第十六章 基因工程和蛋白质工程简介
第一节 DNA重组与基因工程
第二节 蛋白质工程简介
第三节 核酸研究技术简介
返回
第一节 DNA重组和基因工程
基因工程亦称遗传工程，即利用 DNA重组技术的方法，把
DNA作为组件，在细胞外将一种外源 DNA（目的基因）和载体
DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使
外源基因 DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（ cloning，
克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物
原有的遗传性状。
一,DNA重组 的技术路线
二,基因工程的应用与前景
三,DNA体外重组常用的酶
DNA重组 的
技术路线
Foreign DNA
to be inserted
Plansmid
vector
Joining
Recombinant
DNA molecule
Introduction into host
cells by transformation of
viral infection
Host chromateme
Slection for cells
coteining a recombinant
DNA molecule
Cloning
+
1、目的基因的制备
2,载体 的构建
3、目的基因与载体
的重组
4、重组 体 导入 宿主
细胞进行扩增
5,克隆基因的鉴定
Ti质粒结构
植物冠瘿瘤
pBR322质粒的结构
以 ?噬菌体为载体进
行 DNA克隆
?DNA
用限制性内切酶
除去中间一段
与外源 DNA连接
重组载体的体外包装
带有外源 DNA的
?噬菌体
太小不能被包装
头部前体
多联体
DNA
A蛋白
COS
COS COS
成熟的颗粒
在宿主细胞内进行
DNA的装配过程
?噬菌体感染大肠杆菌的途径
DNA重组体的筛选
? 载体特征的直接筛选
? 菌落的原位杂交
? 免疫学方法
pBR322质粒结构
如果外源 DNA
插入，氨卞青霉
素抗性基因失活
如果外源 DNA
插入，四环素抗性
基因失活
原位杂交法筛选
DNA重组体 图解
复印至硝酸
纤维素膜上
用 NaOH菌体裂
解 DNA变性
杂交
放射自显影
32P-cDNA
与放射性 cDNA杂
交的菌落的斑点
细菌菌落
单链 DNA结
合到膜上
Southern
印迹法
DNA分子
限制片段 限制性酶切割
琼脂糖电泳
转移至硝酸纤维素膜上
与放射性标记
DNA探针杂交
放射自显影
带有 DNA片
段的凝胶
凝胶
滤膜
用缓冲液
转移
DNA
吸附有 DNA
片段的膜
Southern和 Western印迹法
DNA frangment Electrophoresis
Transfer of
DNA by
blotting
32P-labled
DNA probe
Autoradiography
Agarrose gel Autoradiogram Nitrocellulose
sheet
Autoradiogram Polymer
sheet SDS-Polyacrylamide gel
Transfer
protein
Add radiolabled
spesfic antibody
,Wash to
remove unboud
antibody
Protein band detected by
specific antibody Autoradiography
DNA重组技术的应用
(1) 开辟生物学研究的新纪元
?反向生物学（ invese biology）的诞生
（ 2）促进生物技术产业的兴起
?基因药物
?基因诊断和治疗
?转基因动植物
胰岛素原的人工合成
胰脏
(A)n
胰岛素原 mRNA cDNA 重组质粒 转化细菌
mRNA
反转录酶
胰岛素原基因
与质粒
连接
感染
E.coli
胰岛素原
Ti
质
粒
为
载
体
的
植
物
基
因
工
程
I 二元载体系统
II 共整合 载体
III T-DNA的转移与整合
Ti辅助质粒 Ti辅助 DNA给体质粒
Ti辅助 DNA
给体质粒
pBR型质粒
（ 给体质粒）
宿主特
异性
外源基因
宿主特
