第五章：质谱法测定分子结构
1
有机质谱原理及应用
第五章：质谱法测定分子结
构 (II),大分子
第五章：质谱法测定分子结构
2
?方法,ESI和 MALDI两种电离方法。
?对象：带有官能团的可溶解高分子。
1988年,Tanaka,最早报道聚乙烯醇 (PEG),~22,000。
1992年,Danis,MALDI,聚丙烯酸和聚苯乙烯磺酸,~30,000。
M,Karas & F.Hillenkamp MALDI,聚苯乙烯 ~70ku,PEG ~40ku。
1996年,C,Fenselau,聚苯乙烯 ~1500ku。
§ 5.1 高聚物质谱分析
第五章：质谱法测定分子结构
3
一、质谱方法分析高聚物的特点
1、人工合成高聚物的复杂性
? 合成高分子是混合物，分子量是一种分布。
? 不同的引发和终止反应所得的高分子有不同的端基。
? 在随机共聚物中，高分子链的组成呈现某种化学分布。
? 在嵌段共聚物中存在着不同的嵌段长度和顺序。
? 非线性高分子，如环状、支链和树枝状高聚物。
2、质谱分析高聚物的特色
? 样品用量少、耗时短、速度快。
? 仪器分辨率高．使单体分析和端基分析成为可能。
? 直接测定绝对分子量，而不是相对分子量，精度高于光散射和膜渗透方法。
? 测定分子量时，不需要标准品或 Mark-Houwink常数。
? 由分子量分布可获得聚合反应的链增长常数。
第五章：质谱法测定分子结构
4
二,MALDI-TOF方法测定高聚物影响因素
1、基质
基质的作用：
? 从激光脉冲中吸收能量。要求：基质对激光光源必须有很强的吸收。
? 使被测分子分离成单分子状态。要求：基质和被测高分子具有很好的
相容性，同时不能有强的分于间的相互作用。
? 使用不同种类的激光 (IR,UV)电离，需要用不同类型的基质。
? 紫外激光解离的基质
蒽三酚和银盐的混合是分析聚苯乙烯的首选，但是这个混合物不稳定，
见表格。
? 红外激光解离的基质
YAG激光 (3.27?m,相当于 3050 cm-1) 激发 C-H的伸缩振动。应用于 UV-
MALDI的基质也可用于 IR-MALDI。
第五章：质谱法测定分子结构
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Matrices Polymers
Hydrophilic
2,5-dihydroxybenzoic acid Polypropylene glycol
?-Cyano-hydroxycinnamic acid Polyvinyl acetate
Ferulic acid Polytetramethylene glycol
Indoleacrylic acid Polymethylmethacrylate
Dithranol Polystyrene
all trans-Retinoic acid Polybutadiene
Diphenylbutadiene Polydimethylsiloxane
Hydrophobic
红外激光与紫外激光电离的比较：
红外激光有较强的穿透能力，一次红外激光照射能够解吸更多的样品，因此
在一个样品点上获得的质谱图较少，要经常更换激光照射点。
红外激光的脉冲较长。一般在 10～ 20 ?s,而通常的紫外激光的脉冲约在
3～ 5 ?s,这导致了 IR-MALDI的分辨率较差。一般来讲，紫外激光器更适于分
析合成高分子，红外激光器可用于一些卤代高分予的分析。
基质的选取：极性相似原则！
常见基质的极性比较
第五章：质谱法测定分子结构
6
基质 Mr ? /cm-1(at 337nm) PA(kJ/mol)
2,5-DHB 154 0.79?105
-
841~866
854 ± 14
854 ± 16
?-CHCA 189 0.79 ?105
-
841
933 ± 9
766 ± 8
芥子酸 (SA) 224 1.10 ?105
-
887
894 ± 13
蒽三酚 226 - 874 ± 8
IAA 187 - 900 ± 16
HABA 242 - 943
766 ± 8
UV-MALDI基质的理化性质
第五章：质谱法测定分子结构
7
2、盐效应
高分子测定过程中的阳离子化不是质子转移反应，而是金属离子与高分子发
生阳离子化反应，形成加合的高分子正离子。一般用 Na+,K+等作为加合离子。有
时不需要特别加入这些金属，亦可以得到加合的正离子，这是由于容器上的 Na+或
K+所致。
? 具有杂原子的合成高分子，在加钠盐、钾盐后产生加合金属阳离子的正离
子。聚醚、聚酯、聚丙烯酸酯、聚酷胺等。
? 没有杂原子的非极性合成高分子，如聚苯乙烯、聚丁二烯、聚异戊二烯在
