三、填空题 1.RNA是由核糖核苷酸通过 键连接而成的一种 。几乎所有的 RNA都是由 DNA 而来，因此，序列和其中一条链 。 2.多数类型的RNA是由加工 产生的，真核生物前体tRNA的 包 括 的切除和 的拼接。随着 和 端的序列切除，3’端加上了序列 。在四膜虫中，前体tRNA 的切除和 的拼接是通过 机制进行的。 3.RNase P是一种 ，含有 作为它的活性部位，这种酶在 序 列的 切割 。 4.Cot1／2实验测定的是 。 5.假定摆动假说是正确的，那么最少需要 种tRNA来翻译61种氨基酸密码子。 6.写出两种合成后不被切割或拼接的RNA： 和 。 7.在 DNA合成中负责复制和修复的酶是 。 8.染色体中参与复制的活性区呈Y型结构，称为 。 9.在 DNA复制和修复过程中修补 DNA螺旋上缺口的酶称为 。 10. 在 DNA复制过程中，连续合成的子链称 ，另一条非连续合成的子链称为 。 11. 如果 DNA聚合酶把一个不正确的核苷酸加到3’末端，—个含3’→5’活性的独立催化区会将这个错配碱基切去。这个催化区称为 酶。 12. DNA后随链合成的起始要一段短的 ，它是由 以核糖核苷酸为底物合成的 。 13. 复制叉上DNA双螺旋的解旋作用由 催化的，它利用来源于ATP水解产生的能量沿 DNA链单向移动。 14.帮助 DNA解旋的 与单链DNA结合，使碱基仍可参与模板反应。 15. DNA引发酶分子与 DNA解旋酶直接结合形成一个 单位，它可在复制叉上沿后随链下移，随着后随链的延伸合成 RNA引物。 16. 如果 DNA聚合酶出现错误，会产生一对错配碱基，这种错误可以被一个通过甲基化作用来区别新链和旧链的特别 系统进行校正。 17. 对酵母、细菌以及几种生活在真核生物细胞中的病毒来说，都可在 DNA独特序列 处观察到复制泡的形成。 18. 可被看成一种可形成暂时单链缺口(Ⅰ型)或暂时双链缺口(Ⅱ型)的可逆核酸酶。 19. 在大肠杆菌中发现了 种 DNA聚合酶。 DNA修复时需要 DNA聚合酶 。 20.真核生物中有5种DNA聚合酶。它们是：(l) (2) (3) (4) (5) 。 21. 在 DNA修复过程中，需要第二种酶， ，作用是将 DNA中相邻的碱基 起来。 DNA聚合酶具有外切核酸酶的活性。有两种外切核酸酶的活性，它们分别从 和 降解 DNA。DNA聚合酶 只有 外切核酸酶活性。 22. 只有真核 DNA聚合酶 和 显示 外切核酸酶活性。 23.DNA大多数自发变化都会通过称之为 的作用很快被校正。仅在极少情况下，DNA将变化的部分保留下来导致永久的序列变化，称为 。 24.偶然情况下，在同一基因两个稍微不同拷贝(等位基因)间发生重组的过程中，一个等位基因经过 过程会被另一等位基因代替。 25.通过 基因重组，游动 DNA序列和一些病毒可进入或离开一条目的染色体。 26.DNA修复包括3个步骤： 酶对 DNA链上不正常碱基的识别与切除， 酶对已切除区域的重新合成， 酶对剩下切口的修补。 27.一种主要的 DNA修复途径称 ，包括一系列 酶，它们都能识别并切去 DNA上不正常碱基。 28. 途径可以切去任何造成 DNA双螺旋大片段改变的 DNA损伤。 29. 大肠杆菌中，任何由于 DNA损伤造成的 DNA复制障碍都会诱导 的信号，即允许跨过障碍进行复制，给细胞一个生存的机会。 30. 在 中，基因交换发生在同源 DNA序列间，最常见是发生在同一染色体的两个拷贝间。 31. 在交换区域，一个 DNA分子的一条链与另一个 DNA分子的一条链相互配对，在两个双螺旋间形成一个 。 32. 通过 ，两个单链的互补 DNA分子一起形成一个完全双链螺旋，人们认为这个反应从一个慢的 步骤开始。 33. 大肠杆菌的染色体配对需要 ；它与单链 DNA结合并使同源双链 DNA与之配对。 34. 一般性重组的主要中间体是 ，也用它的发现者名字命名为 。 35. 产生单个碱基变化的突变叫 突变，如果碱基的改变产生一个并不改变氨基酸残基编码的 ，并且不会造成什么影响，这就是 突变。如果改变了氨基酸残基的密码，这就是 突变。这种突变对蛋白质功能影响程度要根据被改变的氨基酸残基在蛋白质 或 结构中的重要程度，或是与酶的 的密切性来决定，活性变化范围可从 到接近正常。 36. 一种由于蛋白质序列中丢失了 残基引起的突变将会阻止 的形成，这种蛋白质更容易 。如果在 温度是稳定的而在 温度是不稳定的，将它称为 突变，是 突变的一个例子。 37. 无义突变是将一种氨基酸的 转变成 密码子，结果使蛋白质链 。一个碱基的插入或 叫 突变。由于三联 的移动，突变位置 的整个氨基酸序列都会被改变。上述两种类型的突变(插入和缺失)所产生的蛋白质同 的不同，通常是完全 。 38. 下面所列的是由突变而产生的一些异常表型(A)，同时也列出了表型由突变而造成的缺陷的可能原因(B)。请尽可能地将 A项所列的异常表型同 B项所列的可能原因配对。 A 异常表型： B 缺陷可能出现在： (a)细菌的营养缺陷型 (t)合成途径 (b)细菌温度敏感突变体 (u)降解途径 (c)细菌的诱导酶变成组成酶 (v)DNA的修复 (d)果蝇的红眼变成白眼 (w)转录控制 (e)果蝇形成两个胸节 (x)细胞分裂控制 (f)人的镰刀状细胞贫血症 (y)胚胎发育控制 (g)人的原卟啉症 (z)蛋白质的稳定性 (h)人着色性干皮病 (i)苯丙酮尿症 (j)人肿瘤的发生 39.下面各句是对不同诱变剂作用的叙述，写出相应情况的诱变剂的名称： (1)通过同双螺旋的结合，引起变构，并激活修复性内切核酸酶的诱变剂是： 。 (2)引起总染色体的损伤如断裂和转位的诱变剂是： 。 (3)取代正常的碱基而掺人到 DNA中，并通过互变异构引起复制错误的诱变剂是： 。 (4)只能够除去胞嘧啶和甲基胞嘧啶的氨基基团的诱变剂是： 。 (5)主要是引起同一条链上的相邻嘧啶间的交联的诱变剂是： 。 (6)主要是在 DNA双螺旋的形变和链的错排过程中引起插入或缺失的诱变剂是： 。 (7)可以除去 DNA中任何一个带有氨基基团的碱基上氨基基团的诱变剂是： 。 40. 据估计，单倍体人基因组包括50O00个基因，如果每个世代每个基因的突变率为5×10—5，那么，每个个体中存在 刚产生的突变。 41. DNA中两种常见的自发突变是由于腺嘌呤、鸟嘌呤与脱氧核糖间的N-糖基连接断裂而导致的 和使胞嘧啶变为尿嘧啶而导致的 。 42．能够诱导操纵子但不是代谢底物的化合物称为 诱导物。能够诱导乳糖操 纵子的化合物 就是其中一例。这种化合物同 蛋白质结合，并使之与 分离。乳糖操纵子的体内功能性诱导物是 。 43.色氨酸是一种调节分子，被视为 。它与一种蛋白质结合形成 。 乳糖操纵子和色氨酸操纵于是两个 控制的例子。 cAMP—CAP蛋白通过 控制起作用。色氨酸操纵子受另一种系统一的调控，它涉及到第一个结构基因被转录前的转录 。 44.负责把RNA转录成互补 DNA分子的 酶可以解释由 引起的永久性基因转变。 45.利用自已的位点专一重组酶把自己从寄主基因组中的一个地方移到另一地方的遗传元件叫 ，也叫作 。 46.酵母的 Tyl元件是一种 ，它的转座需一段完整RNA转录物的合成，这个转录物又被复制成一个双螺旋 DNA，随后被整合到一个新的染色体位置。 47.真核生物的mRNA加工过程中，5’端加上 ，在3’端加上 ，后者由 催化。如果被转录基因是不连续的，那么， 一定要被切除，并通过 过程将 连接在一起。这个过程涉及许多RNA分子，如Ul和U2等，它们被统称为 。它们分别与一组蛋白质结合形成 ，并进一步地组成40S或60S的结构，叫 。 48.胶原蛋白通过在不同的脯氨酸残基上添加 基团而被化学修饰。这个反应是由两种酶催化的，它们是 和 。其他的一些蛋白质被 磷酸化。蛋白质上添加寡聚糖的过程叫 ，而添加脂肪酸链则叫 。O—寡聚糖是一种同 或 残基上氧连接的寡聚糖，而 N—寡聚糖是通过与 上的氮原子连接而成。N—寡 聚糖又是从同一种叫做 脂的前体寡聚糖衍生而来。 49. 阿黑皮素原是 被切割以后可以产生很多活性蛋白质的一个例子。如 之类的RNA病毒也能合成类似的结构物。蛋白水解过程也涉及细胞外毒素的活性，如蜜蜂的 和动物激素的活性，如 和 。 50. 可使每个氨基酸和它相对应的tRNA分子相偶联形成一个 分子。 51. 包括两个tRNA分子的结合位点： ，即 P位点，紧密结合与多肽链延伸尾端连接的 tRNA分子，和 ，即 A位点，结合带有一个氨基酸的tRNA分子。 52． 催化肽键的形成，一般认为这个催化反应是由核糖体大亚基上 的 分子介导的。 53．释放因子蛋白与核糖体上 A位点的 密码结合，导致肽基转移酶水解连接新生多肽与tRNA分子的化学键。 54．任何mRNA序列能以三种 的形式被翻译，而且每一种都对应一种完全不同的多肽链。 55．蛋白质合成的起始过程很复杂，包括一系列被 催化的步骤。 56．在所有细胞中，都有一种特别的 识别 密码子 AUG，它携带一种特别的氨基酸，即 ，作为蛋白质合成的起始氨基酸。 57．核糖体沿着 mRNA前进，它需要另一个延伸因子 ，这一步需要 的水解。当核糖体遇到终止密码( 、 、 )的时候，延长作用结束，核糖体和新合成的多肽被释放出来。翻译的最后一步被称为 ，并且需要—套 因子。 58.基因工程是 年代发展起来的遗传学的一个分支学科。基因工程技术的诞生，使人们从简单地利用现存的生物资源进行诸如发酵、酿酒、制醋和酱油等传统的生物技术时代，走向 的时代。 59.随着基因工程技术的诞生和发展，人类可以通过 、 和 三种主要生产方式，大量取得过去只能从组织中提取的珍稀蛋白，用于研究或治病。 60. Cohen等在 年构建了第一个有功能的重组 DNA分子。 61.基因工程的两个基本特点是：(1) ，(2) 。 62.基因克隆中三个基本要点是： ； 和 。 63. 年，美国斯坦福大学 等 上在发表了题为： “将新的遗传信息插入SV40病毒 DNA的生物化学方法：含有λ噬菌体基因和E.coli半乳糖操纵子的环状 SV40 DNA”的论文，标志着基因工程技术的诞生。这一工作具有划时代的意义，但是他们并没有 。 64.克隆基因的主要目的有四：(1) ；(2) ； (3) ；(4) 。 65.严格地说限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)是指已被证明是 的酶。基因工程中把那些具有识别 内切核酸酶统称为限制性内切核酸酶。 66. 年 Luria和 Human在 T偶数噬菌体对大肠杆菌感染实验中首次发现了细 菌的 现象。 67.1970年，Smith和wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限制酶，能够特异性的切割DNA，这个酶后来被命名为 ，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。 68.通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的 。 69.Ⅱ类限制性内切核酸酶分子量较小．一般在20～40kDa，通常由 亚基所 组成。它们的作用底物为双链 DNA，极少数Ⅱ类酶也可作用于单链 DNA，或DNA／RNA杂合双链。这类酶的专一性强，它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求，而且对更远的碱基也有要求，因此，Ⅱ类酶既具有专一性，也具有 专一性，一般在识别序列内切割。切割的方式有 ，产生末端的 DNA片段或 的 DNA片段。作用时需要作辅助因子，但不需要 和 。 70.完全的回文序列具有两个基本的特点，就是：(1) (2) 。 71.Ⅱ类限制性内切核酸酶一般识别 个碱基，也有识别多序列的限制性内切核酸酶。根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析，限制性内切核酸酶识别序列具有 倾向，即它们在识别序列中含量较高。 72.EcoK是 Ⅰ类限制性内切核酸酶，分子组成是α2β2γ，分子量是300kDa。在这些亚基中，α亚基具有 作用；β亚基具有 的活性；γ亚基的作用则是 。 73.个体之间 DNA限制性片段长度的差异叫 。 74.限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自 ，第二、三两个字母取自 ，第四个字母则用 表示。 75.限制性内切核酸酶 Acy Ⅰ识别的序列是5’－GRCGYG-3’，其中R ， Ｙ 。 76.在酶切反应管加完各种反应物后，需要离心2秒钟，其目的是 和 。 77.部分酶切可采取的措施有：(1) (2) (3) 等。 78.第一个分离的限制性内切核酸酶差异是 ；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是 。 79.限制性内切核酸酶 BsuR Ⅰ和ＨaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是 ， 它们属于 。 80.由于 DNA是由4种碱基组成的，所以任何限制性内切核酸酶的切割频率的理论值应该是 。 81.Sal Ⅰ和 Not Ⅰ都是哺乳动物中识别序列稀有的酶,在哺乳动物基因组的5kb片段中，找到Ｎot Ⅰ切点的概率是 。 82.部分酶切是指控制反应条件，使得酶在 DNA序列上的识别位点只有部分得到切割，它的理论依据是 。 83.Ⅰ类限制酶识别 DNA的位点和切割的 DNA位点是不同的，切割位点的识别结合有两种模型，一种是 ，另一种是 。 84.限制性内切核酸酶通常保存在 浓度的甘油溶液中。 85.连接酶(ligase)是一类用于核酸分子连接形成 键的核酸合成酶，有DNA连接酶和RNA连接酶之分。 86.原核生物主要有两种类型的 DNA连接酶： E．coli DNA连接酶和 T4 DNA连接酶。 基因工程中使用的主要是 T4 DNA连接酶，它是从 T4噬菌体感染的E．coli中分离的一种单链多肽酶，分子量为 kDa，由 T4噬菌体基因 编码。E．coli DNA连接酶是由大肠杆菌基因 编码，也是一条多肽链的单体，分子量为 kDa。这两种 DNA连接酶有两个重要的差异：第一是它们在催化反应中所用的能量来源不同，T4 DNA连接酶用 ，而E．coli DNA连接酶则用 作为能源。第二是它们催化平末端连接的能力不同，在正常情况下只有 T4 DNA连接酶能够连接平末端，E．coli DNA连接酶则不能。即使是调整反应条件，E．coli DNA连接酶催化平末端的连接效率也只有 T4 DNA连接酶的 。 87.DNA连接酶的单位通常用Weiss单位表示，一个Weiss单位是： 。 88.DNA聚合酶Ⅰ是 在1965年从大肠杆菌细胞中分离的，所以又称为 聚合酶。该酶由大肠杆菌基因 编码，是一种单链球蛋白，分子量为109kDa，酶蛋白中含有一个 Zn原子。 89.T4 DNA聚合酶与 Klenow酶一样，具有5’→3’聚合酶和3’→5’外切酶两种活性，但是它的3’→5’外切酶的活性比 Klenow酶强 倍。该酶的3’ →5’外切活性既能作用于单链 DNA也能作用于双链 DNA，不过作用于 链的活性要强于 链。 90.反向转录酶(reverse transcriptase)是由 kDa和 kDa两个亚单位组成的二聚体，作用时以RNA为模板合成 DNA。 91．从小牛胸腺中分离纯化的末端转移酶催化的基本反应是将 ，同时释放出游离的无机磷。催化反应时不需 ，但需要引物，单链 DNA是最好的引物，单链 DNA受体的长度最短需有 个 dNTP。具有3’突出末端的双链 DNA也是较好的反应底物。二价离子和 DNA末端状态对催化反应影响较大，但是用 作为辅助离子，可以催化任何形式的末端(突出的、隐含的、平齐的)加接单核苷酸，但突出的3’端效率较高。以 Mn2+／Mg2+作为辅助因子，只能在单链 DNA或双链 DNA的3’突出端加尾。 92. S1核酸酶(S1 nuclease)是从米曲霉(Aspergilluc oryzae)中分离纯化的一种含 的金属蛋白，分子量为32kDa，是一种耐热的酶(37—65℃)。 93．在 S1保护实验中， S1切割的温度有两种：20℃和45℃，这是因为：在20℃时， ;在45℃时， 。 94. 技术可以用来鉴定 DNA分子中与 DNA结合蛋白相互作用的特定序列。 95.真核生物有两种 DNA连接酶，连接酶Ⅰ主要是参与 ，而连接酶Ⅱ则是参与 。 96．T4RNA连接酶是1972年发现的，并于 1977年纯化。该酶是由 T4噬菌体基因 编码，作用是不需要模板。它在体内的作用是参与 T4噬菌体 不参与 DNA合成的连接，但在 中可能有作用。 97．DNA聚合酶 Ⅰ的Klenow大片段是用 切割 DNA聚合酶Ⅰ得到的分子量为76KDa的大片段，具有两种酶活性：(1) 。 (2) 的活性。 