异性
整合
带有外源基因
的 Ti质粒 植物 DNA
Ti质粒转移并
插入植物 DNA
第二节 蛋白质工程简介
?蛋白质 技术和核酸技术的相互增强
在广泛利用自然界存在的各种蛋白质的过程中发现。这些蛋
白质只是适应生物自身的需要，而对于它们的产业化开发往往
并不合意，需要加以改造。 1983年美国基因公司的 Ulmer首先提
出蛋白质工程这个名词，它是指按照特定的需要，对蛋白质进
行分子设计和改造的工程。自此之后，蛋白质工程迅速发展，
生物工程的重要组成部分。
蛋白质工程首先是以蛋白质的结构为基础，通过蛋白质一级
结构、晶体结构和溶液构象的研究，积累成千上万蛋白质一级
结构和高级结构的数据资料,然后按照蛋白质形成的规律，经
周密的分子设计，改造蛋白质或构建新的蛋白质。
研究得多，取得成果最显著的是生物技术药（激素、细胞
因子、酶、酶的激活剂、受体和配体、细胞毒素和杀菌肽以
及抗体等）和工业用酶的 蛋白质工程 。
生物酶工程示意图
酶的蛋白质结构功能 新酶分子蓝图 选择性修饰方案
突变酶
新酶
克隆酶
产品
效用
发
展 酶基因
遗传设计
遗传修饰
DNA重组
技术
DNA重组
技术
蛋白质技术和核酸技术的相互增强
插入表达载
体
转化寄主细
胞
推导出
AA顺序 制备合成肽 制备对所编码蛋白 专一的抗体 基因或cDNA
蛋白质
蛋白质
测定出
AA顺序
合成 cDNA
探针
制备专一的抗体 沉淀核糖体分离 mRNA
用 Southern印迹法
筛选 DNA文库
基因或
cDNA
第三节 核酸研究技术简介
一,DNA序列测定
二, 基因文库与 cDNA文库
三, 聚合酶链式反应 （ polymerase chain reaction,PCR）
DNA测序的基本战略
设法产生带标记的不同长度的成套 DNA
片段, 各带有标记的片段起点相同, 终点不
同, 使待测的 DNA链中的相应每个核苷酸处
都有断裂或终止 。 通过 PAGE电泳, 能够将相
差一个核苷酸的 DNA片段分开, 放射自显影
后, 根据长短排列, 根据特定末端碱基的
DNA片段就可读出待测 DNA的碱基序列 。
?酶法 ?化学法 ?测序技术进展
酶
法
序
列
分
析
的
原
理
酶
反
应
电
泳
方
向
模板 CCGGTAGCAACT 3′ 5′
GG 5′ 3′ 引物
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
+ddATP
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
+ddTTP
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
+ddGTP
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
+ddCTP
GGCCA
GGCCATCGTTGA
GGC
GGCC
GGCCATC
GGCCATCGTTG
GGCCATCG GGCCAT GGCCATCGT
GGCCATCGTT
A C G T
AG
TT
GC
TA
CC
3′
5′
TC
AA
CG
AT
GG
5′
3′
读出模板
互补序列
读出模板
序列
GGCCATCGTTGA
GGCCATCGT
GGCCATCGTTG
GGCCATCGTT
GGCCATCG
GGCCATC
GGCCA
GGCCAT
GGCC
GGC
DNA的
Sanger
测序法
(酶法 )
读出模板
互补序列
dNTP
凝胶电泳
较大片段
较小片段
ddGTP ddATP ddCTP ddTTP
反应混合物
Klenow酶
未知序列的单链 DNA
读出待测
序列
CTGACTTCGACAAAGAA 5′ 3′
放射性标记的引物 TGTT
A C T G
ddG
ddG
ddG
ddG
GA
CT
GA
AG
CT
GT
T
3′
5′
CT
GA
CT
TC
GA
CA
A
5′
3′
DNA的测序仪示意图
computer
analysis
凝胶中 DNA移动方向
样品槽
激光器
输入光学系统
成象透镜
聚焦透镜
高灵敏度相机
旋光镜 /棱镜组件
DNA的化学测序示意图
反应试剂
G反应：硫酸二甲酯
G+A反应：甲酸
T+C反应：肼