加入银盐或铜盐后能够成功的离子化，这些金属阳离于与高分子中的双键
发生了作用。
? 没有杂原子和双键的合成高分子．如聚乙烯和聚丙烯目前仍较难被 MAIDI
分析，因为它们的金属阳离子结合能极低。
第五章：质谱法测定分子结构
8
3、样品制备
? 简单混合法：
在使用一个特定的样品制备方法时，必须先选择适用于基质、样品和阳离子
化盐的溶剂，最理想的情况是使用一种溶剂．这样可以减少样品在靶上结晶时分
层的危险。然而，盐类几乎不溶于用于非极性合成高分子的有机溶剂。一般来讲，
盐可以先溶于一个中间溶剂．如丙醇中，然后再用用于基质和样品的溶剂稀释。
制备样品时，应选择适当的溶剂、合适的浓度及配比，才能获得较好的结果。
? 电喷雾法
一个很有前途的样品制备方法是电喷雾沉积法，比起传统的干点甚或薄层法，
电喷雾法的优点在于它可以形成小而均匀的结晶体。电喷雾沉积法制得样品的点
点之间重复性好，并且信号强度较大，层式的电喷雾效果更好一些。
? 压片法
对于不溶的高分子样品，如聚氨酯和大的多环芳香化台物，发展了一砷新的
制样方法 —压片法．即将样品和基质按一定比例混合后用球磨机研磨均匀，压成
薄片进行 MALDI-TOF-MS分析。
第五章：质谱法测定分子结构
9
三,MALDI-TOF方法测定高聚物的应用
1、分子量的测定及分子量的分布
计算公式：
nw
ii
ii
w
i
ii
n
MMPD
Mn
Mn
M
n
Mn
M
/
2
?
?
?
?
?
?
?
当分子量的分散度小于 1.2时．可获得符合 Poisson分布的质谱图，与 GPC的
结果一致。
Mn,数均分子量
Mw,重均分子量
PD,分布常数
ni,第 i个寡聚物的相对丰度
Mi,第 i个寡聚物的质量
PS 2800的 MALDI-TOF质谱图 PEG 2000的 MALDI-TOF质谱图
第五章：质谱法测定分子结构
10
PEG 3100的 MALDI-TOF质谱图 PS 29ku 的 MALDI-TOF质谱图
聚合物 数均分子量 M
n
重均分子量
Mw
分子量分布
PD 测定方法
PS46000 46760 47319 1.01 MALDI-TOF
42000 43500 1.03 GPC
PS70000 73914 74518 1.01 MALDI-TOF
66000 67500 1.03 GPC
PEG12600 12426 12492 1.01 MALDI-TOF
11843 12320 1.04 GPC
PEG230200 22115 22105 1.01 MALDI-TOF
20240 21228 1.06 GPC
MALDI-TOF-MS方法与 GPC方法所测分予量的比较
第五章：质谱法测定分子结构
11
2、末端基分析
S
S
N NC 10 H 21
C 10 H 21
n]
[
S
N N
R
[
] n
R = C 6 H 13
C 8 H 17
C 10 H 21
1
2
3
含有联吡啶 的共轭高分子结构
聚合物的 MALDI-TOF质谱
(a) IAA为基质,(b) IAA为基质。并加入细 AgTFA
第五章：质谱法测定分子结构
12
高分子化合物 3(n=5),环状寡聚物的实验结果 (左 )和理论同位素分布 (右 )
(a),[(C28H32N2S)5+H]+ (b),[(C28H32N2S)5+Ag]+
选取 2142.1u的单同位素峰来计算端基的质量。重复单元的质量是 428.2,
代入 2142.1/428.2＝ 5，即 428.2 ? 5＝ 2141。 这个峰的质荷比等于 5个重复单
元加 1个质子比时带上的氢原子的质量，因此可以椎测这个系列的高分子为
环状高分子．没有端基。
第五章：质谱法测定分子结构
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N
NN
O C
2
H
5
N
C l
N
O C
2
H
5
N N
N
H
H
C l
[ ]
n
N
NN
O C
2
H
5
N
C l
N
O C
2
H
5
N N
N
H
H
O H
[ ]
n
N
NN
O C
2
H
5
N
H O
N
O C
2
H
5
N N
N
H
H
O H
[ ]
n
N
NN
O C 2 H 5
C l C l
H 2 N N H 2
35u + 158u + H + 237u ? 6 = 1616u
35u + 140u + H + 237u ? 6 = 1598u
17u + 140u + H + 237u ? 6 = 1580u
n=6
?一种寡聚物的 MALDI-TOF质谱分析
两种单体：
三嗪聚胺的 MALDI-TOF的质谱
第五章：质谱法测定分子结构
14