98．反向转录酶除具有以 DNA和RNA为摸板合成 DNA的5’→3’合成酶的活性外，还具有4种酶的活性：(1) ； (2) ； (3) ；(4) 。 99．RNA连接酶作用时除了需要 ATP和 Mg2+外，还需要 。 100．DNA聚合酶 Ⅰ是一种单体酶，分子量为109kDa，它含有金属离子 。 101. 为了防止 DNA的自身环化，可用 脱去双链DNA 。 102．T4单核苷酸激酶进行DNA片段的5’端标记时，主要是通过两种反应即 和 。 103．CIP催化脱磷酸时有两种最适温度，一种是37℃，适用于 端脱磷酸；另一种是56℃，适用于 端脱磷酸。 104. λ外切核酸酶可从双链 DNA的5’端依次切下5’单核背酸，但对不同末端的底物来说，作用效率不同， 最高， 最低。 105．EGTA是 离子螯合剂。 106．测序酶是修饰了的 T7 DNA聚合酶，它只有 酶的活性，而没有 酶的活性。 107．切口移位(nick translation)法标记 DNA的基本原理在于利用 的 和 的作用。 108．欲将某一具有突出单链末端的双链 DNA分子转变成平末端的双链形式，通常可采用 或 。 109．反转录酶除了催化 DNA的合成外，还具有 的作用，可以将 DNA-RNA杂种双链中的 水解掉。 110．基因工程中有3种主要类型的载体： 、 、 。 111．由于不同构型的 DNA插入 EB的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不 同， SC DNA的泳动速度 ，OC DNA泳动速度 ， LDNA居中，通过凝胶电泳和 EB染色的方法可将不同构型的 DNA分别开来。 112．质粒的复制像染色体的复制一样，是从特定的起始点区开始的。然而，质粒的复制可以是 向的、或是 向的。在杂种质粒中，每个复制子的起点都可以有效地加以使用。但是在正常条件下只有一个起点可能居支配地位。并认为：当某些具有低拷贝数的严紧型质粒与松弛性质粒融合后，在正常情况下的复制起点可能被关闭。 113．就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部 分： 、 、 。 另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 114．如果两个质粒不能稳定地共存于同一个寄主细胞中，则属于 群， 这是因为它们的 所致。 115．质粒拷贝数是指细胞中 。 116. 复制子由三部分组成：(1) (2) (3) 。 117．酵母的2μm质粒有 ，可以配对形成哑铃结构。 118．一个带有质粒的细菌在有 EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测不出质粒，这种现象叫 。 119．pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于 ，它的四环素抗性基因来自于 ，它的氨苄青霉素抗性基因来自于 。 120．质粒的消失同染色体基因的突变是不同的，前者不能恢复，后者可以通过 恢复该基因的性状。 121．Co1El质粒复制的起始需要三种酶，即 、 和 。 122．YAC的最大容载能力是 ，BAC载体的最大容载能力是 。 123．pSC101是一种 复制的质粒。 124．把那些没有可检测表型的质粒称为 。 125．转座子主要由下列部分组成：(l) （2） (3) 。 126. pUC18质粒是目前使用较为广泛的载体。 pUC系列的载体是通过 和 两种质粒改造而来。它的复制子来自 ， Amp抗性基因则是来自 。 127.在基因型的表示中，符号Ω表示 ；符号A表示 。 128.噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是 ；二是 。 129.第一个报道的全测序的单链 DNA噬菌体是φX174，DNA长5386个碱基对，共 个 基因，为一环状 DNA分子，基因组的最大特点是 。 130.λ噬菌体的基因组 DNA为 kb，有 多个基因。在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按 复制，成熟包装(晚期复制)则是按 复制。它有一个复制起点，进行 向复制。λ噬菌体的 DNA既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。其原因主要是在λ噬菌体线性DNA分子的两端各有一个 个碱基组成的天然粘性末端。这种粘性末端可以自然成环。成环后的粘性末端部位就叫做 位点。 131.根据噬菌体的包装能力，将野生型λ噬菌体的基因组 DNA改造成插入型载体，该载体的最小分子大小约为 kb，插入的外源片段最大不超过 kb。 132.野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是 和 。 133.粘粒(cosmid)是质粒-噬菌体杂合载体，它的复制子来自 、cos位点序列来自 ，最大的克隆片段达到 kb。 134.有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。从酶切点看，插入型为 个， 取代型为 个。 135.野生型的λ噬菌体 DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。 136.M13单链噬菌体的复制分为三个阶段：(1) （2） (3) 。 137.噬菌粒是由质粒和噬菌体 DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是 ，而来自噬菌体的主要结构是 。 138.M13单链噬菌体基因2和基因4之间的 IG区有三个最重要的功能，即(l) (2) (3) 。 139.野生型的 M13有10个基因，分为三个功能集团，其中与复制有关的两个基因是： 和 。 140.以λ噬菌体载体和粘粒载体构建文库时，起始 DNA的长度是不同的，前者为 kb后者为 kb。 141.λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源 DNA片段后，总的长度应在噬菌体基因组的 的范围内。 142.不同的宿主细胞其核酸酶的活性是不同的，如细菌中的 HB101菌株及 JM系列的宿主菌所含核酸酶的活性比 DHl、 LE392等菌株 。 143. SDS是分离DNA时常用的一种阴离子除垢剂，它有四个作用： (1) ； (2) ； (3) ； (4) 。 144.酚是蛋白变性剂，用酚抽提细胞 DNA时，具有两方面的作用：(1) (2) 。 145.用酚—氯仿抽提 DNA时，通常要在氯仿或酚—氯仿中加少许异戊醇。这是因为：异戊醇 。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含 DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维 持稳定。 146.同其他水解蛋白酶相比，蛋白水解酶 K具有两个显著的优点：(1) (2) 。 147.在分离 DNA时要使用金属离子整合剂，如EDTA和柠檬酸钠等，其目的是 。 148.用乙醇沉淀 DNA时，通常要在DNA溶液中加入单价的阳离子，如 NaCl和 NaAc，其目的是 。 149.浓缩 DNA的方法有：(1) ;(2) ;(3) (4) 。 150.通常可在三种温度下保存 DNA:4～5℃、—20℃、—70℃，其中以 最好。 151.用于分离质粒 DNA的细菌培养浓度达到0.8×109细胞／ml时，即可通过离心收 集菌体。收集菌体使用定角转子，离心的速度以 为宜。 152.引物在基因工程中至少有4个方面的用途：(1) ; (2) ; (3) ;(4) 。 153.Clark发现用Taq DNA聚合酶得到的 PCR反应产物不是平末端，而是有一个突出碱基末端的双链DNA分子。根据这一发现设计了克隆 PCR产物的 。 154.在用 SDS分离 DNA时，要注意 SDS的浓度，0．1％和 l级的 SDS的作用效果是不同的，前者 ，后者 。 155.碱解法和清亮裂解法是分离质粒的两种常用的方法，二者的原理是不同的，前者是根据 ，后者则是根据 。 156.在 DNA分离过程中，通常要进行透析，其目的是 。 157.在分离质粒 DNA的菌体培养过程中，加入氯霉素有两个好处：(1) (2) 。 158.在 DNA分离过程中造成 DNA分子断裂的因素很多，主要有(1) (2) (3) 。 159.在分离 DNA时，常用 法、 法、 法 及 法等方法去除蛋白质。 160.在 DNA保存液中，常加一滴氯仿，主要是起 作用。 161.按照人们的意愿，改变基因中碱基的组成，以达到 的技术称为 。 162.1955年，英国剑桥大学的 第一个合成了具有3’，5’—磷酸二酯键的 TpT和 pTpT，为此获得了 年的诺贝尔奖。 163.可以用 除去 DNA溶液中的氯化绝。 164.在 cDNA的合成中要用到 S1核酸酶，其作用是切除在 。 165.在简并引物的设计中，常常要用到 dI(次黄嘌呤)，原因是 。 166.在分离 DNA时，要戴手套操作，原因是 。 167.乙醇沉淀 DNA的原理是 。 168.简并引物 PCR主要是根据蛋白质的氨基酸序列设计 引物来合成相应的基因。 169.超离心法纯化质粒 DNA时，选用 CsCl作介质的优点是： (1) (2) ，从而使不同分子量的 DNA分子得以分开。 170.缺失突变的原理是缺失了 。 171.用核酸酶 Bal 31作系列缺失突变，得到的产物是： 。 172.SSC是由 NaCl和柠檬酸钠组成的试剂，其中 NaCl的作用是使 ，而柠檬酸钠的作用是 。 173.在重蒸酚中加入0.1％的8—羟基喹啉及少量β-硫基乙醇，不仅可以防止酚的氧化，还可以 的活性及 作用。 174.对于 HB101及其衍生株不宜用煮沸法分离质粒 DNA，其原因是 。 175.克隆策略有三层涵义：(1)第一层是 ； (2)第二层涵义是 ； (3)第三层涵义就是 。 176.假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件： (1) (2) (3) (4) 。 177.现有的基因克隆策略大体上分为三类： 、 、 。 178.受体细胞的感受态是 。 179.DNA重组连接的方法大致分为四种：(1) (2) (3) (4) 。 180.平末端连接法(blunt end ligation)的连接效率比粘性末端连接的效率低得多，所以通常在连接反应体系中适量添加促进大分子凝聚的凝聚剂，以提高平末端 DNA连接的效率。常用的凝聚剂是 。 181．一个细菌的表面大约有 个同 DNA结合的位点。 182．1984年，Hung和 Wesink发现如果两个不同的5’粘性末端通过部分填补得到如下的单链突出末端，即可有效地相互连接：(1) (2) (3) 。 183．将含有外源基因组一个酶切片段的质粒称之为含有一个 ，各种此类质粒的集合体称之为构建了一个 。 184．将含有一个 mRNA的 DNA拷贝的克隆称作一个 ，源于同一批RNA制备 物的克隆群则构建了一个 。 185．在构建 CDNA克隆之前，可以用 来富集一特殊的核苷酸序列。做法是：用来自于能够产生目的蛋白的细胞 mRNA分子同来自于另一类型细胞(不产生这种 蛋白质，但亲缘关系密切)的过量 mRNA分子杂交。 186．一旦克隆了一个遗传定位的基因，就可以用 技术来鉴定基因组DNA文库中与之相邻的基因克隆。 187．只要知道基因组中某一特定区域的部分核苷酸组成，用 可以将这段 DNA进行百万倍的扩增。 188．SD序列是 mRNA分子中同 结合的序列，其结构特征是 的全部或一部分。 189．环状质粒的转化效率很低，通常是线性双链 DNA转化效率的 。 190．cDNA技术是进行真核生物基因克隆的一种通用方法，因为它可以用 为模板通过反转录合成一个双链的、无 的基因，因而有利于在原核细胞中进行功能表达。 191．产生平末端的方法通常有：(1) (2) (3) 。 192.不同细菌出现感受态的时期是不同的，如肺炎球菌感受态出现的时期是 、而枯草杆菌感受态的出现是在 。 193. 人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为 时吸附 DNA， 时摄入 DNA。 194．感受态细胞是可以诱导的，诱导的方法有 、 、 。 195．影响酶切的主要因素之一是底物DNA，底物的影响包括 ， ， ， 。 196．sal Ⅰ是识别6个核苷酸的酶，其识别切割的理论值是 个碱基就有一个切点，但在哺乳动物中，大约 才有一个切点。 197．在精简基因组文库中，用标记的 同末标记的杂交，最后建成的是 库。 198．构建基因组文库时连接方法主要是 ；而构建 cDNA文库，可用 或 。 199．将携带有外源基因并能持久传递给子代的动物称为 动物，这些外源基因就叫做 。 200．为了提高重组 DNA分子对E.coli转化效率，通常可采取 处理和 。 201．重组体的筛选有两层涵义，一是将 ，二是将 。 202．目前，在重组体的筛选中，已经发展了许多构思巧妙、具有极高准确性的筛选方法。大致可以分为：(1) (2) (3) (4) 等。 203．噬菌斑形成选择法有两种判断标准，一是 ，二是 。 204． PCR扩增筛选重组体是比较简便的筛选方法，它适合于 。 205．核酸杂交探针可分为两大类： DNA探针和RNA探针。其中 DNA探针又分为 探针和 探针。 206. 如果用限制性内切核酸酶切割双链 DNA产生3’突出的粘性末端，则可以用 进行3’末端标记。如果用限制性内切核酸酶切割 DNA产生的是3’突出的粘性末端，可以用 行3’末端标记。 207．单链 DNA探针的标记可以采用下列方法：(1) (2) (3) 。 208．根据 Northern杂交的结果可以说明： 。 209．差示杂交(differential hybridization)技术需要 。 210．RNA分子经凝胶电泳后按大小不同分开，然后被转移到一张硝酸纤维素膜(尼龙膜)上，同一放射 DNA探针杂交的技术称 。 211.在 技术中， DNA限制性片段经凝胶电泳分离后，被转移到硝酸纤维素膜(或尼龙膜)上，然后与放射性的 DNA探针杂交。 212. 使用核酸探针检测细胞和组织中特定核苷酸序列的位置。 213.为了鉴定某一具有特殊功能蛋白质的结构，可以用一个容易检测的报告蛋白制 备 ，然后跟踪报告蛋白在细胞中的行为即可。 214．可用 T4 DNA聚合酶进行平末端的 DNA标记，因为这种酶具有 和 的活性。 215.硝酸纤维素膜(NC)结合 DNA的能力为 ，尼龙膜(Nylon)为 。 216.如果对一个克隆的基因进行遗传操作，使互补的链转录，会产生同正常的RNA转录物互补的 分子。 217.在 Southern印迹中， DNA转移的速度取决于 和 。 218．根据噬菌斑的清晰程度筛选重组体主要是 cI基因的 。 219．用不对称 PCR合成单链 DNA探针时。两个引物的浓度比为: 。 220．微细胞是一种E.coli的突变体，通常只有正常细胞的 、而且不含 。 221.点杂交的主要缺点是 。 222.根据外源片段提供的遗传表型筛选重组体，必需考虑三种因素：（1） (2) （3） 。 223.阻断翻译杂交法是 同 的杂交。 224.在切口移位标记探针时，DNAaseⅠ处理DNA的温度应控制在 温度过高， ，不利于标记。 225.Northern印迹和Southern印迹有两点根本的区别： （1） （2） 。 226.放射免疫筛选原理基于以下三点：(1) (2) (3) 。 227．分子遗传学认为，生物体的第I类遗传信息是指 。第II类遗传信息是指 。 228．E. coli Trp合成酶的Attenuator存在于 序列中，Attenuator序列的结构特点是 。当Trp饥饿时，Attenuater开启转录的机理是 。 229． 核基因组mRNA内含子剪接的Chambon rule是 。snRNA的作用是 。切除内含子不需能量，仅由内含子中的A发生 反应来完成。 230．卫星DNA形成的理论主要有 、 、 。 231．基因表达在转录水平上的调控机制中，调节蛋白的 特性与调节区序列的特性 与调节区序列的 特征相统一，调节蛋白中的特异氨基酸识列DNA双螺旋体 内的特异碱基序列。 232．真核生物成熟mRNA的Cap结构特点是 ，加尾识别序列是 。 233．真核生物基因启动子包括 ， ， Box，原核生物基因启动子包括 ， ， box。 234．检测某DNA分子具有呼吸作用，这意味着，该DNA分子的序列具有 特点 235．采用双脱氧法进行DNA序列分析时，在A系统反应中，每一DNA片段的3’-末端是 核苷酸，这是因为 。 