C反应,NaCl+肼
测序技术进展
同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳
多色荧光标记
毛细管电泳
单色荧光标记
平板电泳
同位素标记
平板电泳
A C G T A C G T
测序图谱
T A TTG CAT TG TC TGCATTG T C T
引物标记法测序 (Dye Primer)
一个样本,4个反应。 4个反应中引物序列相同，但分别标记有不同颜色的荧光。
+ AmpliTaq FS enzyme dCTP,dATP,dGTP,dTTP
ddATP (terminator)
+ AmpliTaq FS enzyme dCTP,dATP,dGTP,dTTP
ddCTP
+ AmpliTaq FS enzyme dCTP,dATP,dGTP,dTTP
ddGTP
+ AmpliTaq FS enzyme dCTP,dATP,dGTP,dTTP
ddTTP
反应结束后
，将 4管反应液
混合，经乙醇沉
淀后上样
终止法测序 (Dye Terminator)
一个样本,1个反应。反应中包含分别带 4色荧光标记的 ddNTP(终止子 )
unlabeled primer
template DNA
+
AmpliTaq FS
dATP,dCTP,dGTP,dTTP
ddCTP
ddATP
ddGTP
ddTTP
测序反应结束后，采用乙醇沉淀法进
行纯化，除去过量的 ddNTP后上样。
三．基因文库与 cDNA文库
1,基因文库 （ genomic library）
cDNA文库 （ complemental DNA library）
2, 文库的构建
基因文库
基因文库是指整套由基因组 DNA片段插入克隆载体获得的
分子克隆之总和。应用 DNA重组技术，可以将各种生物体全部
基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定重组体中，以
备需要时应用。好象将文献资料贮存于图书馆一样，所以称其
为 genomic library。
基因文库中应包含多少 DNA克隆才能使任意所需要的基
因以极高的概率存在于该文库中？其计算公式如下,
N=ln(1-p)/ln(1-f)
N ? 基因文库所包含克隆的数目；
p ? 任意所需基因存在于基因文库中的概率，要求大于
99%；
f ? 克隆的 DNA片段大小（ bp） 占基因组大小 (bp)的分数。
cDNA文库
真核细胞基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外
显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经 RNA转录后加工过程才使
编码序列拼接在一起。真核生物基因不能在原核生物中表达，只有将加
工成熟的 mRNA反转录成 cDNA （ complemental DNA）接上原核生物表
达控制元件，才能在原核生物中表达。再有，真核生物的基因通常只有
一小部分进行表达，由于 mRNA的不稳定性，对基因表达和有关 mRNA
都通常通过对其 cDNA来进行研究的。将细胞全部 mRNA反转录成 cDNA
并被克隆的总和称为 cDNA文库。 RNA病毒的基因组是 RNA，也必须将
RNA先转录成 cDNA，再建立文库。
为使低丰度的 mRNA的 cDNA克隆存在的概率大于 99%,cDNA文库
应含的克隆数的计算公式如下,
N=ln(1-p)/ln(1-1/n)
N? cDNA文库所包含克隆的数目；
p ? 低丰度 cDNA存在于基因文库中的概率，要求其大于 99%；
1/n ? 每一种 低丰度的 mRNA占总 mRNA的分数。
基因文库和 cDNA文库的建立
组织
可克隆之 DNA
载体
DNA
cDNA
mRNA
部分或完全
酶解 DNA
DNA长度分级 甲基化，双链接头 DNA
DNA与载体连接
引入大肠杆菌
鉴定文库的滴度和特性
扩增后供
长期储存
筛选出所需
要的克隆
噬
菌
体
为
载
体
的
基
因
文
库
的
构
建
四、聚合酶链式反应（ PCR）
1985年 Mullis发明 PCR（ polymerase chain reaction） 快速扩增