3、高分子混合物分析
用 MALDI分析不同种类的高分子混合物的文章很少．也许是因为离
子化效率的显著不同和其他一些歧视固素。例如二两种窄分布的标准品
PS10200和和 PMMA9200分别溶解在 THF中，以几种体积比混合，接着以
IAA为基质加甲酸钠或以蒽三酚为基质加三氟乙酸银。在第一套实验方案
中,PS和 PMMA的体积比从 0:1增加到 199:1，基质是 IAA/Na,也就是对
PMMA是最佳条件，试验结果十分令入惊奇，甚至 PMMA是以 0 5％的不
纯物存在干 PS中，质谱图仍然是 PMMA的 [M＋ Na]+峰为主要峰。在第二套
实验中,PS和 PMMA的体积比从 1:0到 1:9，基质是蒽三酚 /Ag,也就是 PS
的最优化条件。在所有混合物实验中,PMMA是主要离子，而 PS仅以相对
干 PMMA为 10%的峰出现，质谱图上主要是 PMMA的峰。
当然，这种有利于 PMMA的歧视效应也许可以用来检测 PS中中痕量的
PMMA,但是从这些结果中也可看出，用 MALDI分析高分子混合物还要
走很远的一段路。
第五章：质谱法测定分子结构
15
4、嵌段型高分子分析
嵌段共聚物之中嵌段和组成分布对于聚合物的最终性能有重要的影响。
MALDI-TOF-MS也可以成功地应用于嵌段型高分子的研究。 Dams等人用 MALDI
分析了 ?-甲基苯乙烯和乙烯基吡啶的嵌段共聚物。 Wilezek-Vera等 MALDI-TOF MS
与 1H NMR相结合，对苯乙烯 /?-甲基苯乙烯嵌段共聚物进行研究，测定了该共果物
的组成分布和嵌段长度，我们研究组研究了荣乙二醇和聚苯乙烯的嵌段共聚物。
用 MALDI/TOF测得的分子量和以 GPC测定的结果参见表。
从表中可以青出，对干这类窄分布的高分子化合物,MALDI/TOF所得结果与
GPC法所得结果比较接近。但是 MALDI/TOF法更加迅速、方便，具有显著的优越
性 。
Mn Mw PD
共聚物 GPC 3577 3756 1.05
No.1 MALDI/TOF 3207 3560 1.11
共聚物 GPC 5719 6348 1.11
No.1 MALDI/TOF 6142 6528 1.06
GPC法和 MALD/TOF MS法测得的分子量比较
第五章：质谱法测定分子结构
16
§ 5.2 药物的质谱分析
一、生物活性物质分析
1、天然产物分析
各种提取物的分析,HPLC/MS联用分析
Roots
Leaves,Bark
+ Solvent Filter
Concentrate
LC-MSn
Where are there biologically active compounds?
第五章：质谱法测定分子结构
17
Methanolic 根部提取物
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
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11.9411.088.703.172.07
18.02
13.46 18.54
14.07
18.83
16.92 19.00
15.13
19.42
1.60
? 水 - 甲醇梯度
? 0.25 mL/min,C-18 Column
? 20 uL 进样
LC-UV (215 nm)
第五章：质谱法测定分子结构
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LC-MS,基峰离子流图
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
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9.49
4.81
4.58
17.88
11.89
6.72
19.08
19.553.16 17.0114.39
13.692.14 15.408.10 10.87 20.026.25 7.975.093.54
21.421.07
Unknow
O
O
OH
O H
O
OH
O H
OH
O H
? 水 -甲醇梯度
? 0.25 mL/min,C-18 Column
? 20 uL 进样
第五章：质谱法测定分子结构
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Ab
un
da
nce
473.1
493.7460.8386.5300.2
487.1
400.3
RT,9.21-9.61
AV,8 NL,1.28E6
RT,11.78-11.94
AV,4 NL,7.42E5?
