杆菌中（该菌含有辅助质粒），最后外源基因由T-DNA携带在Ti衍生质粒的作用下转移至植物细胞，与染色体DNA发生重组，为植物提供了一个新的特性。
2.共整合载体系统(cointegrate vector system)
共整合载体(图10-14a)是由一个缺失了致瘤基因的Ti质粒与一个普通穿梭质粒载体构建而成。其中克隆载体和经修饰的Ti质粒中都含有一段同源的DNA片段。当带有外源基因的克隆载体进入土壤农杆菌后，通过同源重组就可以把克隆的基因整合到Ti质粒上，形成一个共整合载体，然后由Ti质粒提供vir蛋白，协助带有外源基因的T-DNA向植物细胞转移。此外，近年来已成功地发展出一些使外源DNA进入植物细胞的新技术，例如电穿孔、激光穿孔、基因枪等，这些技术使植物基因工程日趋成熟，新的改进性状的工程植物不断被创造出来。
三、转基因动物（transgenic animals）
随着现代生物技术的发展，科学家已经能够应用基因工程技术培育转基因动物，从而开辟动物育种新途径。所谓转基因动物是指用重组DNA技术和显微注射技术，将克隆DNA导入受精卵，使外源基因在实验室研究动物以及具有重要商业价值的饲养动物两者均能得到表达的动物。
构建转基因动物的主要步骤：将克隆的外源基因注射到一个受精卵的细胞核中；然后将接种后的受精卵移植到雌性受体的子宫内；移植后的受精卵发育成为后代，其中部分后代的细胞中携带转入的外源基因并得到表达。
1982年培育转基因小鼠获得成功，使科学们受到极大鼓舞，随后对各种家禽、家畜鱼类进行基因操作，培育出一系列改进性状的新品种。转基因的瘦肉型猪、高产奶的奶牛、快速生长的家畜和鱼类等已进入实用阶段。利用转基因动物生产药物、血清蛋白、疫苗等也获成功。正在尝试培养带有人体基因的猪，使其器官能够移植人体而不被排斥。
转基因动物不仅有着广泛的应用前景，而且对于基础生物医学及发育生物学的理论研究也将起着重要的作用。
四、基因治疗（gene Therapy）
所谓基因治疗是指向靶细胞中引入具有正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，从而达到治疗的目的。
目前基因治疗大致有三类：
①用正常基因去弥补有缺陷的基因，用于治疗遗传性疾病。
②通过转移基因以刺激免疫力，用于肿瘤和艾滋病的治疗。
③所转移的基因用于配合细胞或药物治疗，以便增强特异性或增强疗效。
基因治疗为临床医学开辟了崭新的领域。一些目前尚无有效治疗手段的遗传病、肿瘤、心脑血管疾病、老年痴呆症、恶性传染病（如各型肝炎、艾滋病等）可望通过基因治疗来达到防治的目的。1990年美国首次在临床上将腺苷脱氨酶（ADA）基因导入患者外周淋巴细胞，用以治疗因该基因缺陷而引发的重度免疫缺陷综合症（SCID），获得成功。其后在囊性纤维化（CF）、血友病、肿瘤、艾滋病等疾病的基因治疗中作了有益尝试。我国基因治疗也已取得可喜成果。1991年首例B型血友病基因治疗获得理想结果。脑恶性胶质瘤的基因治疗已完成临床前试验。目前基因治疗还有一些关键技术有待改进，主要是：如何选择有效的治疗基因，构建安全、特异和高效表达载体，将重组DNA导入人体并控制其高表达。人类基因组计划的顺利实施和“功能基因组”研究的开展必将有助于人类重要疾病基因的不断发现和基因治疗手段的提高。可以比较乐观地认为，21世纪20年代以前，基因治疗有可能成为临床医学上广泛采用的治疗手段之一，对人类战胜疾病，促进健康，将带来无尽的益处。
六、基因工程研究展望
基因工程的兴起导致生物科学发生深刻的变化，主要表现在：第一，引发了生物科学中技术上的创新和迅猛发展。使传统生物技术，发展成以基因重组技术为核心的现代生物技术，即简称为生物技术。生物技术用于工程实践而形成了各类生物工程，主要包括基因工程、酶工程、细胞工程、发酵工程和生化工程等，其中以基因工程发展最快，应用最广。第二，技术上的重大突破，促使生物科学获得前所末有的高速度发展，开辟了新的研究领域，进入了新的研究深度。发育分子生物学、神经分子生物学、分子细胞学、分子生理学、分子进化学等学科领域的蓬勃发展。第三，为改造生物提供强有力的手段，使生物学进入创造性的新时期。从而使得在分子水平上重新设计、改造和创建新的生物形态和新的生物物种成为可能。基因工程能够带来的好处是十分巨大的。以上叙述仅涉及制药、农业和医学领域的某些方面。其实，基因工程的应用范围要广泛得多，在食品、化工、环保、采矿、冶炼、材料、能源等众多领域都有诱人的开发前景。它将在人类实践中发挥更大作用和贡献。当然，它也和其它所有新生事物一样，在它给人们带来巨大利益的同时也面临着严峻的挑战。基因工程与传统生物技术的最根本的区别就在于前者是在基因水平上进行操作，改变已有的基因甚至创造新的物种，这是一项前无古人的崭新的工作。因此，基因工程是否具有潜在的危害性，特别是转移至人体的基因是否会激活原癌基因，基因工程是否会导致出现新型病原生物等问题必然也成为人们关心和争议的焦点，也是当前的研究热点之一。但有一点可以肯定，人们既然能发明一种新技术，必然也将会有能力掌握这门新技术，使它朝着人类进步的方向发展。
小 结
1. 基因工程，即DNA重组技术，是在分子生物学、微生物学基础上结合有关现代科学和工程学原理和方法而开拓的新兴技术领域。它的出现促使生物技术迅猛发展，改变了生物科学面貌，并带动了生物技术产业的兴起。
2. 基因工程的操作主要包括：基因的分离、合成和重组，基因的分子克隆，基因的测序和鉴定，基因的体外扩增和定位诱变，基因的表达等技术。
3. 基因克隆载体通常由病毒、噬菌体和细菌质粒DNA改建而成，并需选择适当微生物作为克隆基因的宿主。微生物为基因操作提供了各种工具酶。
4. 为使外源基因表达，必需在克隆载体中安置宿主细胞控制表达的元件，包括启动子和其调控序列、翻译控制序列和终止信号。或者将外源基因整合到染色体DNA中。基因表达已获得广泛应用。
思 考 题
基因工程的基本操作过程。
基因工程工具酶有那些？
微生物与基因工程的关系如何？
| 课件名称： | 微生物学电子教案 |
| 课件分类： | 生物 |
| 课件类型： | 教学课件 |
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