DNA的方法。该法模仿体内 DNA的复制过程，首先使 DNA变性，两
条链解开，然后使引物模板退火，二者碱基配对,DNA聚合酶随即以
4种 dNTP为底物，在引物的引导下合成与模板互补的 DNA新链。重复
此过程,DNA以指数方式扩增。扩增的公式为,
Y=(1+X)n
式中 y一产量 ;
X--扩增效率 ;
n一循环次数。
（ 2） PCR的应用
（ 1） PCR的原理
PCR技术 原理 示意图
靶序列
变性和引
物复姓
循环 1
循环 2
循环 3
变性和引
物复姓
链延伸
Tag酶
链延伸
PCR技术的发展与应用
?用于合成特异探针；
?用于 DNA的测序；
? 将逆转录与 PCR相偶联 （ RT-PCR）；
?用于基因定位诱变；
?末知序列的 PCR扩增；
?基因组序列的比较研究；
?用于临床诊断。
DNA芯片 (DNA chip)技术是采用寡核苷酸原位合成或显微打印手
段，将数以万计的 DNA探针片段有序地固化于支持物表面上，产生二
维 DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，反应结果通过检测杂
交信号的方法（同位素法、化学荧光法、化学发光法或酶标法）显示，
再用精密的扫描仪或 CCD摄象技术记录，通过计算机软件分析，综合
成可读的 IC总信息，来实现对生物样品的快速、并行、高效地检测或诊
断。
芯片分析实际上也是传感器分析的组合。芯片阵列中的每一个单元
微点都是一个传感器的探头，所以传感器技术的精髓往往都被用于芯片
的发展。阵列检测可以大大提高检测效率，减少工作量，增加可比性，
所以芯片技术也是传感器技术的发展。
DNA芯片技术简介
DVA芯片工作示意图
emission
Laser 1 Laser 2
computer
analysis
DNA clones test
reverse
transcription
Label with
fluor dyes PCR
amplification
purfication
hybridize target
to microarray
robotic
printing
reference
第一节 DNA重组与基因工程
第二节 蛋白质工程简介
第三节 核酸研究技术简介
返回
第一节 DNA重组和基因工程
基因工程亦称遗传工程，即利用 DNA重组技术的方法，把
DNA作为组件，在细胞外将一种外源 DNA（目的基因）和载体
DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使
外源基因 DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（ cloning，
克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物
原有的遗传性状。
一,DNA重组 的技术路线
二,基因工程的应用与前景
三,DNA体外重组常用的酶
DNA重组 的
技术路线
Foreign DNA
to be inserted
Plansmid
vector
Joining
Recombinant
DNA molecule
Introduction into host
cells by transformation of
viral infection
Host chromateme
Slection for cells
coteining a recombinant
DNA molecule
Cloning
+
1、目的基因的制备
2,载体 的构建
3、目的基因与载体
的重组
4、重组 体 导入 宿主
细胞进行扩增
5,克隆基因的鉴定
Ti质粒结构
植物冠瘿瘤
pBR322质粒的结构
以 ?噬菌体为载体进
行 DNA克隆
?DNA
用限制性内切酶
除去中间一段
与外源 DNA连接
重组载体的体外包装
带有外源 DNA的
?噬菌体
太小不能被包装
头部前体
多联体
DNA
A蛋白
COS
COS COS
成熟的颗粒
在宿主细胞内进行
DNA的装配过程
?噬菌体感染大肠杆菌的途径
DNA重组体的筛选
? 载体特征的直接筛选
? 菌落的原位杂交
? 免疫学方法
pBR322质粒结构
如果外源 DNA
插入，氨卞青霉
素抗性基因失活