236．在自发和化学诱发引起的取代突变中以 类型为主。 237．a1……a5是5个不同位点发生突变而表型相同的突变型，分析互补测验的结果，你认为分属 个顺反子，其关系是 。 238．多肽链的第一个氨基酸多数情况下是 ，其密码是 相对应于DNA反意链上的序列是 。在真核生物中，如果某一mRNA中这种密码子在多处出现，由于 核糖体会选择第一密码进行准确翻译。 239． 年 对T.噬菌体γⅡ区的突变研究提出了顺反子假说。 年 对玉米胚乳色斑不稳定遗传现象进行研究提出了基因跳跃的概念。 年 对E. coli半乳糖代谢操纵子突变型研究重新发现了基因跳跃现象。 年 对人工合成的3（dG—dC）核苷酸研究提出DNA存在Z—DNA构象。 240．原核生物的S. D序列在 S rRNA的 端，它是富含 序列。 241．原核生物的启动子包括有 个site，它们分别是 以RNA的第一个Nt是 或 。 242．真核生物mRNA的加尾识别序列是 。 243．在Northern Blot的分子杂交过程中，被固定在纤维膜上的是 核酸片段。 244．McClintock考察过一个玉米果穗的三倍体胚乳，其基因型为a1a1A1∶∶DS; ∶∶,∶∶,Wx; 有色A对无色a为显性，直链淀粉对支链淀粉Wx为显性，为非活化状态，这些籽粒胚乳的表型是 ，如果某些细胞中的一个处于活化状态，其表型是 。如果某些细胞中的两个都处于活化状态，其表型是 。 245．将mtDNA放在含52Ci/mmol的H3一T条件下开始进行体外复制，中途转入5Ci/mmol H3—T条件下复制，接近未期时又转入52ci/mmol H3—T条件下复制，完成一个周期，如果两个子代DNA分子还未分离，它的放射自显影图象是 。 246．将一个重组质粒PMRI感染整合有不同PROR区（W.t或OR1—或OR2—）的λ噬菌体的三个溶原性E. coli，培养于含ONPG 的培养皿中，随加入IPTG 量的逐步增加检测被分解的邻硝基苯的黄色色度，并换算成Dac Z酶的酶活，请根据测定的结果，判断这三条曲线分别代表哪一个测验体系（wt, OR1—, OR2—）。 247．a、b为两个不同的顺反子，基因型为的细胞，其表型为 型，基因型为的细胞，其表型为 型。 248．某核酸分子的A+G/T+C=1.5,你认为这种核酸分子的特点是 。 249．以某真核生物的DNA分子的Cot1/2值所估算的长度（dNt数目）低于在电镜下所测量的长度（换算成dNt）这是因为 。 250．按顺序写出的DNA链上一个加工基因的各个区域。 （5’ 3’） 在电镜下观察到两种双链DNA分子经变性后再复性的图象。 （1） （2） 请分别说明它们的特点 。 251. mRNA的5’端第一个碱基是 或 。 5’-AAG……27ATGAAA…………GGCTTTTTTT140—3’ a+ b+ a+ b+ 252. 设a、b分别为两个cistron中的muton位点，基因型为 的基因型为 a- b- a- 的细胞，表现型为 ，（表现型为V. t. mut） 253．在RNA转录过程中 K因子的作用是 。 pho 因子的作用是 。 Sigma 因子的作用是 。 βˊ因子的作用是 。 NusAp因子的作用是 。 254．一段poly(dG-dc)的双螺旋DNA分子在 mol浓度的NaCl溶液中较易形成Z-DNA构型，测定其长度为37.2?，推测这段DNA分子含 个bp，每一bp由 氢键连接，其中 为顺式构象， 为反式构象，与相同序列的B—DNA分子比较，当用烷化剂处理时Z—DNA分子中的 核苷酸易发生烷化，主要原是 。 255．编码一个短肽链的双链DNA的分子序列为 第一单链 TCATTTGCGTAGTGCCAT 第二单链 AGTAAACGCATCACGGTA 第 单链为有意链，极性方向为（左 右 ），mRNA的转录方向是（左 右），能翻译 个氨基酸的短肽，以第 链为有意链可转录出其micRNA，它的序列和极性方向为 。 256．将玉米叶片H3-mDNA进行RNA Driven杂交，叶片H3-mDNA与子房N—RNA进行RNA Driven杂交，根据Indiscriminate transcription-post transcription selection理论，两者Rot/2的比值应为 。 257．在分子杂交过程中选 65℃的杂交温度，其目的在于 。 258．原核生物中Attenuator存在于 序列中，其调控机理是 Enhancer存在于 序列中，其调控机理是 。 A B D 259．根据Whitehouse的palaron Hybrid DNA理论，在杂合体 中，如果 a b d plaron发生在B/b基因内，形成AD，Ad, aD, ad配子的比例为 ，形成 AB，Ab配子的情况为 。 四、简答题 1.碱基对间在生化和信息方面有什么区别? 2.在何种情况下有可能预测某一给定的核苷酸链中“G”的百分含量? 3.真核基因组的哪些参数影响 Cot1／2值? 4.请问哪些条件可促使 DNA复性(退火)? 5.为什么 DNA双螺旋中维持特定的沟很重要? 6.大肠杆菌染色体的分子量大约是2.5×109Da1)，核苷酸的平均分子量是330Da，两个邻近核苷酸对之间的距离是0.34mn；双螺旋每一转的高度(即螺距)是3.4nm，请问： (l)该分子有多长? (2)该 DNA有多少转? 7.曾经有一段时间认为，DNA无论来源如何，都是4个核甘酸的规则重复排列(如， ATCG．ATCG．ATCG．ATCG…)，所以 DNA缺乏作为遗传物质的特异性。第一个直接推翻该四核苷酸定理的证据是什么? 8.为什么在 DNA中通常只发现 A—T和 C—G碱基配对? 9.列出最先证实是 DNA(或RNA)而不是蛋白质是遗传物质的一些证据。 10.为什么只有 DNA适合作为遗传物质? ll.什么是连锁群?举一个属于连锁基因座的例子。 12.什么是顺反子?用“互补”和“等位基因”说明“基因”这个概念。 13.对于所有具有催化能力的内含子，金属离子很重要。请举例说明金属离子是如何作用的。 14.列出真核生物mRNA与原核生物mRNA的区别。 15.列出各种tRNA所有相同的反应及个别 tRNA的特有反应。 16.在体内，rRNA和 tRNA都具有代谢的稳定性，而 mRNA的寿命却很短,原因何在? 17.为什么真核生物核糖体RNA基因具有很多拷贝? 18.为什么说信使RNA的命名源自对真核基因表达的研究，比说源自对原核基因表达的研究更为恰当? 19.说明为什么mRNA仅占细胞RNA总量的一小部分(3％一5％)。 20.为何rRNA和tRNA分子比 mRNA稳定? 21.起始tRNA具有哪两种与其他 tRNA不同的特性? 22.区别rRNA和mRNA在翻译中的作用。 23.氨基酸分子如何与正确的tRNA分子连接? 24.简要说明证明信使的存在及其本质为RNA的证据。 25.列举4种天然存在的具有催化活性的RNA。 26.Ⅰ型内含子发生改变后，可以产生其他酶的活性吗?如果可以，是哪些活性?这意味着Ⅰ型内含子的催化中心有什么特点? 27．某些自剪接的内含子具有可读框，它们编码何种蛋白?这与内含子的移动有什么关系? 28.描述 Meselson-Stahl试验，说明这一实验加深我们对遗传理解的重要性。 29.请列举可以在线性染色体的末端建立线性复制的三种方式。 30.为什么一些细菌完成分裂的时间比细菌基因组的复制所需的时间要少?为什么在选择营养条件下，E. coli中可以存在多叉的染色体或多达4个以上的开环染色体拷贝， 而正常情况下染色体是单拷贝的? 31.在 DNA聚合酶Ⅲ催化新链合成以前发生了什么反应? 32.DNA复制起始过程如何受DNA甲基化状态影响? 33.请指出在 oriC或фX型起点起始的 DNA复制之间存在的重要差异。 34.大肠杆菌被 T2噬菌体感染，当它的 DNA复制开始后提取噬菌体的 DNA，发现一些RNA与 DNA紧紧结合在一起，为什么? 35.DNA连接酶对于 DNA的复制是很重要的，但RNA的合成一般却不需要连接酶。解释这个现象的原因。 36.曾经认为 DNA的复制是全保留复制，每个双螺旋分子都作为新的子代双螺旋分子的模板。如果真是这样，在Meselson和 Stahl的实验中他们将得到什么结果? 37.描述 Matthew和Franklin所做的证明 DNA半保留复制的实验。 38.解释在DNA复制过程中，后随链是怎样合成的。 39．描述滚环复制过程及其特征。 40.假如发生了碱基对的错配会产生什么表型，它们怎样被修复? 41.为什么 DNA的甲基化状态可以为复制的调节和 DNA的修复所利用? 42.错配修复的方向可以怎样被调节(突变型到野生型或野生型到突变型)? 43.RecA蛋白是怎样调节 SOS反应的? 44.以图4.1A为例，画出图4.1B所示分子同源区域交叉重组的产物，图中用一条单线表示 DNA双螺旋，同源重组的靶位点用箭头标出。 图4.1 各种重组的底物 45.图4.2所示为两条同源的亲代双螺旋和两套可能的重组产物。请画图表示两亲代双螺旋间可以产生指定重组产物的 Holliday连接，在每条链的左端标明 Holliday连接的3’或5’端，这样亲代和重组双螺旋间的关系就比较清楚。请指明为了产生每套重组产物哪些链应被切去。最后，画出经过一轮 DNA复制后的重组产物。 图4.2 亲代与重组的双螺旋 46.为什么基因内互补只发生在：(1)某一基因座的等位基因间；(2)这些基因座的特殊等位基因对间? 47.有很多突变对于野生型基因是隐性的，也就是说，在一个含有突变型和野生型基因二倍体细胞中，野生型的特性能够得到表达。请根据对突变过程的认识解释这一事实。对于说明为什么有些突变是显性的，有何见解? 48.为了选择下面两种突变型，应对只含有葡萄糖、硫酸铵以及无机离子的基本培养基作何调整? (1) leu—，亮氨酸营养缺陷型； (3) gal—，不能以半乳糖作为唯一碳源的突变型。 49.写出利用突变研究以下问题的步骤： (l)氨基酸 X的代谢途径； (2)E．coli中细胞分裂的控制。 50.在工业微生物菌种的选育中，人们喜欢用诱变的方法筛选解除了酶合成阻遏的突变株，而不要解除了酶活性反馈抑制的突变株。请解释原因。 51.为什么一个基因座的正向突变发生的频率要比回复突变高? 52.一个基因间阻遏物突变怎样阻遏了一个错义突变? 53.为什么吖啶类染料诱导的突变较碱基类似物诱导的突变对生物体更有害? 54.羟胺对游离噬菌体和转化 DNA都是高度特异的致变剂。它只与 DNA中的C反应，使之转变成偶尔可与 A错配的形式。 (1)羟胺诱导的碱基替代是什么? (2)推测羟胺是否可回复自身诱导的突变? (3)羟胺可以回复5—溴尿嘧啶诱导的突变吗? (4)5—溴尿嘧啶可以回复羟胺诱导的突变吗? 55.在下列哪些基因中你可以分离到温度敏感突变和琥珀突变? (l) lacO；(2) lacZ; (3) lacP；(4) lacI 56.区别反向突变、回复突变和第二位点回复突变。 57.指出突变频率和突变率的区别。 58.简述大肠杆菌中的增变基因。 59.简述怎样利用化学诱变剂在细菌中的诱变来检测它们致癌作用。 60.简述 Muller—5技术，并说明如何利用它测得 X射线对果蝇突变频率的影响。 61.列举几种具以下特征突变：(1)不能合成特殊多肽；(2)组成型合成多肽。 62.突变能影响高等真核生物结构基因表达的几个水平?并指出每种突变最明显的分子表型。 63.当E.coli菌株 K同时被两个特异的 T4噬菌体 rⅡ突变体所感染时，感染细胞裂解并释放出正常数量的噬菌体后代。这些后代是重组的结果还是互补作用的结果?应怎 样辨别? 64.在E.coli中， A和 B基因座相隔了大约5％的基因组，另一对标记 C和 D间隔1％的基因组。哪对能被(1)共转化；(2)共转导? 65.当一个烈性噬菌体的所有基因全部表达时，如果不对转录进行时序性调控，将出现 什么问题? 66.为什么λ噬菌体感染产生的溶源菌通常对其他的λ噬菌体的感染有免疫? 67.请预测具有下列突变的λ噬菌体感染细菌的表型。并说明原因： (1)产生一个抗蛋白酶的λ cⅡ蛋白的突变。 (2)具有阻止蛋白结合的λOR2的突变。 (3)使λN基因失去作用的突变。 (4)编码λ c I蛋白的基因突变。 68．鉴定化合物的致癌性的一个通用实验是爱姆斯试验，通过营养缺陷型菌的回复突变 确定其致癌性。用人噬菌体和E.coli设计一个实验使之能用于致癌物的检测。 69．为什么像流感病毒这样的RNA 病毒的生命周期，有力地支持了以下这一论点：与其说病毒是生命有机体，不如说它是“寄生的遗传因子”。 70.大肠杆菌噬菌体 T2的染色体是一个线性 DNA分子，它的两端都有冗余并且可作循 环变换。解释冗余的含义并说明这些分子是怎样产生的。 71.烈性噬菌体和温和噬菌体的区别是什么? 72.从噬菌体 MS2中提取出来的裸露染色体可以感染大肠杆菌的原生质球(去除胞壁的细菌)，这会产生和具感染能力的噬菌体一样的噬菌体颗粒。如果染色体先用RNA酶处理，就会失去感染能力；另外，如果标记感染的RNA，在子代中不出现标记。解释这些现象。 73.从λ噬菌体中提取的 DNA用两种只攻击单链 DNA的外切核酸酶处理。外切核酸酶 A只从突出的5’端消化 DNA，而外切核酸酶 B只攻击自由的3’端。这种处理对λ噬菌体 DNA的生物活性有什么影响? 74．比较真核生物与原核生物转录起始的第一步有什么个同。 75．转录涉及模板链和编码链的分离，解释在转录中单链 DNA是怎样被保护的。 76．概括说明σ因子对启动子调节的辅助功能。 77．什么是增效与减效突变? 78．细菌促旋酶突变通常是致死的，但是促旋酶／拓扑异构酶Ⅰ突变却可以成活，其原何在? 79．解释因子是怎样选择专一性启动子共有序列而启动不同基因表达的(考虑对环境压力的应答)。 80． rpoN基因编码σ因子:σ54，它具有不同于已知原核生物的因子的特征。请与E. coli的因子：σ70(RpoD)作比较讨论这些特征。 81．在原核生物中，核心酶与 DNA的松散结合和紧密结合之间存在—种平衡，为什么这比核心多聚酶自身形成游离与结合平衡更有利? 82．正调控和负调控的主要不同是什么? 83．区别(1)启动子增效突变与启动子减效突变；(2)上游序列和下游序列。 84．解释为什么操纵子和启动子是反式隐性、顺式显性的，而编码阻碍蛋白的基因既是反式显性又是顺式显性。 85．为什么只有 DNA双螺旋中的一条链能被正常的转录? 86．哪三个序列对原核生物mRNA的精确转录是必不可少的? 87．说明因 RNA聚合酶—启动子不同的相互作用如何导致不同基因的转录。 88．原核生物的核糖体 RNA和 tRNA的相对较稳定并且半衰期长，而 mRNA却不稳定，很快被降解，请解释这种稳定性的差异。 89．列举两种受调控蛋白控制的、与氨基酸的生物合成有关的操纵子。 90．什么是安慰诱导物? 91．葡萄糖是如何影响涉及糖代谢的操纵子(葡萄糖敏感型操纵子)的表达? 92．在大多数细菌操纵子中，结构基因通常紧靠在一起并由单个操纵序列—启动子区调控，而在一些例子中结构基因分散在染色体上。请问这些基因是如何以简单的方式达到协同调节的。 93. 反转录病毒与反转录转座子有什么不同? 94. gag和pol基因的蛋白产物是怎样生成的? mRNA编码的 Env蛋白是怎样生成的? 95. 蛋白酶为什么对反转录病毒生活史很重要? 96. 列出转化病毒正链RNA掺入到宿主双链 DNA的详细过程。 97. 噬菌体整合到宿主基因组后，4～6个宿主 DNA的核苷酸被复制，这是为什么?这与转座子插入新位点有何相似之处?另外，两个核苷酸从5’U3的5’和3’被切除，这意味着遗传信息从反转录病毒中被丢失吗? 98．反转录病毒怎样获得像onc基因这样的细胞基因?获得此类基因会对反转录病毒基 因产生影响吗?一个反转录病毒怎样才会丢失如 pol和 env这样的重要的基因而复制? 99．描述酵母 Ty元件的结构。它与反转录病毒有何相似之处?为什么它不形成感染粒子? 100．你如何证明 Ty元件在转座时经历了一个RNA中间体? 101．FB元件与copia因子有何不同? 102．列出病毒和非病毒超家族反转录转座子之间的4种差异。 103．为什么说 Alu元件可能作为 DNA复制的起点?有什么理由不支持这种假说呢? 104．描述两种转座子引起基因组重排的方式。 105． IS元件整合到靶位点时会发生什么? 106．一个复合转座子和一个 IS元件之间的关系是什么? 107．列出一个转座子插入到一个新位点所要求的步骤。 108．当(l)DNA在两个定向重复之间(2)DNA在两个反向重复之间发生重组的效应各是什么? 109．在什么过程中会形成一个共整合体?它的结构是什么? 110．Tn10元件只有在自己的转座酶基因具有活性时发生转座(与利用基因组中 Tn10元件表达的转座酶的情况正好相反)，这种偏爱的原因是什么? 111．什么是杂种不育?是什么引起的? 112．