O
O
OH
O H
O
OH
O H
OH
O H
(M-H)
(M-H)
负离子 ESI全扫描质谱图 (Full Scan MS)
Δ +14 u
Unknown 1
第五章：质谱法测定分子结构
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ive
Ab
un
da
nce 293.1
179.1149.2 311.9219.1
180.5169.0 294.2 327.9121.1 195.3144.9
211.7 275.2225.8164.0 255.9244.5 281.5
324.9
293.3307.2
193.3
325.8
219.2179.3 294.3 308.3131.5 200.5159.9 276.1
265.4233.3 334.5246.5155.0 285.1
m/z 293
310.9
O
O
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
Negative Ion ESI Data Dependant MS/MS Spectra
Unknown 1
Δ +14 u
m/z 179
第五章：质谱法测定分子结构
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473.1
493.7460.8386.5300.2
487.1
400.3
RT,9.21-9.61
AV,8 NL,1.28E6
RT,11.78-11.94
AV,4 NL,7.42E5O
O
OH
O H
O
OH
O H
OH
O H
O
O
OH
O H
O
OH
O H
OH
O H
(M-H)
(M-H)
Proposed Echinacoside Structure at m/z 487
增加一个
亚甲基
第五章：质谱法测定分子结构
22
RT,0.11 - 21.82
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
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6.72
11.39 19.08
19.553.16 17.0114.39
13.692.14 15.408.10 10.876.25 7.975.093.54
21.421.07
O
O
OH
O H
O
OH
O H
OH
O H
O
O
OH
O H
O
OH
O H
OH
O H
Proposed EchinacosidesConfirmed Echinacoside
On-The-Fly Analysis !
第五章：质谱法测定分子结构
23
大脑促眠素的发现与确证
从猫脑袋中取出脑髓液，用液相色谱分离各组分，用电喷雾串联质谱、气质
联用、薄层层析、红外及核磁确定各组分的化学结构,目的 是找出与睡眠规律有关
的物质。
? 在猫睡眠周期的不同时间点采取脑髓液样品，测定各样品的紫外吸收光谱，
发现猫在处于即将入睡状态时，脑髓液试样有一个特别显著的紫外吸收峰。
? 电喷雾四极杆串联质谱分析各样品的色谱峰中有显著差异的组分，发现
m/z282的离子。并证明是 MH+离子，用快原子轰击磁质谱测得其分子式为
C18H35NO。
? CID实验,m/z282的 MS2和 MS3。在低质量范围,m/z282的子离子谱显示长
链烷烃的特征。质量数为 17和 35的中性丢失是母离子 m/z282电离产生子离
子 m/z265,m/z247时产生的。
? 在以上质谱分析的基础上，综合其它分析手段的表征结果，初步推测出这
种催眠素的结构为 顺 -9,10-十八碳烯酰胺。该化合物的合成和结构表征证实
这一结构推测是正确的。
第五章：质谱法测定分子结构
24
大脑促眠素的 MS/MS
质谱确定大脑促眠素的 化学结构
脑髓液中分离
出的促眠素化
学结构
第五章：质谱法测定分子结构
25
? 结构分析：确定代谢途径，微量
条件下进行。
? 定量分析：确定生物利用度等，
在复杂本底的条件下测定。
OC H3
N
H
Cl
O
S
N
H
N
H
O O O
H +
OH
parent
? 例：一种非胰岛素依赖型糖尿病药物的代谢分析 (Non insulin
dependent diabetes drug)
代谢物是有效的还是有害的?
二、药物代谢分析
LC/MS/MS
技术
第五章：质谱法测定分子结构
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2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
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e
23.87
8.72
10.65
11.89
13.01
16.79
Glyburide 代谢物
10x
On-line LC-MSn
第五章：质谱法测定分子结构
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100 150 200 250 300 350 400 450 500 550
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510
512
222199
279241
123