如果外源 DNA
插入，四环素抗性
基因失活
原位杂交法筛选
DNA重组体 图解
复印至硝酸
纤维素膜上
用 NaOH菌体裂
解 DNA变性
杂交
放射自显影
32P-cDNA
与放射性 cDNA杂
交的菌落的斑点
细菌菌落
单链 DNA结
合到膜上
Southern
印迹法
DNA分子
限制片段 限制性酶切割
琼脂糖电泳
转移至硝酸纤维素膜上
与放射性标记
DNA探针杂交
放射自显影
带有 DNA片
段的凝胶
凝胶
滤膜
用缓冲液
转移
DNA
吸附有 DNA
片段的膜
Southern和 Western印迹法
DNA frangment Electrophoresis
Transfer of
DNA by
blotting
32P-labled
DNA probe
Autoradiography
Agarrose gel Autoradiogram Nitrocellulose
sheet
Autoradiogram Polymer
sheet SDS-Polyacrylamide gel
Transfer
protein
Add radiolabled
spesfic antibody
,Wash to
remove unboud
antibody
Protein band detected by
specific antibody Autoradiography
DNA重组技术的应用
(1) 开辟生物学研究的新纪元
?反向生物学（ invese biology）的诞生
（ 2）促进生物技术产业的兴起
?基因药物
?基因诊断和治疗
?转基因动植物
胰岛素原的人工合成
胰脏
(A)n
胰岛素原 mRNA cDNA 重组质粒 转化细菌
mRNA
反转录酶
胰岛素原基因
与质粒
连接
感染
E.coli
胰岛素原
Ti
质
粒
为
载
体
的
植
物
基
因
工
程
I 二元载体系统
II 共整合 载体
III T-DNA的转移与整合
Ti辅助质粒 Ti辅助 DNA给体质粒
Ti辅助 DNA
给体质粒
pBR型质粒
（ 给体质粒）
宿主特
异性
外源基因
宿主特
异性
整合
带有外源基因
的 Ti质粒 植物 DNA
Ti质粒转移并
插入植物 DNA
第二节 蛋白质工程简介
?蛋白质 技术和核酸技术的相互增强
在广泛利用自然界存在的各种蛋白质的过程中发现。这些蛋
白质只是适应生物自身的需要，而对于它们的产业化开发往往
并不合意，需要加以改造。 1983年美国基因公司的 Ulmer首先提
出蛋白质工程这个名词，它是指按照特定的需要，对蛋白质进
行分子设计和改造的工程。自此之后，蛋白质工程迅速发展，
生物工程的重要组成部分。
蛋白质工程首先是以蛋白质的结构为基础，通过蛋白质一级
结构、晶体结构和溶液构象的研究，积累成千上万蛋白质一级
结构和高级结构的数据资料,然后按照蛋白质形成的规律，经
周密的分子设计，改造蛋白质或构建新的蛋白质。
研究得多，取得成果最显著的是生物技术药（激素、细胞
因子、酶、酶的激活剂、受体和配体、细胞毒素和杀菌肽以
及抗体等）和工业用酶的 蛋白质工程 。
生物酶工程示意图
酶的蛋白质结构功能 新酶分子蓝图 选择性修饰方案
突变酶
新酶
克隆酶
产品
效用
发
展 酶基因
遗传设计
遗传修饰
DNA重组
技术
DNA重组
技术
蛋白质技术和核酸技术的相互增强
插入表达载
体
转化寄主细
胞
推导出
AA顺序 制备合成肽 制备对所编码蛋白 专一的抗体 基因或cDNA
蛋白质
蛋白质
测定出
AA顺序
合成 cDNA
探针
制备专一的抗体 沉淀核糖体分离 mRNA
用 Southern印迹法
筛选 DNA文库
基因或
cDNA
第三节 核酸研究技术简介
一,DNA序列测定
二, 基因文库与 cDNA文库
三, 聚合酶链式反应 （ polymerase chain reaction,PCR）
DNA测序的基本战略
设法产生带标记的不同长度的成套 DNA
片段, 各带有标记的片段起点相同, 终点不
同, 使待测的 DNA链中的相应每个核苷酸处
都有断裂或终止 。 通过 PAGE电泳, 能够将相
差一个核苷酸的 DNA片段分开, 放射自显影
后, 根据长短排列, 根据特定末端碱基的
DNA片段就可读出待测 DNA的碱基序列 。
?酶法 ?化学法 ?测序技术进展