即使不携带癌基因，反转录病毒依然会导致癌变转化。列举这种现象发生的三种方式。 113．简述大肠杆菌的插入序列，并指出它们对自发突变的重要性。 114．比较基因组的大小和基因组复杂性的不同： —个基因组有两个序列，一个是 A，另—个是 B，各将2000bP长。其中—个是由400bp的序列重复5次而成，另一个则由50bp的序列重复40次而成，问： (1)这个基因组的大小怎样? (2)这个基因组的复杂性如何? 115. 一个基因如何产生两种不同类型的mRNA分子? 116. 在一个克隆基因的分析中发现：—个含有转录位点上游3.8kb DNA的克隆，其 mRNA直接转录活性比仅含有3.1kb上游 DNA的克隆的转录活性大50倍。这表明了什么? 117．被加工的假基因与其他假基因有哪些不同?它是如何产生的？ 118．非转录间隔区与转录间隔区分别位于 rRNA重复的什么位置?转录间隔区与内含子 有何区别? 119．请描述 C值矛盾，并举一个例说明。 120．在酵母基因中，其生活必需基因占多大比例?为什么有些基因可能是不必要的? 121．酵母mRNA的大小一般与基因的大小相—致。而哺乳动物 mRNA比对应的基因明显小。为什么? 122．在一个基因复制后，外显子发生突变的机率比内含子小。但是，所有 DNA的突变率是相同的。请解释原因。 123．什么证据表明外显子与蛋白质的功能结构域相一致?这一证据如何支持外显子改组 (exon shuffling)假说? 124．为什么卫星 DNA在密度梯度离心时会形成一个清晰的峰? 125. 为什么基因组 DNA在用限制性内切核酸酶消化时，哺乳类的卫星 DNA会产生特 异的带? 126．举例说明什么是梯级重复，这样的序列是如何产生的? 127．跳跃复制的结果是什么? 128．重复序列并不是在选择压力下存在，因此能快速积累突变。这些特性表明重复序列相互间应存在很大的不同，但事实并不是这样的。请举例说明。 129．哪些细胞器带有自身基因组?为什么这些细胞器带有自身的基因组? 130．线粒体 DNA的突变率与细胞核 DNA突变率有什么不同?为什么? 131．人线粒体 DNA的哪些特征表明了其基因组的组织方式具有经济性? 132． RNA分子能被运到细胞器中吗? 133．什么证据表明细胞器与原核生物关系比真核生物关系密切? 134．酵母 rho—小菌落突变株的线粒体DNA发生了什么变化? 135．除了自身免疫疾病，机体如何实现不对“自己”产生免疫? 136. 简述重链免疫球蛋白基因重排的步骤。 137．列举产生免疫多样性的途径。 138．当J区与 V区发生重排后，其5’端的命运如何?3’端呢? 139. 假设免疫球蛋白是由基因组中完整的基因编码，而不是多个片段组装而成，那么人 体识别百万个不同的抗原需要多少个基因参与免疫反应?这些基因占人基因组的多 大比率? 140．地中海贫血症是一类因α和β珠蛋白合成降低而导致的疾病，什么类型的 DNA重排能引发这些疾病? 141．列举一个已知的 DNA序列编码一种以上蛋白质的三种方法。 142．哺乳动物中，从母亲与父亲遗传而来的基因是差异表达的，这种现象的理论基础是什么? 143．简述 T—DNA转化所需的细菌及质粒基因。 144．氨甲蝶呤对哺乳动物细胞有何作用?细胞是如何对这种药物产生抗性的?其中稳定 和不稳定抗性有什么不同? 145．一个tRNA基因的启动子序列突变将会分别对(l)基因产物和(2)细胞或生物体的表型有什么影响? 146．列举原核生物同真核生物转录的差异。 147．增强子具有哪些特点? 148．哪些转录因子含有 TBP?为什么它们被称为定位因子?请用一个模型解释为什么所 有三种RNA聚合酶都能与 TBP发生作用? 149．什么是转录起始前复合体? 150．RNA聚合酶的内部启动子位于起始位点下游50个核苷酸的位置，它是如何被定位并正确起始转录的? 151．对带有内部启动子的RNA聚合酶Ⅲ基因有什么样的编码限制因素? 152．当一段活性转录 DNA受损时，模板首先被修复。请用一个模型解释这一现象。 153．真核生物中，基因的表达受不同水平的调控，请列举其中3种。 154．甾醇类转录因子与锌指蛋白类转录因子的区别是什么? 155．亮氨酸拉链蛋白所识别的 DNA有何特点?如何理解亮氨酸拉链转录因子的二聚体结构同识别位点的关系? 156．虽然同源异型蛋白与锌指蛋白差别很大，但是它们识别 DNA序列的结构元件相 似的，这个元件是什么? 157．协同控制(coordinate control)下的基因是如何被同时激活的? 158．列出调控转录因子被激活的7种途径，并各举一例。 159．许多转录因子是细胞原癌基因的产物，为什么突变的转录因子可能导致癌变? 160．转录因子能够与装配成核小体的 DNA序列结合吗? 161．有两个模型可以解释染色质中的基因是如何被转录的。优先模型(preemptive model)中，转录因子和RNA聚合酶是如何与启动子结合的?为什么在动态模型中需要ATP? 162．为什么酵母SWI与SNF基因的突变会影响不同靶基因的转录? 163．一般认为，染色体中具有多个调控基因表达的结构域。每个结构域中可以找到哪些功能位点，它们的作用如何? 164．MyoD是一种 bHLH蛋白，对肌肉细胞的发育很重要，它的活性是如何被调控的? 165．酵母 U6 sRNA基因有一个TATA盒位于上游，在基因内有一个弱的 A盒，基因下游的远端还有一个保守的 B盒。体外实验时，RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ都可以转录这个基因，但体内实验发现只有RNA聚合酶Ⅲ可以转录它。如何确定该基因启动子的聚合酶特异性? 166．举例说明单链核酸中形成茎环结构的重要性。 167．用负超螺旋环状 DNA样品进行体外转录实验。但是预实验中并没有获得满意的结果，试讨论改进实验的可行方法。 168．组蛋白 H2A基因在所有细胞中都进行表达，而免疫球蛋白基因只在淋巴样细胞中表达。两类基因的启动子都含有转录因子 Oct-1的结合位点， Oct-1也存在于这两类细胞中，但为什么免疫球蛋白只在淋巴样细胞中表达? 169．RNA聚合酶Ⅱ起始转录后，起始复合物必须转变为延伸复合物。因此聚合酶复合 物必须解旋一小段 DNA。在线性 DNA上，解旋需要ATP， TFⅡE， TFⅡH和解旋酶活性。然而，超螺旋 DNA的转录并不需要这些因子。请解释这一现象。 170．RNA聚合酶Ⅲ特异性地转录小分子RNA，但为什么不转录5.8S rRNA? 171．当剪接的分支位点被移到内含子内的另一个位置，其活性将会消失。相反，正确位置附近隐藏的一个分支位点被激活。请作出解释。 172．请列举剪接体组装过程中的各个步骤，其中哪一个复合物是具有活性的剪接体? 173． Ul SnRNP与5’剪接位点间作用的基础是什么?如何证明? 174．列举前体mRNA剪接过程中发生的6种RNA-RNA相互作用? 175．通过遗传筛选，在酵母中分离得到许多与前体mRNA剪接有关的基因。其中几个基因编码RNA解旋酶。如何解释前体mRNA的剪接需要多个RNA解旋酶?这些酶可能在哪一步反应中起作用? 176．前体mRNA剪接体的催化中心是什么?它是如何形成的?有什么证据可以证明这 个模型? 177．据说前体mRNA的剪接是从Ⅱ型剪接进化而来的。有什么证据可以证明这一点?是如何发生的?这种进化为什么对生物体有利? 178．可变剪接如何控制果蝇中的性别分化? 179．比较RNA聚合酶 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ催化的转录终止过程和转录产物3’端的形成。 180．组蛋白mRNA3’端的加工需要什么样的RNA结构?如何证明所涉及的是RNA的二级结构而不是初级结构?在其他反应中会形成类似的结构吗? 181．为什么把同样的第一外显子(SL外显子)加在所有mRNA上对锥虫是有利的? 182．如何确定在一个多内含子基因的剪接过程中，内含子被切除的顺序? 183．为什么mRNA的翻译起始密码子的上游必须含有不被翻译的核糖核苷酸? 184．在RNA编辑中，向导RNA(gRNA)的作用是什么?它的哪些部分分别与：(1)编辑前mRNA；(2)编辑后的前体 mRNA互补? 185．指出下列序列中的3’剪接位点： 5’—ACGUACUAACAUUCUAUUCCUUAAG/UUCAUAAGUUGAGUC—3’ 如果3’剪接位点的保守序列发生突变，附近的一个“隐藏”3’剪接位点通常取而代之。这个位点在哪里?这将对该前体mRNA所编码的蛋白产生什么影响? 186．既然真核rRNA的 poly(A)尾不是由 DNA编码的，为什么能将它准确地加到3’末端上呢? 187. 解释什么是“套索结构”，在内含子套索中的磷酸二酯键有什么特别之处? 188．哪一种真核生物RNA不需要加工? 189．为什么剪接是一个精确的过程? 191. 如果剪接发生在一个内含子的 GU序列与相邻内含子的AG序列间，会有什么结果? 192． N—甲酰甲硫氨酸—tRNA的功能是什么? 193. 解释核糖体肽基转移反应。 194．简述真核细胞中翻译终止的过程。 195．真核与原核核糖体的主要区别是什么? 196．简述真核与原核细胞中翻译起始的主要区别。 197．氨酰tRNA合成酶的功能是什么? 198．有两个系统发育上十分接近的物种，它们染色体中的(G十C)%含量不同， A株(G+C)含量为55％而 B株是68％。同源及异源转化／重组实验表明：来自(G+C)％低的DNA易于转化入(G十C)％高的生物体/基因组中，反之则不然。请说明原因。 199．根据翻译过程所涉及的各个步骤，设计出至少六种抑制翻译的方案。 200．根据遗传密码字典，将mRNA序列5’-AUGUUCCAGAGCACGGGCCCUAAA-3’翻译成多肽，假定翻译从5’端的 AUG开始。如果： (1) C改成 G； (2) C改成 A； (3) C被缺失。 上述变化对多肽有何影响? 201．在大肠杆菌的一个无细胞蛋白质合成系统中，耗尽内源 mRNA后与 poly(AG)的随机多聚体共温育，其中 A∶G=3∶1。预测何种氨基酸能够掺人到多肽中，以及它们的相对掺入频率。 202．为什么说翻译后氨基酸的化学修饰与蛋白质总体构象的形成有关? 203．说明氨基酸残基的磷酸化怎样调节蛋白质的活性? 204．比较并指出O-连接和N-连接合成途径的异同。 205．为什么大多数移码突变导致多肽链的提前终止? 206．为什么说基因工程技术是60年代末70年代初发展起来的? 207．重组 DNA的含义是什么? 208．如何理解基因工程的两个特点? 209．在 Cohen构建有生物功能重组体的第一步实验中，用EcoR Ⅰ切割了 R6—5质粒，然后转化正E.coliC600，在卡那霉素抗性平板上筛选到了 pSC102，它是由 R6—5的三个E.coR Ⅰ片段组成，请推测这个质粒具有什么遗传特性： 210．什么是动物乳腺生物反应器? 211．现分离到Ｘ82噬菌体的一个突变型，它同野生型的噬菌斑相当不同，并已分离到这两种噬菌体的 DNA，请设计一个实验，初步鉴定是点突变、插人突变还是缺失突变? 212．说明 Sanger DNA测序法的原理。 213．在酶切反应缓冲液中加入 BSA的目的是什么?机理是什么? 214． Fredrick和 McClarin等用一个由13个碱基对的 DNA片段与EcoR Ⅰ反应，然后分离到酶和 DNA共结晶的复合物，通过 X射线分析发现了什么? 215. 有些噬菌体和质粒常常编码一些抗限制性酶的蛋白以中和宿主的限制系统。你认为 噬菌体和质粒还有哪些可能的方式避免宿主的限制作用? 216．某学生在用EcoR Ⅰ切割外源片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因? 217．在序列5’—CGAACATATGGAGT-3’中含有一个6bp的 Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么? 218．下面几种序列中你认为哪一个(哪些)最有可能是Ⅱ类酶的识另别序列： GAATCG，AAATTT， GATATC，ACGGCA?为什么? 219．用连接酶将Sau 3AI(↓GATC)切割的 DNA与经BamHⅠ(G↓GATCC)切割的DNA连接起来后，能够被BamH Ⅰ切割的机率有多大(用百分比表示)? 220．用Klenow酶填补的办法可使5’粘性末端转变成平末端。这种方法常使 DNA上的 某些限制酶的识别位点消失。请问，对于下列限制酶，用这种方法处理会不会使它们的识别序列都消失?BamH (G ↓ GATCC)；Taq Ⅰ(T ↓ CGA)，BssH Ⅱ(G↓ CGCGC)。 221．请推测细菌的染色体上是否会有编码识别8个碱基的内切酶?怎样验证? 222．当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施?为什么? 223．按适当的顺序，列出将一种mRNA的 cDNA克隆到表达载体所用到的酶。 224．为什么反转录酶在聚合反应中会出错? 225．什么是测序酶(sequenaseTM)? 226. 什么是 S1核酸酶作图(S1 nuclease mapping)? 227. 基因工程中，为什么不喜欢用 BAP来脱去 DNA的5’端的磷酸基团? 228．RNase A和RNase H在催化活性和应用上有何不同? 229．切口移位(nick translation)标记 DNA前，用 DNase Ⅰ处理 DNA时，应注意什么? 230．核酸酶与外切核酸酶Ⅲ用于系列缺失突变有什么不同? 231．YAC载体具有什么样的功能性 DNA序列?为什么在克隆大片段时，YAC具有优越性? 232．列举质粒载体必须具备的4个基本特性。 233．什么叫穿梭载体? 234．说明减少质粒和噬菌体载体上某种酶的识别位点的方法和原理。 235．虽然质粒的带动转移给质粒载体的安全性带来一定的困难，但是通过带动转移将质粒转移到特定的受体菌中也是基因工程中常用的实验技术。请举一例说明之。 236．为什么来自 Hfr× F—的重组体几乎总是 F—? 237．解释为什么不同的 Hfr菌株具有不同的转移起点和方向? 238．怎样从一个 E．coli的 Hfr菌株中分离到一个 F’gal+的菌株? 239．你已经分离了一个新的 F’因子，怎样用最简便的方法知道最初的 F因子的部分 DNA已经被切除，并被一个外源 DNA(也就是细菌 DNA)所替代? 240．你能用哪一种基因转移的方法确定 (1) E．coli染色体上一个新发现的基因座在其染色体上的位置； (2)一个新分离的突变在基因内的位置。 241．用加有注释的图表说明 F质粒是怎样从一个 F+细胞转移到 F—细胞。并简要说明转移复制如何不同于营养体的复制。 242．在转导过程中，通常需要把受体菌和在供体中生长的噬菌体悬浮液分别铺在选择性培养基上，为什么? 243．如何将野生型的λ噬菌体改造成为一个理想的载体? 244．用salⅠ切割从噬菌体 J2分离的 DNA时，得到8个片段，分别是：1.3、2.8、3.6、5.3、7.4、7.6、8.1和 11．4kb。但是，用Sal Ⅰ切割从被感染的寄主细胞中分离到的 J2噬菌体 DNA时，只得到7个片段，分别是：1.3、2.8、7.4、7.6、8.1、8.9和 11.4kb，根据这些结果，您得到哪些信息? 245．在cⅠ基因正常时为什么也会出现浑浊的噬菌斑?不正常则是清亮的噬菌斑? 246．λ噬菌体 DNA被包装到噬菌体的头部，需要哪些基本条件?为什么? 247． PCR反应包括引物与 DNA模板链间的解链与复性。讨论循环温度范围对引物—DNA双螺旋稳定性的影响及对 PCR产率的影响。 248． Sanger的双脱氧法测序的原理。 249． 分离DNA时，为什么要在缓冲液中加入一定浓度的 EDTA和蔗糖? 250． PCR的基本原理是什么?用 PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息? 251． 说明合成接头在基因工程中的主要作用。 252． 从细菌中分离总 DNA，应采取哪些指施获得高分子量的 DNA? 253. 用酚抽提蛋白质时，离心后，为什么蛋白质总是会停留在水相和酚相之间? 254. 分离 pBR322 DNA可考虑用氯霉素扩增，分离 pUC18质粒 DNA则不必用氯霉素扩增，为什么? 255．溶菌酶是破碎细菌细胞的有效方法。但有些细菌的孢子对溶菌酶不敏感，应该如何处理? 256．假定你从粘质沙雷氏菌中克隆了一个基因，并推测可能是依赖于锌的金属蛋白酶， 因为它含有两个组氨酸和一个谷氨酸与锌形成锌指结构。请你设计一个方案，改变其中一个组氨酸看看是否改变蛋白酶的活性? 257．你打算扩增下图所示的两段序列之间的 DNA，请从所列出的引物中选出合适的一 对。 