391 532176 399
369
Full scan MS Spectrum of peak at 8.72 min
On-line Data-Dependant LC-MSn Trigger Mass
第五章：质谱法测定分子结构
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150 200 250 300 350 400 450 500
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371
395
352 492
m/z 510 > MS2
On-line Data-Dependant LC-MS2
第五章：质谱法测定分子结构
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100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360
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304
306
288
m/z 510 > m/z 369 > MS3
On-line Data-Dependant LC-MS3
第五章：质谱法测定分子结构
30
m/z 369
OCH3
N
H
Cl
O
S
NH2
O O
H +
m/z 395
OCH3
N
H
Cl
O
S
N
H
O O O
+
m/z 352
OCH3
N
H
Cl
O
S
O O
+
m/z 304
OC H3
N
H
Cl
O
NH2
+
m/z 288
OCH 3
N
H
Cl
O
+
m/z 169
O
OCH3
Cl +
m/z 510
OCH3
N
H
Cl
O
S
N
H
N
H
O O O
H +
OH
m/z 492
+
OCH3
N
H
Cl
O
S
NH N
H
O O O
H
MS1
MS2
MS3
Fragmentation Scheme
第五章：质谱法测定分子结构
31
三、远电荷碎裂反应 (Charge-Remote Fragmentation)
远电荷碎裂：断裂发生在远离电荷的位臵，与质谱解析一章中裂解均与
电荷或自由基有关不同。主要原因是这种远电荷碎裂反应发生在具有较长的
碳链化合物中，如长链脂肪酸、胆汁酸、类固醇等。
远电荷碎裂反应在蛋白质分析中有时也会发生。
研究方法：高能、中能、低能碰撞诱导解离 MS/MS质谱。
?高能碰撞,2~10kV,磁质谱仪上,TOF/TOF等。
? 低能碰撞, 100V以内，四极杆质谱仪，离子阱质谱仪。
? 中能碰撞,100~1000V,扇形电场磁场 /TOF联用质谱 (特制质谱 )。
第五章：质谱法测定分子结构
32
1、远电荷碎裂的主要反应机理
?长链饱和化合物
? 1,4氢消除反应 (1)
? 两步均裂反应 (2)
产生荷基异位离子
末端不饱和离子
?长链不饱和化合物
(a) 近烯丙基键，记作 "Ap断裂，
Proximal allyl bond。
(b) 远烯丙基 -乙烯基键
distal allyl–vinyl bond,"Avd
(c) 近烯丙基 -乙烯基键，记作 Avp断裂，
proximal allyl–vinyl bond。
X = O+ 或 OLi2+。
第五章：质谱法测定分子结构
33
13-羰基 -十八烷酸,12-羰基 -十八烷酸的远电荷碎裂谱图
第五章：质谱法测定分子结构
34
十八烷酸 CID-MIKES谱图,[M-Ht2Li]+
(A) 4,7-二烯十八烷酸,m/z 293
(B) 6,9-二烯十八烷酸 m/z 293
高能碰撞,6kV
给出较多的信息，常用的远电荷碎裂的方法。
第五章：质谱法测定分子结构
35
长链脂肪酸 [M-H]+离子的 ES-MS/MS 谱图
(a) 硬脂酸,m/z 283; (b) 油酸,m/z 281; (c)
亚油酸,m/z 279,谱图采自于 AutoSpec-
OATOF仪器。碰撞能量 400eV,Xe用作碰
撞气体。
中能碰撞,400eV
特殊设计的仪器上实现，有较多的信息。
第五章：质谱法测定分子结构
36
低能 CID谱,[M-Ht2Li]+,(4,7,10,13,16,19)-六烯
二十二烷酸 (docosahexaenoic acid,m/z341)。
低能碰撞,400eV
信息较少，特殊情况使用。
第五章：质谱法测定分子结构
37
§ 5.3 糖类的质谱分析
糖：生命体的能源供给者，传统的认识。
糖的生物活性：
?与蛋白质、脂质、磷酸脂结合成“糖复合物” (glycoconjugate)，
血浆、酶、激素及细胞外膜均有含糖蛋白。糖复合物参与细胞的识
别、增生、分异；维持生物体的免疫系统、生殖系统、神经系统和
新陈代谢平衡。
?寡糖和多糖具有增强免疫力，抗辐射、抗肿瘤活性，成为药物，
中药应用，生物多糖，保健药物，保健品。
糖结构的复杂性：
?单糖的组成为 CnH2nOn (n=3~9),其中 n=5和 6最为常见。每个单糖
有多个手性碳原子。有链式结构和环式结构。
?寡糖和多糖的糖链是由含多元羟基的环状己糖或戊糖通过苷键连
接而成。各羟基环上有顺反异构体，各单糖分子上有五个手性碳，
连接的位臵和构型多种多样。
第五章：质谱法测定分子结构
38
糖类分析的困难性：
? 强极性，分离难,HPLC峰形不好。
? 连接方式复杂，立体化学复杂。
? 同系物多，糖苷键弱，复杂混合体系。