酶
法
序
列
分
析
的
原
理
酶
反
应
电
泳
方
向
模板 CCGGTAGCAACT 3′ 5′
GG 5′ 3′ 引物
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
+ddATP
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
+ddTTP
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
+ddGTP
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
+ddCTP
GGCCA
GGCCATCGTTGA
GGC
GGCC
GGCCATC
GGCCATCGTTG
GGCCATCG GGCCAT GGCCATCGT
GGCCATCGTT
A C G T
AG
TT
GC
TA
CC
3′
5′
TC
AA
CG
AT
GG
5′
3′
读出模板
互补序列
读出模板
序列
GGCCATCGTTGA
GGCCATCGT
GGCCATCGTTG
GGCCATCGTT
GGCCATCG
GGCCATC
GGCCA
GGCCAT
GGCC
GGC
DNA的
Sanger
测序法
(酶法 )
读出模板
互补序列
dNTP
凝胶电泳
较大片段
较小片段
ddGTP ddATP ddCTP ddTTP
反应混合物
Klenow酶
未知序列的单链 DNA
读出待测
序列
CTGACTTCGACAAAGAA 5′ 3′
放射性标记的引物 TGTT
A C T G
ddG
ddG
ddG
ddG
GA
CT
GA
AG
CT
GT
T
3′
5′
CT
GA
CT
TC
GA
CA
A
5′
3′
DNA的测序仪示意图
computer
analysis
凝胶中 DNA移动方向
样品槽
激光器
输入光学系统
成象透镜
聚焦透镜
高灵敏度相机
旋光镜 /棱镜组件
DNA的化学测序示意图
反应试剂
G反应：硫酸二甲酯
G+A反应：甲酸
T+C反应：肼
C反应,NaCl+肼
测序技术进展
同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳
多色荧光标记
毛细管电泳
单色荧光标记
平板电泳
同位素标记
平板电泳
A C G T A C G T
测序图谱
T A TTG CAT TG TC TGCATTG T C T
引物标记法测序 (Dye Primer)
一个样本,4个反应。 4个反应中引物序列相同，但分别标记有不同颜色的荧光。
+ AmpliTaq FS enzyme dCTP,dATP,dGTP,dTTP
ddATP (terminator)
+ AmpliTaq FS enzyme dCTP,dATP,dGTP,dTTP
ddCTP
+ AmpliTaq FS enzyme dCTP,dATP,dGTP,dTTP
ddGTP
+ AmpliTaq FS enzyme dCTP,dATP,dGTP,dTTP
ddTTP
反应结束后
，将 4管反应液
混合，经乙醇沉
淀后上样
终止法测序 (Dye Terminator)
一个样本,1个反应。反应中包含分别带 4色荧光标记的 ddNTP(终止子 )
unlabeled primer
template DNA
+
AmpliTaq FS
dATP,dCTP,dGTP,dTTP
ddCTP
ddATP
ddGTP
ddTTP
测序反应结束后，采用乙醇沉淀法进
行纯化，除去过量的 ddNTP后上样。
三．基因文库与 cDNA文库
1,基因文库 （ genomic library）
cDNA文库 （ complemental DNA library）
2, 文库的构建
基因文库
基因文库是指整套由基因组 DNA片段插入克隆载体获得的
分子克隆之总和。应用 DNA重组技术，可以将各种生物体全部
基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定重组体中，以
备需要时应用。好象将文献资料贮存于图书馆一样，所以称其
为 genomic library。
基因文库中应包含多少 DNA克隆才能使任意所需要的基