5’-GACCTGTGGAAGC-----CATACGGGATTG-3’ 3’-CTGGACACCTTCG-----GTATGCCCTAAC-5’ 引物 1 引物2 5’-GACCTGTGGAAGC 5’-CATACGGGATTG 5’-CTGGACACCTTCG 5’-GTATGCCCTAAC 5’-CGAAGGTGTCCAG 5’-GTTAGGGCATAC 5’-GCTTCCACAGGTC 5’-CAATCCCGTATG 258. cDNA克隆与基因组克隆有何不同? 259．怎样将一个平末端 DNA片段插入到EcoR Ⅰ限制位点中去? 260．有哪些可能的原因使一个基因在 DNA库中丢失? 261．简述以粘粒为载体构建基因文库的原理。 262．一个双链 DNA分子(为5’突出端)可采用哪些方法使之加上 dA100～120的尾巴? 263．酵母人工染色体要在酵母细胞中稳定存在，必须有哪些基本的结构? 264．何谓YAC?主要特性是什么? 265. Muller的 PCR反应同大肠杆菌体内的 DNA复制有哪些不同?你认为根本的差别在哪里? 266．在构建 CDNA文库时，为什么常用GC接尾而不用 AT接尾法连接? 267．用限制性内切核酸酶切割 DNA后，经电泳检查，发现有拖尾现象，其可能的原因是什么? 268．欲将一真核生物的结构基因克隆后转移到原核生物(如Ecoli助中进行表达，克隆时应注意哪些问题? 269．假定你分离到一个Ecoli的 Thy—突变体，并推测有可能是ThyA基因突变。请设计一个方案用 PCR从染色体 DNA扩增突变的ThyA基因，测定突变的序列。(注：E.coli 野生型的ThyA基因的序列是已知的) 270. 点印迹与 Southern印迹相比，有何优点和缺点? 271．你在做 Southern印迹分析，并且刚完成了凝胶电泳这一步。根据方案，下面一步骤是用 NaOH溶液浸泡凝胶，使 DNA变性为单链。为了节省时间，你略过了这一步，直接将 DNA从凝胶转至硝酸纤维素膜上。然后用标记探针杂交，最后发现放射自显影片是空白。错在哪里? 272．切口移位(nick translation)标记探针的主要步骤有哪些? 273．插人失活和插入表达法筛选重组体的主要差别是什么? 274．一个携带有氨苄和卡那霉素抗性基因的质粒被仅在卡那霉索基因中有识别位点的 EcoR Ⅰ消化。消化物与酵母 DNA连接后转化对两种抗生索都敏感的E coli菌株。 (l)利用哪一种抗生素抗性选择接受了质粒的细胞? (2)怎样区分接受了插入酵母 DNA的质粒的克隆? 275．用互E.coR Ⅰ和HindⅢ分别切割同一来源的染色体 DNA，并进行克隆，在前者的克隆中筛选到 A基因，但在后者的克隆中未筛选到 A基因，请说明原因。 276．什么是Western印迹?它与 Southern印迹有什么不同? 277. 用一限制性内切核酸酶切割 Lac+ Tetr的质粒载体，已知该酶识别的是4个碱基序列，并产生有两个碱基突出的单链末端，该酶在 lac基因内有切割位点，并在第二个氨基酸密码子内，该位点可以被任何氨基酸所取代而不影响酶活性。用该酶切割后，用DNA聚合酶将单链末端补齐为双链的平末端，然后重新连接成环，转化 Lac+ Tetr受体菌，筛选 Tetr转化子，问：Lac的基因型是什么?并说明原因。 278．严谨杂交实验是如何控制的? 279．RNA与基因组 DNA复性已被广泛用于检测不同类 DNA的转录。 DNA驱动的复性 实验与RNA驱动的复性实验有何不同? 280．在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用 cDNA而不用基因组 DNA?为什么要在 cDNA前加上细菌的启动子? 281．从某种意义上讲，生物体的空间密码较三联体密码具有更广泛的简并性。 282．原核生物的RNA polymerase中δ(sigma)因子具正、负两方面的效应 283．Ⅱ、Ⅲ型Intron的Branch site中A具有高度保守性。 284．一般认为luxury gene才具Enhancer。 285．5BrU诱发“复制错误”（Replication error）的突变频率低于诱发“掺入错误”（incorporation error）的突变频率。 286．Lac operon的O+/Oc部分二倍体的E. coli细胞中，Oc对O+具有Cis-dominant效应。 287．将重组的苏云金杆菌δ毒素基因转化到植物细胞内，可以正确表达，但毒素蛋白合成效率较低。 288．采用“加、减法”进行DNA序列分析时，在“+A”系统中，所合成的片段末端均为A。 289．将CHS（色苷合成酶）反义DNA基因导入红花烟草原生质体中，诱导培养出白花植株，并对红花植株具显性效应。 290．在具Spm转座系统的玉米籽粒中，发现在无色胚乳的背景上出现有色斑圈。 291．E. Coli trp合成酶操纵子的trp L29突变株（第29dNt发生G的转换突变）表现型为trp缺陷型。 292．一段Poly dG-dc双链DNA分子在体外，4.0M NaCl及含有Br原子的条件下，可以形成稳定的Z—DNA构型，转入体内生理条件下，也能保持其结构的稳定性并制备Z—DNA抗体。 293．E. Coli在Histidine缺乏时，体内至少有三套调控系统启动，以控制对这种环境的适 应。 294．利用改良的RNA Driven技术体系，可以估算出真核生物基因表达的数目及其丰富度。 295．利用某一随机引物分子进行某一生物总DNA的PCR反应时，选用45℃ anneal temperature所显示的带纹数较选用35℃所显示的带纹数要少。 296．λE. Coli C λ—CE.Coli Kλ—K eop=1 eop=1 297. 真核生物中，mRNA×DNA出现R—Loop的电镜图象。 298．原核生物中具有Direct Repeats的Tn9复合因子较具Inverted Repeats的Tn10复合因子的稳定性差。 299．E. Coli在仅Arg饥饿时也会合成trp。 300．通过二点或三点测验测定的基因间的遗传图距与物理图距之间存在非对应的线性关系。 301．pseudo gene是重复基因家簇中无功能的基因成员。 302．原核生物基因转录的强终止子，在行使其功能时，不一定需要Rho因子。 303． 近代研究发现若干Anti-Central dogma的现象，从而丰富和发展了１９５７年Ｃrick提出的Ｃentrol dogma理论。 304．将复制进行一半的E. Coli转接于含利福平的培养基上，E.Coli可以完成该周期的DNA的复制，但不能进入下一周期的复制。 305．生物体的翻译体系能在mRNA中UCU, UCC, UCA, UCA, UCG,AGU,AGC等6个密码子处准确聚合Ser。 306．并非所有氨基酰tRNA合成酶的Amino Acio Site都具有双筛功能。 307．yeast Alg4具有7个非全同等位基因，研究表明它们发生基因转换的频率，从5ˊ→3ˊ呈递减的趋势。 308．E. Coli的SOS修复系统的表达，必须受到紫外线诱导。 309．将转导噬菌体P1（h1-a、H2-b）·Fla感染沙门氏菌（H1—c、h2—d）fla菌株，获得33个Fla转导子，血清反应检测其中11个为H1—a相，22个为H1—c相。 提示：Fla:鞭毛蛋白基因，与H1基因紧因紧密连锁，控制沙门氏菌的运动。 （H1—a、h2—b）为H2相基因表达，血清型为a型 （H1—c、h2—d）为H1相基因表达，血清型为c型 310．从λphage溶源，裂解途径选择的分子机制中，你得到哪些有关生物基因表达调控的启示。 311．E. coli在含有Glucose和Lactose的培养基中，Lactose不被分解利用。 312．E. coli,K菌株被T4 phage的rⅡa,rⅡb两种突变体双重感染后，细菌裂解，并放出正常数量的T4 phage。 313．羟胺（HA）不能使终止突变的a基因发生回复突变。 314．从寄主菌中分离提取PBR322质粒DNA，经电泳检则，出现了三条迁移率不同的带纹。 315．tRNA作为adaptor，保证了蛋白质合成过程中氨基酸的准确聚合。 316．核糖体可以准确地在mRNA5’端第一个AUG密码处起译蛋白质。 317．选用10个碱基的随机引物进行PCR反应时，在50℃退火温度下较37℃退火温度下扩增出的带纹少。 318．DNA复制时，新生单链DNA总是从5’端向3’端延伸。 319．假基因也称为Retrogene，并且只在真核生物的重复基因家族中发现有假基因存在。 320.玉米中，由DS引起的插入突变基因，也称为Non-Autonomous mutable gene。 321．A，a1, a2, a3是一组非全同复等位基因，研究发现它们发生基因转换的频率为a1> a3> a2 322. 真核生物的基因在转录水平上的表达调控往往采用Positive control方式，而原核生物多采用Negative control方式。 323. Z-DNA在活体细胞内能稳定存在。 324．两种GC%含量相同的DNA分子，分别在pH=12和pH=7的变性缓冲液中进行的变性反应，测得的Tm值不同。 325．进行DNA复性动力学研究时，应保持缓冲液的Na+浓度为0.18～0.2M，复性反应的温度一般控制在低于Tm值25℃左右。 326．合成与高度重复的卫星DNA（satellite DNA）两侧序列互补的特异引物，进行PCR反应的技术，是研究DNA多型性的一种分子标记技术（SSR，Simple Sequence Repeats）。 327．各种类型的转座因子均具有“限制转座频率的负控制”机制。 328．同相重叠基因可以产生长度不同，序列相似的isoform protein，而异相重叠基因仅能产生结构与功能完全不同的蛋白质。 329．Enhancer的启动具有严格的组织特异性。 330．生物体能保证DNA复制的错误机率小于10-11。 331．E. coli 组氨酸合成酶操纵子的引导区内存在一个编码16氨基酸的orf，并且其中有7个组氨酸的密码子连续排列。 332．Neuraspora A type 与a type杂交，形成的八核子囊孢子出现了A∶a=5∶3, 2∶6, 6∶2, 4∶4的多种分离的类型。 333．DNA复制过程中，新生单链DNA的延伸是从5’端向3’端方向进行的。 334．将提取的某种DNA分别置于含有与不含EB（溴化乙锭）的琼脂糖凝胶中电泳，发现其迁移率不同。 335．真核生物染色体的端粒结构有效地防止了染色体DNA复制中5’端短缩的问题。 336．E. coli在色氨酸缺乏的条件下至少有三种调控机制被启动。 337．codon usage既有物种的共性规律，又有物种的个性特点。 338．一个真核生物的基因要在受体菌(E. Coli)中将到准确的表达，一般是： 1）用该基因的cDNA导入，而不用分离出来的DNA。 2）导入的cDNA必须与载体的某一基因的启动子和引导序列组成重组DNA。 3）载体分子的连接末端一般接上3种不同长度的人工聚合的同聚核苷酸对 G C GG CC GGG CCC 当外来的目的基因连接的末端径S1酶（专化性酶切S.SDNA）消化后，与载体连接，导入受体细胞后，即可筛选到准确表达的克隆。 339. 已知AGA是Arg的密码，AGC是Ser的密码，你认为tRNAser的反密码子是否可能为ICA？为什么？ 340．分离真核生物基因的方法，以提出mRNA后制备cDNA的技术为主，其中有两条技术路线。 其一，利用固定有poly u的亲合柱层析分离mRNA。 其二，（以Adh基因为例）将Adh酶纯化，制备Adh抗体，再与翻译体系混合，离心收集复合物，然后使复合物解体从中分离mRNA，它们的理论据是什么？ 341．利用分离到的mRNA制备成cDNA,但这种cDNA不能代表真正的基因，加以利用，必须将它制成探针与总DNA进行分子杂交。才能获得真正的目的基因，这是为什么？ 342．采用双脱氧法进行DNA序列分析时，A系统反应液中每一DNA片段的3’—末端都为A，为什么？ 343．一般都利用限制性核酸内切酶和连接酶将质粒DNA与目的基因构成重组DNA分子，理论依据是什么？ 344．将带有启动子和终止子在内的玉米Adh完整基因导入E. coli细胞内没有得到表达，其主要原因是什么？ 345．说明下列基因操作技术的分子遗传学原理。 A、运用Southern Blot技术在68℃（High Stringency）的条件下杂交，洗膜，可以确定真核生物单拷贝基因DNA酶切片段的电泳位置。 运用羟基磷灰石柱层析法法，对在50℃(Low Stringency)条件复性的DNA分子进行层析，可以分离出单拷贝基因的DNA分子。 B、E.coli的质粒PBR322的AmpR和TctR基因中分别具有PStI和 BamHI的切点，如果以PBR322作外来目的基因的载体，制备目的基因的克隆，一般是将目的基因片段插入pStI或BamHI的切口内。 C、载体分子的连接末端一般接上3种不同长度的人工聚合的同聚核苷酸对 G C GG CC GGG CCC 当外来目的基因的连接末端S1酶（专化性酶切单链DNA分子）消化后，在连接酶作用下，与载体接头重组，导入受体细胞内，即可筛选到准确表达的克隆 346．Repetive gene 形成的三种假说。 347．复制型转座因子与逆转录型转座因子。 348．Prokaryotic promoter与Eukaryotic promoter的基本结构。 349．Enhancer与Attenuator的功能与原理。 350．paracodon与codon in codon的特点与功能。 351．Rifampin是RNA转录的抑制剂。 A C 352．反向重叠基， 同向重叠基因 各具有不同的基因表达方式。 B D 353．生活细胞内DNA分子在结构上的不均一性体现在： dNt conformation, Helical form, Hydrogen bond, Superhelical direction, Dnase Sensitivity, chromatin structure. 354．两种DNA分子的GC%相同，但Tm值不同。 两种DNA分子的Tm值相同，但Cot1/2值不同。 两种DNA分子的Cot1/2值相同，但Tm值不同。 两种DNA分子的经随机引物扩增的片段长度相同，但DNA Sequence不同。 355．Yeast的cyt. b gene在E. coli内不能表达。苏云金芽胞杆菌的ICP基因在E. coli内的表达量降低。 356．DNA复制的ε≤10-11，蛋白质翻译的ε≤10-4。 357．丝氨酸tRNA的anti-codon不会为ICU （AGA为Arg的codon, AGC为Ser的codon） 五、实验设计与分析 1.假定你在25℃条件下用如下浓度的 DNase I：0，0.1，1.0及10.0mg／ml，对鸡红细胞细胞核的染色质进行酶切20分钟。将这些样品与分子量标记一起上样于6％变性聚丙烯酚胺凝胶，下图是凝胶电泳的结果。但由于你混淆了样品，因此弄不清每个泳道对应的样品是什么。惟一可以确信的是分子量标记上样于左边的泳道，但忘记了各带对应的分子量大小(图1.1)。 (l)请回忆起在各泳道分别使用的是哪一浓度的 DNase I? (2)请指出分子量标记泳道(用 M表示)各带的大约分子量。 (3)描述各泳道所显示的染色质结构特征，证实所记忆的数字是正确的。 图1.1 DNase Ⅰ消化鸡红细胞细胞核染色质后的电泳图 2.从4种不同的物种分离出的核酸中各种碱基的比率(％)如下： A T U G C A+T(或A+U) A+G        G+C C+T（或C+U）  1 17 17  33 33 0.5 1.0  2 29 19  22 30 0.97 1.0  3 24  16 24 36 0.66 0.92  4  34    2.1 1.0   (1)对于每个物种，回答以下问题： ①核酸是 DNA还是RNA? ②它是双链还是单链? (2)填充物种4中缺少的碱基百分比。 3．假定你从一新发现的病毒中提取了核酸。请用最简单的方法确定： (1)它是 DNA还是 RNA? (2)它是单链还是双链? 4. 某公司要招聘技术人员加入他们的抗病毒小组帮助设计新药对抗艾滋病病毒感染。 为了得到这份工作，要求应聘者设计一个方案来阻止艾滋病病毒基因表达但不影响宿主基因的表达。你能设计吗? 5. 假定你正在研究原核生物转座子 Tn1O，并已设计出一个很好的方法来确定 Tn1O在 转座期间是否是通过复制还是不干涉 DNA复制直接移动。你的想法是根据这两种机制的主要不同点：如果不复制那么转座子的两条亲链将同时移动，如果复制则只有一条亲链移动(如图8.1)。你打算把来自两个不同 Tn10的链经退火后都标 图8.1一个转座子的复制与非复制转座 转座因子被示为一条杂合双链，由两条遗传上不同的链组成—条白色一条黑色。 