? 电离效率不高、种类有限。
16种单糖的常见结构
一、单糖及多糖的结构
1,核糖
?-D-呋喃核糖
Rib
2,阿戊糖
?-L-吡喃阿戊糖
Ara
3,戊醛糖
?-D-呋喃 戊醛 糖
Xyl
4,葡萄糖
?-D-吡喃 葡萄 糖
Glc
5,甘露糖
?-D-吡喃 甘露 糖
Man
6,半乳糖
?-D-吡喃半乳糖
Gal
7,海藻糖
L-吡喃 海藻 糖
Fuc
8,乙酰氨基葡萄糖
N-乙酰基 -(?-D-吡喃 葡萄糖酰胺 )
GlcNAc
第五章：质谱法测定分子结构
39
9,葡萄糖醛酸
GlcA
10,鼠李糖
L-吡喃鼠李糖
Rha
11,乙酰神经氨糖酸
NeuNAc
12,胞壁酸
2-氨基 -3-氧 -(1-羧乙基 )-2-脱氧 -?-
D-葡萄糖 Mur
14,鸡纳糖
6-脱氧 - ?-D-葡萄糖
15,泰威糖
Tyv 16,D-果糖Fru
一个典型的双触角氮连接多糖的结构特征
触角
核心区
第五章：质谱法测定分子结构
40
二、质谱分析
电离方式：
? FAB,传统的电离方法，主要集中于低聚寡糖的分析。
? ESI,对于常规的 ESI,天然多糖的电离不如肽和蛋白，纳升喷雾可以
改善电离效率，可以达到与肽和蛋白相当的程度。寡糖的亲水性限制
了 ESI雾滴的表面活性，灵敏度低。纳喷雾雾滴小，可以突破亲水性
的限制，灵敏度显著升高。多糖的衍生化，减小亲水性，可提高灵敏
度，导致灵敏度提高的是表面活性的增加，而不是样品的挥发性。
? MALDI,低聚物糖的电离效率基本与分子量无关。由于糖的不稳定
性,MALDI电离时会产生某些分解，尤其会产生亚稳离子分解，可
以用源后解离 (PSD)技术测定亚稳离子，但会使谱图变得复杂。
多糖碎片代号表示法
非还原端用 A,B,C表示。
还原端用 X,Y,Z表示。
左上角标表示，环中两根断裂键
所连碳原子的编号 (从环上氧原子
开始计数，红色数字 ),右下角的
数字表示残基的序号。
Z 0Y
0Z 1Y 1Z 2Y 2
B 1 C 1 B 2 C 2 B 3 C 3A
1
0,2
X 1
1,5
H O C H 2
ROO
O H
O H
C H 2 O H
O
O
O H
O H
O H
C H 2 O H
O
O H
O H
O
还原端 非还原端
1
2
3
4
5
0
第五章：质谱法测定分子结构
41
O
O
O
O H
O
H O O H H O O H
O H
O
H
+
.,
O
O H
O
H O O H
.,
O
H O O H
O H
OH O
+
+
L o w ac t i v at i o n
b ar r i er
O
O
O
O
O
H O O H H O O H
O H
O
M
+
.,
H
O
O
O
O
O
H O O H H O O H
O H
O
M
+
.,
H
H i g h ac t i v at i o n
b ar r i er
X -
+
第五章：质谱法测定分子结构
42
H O
O H
O H
O H
O
O O
O H
O H
O H
O H
H O
O H
O H
O H
O
O O H
O H
O
H
H
O H
H O
H
+
M
+
C r o s s - r i n g
c l eav ag e
( c )
H O
O H
O H
O H
O
O O
O H
O H
O H
O H
+ M
+
H O
O H
O H
O H
O
O
H O
O H
O H
O H
O H
O
M
+
+
( a)
M et al i o n l o s s
G l y c o s i d i c - b o n d
c l eav ag e
( b )
M
+
第五章：质谱法测定分子结构
43
第五章：质谱法测定分子结构
44
Human Genome Project
§ 5.4 核苷酸 (Oligonucleotide)的质谱分析
Understanding The Genome
To Fight The Disease Y2K
Drug Design
第五章：质谱法测定分子结构
45
500 600 700 800 900 1000 1100 1200
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Re
lat
ive
A
bu
nd
an
ce
919.1
915.4
1098.6
1102.9
787.8
1107.3
922.5784.5
686.1
790.6
817.1
1147.9689.1 851.6
691.7 956.7609.9
1070.7
1064.7905.3768.7617.3
1153.7
1061.7720.3 959.3
664.8 901.7 1174.31040.0590.0
549.1522.1
Negative Ion ESI Of 18 mer (200 fg/uL)
? 进样速度,3 uL/min
? 乙腈 -甲醇 -丙酮 (70:20:10,v/v/v,5% TEA)
? 毛细管温度, 100° C
OLIGO22 # 209-213 RT,1.96-1.99 AV,5 NL:1.49E5
T,- p Full ms [ 450.00-1200.00]
第五章：质谱法测定分子结构
46
OLIGO22 #217-225 RT,2.03-2.09 AV:8 NL,1.63E5
T,- p Full ms [ 450.00-1200.00]