因以极高的概率存在于该文库中？其计算公式如下,
N=ln(1-p)/ln(1-f)
N ? 基因文库所包含克隆的数目；
p ? 任意所需基因存在于基因文库中的概率，要求大于
99%；
f ? 克隆的 DNA片段大小（ bp） 占基因组大小 (bp)的分数。
cDNA文库
真核细胞基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外
显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经 RNA转录后加工过程才使
编码序列拼接在一起。真核生物基因不能在原核生物中表达，只有将加
工成熟的 mRNA反转录成 cDNA （ complemental DNA）接上原核生物表
达控制元件，才能在原核生物中表达。再有，真核生物的基因通常只有
一小部分进行表达，由于 mRNA的不稳定性，对基因表达和有关 mRNA
都通常通过对其 cDNA来进行研究的。将细胞全部 mRNA反转录成 cDNA
并被克隆的总和称为 cDNA文库。 RNA病毒的基因组是 RNA，也必须将
RNA先转录成 cDNA，再建立文库。
为使低丰度的 mRNA的 cDNA克隆存在的概率大于 99%,cDNA文库
应含的克隆数的计算公式如下,
N=ln(1-p)/ln(1-1/n)
N? cDNA文库所包含克隆的数目；
p ? 低丰度 cDNA存在于基因文库中的概率，要求其大于 99%；
1/n ? 每一种 低丰度的 mRNA占总 mRNA的分数。
基因文库和 cDNA文库的建立
组织
可克隆之 DNA
载体
DNA
cDNA
mRNA
部分或完全
酶解 DNA
DNA长度分级 甲基化，双链接头 DNA
DNA与载体连接
引入大肠杆菌
鉴定文库的滴度和特性
扩增后供
长期储存
筛选出所需
要的克隆
噬
菌
体
为
载
体
的
基
因
文
库
的
构
建
四、聚合酶链式反应（ PCR）
1985年 Mullis发明 PCR（ polymerase chain reaction） 快速扩增
DNA的方法。该法模仿体内 DNA的复制过程，首先使 DNA变性，两
条链解开，然后使引物模板退火，二者碱基配对,DNA聚合酶随即以
4种 dNTP为底物，在引物的引导下合成与模板互补的 DNA新链。重复
此过程,DNA以指数方式扩增。扩增的公式为,
Y=(1+X)n
式中 y一产量 ;
X--扩增效率 ;
n一循环次数。
（ 2） PCR的应用
（ 1） PCR的原理
PCR技术 原理 示意图
靶序列
变性和引
物复姓
循环 1
循环 2
循环 3
变性和引
物复姓
链延伸
Tag酶
链延伸
PCR技术的发展与应用
?用于合成特异探针；
?用于 DNA的测序；
? 将逆转录与 PCR相偶联 （ RT-PCR）；
?用于基因定位诱变；
?末知序列的 PCR扩增；
?基因组序列的比较研究；
?用于临床诊断。
DNA芯片 (DNA chip)技术是采用寡核苷酸原位合成或显微打印手
段，将数以万计的 DNA探针片段有序地固化于支持物表面上，产生二
维 DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，反应结果通过检测杂
交信号的方法（同位素法、化学荧光法、化学发光法或酶标法）显示，
再用精密的扫描仪或 CCD摄象技术记录，通过计算机软件分析，综合
成可读的 IC总信息，来实现对生物样品的快速、并行、高效地检测或诊
断。
芯片分析实际上也是传感器分析的组合。芯片阵列中的每一个单元
微点都是一个传感器的探头，所以传感器技术的精髓往往都被用于芯片
的发展。阵列检测可以大大提高检测效率，减少工作量，增加可比性，
所以芯片技术也是传感器技术的发展。
DNA芯片技术简介
DVA芯片工作示意图
emission
Laser 1 Laser 2
computer
analysis
DNA clones test
reverse
transcription
Label with
fluor dyes PCR
amplification
purfication
hybridize target
to microarray
robotic
printing
reference