在复制转座期间：一条链与供体 DNA留在一起，一条被转向受体DNA;非复制转座 时，转座子被从供体 DNA上切下，全部转到受体 DNA上 记上。为了把这些杂种 Tn10双螺旋足够地分配到细胞中。你用了含有 Tn10的λ噬菌体 DNA，它既能在体外操作又能包在病毒壳内成为有侵染力的噬菌体。你决定使用一个因为其他突变而失去活性的噬菌体基因组，因此它就不会复制整合，而且最终可被除去，这样噬菌体基因组可被忽略。你的噬菌体 DNA在同样位点插入了稍微不同的Tn10。两种 Tn1O都含有四环索抗性基因和乳糖代谢基因(lacZ)，但其中一种由于突变使lacZ 基因失活。这种差异为追踪两种 Tn10提供了一个很方便的方法，因为 lacZ+细菌克隆(与适当的底物共育时)会变蓝，而 lacZ—克隆则还是白色。你把两种噬菌体 DNA的混合物变性后退火，得到两份相等的杂交双链与纯合双链的混合物(图8.2)。 图8.2把两种不同的含 Tn10的λ噬菌体基因组变性与复性后，杂交双链与纯合双链混合物的形成浅线表示噬菌体 DNA，框表示 Tn10。两种 Tn10的突变不同点如黑片段和白片段所示 然后你将混合物包装到噬菌体外壳中，侵染 lacZ—细菌，并把被侵染细菌涂布在含 四环素和可产生有色底物的平板上。一旦噬菌体 DNA进入了细菌，转座子将进入细菌基因组(频率很低)，给细菌带来四环素抗性。获得一个 Tn10的稀有野生细菌，可以在选择条件下生存并形成克隆。统计大量这样的克隆会发现有25％为白色，25％为蓝色，50％为蓝色部分与白色部分的混合物。 (1)解释每种细菌克隆的来源并确定结果是否能说明 Tn10复制或不复制的转座机 制。 (2)你使用了一种无法修复 DNA错配的细菌菌株作为受体、来做这些实验。如果你用可以修复错配的细菌菌株作为受体那么结果会有什么不同? (3)λ噬菌体 DNA通过位点专一重组整合到细菌基因组上要比转座更常见，如果你用能复制但不能整合的λ噬菌体突变体结果有什么不同? 6．分析比较细菌转座子的结构与特点。 六、分析题 1.有一个被认为是 mRNA的核苷酸序列，长300个碱基，你怎样才能： (1)证明此RNA是mRNA而不是 tRNA或rRNA。 (2)确定它是真核还是原核mRNA。 2.如果两个RNA分子具有适当的序列以及配对恰当，就可以利用它们构建锤头型核酶。其中，“底物链”必须含有5’—GUN-3’(N代表任一种核苷酸)序列，而“酶链”则必须具有核酶催化中心的序列，同时与底物链配对。这样，酶链在 N核苷酸的3’端对底物链进行切割。提供适当的酶链，可以降解细胞中不能被锤头型核酶切割的RNA，这为把酶链作为阻断某些基因表达的治疗试剂提供了可能。例如，一些研究小组正在设计可以切割HIV RNA的酶链，将如何设计这种核酶的酶链?如何选择HIV RNA中的靶序列?该酶链应具有什么特点?另外，以RNA作为药物，将会碰到什么问题? 3．E. coli OH157生长得特别快。在正常(较差的环境)条件下，这些菌60-70分钟后分裂表明复制和细胞的分裂是连续的过程，一个仅在另一个完成后才起始。假如有机会生长在一个多汁的暖和的牛肉饼上，加倍的时间接近20分钟，这比复制过程所需的标准时间快 l倍。请解释原因。详细描述原核生物中 DNA的复制过程(如：结构和功能特征及一系列过程)。涉及多基因组拷贝的复制却没有发生碰撞，其复制机制如何? 4.图3.1中的 DNA片段两端为双链，中间为单链，上面一条链的极性已标出。 图3.1 一个具有单链缺口的双链 DNA分子 (1)下面一条链中所示的磷酸所连的是片段的5’端还是3’端? (2)你能设想在细胞中这个缺口怎样在 DNA修复过程中被修复的? (3)如果缺口在含有脱氧核营三磷酸和 DNA聚合酶的无细胞系统中被修复、那么底部那条链将包括几个片段? 5.除了聚合作用外， DNA聚合酶 I还具有3’→5’校正核酸外切酶的活性，在把错配碱基从新合成 DNA链末端切去的校正过程中发挥作用。为了鉴定这种活性，你制备了人工合成的 polyA链和 polyT链作为底物，其中 polyT链上含一段32P标记的 dT残基，同时其3’端还连了几个3H标记的 dC残基，如图3.2所示。分别统计在没有任何 dTTP存在，DNA不可能合成以及有 dTTP存在，DNA可以合成的两种情况下，标记 dT和 dC残基的丢失，结果如图3.3所示。 图3.2研究大肠秆菌 DNA聚合酶 I校正功能的人工底物 黑体字母表示被放射性标记的核苷酸 图3.3 DNA聚合酶 Ⅰ在含有(A)和缺少(B)dTTP时的校正功能 (1)为什么要用不同的同位素来标记 T，C残基? (2)为什么在 dTTP不存在情况下，切除 T残基比切除 C残基需要更长的时间? (3)为什么在 dTTP存在的情况下，没有一个T残基被切除，而无论是否有 dTTP， 残基都被切除? (4)若是加入了 dCTP和 dTTP。图3.3中的结果会改变吗? 6.大肠杆菌的 dnaB基因编码一个在复制叉上可将 DNA解折叠的解旋酶(DnaB)。已利用如图3.4所示的人工底物对它的特性进行了研究。实验方法是在多种条件下培养底物，然后把样品进行琼脂糖凝胶电泳。如果短单链 DNA与长的 DNA已退火结合在一起，那么泳动速率就会快些，但如果它已解折叠且已变性，则泳动速率就会慢些。把短链进行放射性标记就可选择性地跟踪它的迁移，然后用放射自显影检查它的位置。 图3.5所示为几个实验的结果，底物 l没有尾巴的杂交体，不被 DnaB解折叠(图3.5，第 1，第2泳道)；但是有尾的底物和 DnaB、ATP在37℃下温育同样能释放出大量解折叠的小片段(第6，第10泳道)。对于底物3，只有3’半片段是解折叠的(第10泳道)，所有的解折叠产物都绝对依赖于 ATP的水解。加 DNA单链结合蛋白(SSB)可在一定程度上加强这种解折叠(比较一下第5泳道第9泳道与第10泳道)。有趣的是， SSB必须在 DnaB加后3分钟加入，否则会抑制解折叠。 (l)为什么解折叠需要 ATP水解? (2)DnaB沿长单链 DNA的哪个方向移动?这个方向和它在先导链还是后随链上的移动方向是否一致? (3)为什么在加入 DnaB前加入 SSB会抑制解折叠而在其后加人 SSB又会促进解折叠? 图3.4 用来检测 DnaB的底物 图3.5几个检测 DnaB解折校实验的结果，只有单链片段被放射性标记， 它们各自的位置已在图中标明 7.一个研究小组正在利用一个环状双链 DNA作为一种动物病毒的基因组来研究它的生命周期。实验的第一步是要确定复制区的位置，同时决定复制是沿起点的单向还是双向进行。为此目的，先分离出复制中的分子,用限制酶在一个位点切割病毒基因组使其成为一个线性分子，然后用电镜来观察所得到的分子。 图3.6 是所观察到的一些分子(注意：电镜下不可能区分DNA分子的两端)。根据这一结果，如何判断： (1)复制起点是单个还是多个? (2)复制是单向还是双向? 8.实验结果表明所研究细菌的一个操纵子具有三个相似拷贝，它编码一个关键酶的亚基。由于没有检测到第三个碱基简并性(摇摆性)现象，由此说明接近的相同性(99％)是由于 DNA修饰作用的结果。请问这涉及哪些可能的机理? 9.根据对细菌限制和修复系统的知识，设计一个简单的实验来检测你收集的菌株是否有原噬菌体的存在。 10.大肠杆菌中的几个基因包括 uvrA、 uvrS、 uvrC和 recA都与紫外线损伤的修复有关，含有一个有缺陷的上述基因的大肠杆菌细胞系比起野生型细胞对紫外光的射线更敏感，就如图4.3A所示的 uvrA与 recA突变株。单个不同基因的突变可以成对联合起来形成所有可能的双突变体。比起单突变体，双突变体的敏感性变化很大。相对uvr单突 图4.3紫外光不同剂量作用下的细胞存活曲线 (A)野生型uvrA、rerA单突变体， uvrArecA硬朗双突变体的存活曲线 (B)uvrArecA存活曲线的放大图 变体，两个uvr突变形成的双突变体对紫外光的敏感性并无多大增加，但recA缺陷和任一种 uvr突变体形成的双突变体却使一个细胞株对紫外光极度敏感，如图4.3B所示的 uvrArecA双突变体放大图。 (1)为什么一个recA突变和一个uvr突变的结合会产生一个对紫外光极其敏感的细菌菌株，而不同 uvr基因突变的结合却和单个突变没有差别? (2)根据泊松分布，当一个细菌种群平均受到一个致命“轰击”，37％(e-1)的个体将存活下来，因为它们实际上并没有受到轰击。对于 uvrArecA双突变体，0.04J／m2的剂量使37％的个体存活(如图4.3B)。计算对 uvrArenA双突变体细胞株来说，多少嘧啶二聚体会组成致死轰击，假设大肠杆菌的基因组有4×106个碱基对，包括50％的GC，而且把 DNA暴露在400J/m2的紫外线下，会使1％的嘧啶对(TT、 TC、 CT和 CC)变成嘧啶二聚体。 11．除了uvrABC内切核酸酶修复、重组修复和 SOS修复，细菌还具备一种对嘧啶二聚体更有效的修复系统。这个现象是在一个关于紫外线对细菌影响的调查中为了确定一个失控的数量而发现的。发现过程可以假设为： 你与你的同事正试图利用紫外线作为诱变剂来分离大肠杆菌中的突变体，为得到足够的突变子，你觉得有必要使用对细菌杀伤率为99.99％的辐射剂量。比起你的同事你已经获得了更可靠的结果，而他要用10倍至100倍的辐射剂量才能获得同样的杀伤率。因为你常在晚上他离开后才做实验，所以他有点怀疑你结果的可靠性，他坚持你早上来做一个平行实验。当你们都得到同一结论时你们两人都感到惊奇，你有些懊恼，因为结果更接近你同事的结论；当你在晚上重复平行实验时，你的同事对结果感到很惊奇，结果正如你以前所描述的一样。 你发现在下午要取得同样的杀伤率需要用比早上更高的辐射剂量，晴天比阴天需要的剂量高，你的实验室朝西，是什么因素影响着你的实验? 12．噬菌体 T4编码一个对重组和 DNA复制很重要的单链 DNA结合蛋白(SSB蛋白)。含有编码 SSB蛋白温度敏感型基因的噬菌体 T4突变体在升高温度时会快速地终止重组和 DNA复制。 噬菌体T4 SSB蛋白是分子量为35 O00Da的单体蛋白，它和单链而不是双链 DNA紧密结合，结合体中 DNA与蛋白质的重量比为 1∶12。然而 SSB蛋白和 DNA的结合显示出一个很特别的性质，如图4.4所示。当单链 DNA过量时(10μg)，而 SSB蛋白为0.5μg时则完全检测不到结合体(图4.4A)，然而当 SSB蛋白为7.0μg时，可以看见许多二者的结合体(图4.4B)。 (1)饱和的情况下，单链 DNA与 SSB蛋白分子的分子比为多少(单核苷酸的平均分子量为330Da)? (2)当 SSB蛋白和 DNA结合达饱和时，邻近的 SSB蛋白单链能收缩吗?假设结合时，一个 SSB单体绕 DNA延伸12nm，同时与SSB结合后，单链DNA中的碱基空间排布与在双链 DNA中是否一样(即每3.4nm有10个核苷酸)? (3)为什么SSB与单链 DNA结合对 SSB的量有很强的依赖性(图4．4所示)? 13. 大肠杆菌中 lacI基因的紫外诱导突变模式已被广泛地分析。图5.1所示为独立分离到的错义(氨基酸替换)突变(线以上)和移码突变(读码框改变)突变(线以下)的总量，每类突变的数量几乎都相等。错义突变可以通过对 lacI基因所编码蛋白(乳糖的阻遏物)功能的丧失的情况来鉴定;而移码突变可以由基因融合进行测定，这种测定与 乳糖阻遏物的功能无关。 (1)为什么在基因的尾部比在基因的中间有更多的错义突变?根据什么可以判定移码突变或多或少地平均分布在整个基因上(除一两个“热点”之外)? 图4.4 噬菌体 T4 SSB蛋白与单链DNA的结合通过蔗糖梯度离心分析 SSB蛋白与DNA 的结合，发现 DNA较蛋白重得多，沉得快，因此更靠近梯度的底部 图5.1 大肠杆菌 lacI中紫外光诱导突变的模式 (2)对热点(图5.1 I)的 DNA序列分析发现，它的野生型序列为TTTTTC，而突变序列为TTTTC。另一很普遍的突变(图5．1 II)是 GTTTTC向GTTTC的转变。对其他移码的分析表明：它们几乎都是由于失去一个碱基造成的，没有发现插入。根据所知的紫外损伤本质，请提出一个可以解释单碱基对缺失的分子机制。 14．由 MNNG(亚硝基胍)引起的诱变损伤的本质以及它从 DNA上被修复的机制可以用下面的实验来鉴定。为了确定诱变损伤的本质，未经处理的细菌和已用低剂量 MNNG 处理的 图5.2 层析法分离未被处理和已被低剂量 MNN0处理的细菌 DNA中被标记的甲基化嘌呤 实线表示未被处理细菌 DNA中的甲基化嘌呤；虚线表示MNNO处理的细菌所得结果 细菌都在含50μg／ml3H-MNNC的培养物中培养10分钟。分离它们的 DNA并水解成核苷酸，然后经过纸层析分析放射性的嘌呤，结果如图5.2所示。 为了研究诱变损伤切除的机制，首先纯化负责切除的酶，把不同量的酶(分子量1900O)和已被3H标记含0.26pmoI突变碱基的 DNA一起温育，分析切除动力学。在不同时间取样，分析 DNA以确定还存在多少突变残基(图5.3)。当在5℃而不是37℃重复这个实验时，虽然最初的切除速率较慢，却得到—样的终点。 (l)哪一种甲基化的是 MNNO的致突变作用位点? (2)突变碱基中甲基的切除动力学有何特异之处?这是由于酶的不稳定造成的吗? (3)计算每个酶分子除去的甲基数，看看计算结果是否有助于解释这种特异的动力学 15．已经分离得到一个所研究的特定基因内的一系列琉璃突变。如何利用这些系列突变证实一个基因与它编码的多肽是共线性的? 图5.3纯化的甲基转移酶把3H标记的甲基从 DNA上切除所示为纯化酶的量 16．trp-1、trp-2、trp-3和 trp-4是链孢霉属不同基因中的突变，而且都导致色氨酸缺陷。这些突变体对色氨酸合成途径的假设中间产物有如下反应： trp-1 在添加邻氨基苯甲酸、吲哚甘油磷酸、 吲哚和色氨酸时能生长； trp-2 添加吲哚和色氨酸可生长； trp-3 添加吲哚甘油磷酸，吲跺和色氨酸可生长； trp-4只有添加色氨酸时可生长。 问：色氨酸合成的可能途径是什么? 17.表5.1显示三种硫胺素(thiamine)缺陷型的链孢霉突变株效应的可能前体化合物。 请推测硫胺素的生物合成途径是什么。 表5.1 三种硫胺素的缺陷型在不同培养基上生长情况 生 长 于 存 在   基本培养基 噻唑 嘧啶 硫胺素  thi-1 thi-2 thi-3 - - - - - + - + - + + +   18.可衡量单个侵染周期中病毒数量增加的一步生长曲线对确定噬菌体和细菌相互作用基本参数是很重要的，请思考下面 T4噬菌体的一步生长曲线。 少量(0.1ml)T4噬菌体的悬浮液(1010个／ml)与100ml大肠杆菌的培养物(107个／ml)混在一起在37℃下共培养。混合后5分钟，两份被侵染的细菌重复样品中加入氯仿振荡以杀死细菌，一份样品中加入溶菌酶破裂细胞，另一份不加酶，氯仿和溶菌酶对T4都无影响，测定所有样品中噬菌体的效价，结果如图6.1所示。 图6.1 T4噬菌体的一次生长曲线 (1) T4与大肠杆菌培养物混合后的初始效价为多少? (2)为什么5分钟后噬菌体的效价少于初始效价? (3)解释为什么在没有用溶菌酶处理过的样品中噬菌体效价升高比较慢而最后却达到和溶菌酶处理样品同样的水平? (4)计算每个被侵染细菌中产生多少个噬菌体? 19．把少量 T4噬菌体与过量的大肠杆菌细胞系 B混在一起，然后在含—层厚营养琼脂细菌培养基的表面上铺一层薄的软琼脂层，细菌长成一片连续的菌苔。但在被噬菌体侵染的细菌到达的地方，噬菌体增殖并杀死周围的细菌，在云状的菌落中形成—个中圆形清晰的“噬菌斑”。一种已观察到的病毒突变可以改变噬菌斑的形状，噬菌体 T4的“ r”突变体首先被注意到，因为它们可以在大肠杆菌 B的菌落中形成更大的噬菌斑(r代表快速溶菌)。 r突变体中的 rⅡ类型在大肠杆菌菌株 K中并不形成噬菌斑，虽然它们可以起始侵染大肠杆菌 K，但侵染不成功，不产生子代病毒。它们在大肠杆菌 B上可辨的噬菌斑形态及无法在大肠杆菌 K中生长的特性，很早就被用于鉴定突变的一般性质和遗传密码的三联结构。为进一步了解这些经典研究，绘出8个rⅡ型突变子让你鉴别。首先，你做了—系列斑点测试，用高浓度的突变1和突变分别侵染两个大肠杆菌 K平板，这样，每个平板上大部分细菌都被侵染了，然后你在平板上依次滴一滴每种突变型和野生型 T4噬菌体使之排列成环状。作为对照，你在一未被侵染的大肠杆菌 K平板上也做了同样的处理，过夜培养后你观察如图6．2的结果。 这些结果很有意义，但你觉得迷惑。为了确定在清晰斑上出现的是哪种噬菌体，你从野生斑和突变5形成的清晰斑中收集一些噬菌体并检测它们的生长情况。如你所料。从野生斑上收集的噬菌体在大肠杆菌 B和 K上都可形成正常的噬菌斑。在突变5斑块上收集来的大多数噬菌体仍显示出突变体的性质：它们可以在大肠杆菌 B上形成 r噬菌斑，但不能在大肠杆菌 K上生长；但来自突变5斑块上的某些噬菌体却表现为野生型：它们可在两个细胞株中形成正常的噬菌斑，野生型出现的频率很高，不可能来自反向突变(回复突变)，因为反向突变即使发生，频率也只有10一5-10-6 。 