650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Re
lat
ive
A
bu
nd
an
ce
1102.9
1098.6
918.8
915.4
787.5
784.5
689.3
686.4
611.2
-5
-6
-7
-8
Negative Ion Charge States of 18 mer
第五章：质谱法测定分子结构
47
# 1 RT,0.00 P,- NL,3.85E5
T,- p Full ms [ 450.00-1200.00]
4800 5000 5200 5400 5600 5800 6000 6200
mass
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Re
lat
ive
A
bu
nd
an
ce
5520.0
5498.0
5541.0
5565.0 5745.0
4788.0 5972.05579.05385.05017.0 5221.04908.0 5116.0
6086.05762.0 6206.0
4821.0
GATTCGTAGCTACGAATC
Reported Avg,Mol,Wt,5500
Monoisotopic Mass,5497.7
Negative Ion Deconvoluted Spectra
第五章：质谱法测定分子结构
48
Negative Ion MS2 Spectra of the - 5
and -7 Charge States
OLIGO22 # 435-444 RT,4.86-4.98 AV,10 NL:1.29E5
T,- c Full ms2 1098.00@35.00 [ 305.00-2000.00]
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
m/z
0
20
40
60
80
100
Re
lat
ive
Ab
un
da
nce
926.8 1071.5
1134.41068.5
1236.0
817.9
1290.81167.9
782.6610.1
1009.9 1347.1
1636.1850.3
617.7 1388.0770.2 1480.0 1637.0481.2 1854.3
506.1426.1 1997.7
OLIGO22 # 495-507 RT,5.62-5.79 AV,13 NL:2.65E5
T,- c Full ms2 784.00@35.00 [ 215.00-2000.00]
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
m/z
0
20
40
60
80
100
Re
lat
ive
Ab
un
da
nce
765.3
886.7
875.8
617.8
923.2 1134.3610.3 860.1
673.6 1014.8
1135.1461.5 1347.1549.3
1636.11235.1426.2 1413.1 1485.3306.3 1782.0 1880.2
GATTCGTAGCTACGAATC
GATTCGTAGCTACGAATC
第五章：质谱法测定分子结构
49
§ 5.5 蛋白质分析
一、氨基酸和小肽
小肽断裂碎片离子定义
第五章：质谱法测定分子结构
50
研究小肽的结构,MS/MS分析
?例：一个五肽的分析
具有保护基的五肽的一级结构：
BOC－ Gly－ Ala－ D－ Val－ Leu－ Ile－ OBz
BOC = t-Butyloxy carbony,Bzl = benzyl.
离子类型 MH+ [MH-56]+ [MH-100]+ y4" y3" y2" y1" b4 b3 b2 b1
m/z 662 606 562 505 434 335 222 441 328 229 158
( C H 3 ) 2
C H
C H 2
O
N H C H C O B z l
O
CC HN H
O
B O C N H C H 2 C N H C H C N H C H
O
C H 3
O
C H
C
( C H 3 ) 2
b 1 b 2 b 3 b 4
y 1y 2y 3y 4
yn" = yn
第五章：质谱法测定分子结构
51
各离子的生成途径
?[MH-56]+
McLafferty重排
?[MH-100]+
m / z 6 0 6
C
C H 2
+ C
O H
N H C C
OR
HO
N
O
C
O
H
N H C C
OR
H
N H + H
+
m / z5 6 2
C H 3 C O C N
C H 3
C H 3
O
H
+ N
O
O
C H 2
H
+
C C H 2 + C O 2 H N H
+
+
第五章：质谱法测定分子结构
52
?bn系列离子
B O C N H C
C
N H 2
C
C
O B z l
O
R 2
HO
R 1
H
+
B O C N H C
C
O
R 1
H
+ N H 2
C
C
O B z l
O
R 2
H
+
b n
?yn"系列离子,yn" = yn + 2
B O C N H C
C
N H C C O B z l
O
R 2
H
O
R 1
H
H
+
B O C N H C C O
R 1
+
y n "
+
N H 3 C C O B z l
O
R 2
H
第五章：质谱法测定分子结构
53