图6.2 多种 rⅡ突变体的斑块测试 (1)为什么斑块试验中有的突变噬菌体混合物可以生长而有的不行? (2)如果用突变3侵染大肠杆菌 K重复斑块试验，预计一下有怎样的生长模式。 (3)在突变5形成的清晰斑中少量野生型 T4是怎样产生的? 20．试证明一个基因中只有一条 DNA链作为模扳被转录。 21．经过测序分析，欲克隆的一段 DNA序列如下: GAATTCCGGCGGCGGGGTTTTCATTATTATGATCGTTGACATGGGACAAGGGGCTCCTATAATAGGTGC ATTTGTAGGGGATGTGGCCACATGATAGCGCGTCGAGGCATTCAGGACCGATATTGTCATATTGCCAGC ATGCTGCAGCGCGCCAACTTAGTTACAACTTATACGATGATTTTAAAAAAGAATATCAAATAGCCATC CACCCGAAAGACCACCGCAAGTATCGGTACGATCGTACCAGCACACACCACAGTCGCCAGTCTGTTACC AAATAATAAAGTTGATAATTAATTCACATCTACCTGGGTAACCCAGGTAGATGTGAATTTTAGAATTC 这段序列被克隆到某多拷贝质粒的一个EcoRⅠ限制性位点，并表达了一个小肽，请找出这段序列中所含有的以下几个功能位点： (l)两个EcoRⅠ位点 (2)一个启动子 (3)一个转录起始位点 (4)一个转录终止子 (5)一个核糖体结合位点 (6)一个翻译起始密码子． (7)一个翻译终止子 另请标出相应的调控序列及编码区的氨基酸。 22．现分离了一DNA片段，可能含有编码多肽的基因的前几个密码子。该片段的序列组成如下： 5’ C G C A G G A T C A G T C G A T G T C C T O T G 3’ 3’ G C G T C C T A G T C A G C T A C A G G A C A C 5’ (1)哪一条链作为转录的模板链? (2)mRNA的顺序是什么? (3)此mRNA能形成二级结构吗? (4)翻译从哪里开始?朝哪个方向进行? (5)此DNA最可能是从原核细胞还是真核细胞中分离的? 23．简述互补实验怎样区别突变是发生在 lac操纵子的结构基因上还是它的调控序列上? 24．用含中性碳源(例如甘油)的液体基本培养基培养 E．coli不能诱导lac Z操纵子。 一小时后在培养基中加入乳糖和再隔一段时间加入过量的葡萄糖分别会对lac操纵子的表达有什么影响? 25．当 lacZ—或 lacy—突变体生长在含乳糖的培养基上时，lac操纵子中剩余的基因没有被诱导，解释是何原因。 26．蜜二糖是 lac操纵子的弱诱导物，它通常在自己的透性酶作用下进入细胞。但如果细胞在42℃下生长，透性酶失去活性，则蜜二糖只有在lacY透性酶存在的情况下才能进入细胞。这样，42℃下lacY— 和lacP-的突变株不能在以蜜二糖为唯一碳源的培养基上生长。如何通过这种特性分离lac操纵子的组成型突变? 27．图9.1绘出了基因组 DNA的一个区域和该区域相对应的 cDNA的限制性酶切图谱。 有多少个内含子存在于该基因组 DNA上? 图9.1 —段基因组 DNA及其 cDNA的限制性酶切图谱 限制酶的字母缩写：B,BamH I;C.Cla I;H, Hind Ⅲ;R, EcoR I; S, Sal I AAA,poly(A)尾巴 28．现在对人类基因组的主要研究工作是进行基因组的序列测定。然而，有人根据人类基因组是由重复序列组成为由。认为反复对同一种 DNA进行测序是不明智的。你能否拟定两份计划，—份计划应保证仅仅单一序列 DNA被测序，第二个计划应允许仅仅转录的单一DNA序列被测序。请简述你的两份计划。 29. 最初科学家是如何证明内含子两端的保守序列对正确剪接的重要性？ 30．什么证据表明活性基因带有DNase I的超敏位点? 31．表面抗原的变异和哺乳动物免疫多样性都是 DNA重排的结果。锥虫通过 DNA重 排选择表达所携带的一千多个不同的 VSＧ基因中的一个。而哺乳动物细胞则通过 DNA重排产生成百上千个不同的抗体，包括与 VSG蛋白反应的抗体，尽管抗体在数量上的优势，锥虫仍然能够成功地逃避宿主的免疫系统，为什么? 32．请解释酵母的交配型系统为什么可以作为DNA 重组、染色质结构对基因表达的调 控、染色体结构域的保持、转录元件间的蛋白互作、基因表达的细胞类型特异性以及信号传递激活基因的例子。 33．锥虫的表面抗原转变与酵母中的交配型转换有何相似之处?有何不同? 34．解释剂量补偿，在哺乳动物和果蝇中是怎样实现的? 35．列举证明雌性哺乳动物中 X染色体失活随机发生的证据。 36. 什么是可变剪接？它是怎样造成： (1)在不同的组织中基因活性不同？ (2)单个基因翻译产生两个不同的多肽？ 37．在RNA聚合酶的分析中，3H—UTP作为标记的核苷酸，它的比活性是500μCi/μmol (1μCi=2.2×106计数／分钟)。温育10分钟之后，经三氯乙酸沉淀，用对3H效率为60%的液闪计数器测得放射险强度为692521计数每分钟。 (1)请计算掺入到RNA分子中UTP的量(nmol)。 (2)假定RNA分子中的尿嘧啶占30％，请计算RNA分子中掺入核苷酸总的纳摩尔数。 (3)如果 DNA摸板改用 poly(dGdC)，UTP是否可以掺入? (4)如果新合成的RNA分子的核苷酸组成是：20%的 C，32％的G，30％的 U和18%的A，写出转录的DNA链及双链DNA的核苷酸组成的百分比。 38．TFⅢA是5S rRNA基因表达所需的转录因子，这个蛋白含有9个锌指结构域，与5S rRNA基因内的一段序列和5S rRNA本身结合。 (l)如何定位 TFⅢA蛋白的 DNA结合位点? (2)什么样的突变可以证明锌指是 DNA结合所需的? (3)有人发现 TFⅢA C端缺失19个氨基酸后与 DNA结合的能力与野生型一样，但是不能激活5S rRNA基因的转录，请解释原因。 (4)XenoPus的卵母细胞中合成并贮存了大量的5S rRNA，随着5S rRNA的积累，TPⅢA与之结合，这对5S rRNA基因的转录有何影响?调控这个过程的机制是什么? 39. 转录因子 SPl结合的序列是GGCGGG。图 11.1是 SV40早期启动子序列，其中有6个用下画线标出的“GC”框。限制酶Nde Ⅰ和Sma Ⅰ的酶切位点也表示出来。请从该 DNA片段和纯化的 SPl开始，详细描述如何用 DNase I定位出 SPl在 SV40早期启动子上的结合位点。请注意说明起始物质是如何被标记的，以及所有必要的控制步骤， 如何利用这一信息揭示哪个位点对 SPl亲和性最高? 图 11.1 SV40早期启动子序列 40. 为什么被RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子不常见? 41. 什么是增强子?它们与其他调控序列有何不同? 42．在酵母中，上游激活序列是如何调控半乳糖基因的表达? 43. 最初科学家是如何证明内含子两端的保守序列对正确剪接的重要性？ 44. 什么是可变剪接？它是怎样造成： (1)在不同的组织中基因活性不同？ (2)单个基因翻译产生两个不同的多肽？ 45．一段从E.coli中分离出来的DNA单链序列为： 5’—GTAGCCTACCCATAGG—3’ (l)假设mRNA是由这段 DNA单链的互补链作为模板转录而来， mRNA的序列怎样? (2)如果转译从mRNA的5’端开始，将得到什么样的多肽(假设并不需要起始密码 子)?当tRNAAla离开核糖体后，核糖体将结合什么样的tRNA？当Ala的氨基形成肽键后，如果有化学键断裂，是什么键?tRANAla又将怎样? (3)这个RNA可编码多少种不同的肽?如果以另一条 DNA单链作为模板，还会得到相同的肽吗? (4)假设这条 DNA链像 A中所说的那样被转录，但不知道用哪个可读框。请判断 这个 DNA是来自一个基因的头部?中部?还是尾部? 46．某研究小组正在研究单细胞纤毛虫——四膜虫的蛋白质合成，并获得有关四膜虫的一种蛋白质C端氨基酸和核苷酸部分序列： I M Y K Q V A Q T Q L * AUU AUG UAU AAG UAG GUC GCA UAA ACA CAA UUA UGA GAC UUA 实验中遇到了一些困难，主要是不能利用网织红细胞(一种体外分析蛋白质合成的 标准系统)的裂解产物来翻译经纯化的四膜虫mRNA。尽管 mRNA的质量很好，但翻译产物却都是小分子多肽(图13.1，泳道1)。 (1)关于四膜虫蛋白质序列的数据有些什么不寻常之处? (2)有人认为弱高分子量带是纯TMV mRNA在网织红细胞裂解产物中产生的你认为如何? (3)解释一下单独加人四膜虫mRNA与四膜虫细胞浆同时加入情况下主 TMV蛋白质与次TMV蛋白质比率变化的根据，四膜虫中的什么成分是四膜虫mRNA高效翻译所必需的? (4)这一结果在进化上暗示什么? 47．考虑下面血红蛋白α、β链协调合成的实验。家兔的网织红细胞被3H-Lys标记 l0钟(标记时间相对一条珠蛋白单链的合成是足够的)，然后离心分离带新生链的核糖体，除去可溶珠蛋白。新生珠蛋白链被胰蛋白酶消化，使肽链 C端以 Lys或 Arg结尾，接着用HPLC(高效液相色谱)分离出这些肽并测定它们的放射性。图13.2为每条肽链中相对Lys 残基的位置的放射性标志图。 (1)根据这些数据是否可以推断珠蛋白合成从哪一端开始?(N或 C)怎样推断? (2)两种珠蛋白以怎样的比率合成?通过这些数据是否可以估计α-珠蛋白和β-珠蛋 白对应 mRNA的分子数? (3)一旦遇到终止密码，肽链还能与核糖体结合多久? (4)曾经有人假设在珠蛋白合成过程中血红蛋白被加入初生珠蛋白中，而且，只有加入血红蛋白核糖体才会前进。图13.2中的直线表明核糖体并没有很明显地暂 停，而现在认为血红蛋白是合成后才加入的。假设核糖体在 mRNA上移动的半途中有一巨大的障碍，请从图13.3中选择最能表示结果的一幅。 48．细菌中的终止密码子是由两种蛋白质中的一种解读的。释放因子 l(RFl)识别 UAG 和UAA，而 RF2则识别 U9A和UAA。编码 RF1和RF2的基因已被克隆和测序。比较了编码 RF2的基因核苷酸序列与蛋白质的氨基酸排列顺序后，有一惊人的发现，如图13．4中基因图谱所示，终止密码包含在基因序列之中。为排除干扰，基因和蛋白质的序列已经过仔细的检查。请问： (1)令人惊奇的是什么? (2)这暗示了与 RF2基因表达调控有关的什么假设? 49. 蛋白质合成的整体准确性是很难衡量的，一方面，因为极端的准确和错误是罕见的,而且细胞似乎能很快地消灭它们的错误; 另一方面，技术上也有困难。比如，能够确切鉴定一种蛋白质到哪种程度，从概念上说，这和知道怎样提纯，鉴定是两码事。解决这个问题的一个聪明的方法是利用细菌鞭毛虫惟一蛋白：鞭毛蛋白(分子量为40O0O)。鞭毛蛋白有两个优点：首先，鞭毛(即鞭毛蛋白)能被从细菌上切下并用差速离心纯化，另外，鞭毛蛋白中不含 Cys，因此允许利用 Cys错误加人肽链进行灵敏的检测。 为了放射性标记 Cys，细菌在含35SO42—(放射活性为5.0×103 cpm/pmol)和过量的未标记 Met的生长培养基中恰好生长一个世代(这种情况下无可测出的放射性进入Met)，把所得的鞭毛蛋白纯化并在 SDS—聚丙酰胺凝胶电泳，发现从凝胶上回收的8μg鞭毛蛋白中含有35S带来的放射性为300cpm。请问： (1)在放射标记时期内合成的鞭毛蛋白分子中有百分之几含有 Cys?假设在标记期间，鞭毛蛋白的总量加倍且鞭毛蛋白中 Gys的特异活性与用来标记细胞的35SO42-的特异活性是一样的。 (2)在鞭毛蛋白中， Cys在 Arg密码子 CGU和 CGC的位置错误地加入，在反密码子一密码子互相作用的过程中，出了什么错误才会导致以上结果? (3)假设在鞭毛蛋白中有18个Arg，而且所有 Arg的密码子都相同，那么每一个敏感 Arg密码子(CGU和 CGC)错读的机率是多少? (4)假设上面算出的密码子出错率对所有氨基酸都同等适用，估计一下各长100、1000、10000个氨基酸蛋白质在合成中正确合成的分子占百分之几? 50．区别重叠遗传密码和非重叠遗传密码，何以证明遗传密码是非重叠的? 51．简述最初证明遗传密码一般性质的实验。 52. 在用 T4噬菌体 rⅡB 突变体进行的实验中， Crick和 Brenner将不同的单碱基插入或单碱基缺失突变重组到单一基因型的菌株中。大多数双重突变体为野生型，而其他仍然是rⅡB突变型，解释原因。 53. 在体外的蛋白质合成系统中，多聚(AC)刺激苏氨酸和组氨酸掺人多肽链，而多聚（AAC)可产生多聚天冬氨酸，多聚苏氨酸和多聚谷氨酸。从中判断哪一个密码能被确定编码哪一个特定的氨基酸? 54．MS2噬菌体含有一单链的RNA，既是染色体又作为信使。下面是编码蛋白质外壳基因开始的一段序列及蛋白质外壳相应的 N端氨基酸序列： 密码 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 核苷酸 AUG GCU UCU AAC UUU ACU CAG UUC GUU CUC… 氨基酸 Ala -Ser -Asn -Phe -Thr -Gln –Phe -Val -Leu… (1)为什么蛋白外壳的 N端没有甲硫氨酸残基? (2)下列的突变将会对蛋白外壳的氨基酸组成有何影响? ①密码4中缺失一个 A。 ②密码4中的 C缺失。 ③密码6中的 U被 G替代。 ④密码6中的 A被 G替代。 55．许多自发突变涉及 DNA中单碱基的置换，而且当它们发生在编码序列之内时可能引起多肽中单个氨基酸的置换。当 Try被其他氨基酸替代时可能是由于哪些单碱基 的置换? 56．一种野生型E.coli，菌株的一种蛋白质的108位为Val残基，分离出三种突变体(A，B 和 C)发现它们在这个位置分别是 Gly,Glu和 Leu。A和 B的回复突变株中这个位置上的氨基酸分别是Trp和 Lys，突变 C没有做进一步的实验，解释上述结果并推测六种菌株中该位置上的密码。 57．上题中 A， B和 C中哪两个菌株的杂交将会由于108位密码内的交换而产生野生型重组体? 58．在一个体外蛋白翻译系统， poly(UC)可被翻译成由 Phe和 Cys组成的蛋白，但其中没有 Ala。1962年 Chapeville用拉内镍(Raney nickel)处理携带 Cys的tRNA，削弱了 Cys与 Ala的连接，当这种被改变的氨酰tRNA用于体外系统中时， Ala能掺入蛋白中，解释该结果的重要性， 59．种子在储藏过程中发生了某种变化，使得长成的水稻很容易被一种病原菌感染。据推测可能是某一化学诱导的突变导致一个具有抗菌功能的关键酶丢失。请设计一个实验验证这种推测是否正确，如何使种子重新获得对这种病的抗性? 提示：根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有通过其 Ti质粒将细菌 DNA带入植物基因组的独特功能。 60．一个人类疾病基因被定位在7号染色体一段140kb的区域内，并已分离到此染色体区段的克隆，但是并不知道该基因定位在此区域的哪一位置。可用什么方法找到该基因? 61．如何以大肠杆菌质粒 DNA为载体克隆一个编码动物激素的基因，并使之在大肠杆 菌中进行表达?简要说明实验中可能遇到的问题及可能的解决办法。 62．用BamH Ⅰ切割一重组质粒 DNA分子并从中分离纯化了两个 DNA片段，一段长 400bp，另一段长900bp。现在希望将这两个片段重新连接起来，得到如图22．1所示的结果。 于是将这两种片段混合起来，并在连接酶的存在下进行温育，分别在30分钟和8小时取样进行凝胶电泳分析，令人惊讶的是，连接产物并非是理想中的1.3kb的重组分子，而是一种复杂的片段模式(图22.2A)。同时发现随着温育时间的延长，较小片段的浓度逐渐降低，大片段的浓度逐渐增加。如果用 BamH I来切割连接后的昆合物，则起始的片段可以重新产生(图22.2A)。 从凝胶中分离纯化出1.3kb的片段，并取出一部分用 BamH I进行切割，以检查它的结构。正如预料的一样，出现了两个原始的带(图22．2B)。但是用 ECoR I切割另一部分样品，希望能够产生两个300bp和一个长度为700bp的核苷酸片段，然而，凝胶电泳的结果，令人惊奇(图23．2B)。 (1)在原始连接混合物中为什么有如此多的带? (2)为什么用EcoR Ⅰ切割纯化的1.3kb连接物会产生那么多的片段? 图22.1 杂合基因的结构 图22.2 纯化DNA片段连接后电泳检测 63. 四膜虫是一种双核有纤毛的原生动物。小孩(微核)含有细胞染色体的主要拷贝，它 参与细胞的性接合，而并不在通常的基因表达中起作用。大核(巨核)含有细胞基因组的“工作”拷贝，由大量基因大小的双链 DNA片段(微染色体)组成，它们活跃地进行着转录。含有核糖体RNA基因的微染色体拷贝数很多，可以用梯度离心进行分离。 在电子显微镜下检查，每一个核糖体微染色体是一种长为21kb的线性结构。进行凝胶电泳时，核糖体微染色体的迁移也是21kb(图22.3的第一泳道)。但是，如果用限制性内切核酸酶 BglⅡ切割微染色体，产生的两个片段(13.4kb和3.8kb)的总和不等于21kb(图32.3的第二泳道)，改用其他的限制性内切核酸酶切割，所产生的限制性片段 图22.3 四膜虫核糖体微染色体限制性分析数字指的是带的长度(kb) 的总和也都小于21kb，并且不同种酶切割产生的片段总和都不一样。如果把未经切割的微染色体先进行变性和复性处理，然后再进行凝胶电泳，所得到的双链DNA片段只有10.5kb(图22．3第三泳道)；与此相似的是，将 BglⅡ切割的微染色体进行变性和复性，电泳后，13．4kb的片段被6．7kb的片段所 取代(图22．3第四泳道)。请解释为什么限制性片段的总长度不等于21kb?为什么变性和复性之后电泳的结果有所改变?对于核糖体微染色体中的总序列组成你有什么看法? 64．X染色体的失活是一种独特的发育调控机制，它关闭了整个染色体上的所有基因的表达。在人类 X染色体中，失活作用涉及到1.5×108以上的碱基对和几千个基因。在女性中，两条 X染色体中的任何一条失活所造成的 X连锁基因的表达与正常男性单个 X染色体上基因表达的结果是相同的。虽然失活的机理仍不了解，一般认为失活作用是在染色体的特定区域即 X失活中心开始的，然后扩散到染色体的其他部分。 虽然失活染色体上的大多数基因被关闭了，但少数仍有活性，因此，可以推测 X的失活作用与 X连锁基因的表达模式有关。为了验证这种推测，分离了大量的人的 X染色体基因的 cDNA并用 Northern印迹法检查它们的表达。比较了这些基因在 X染色体正常的男性和女性细胞中的表达、在 X染色体异常的男性和女性个体中的表达、以及在啮齿动物：人细胞杂交株中的表达，这种杂交株保留了一个失活的人的 X染色体(Xi)或是一个有活性的人 X染色体(Xa)。 在四种 cDNA中，发现了三种表达模式， A、 B、 C三种 cDNA示于图22.4。 图22．4来自于不同细胞中不同数目、不同类型 X染色体的 Northern印迹分析 RNA先进行凝胶分离，吸印到硝酸纤维素膜上，同 A、B、 C三种 CDNA混合探针进行杂交， 最后进行放射自显影。对应于基因 A、 B、 C的RNA带的位置是通过不同实验决定的 (1)指出每一种表达模式中表达的基因是来自于活性染色体、非活性染色体，还 是二者都有。哪一种是最普遍的，哪一种是最特殊的? (2)根据不正常个体细胞的结果，归纳出一条规律以说明在 X染色体失活过程中，有多少染色体被失活，多少保留活性。 65．许多引起人遗传病的突变都是由单个核苷酸的取代而造成的。寡聚核苷酸的连接作用可提供一个快速检测单个核苷酸差异的手段。这种分析方法要使用成对的寡聚核苷酸：其中一个被生物素标记，另一个具有放射性标记或荧光标记，图22．5B的一对寡聚核苷酸是为了检测镰形细胞白血病(图23．5A)而设计的。 在分析过程中，分别将不同个体的 DNA在有 DNA连接酶的存在下，两两配对进行寡聚核苷酸杂交。将生物素酰化的寡聚核苷酸结合到固相支持物的抗生物素链霉蛋白上，然后通过放射自显影检查杂交结果，如图22.4C所示。 (1)你认为βA与βs寡聚核苷酸会同时与βAβs DNA杂交吗? (2)这种分析是怎样区别βAβsDNA的? 图22.5寡聚核苷酸连接分析 (A) β球蛋白基因的β镰形细胞(βs)突变区的序列。(B)用于连接分析的特异性的寡聚核苷酸；(C) βA与βs之间单个碱基差异的检测分析，将生物素酰化的寡聚核苷酸收集在一个点，然后测定放射性 66．RFLP能够用于跟踪特定染色体区域的遗传。在一定的条件下，可用靠近缺陷基因的RFLP来测定末出生胎儿是否有基因缺失。一对夫妇来进行遗传咨询，他们的第二个孩子出生后不久死于一种遗传性疾病，母亲又一次怀孕了。已夭折的孩子是家系中受此遗传病影响的第二例，另一例是孩子奶奶(父亲的妈妈)的一个兄弟。这对夫妇想知道这次所怀的孩子是否也有这种遗传病。你已经研究过这种病的遗传性，并且知道是由常染色体的隐性基因所引起。在这种致病基因所处的染色体区内，发现整个人群中有几个限制性位点的多态性，如图22.6A所示，多态性位点用符号表示。你分离了双亲、祖父母、以及正常孩子的 DNA样品，并用限制性图谱来分析它们的特性，结果示于图22.6B。现在开始检测胎儿，请预测什么样的限制性酶切 结果表明很可能具有遗传病? 图22.6 携带有致病基因染色体的限制性图(A)及来自不同家族成员的限制性模式(B) 在(B)中，A、B、C表示多态性位点，圆圈代表女性，方框代表男性，三角代表末出生的孩子 67．你打算将一个具有KpnⅠ末端的 DNA片段克隆到具有 BamHⅠ末端的载体中。问题是 BamHⅠ和KpnⅠ的末端是不匹配的，BamHⅠ是5’突出端，Kpn Ⅰ则是突出的3’端(图32．7)。一位朋友建议用图22.7所示的寡聚核苷酸“片段”来进行连接。你并没有马上意识到这种方法是可行，因为你想到的连接作用需要邻近的5’磷酸和3’羟基。虽 图22.7 用一种寡聚核苷酸片段连接不互补的限制性末端的图解 然寡聚核苷酸分子被限制性内切核酸酶切割后会产生合适的末端，但是，合成的寡聚核 苷酸的末端都是羟基。另外，虽然图22.7中接头是BamHⅠ-KpnⅠ，但另一个接头却是KpnⅠ-BamHⅠ，你怀疑相同的寡聚核苷酸是否能够适合这两种方式的连接。 (1)画出KpnⅠ-BamHⅡ结合体和所需要的寡聚核苷酸片段的图，这种寡聚核苷酸 与图22.7所示的是否相同? (2)画出用连接酶处理过的分子图，指明被连接的缺口。 (3)你朋友的图解方法有效吗? 68．λYES(酵母—大肠杆菌穿梭载体)是构建 cDNA文库的高效载体，这种载体是λ噬菌体基因组与一个在大肠杆菌和酵母中都能复制的质粒巧妙结合而成，它兼有病毒和质粒载体的优点。 cDNA被插入载体的质粒部分，然后它能在体外被包装人病毒颗粒中，包装起来的载体感染大肠杆菌的效率比质粒本身要高得多。一旦进入了大肠杆菌，λYES中的质粒序列能够被诱导重组出λ基因组，并进行独立复制，这就可以从质粒中分离出来，以便进行进一步的遗传操作。 为了最大限度地提高克隆效率，载体用只有一个切点的限制性内切核酸酶Xho Ⅰ (5’C↓TCGAG)进行切割，然后在 dTTP存在的情况下、同 DNA聚合酶一起进行温育。将一种具有平末端的双链 cDNA同一段含由两段寡聚核苷酸组成的双链寡聚核苷酸接头连接起来，这两段寡聚核苷酸的序列是：5’—GGAGATTTACC和5’—GGTAAATC，它们的5’端都是磷酸。然后将载体和 cDNA混合并连接在一起。采用这种方法用2μg的载体和0.1μg的 cDNA，构建了一个有4×107个克隆的 cDNA文库。问： (1)假定载体长为43kb， cDNA的平均长度是 1kb，请估计在连接混合物中，载体 分子同 cDNA的比例是多少? (3)在此过程中，载体分子转变成重组体的频率是多少(每对核苷酸的平均分子量是660Da)? (3)说明怎样处理载体和 cDNA分子，才能把它们连接到一起。处理过的载体本 身能自连吗? cDNA呢？ (4)载体和 cDNA分子要经过怎样的处理才能提高产生重组 DNA分子的效率? (5)能够用 Xho Ⅰ从重组质粒中切出 cDNA吗? 69．一个癌基因，从序列上看似乎编码一个转录因子。当放在细胞中表达时，该基因的产物是完全不溶的，这阻碍了对其功能的直接检测，免疫染色表明，这种蛋白定位于细胞核内，如同推测的一样，是一种转录因子。如果能够测出它所结合的 DNA 序列，就可以通过现有的序列资料中查找已知基因启动子的天然位点，从而能够找到它所调节的基因。 有人建议用 PCR扩增同该蛋白结合的微量 DNA，思路(图22.8)是：(l)合成一组长为26个碱基的随机序列的寡聚核苷酸混合体，在该序列的两侧各有一段25个碱基的序列作为 PCR扩增的引物位点(图22.8A)；(2)把这些寡聚核苷酸加到含有转录因子的细胞粗提取物中，转录因子可以同含有结合位点的寡聚核苷酸结合；(3)用转录因子特异的抗体分离同转录因子结合的寡聚核苷酸；(4)用 PCR扩增选择到的寡聚核苷酸进行序列分析。 按照这一思路，用0.2ng单链随机序列的寡聚核苷酸开始了这项实验，这个寡聚核苷酸可以同一个 PCR引物结合成部分双链，经过如图22.8B所示的四轮选择和复制后，用BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ消化分离到的 DNA，将片段克隆到质粒中去，并测定了10个独立的克隆(表22.1)，问： (1)转录因子结合的保守序列是什么? (2)结合的保守序列具有对称性吗?也就是说，具有回文结构吗?据此，能否判断转录因子是以单体还是以二聚体的形式同 DNA结合? (3)在0.2ng的样品中有多少单链的寡聚核苷酸?(一个核苷酸的平均质量是330Da)。 图22.8用随机的寡聚核苷酸选择和扩增特异的 DNA序列 A．用于选择的原初随机序列的寡聚核苷酸， N代表任何一种核苷酸； EcoRⅠ和BamH Ⅰ位点有利于选择 DNA的克隆和序列分析。 B.同序列特异的 DNA结合蛋白结合的寡聚核苷酸的选择和序列分析方案 表22.1 10个克隆的序列 GAATTCGCCTCGAGCACATCATTGCCCATATATGGCACGACAGGATCC GAATTCGCCTCTTCTAATGCCCATATATGGACTTGCTCGACAGGATCC GGATCCTGTCGGTCCTTTATGCCCATATATGGTCATTGAGGCGAATTC GAATTCGCCTCATGCCCATATATGGCAATAGGTGTTTCGACAGGATCC GAATTCGCCTCTATGCCCATATAAGGCGCCACTACCCCGACAGGATCC GAATTCGCCTCGTTCCCAGTATGCCCATATATGGACACGACAGGATCC GGATCCTGTCGACACCATGCCCATATTTGGTATGCTCGAGGCGAATTC GAATTCGCCTCATTTATGAACATGCCCTTATAAGGACCGACAGGATCC GAATTCGCCTCTAATACTGCAATGCCCAAATAAGGAGCGACAGGATCC GAATTCGCCTCATGCCCAAATATGGTCATCACCTACACGACAGGATCC   注：画线的序列是 PCR引物部位，两种序列都是从BamH Ⅰ末端开始，所有序列中结合位点的方向都是相同的。 (4)假定实验开始时所用的寡聚核苷酸混合物中，每一个中心部位的26个核苷酸组成确实是随机的，那么有没有可能所有长14bp的序列都存在于开始的样品中呢? 70. 打算将一个 cDNA克隆到一个表达载体，以便在E.coli中大量制备相应的蛋白质。 这个cDNA的两侧具有 BamH Ⅰ的位点，因此计划将它从BamH Ⅰ的位点插入载体中。实验严格地按照克隆手册中的方法进行：载体用BamH Ⅰ切割以后，立即用碱性磷酸酶处理，除去5’磷酸。接着将处理过的载体同用BamH Ⅰ切割的 cDNA片段混合，加入DNA连接酶后进行温育，连接之后，将 DNA同已处理过的可以接受 DNA的细菌感受态细胞混合。最后，将混合物涂布在加有抗生素固体培养基的平板上。由于载体上带有抗生索的抗性基因，所以，转化的细菌能够存活。 实验中同时设置了4个对照： 对照1：将末同任何载体接触过的细菌细胞涂布在培养平板上； 对着2：将未切割载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上； 对着3：将经切割(但未用碱性磷酸酶处理)并用连接酶连接(但没有 cDNA片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上； 对照4：将经切割(并用碱性磷酸酶处理过)并用 DNA连接酶连接(但没有 cDNA片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上。 在进行第一次实验时，感受态细胞不是自己制备的，结果，在所有的平板上都长出了多到无法计数的菌落(表22.2)。在第二次实验中，自己制备感受态细胞，但这一 次，所有的平板上都没有菌落生长(表22．2)。接着又进行了第三次实验，这次得到了转化子(表22.2)。从实验平板上挑出12个菌落，分离了质粒 DNA，并用BamH Ⅰ进行切割，其中9个克隆产生大小同载体一样的单一的一条带，另三个克隆中切出一个 cDNA片段，实验终于获得成功。 (l)你如何看待第一次的实验结果?对照 1的目的是什么? (2)影响第二次实验结果的原因是什么?对照2的作用何在? (3)对照3和4各有什么作用? (4)为什么要用碱性磷酸酶处理载体? 表22.2 cDNA克隆的结果 制备的样品 实验结果   1 2 3  对照1 只有细胞 TMTC 0 0  对照2 未切的载体 TMTC 0 >1000  对照3 省去磷酸酶处理，无cDNA TMTC 0 435  对照4 无cDNA TMTC 0 25  实验样品 TMTC 0 34  注：TMTC=too many to count, 多到无法计数 71. 打算在细菌中表达一种稀有的人类某种蛋白质，以便能够大量制备这种蛋白。为确保分离纯化，决定将一段6个组氨酸的短肽加到该蛋白质的 N端或 C端。这些带有组氨酸标签的蛋白质能够紧紧地同 Ni2+柱结合，但很容易被 EDTA或咪唑溶液洗脱。此法可以一步完成大量蛋白质的纯化。 图22.9是编码该蛋白的核苷酸序列。请设计一对 PCR引物，各含有18个同该基因同源的核苷酸，能够用于扩增该基因的编码序列，另外，在 N端有一个起始密码，其后是6个组氨酸密码子。另设计一对引物，能够在C端加上6个组氨酸和一个终止密码。 图22.9 欲修饰蛋白质的 N端和 C端的核苷酸序列 编码的氨基酸序列用一个字母标在下面。星号(*)代表终止密码。 此图只标出了双链 DNA上面的一条链 72．从E.coli中分离到一种hemA突变体，这种突变是不可恢复的，并且需要生长在琥珀酸的平板上才能利用δ—氨基乙酰丙酸合成血红素。希望利用该突变体去克隆E.coli的hemA基因。首先用Sau3A部分酶切E.coli的 DNA，得到的 DNA片段平均为2kb，然后将这些片段从BamHⅠ位点克隆到质粒 pBR322中，连接后转化 hemA突变体。根据氨苄青霉素抗性来选择重组体。将筛选到的氨苄青霉索抗性克隆重植在加有δ—氨基乙酰丙酸的平板上进行测试。请问：已经测试的 Ampr抗性转化子中有多少不再需要在培养基中添加琥珀酸?( E.coli基因组的全长为4500kb) 73．raf—1基因编码一种对脊椎动物的发育有重要作用的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶。在果蝇中，当这个基因有缺陷时，胚胎在囊胚期的发育还是正常的，但此后的发育是不正常的，形成一个断尾的胚，也就是缺少后面的四段。在脊推动物中，成纤维细胞生长因子(FGF)刺激中胚层的诱导和后期的发育，同时认为， Raf-1蛋白参与了由FGF启动的信号传递。 Raf-1蛋白由两部分组成，一部分是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域，即分子的 C端(占该分子的1/2)，另一部分是N端的调节结构域，这个结构域在没有接受合适信号的情况下，抑制蛋白激酶的活性。 为了检查 Raf-l的作用，按照方案设想，改变了ATP结合区的一个关键氨基酸残基，构建一个显性负作用的raf—cDNA。这种突变的 cDNA编码一个有缺陷的激酶蛋白质，命名为 NAF(没有功能的 Raf)。从 raf-1 cDNA和 NAF的 cDNA制备了RNA，并将它们单独地或混合地注射到2—细胞蛙胚胎中，以确定它们对蛙发育的影响。实验结果列于表22.3中。在某些注射体中，短尾的表型非常明显。 表22.3 raf-1和NAF RNA对 2-细胞蛙胚的注射 注射物质 总存活数 蝌蚪的表型    正常（%） 短尾（%） 其他异常（%）  raf-1 RNA 94 75 0 25  NAF RNA 80 40 36 24  raf-1 and NAF RNA 93 73 5 22  水 101 92 0 8  未注射 80 99 0 1  (1)请问实验结果能够提供证据证明 Raf-l参与脊椎动物后期发育的假设吗?如果可以，那么它们是怎样证明的? (2)请对 Raf—1蛋白进行一些描述，并提出为什么 NAF可以作为显性负作用蛋白的看法。 （3）为什么raf-1 RNA和NAF RNA混合注射产生短尾表型的频率较低？