?bn和 yn"系列离子生成的另一种机理
[ N - 端 ] N C H C N
R O H
HH
[ C - 端 ]
[ N - 端 ] N C H C
R
H
O
[ C - 端 ] [ N - 端 ] N
C O
C H R
[ C - 端 ]
N H 2
H N
H
H
+
+
+
+ +
1
2
1 2
b n 系列离子
y n " 系列离子
第五章：质谱法测定分子结构
54
氨基酸名称 单同位素相 对分子量 羟胺正离 子质量 氨基酸名称 单同位素相 对分子量 羟胺正离 子质量
甘氨酸 (glycine,Gly/G) 57.02146 30 天冬氨酸 (aspartic acid,Asp/D) 115.02694 87
丙氨酸 (alanine,Ala/A) 71.03711 44 谷氨酰胺 (glutamine,Gln/Q) 128.05858 101
丝氨酸 (serine,Ser/S) 87.03203 60 赖氨酸 (lysine,Lys/K) 128.09496 101
脯氨酸 (proline,Pro/ P) 97.05276 70 谷氨酸 (glutamic acid,Glu/E) 129.04259 102
缬氨酸 (valine,Val/V) 99.06841 72 甲硫氨酸 (methionine,Met/M) 131.04049 104
苏氨酸 (threonine,Thr/T) 101.04768 74 组氨酸 (histidine,His/H) 137.05891 110
半胱氨酸 (cysteine,Cys/C) 103.00919 76 苯丙氨酸 (phenylalanine,Phe/F) 147.06841 120
异亮氨酸 (isoleucine,Ile/I) 113.08406 86 精氨酸 (arginine,Arg/R) 156.10111 129
亮氨酸 (leucine,Leu/L) 113.08406 86 酪氨酸 (tyrosine,Tyr/Y) 163.06333 136
天冬酰氨 (asparagine,Asn/N) 114.04293 88 色氨酸 (tryptophan,Trp/W) 186.07931 159
20种氨基酸残基（ NH-HCR-C=O） 和羟胺正离子的质量
第五章：质谱法测定分子结构
55
500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800m/z0
100
%
998.2
942.7
893.2
848.6
808.3
616.2 771.5
738.0
617.2
1060.5
999.6
1131.1
1061.8
1211.8
1132.5
1137.5
1305.0
1413.7 1541.9
1696.3
16000 17000 18000
m/z0
100
%
16951.4
去卷积
deconvolution
20 fmole 马心肌红蛋白 (Horse Heart Myoglobin) ESI 质谱图
二、蛋白质分析
第五章：质谱法测定分子结构
56
原始数据
去卷积
混合物：主要两种
beta lactuglobulin
第五章：质谱法测定分子结构
57
人血红蛋白 MALDI-TOF 质谱图
第五章：质谱法测定分子结构
58
鸡蛋溶菌酶 ESI质谱图
第五章：质谱法测定分子结构
59
m/z1 = 895
m/z2 = 945
肌红蛋白 ESI质谱图
第五章：质谱法测定分子结构
60
§ 5.6 蛋白质组学及应用
? 什么是蛋白质组？
由基因组，细胞或组织所表达的所有蛋白质成分。
? 蛋白质组的重要性
研究基因组功能的重要途径。
药物目标 - 在分子水平研究健康和疾病的相关。
蛋白质组学是一门在整体水平上研究细胞内蛋白质组成及其活
动规律的新兴学科。
蛋白质组学的终极目标是测定生物物种的所有生命活动中的所
有蛋白质。
Why蛋白质组学?
?mRNA表达水平不能预测蛋白质表达水平
?蛋白质的修饰和加工不能从基因序列直接推导
?蛋白质组是动态的并反映生物系统的状态
第五章：质谱法测定分子结构
61
? 蛋白质组学面临的挑战
? 蛋白质没有可进行量的放大方法 (如 DNR的 PCR方法 )。
? 在生物处理过程中蛋白质是高度动态变化的。
? 物理化学性质的多样性。
? 动态范围的挑战：相对含量超过 106范围 (血清中可达 1012)
?质谱测量在蛋白质组学中的作用
? 质谱是肽 (不是蛋白质 )的一级序列分析的最普遍和最有效的工具。
? 质谱是一种精确的定量工具，尤其是内标法定量 (如对同位素比的
测量 )。
? 质谱在确定蛋白质高级结构时不是很有效。
? 质谱对已知肽和蛋白质重复定量分析不是很有效。
第五章：质谱法测定分子结构
62
经典的氨基酸序列分析方法
? N–端氨基酸单元的分析
最常用的有下列两种方法：
? 桑格尔 (Sanger F)方法：利用肽链 N–端游离氨基与 2,4–二硝基氟苯 (DNP)发生
芳香亲核取代反应，而将 肽链上的氨基酸逐个分解。
? 埃德曼 (Edman)方法：用异硫氰酸苯酯 (PITC)和 N–端的 游离氨基反应, 将肽
链上的氨基酸逐个分解 。
? C–端氨基酸单元的分析：通过羧肽酶催化水解
? 用特定的酶催化使含某种氨基酸的肽键部位水解
? 经典分析方法的缺点
工作量大、测序速度慢、样品用量大。
第五章：质谱法测定分子结构
63
蛋白质的二维分离
第五章：质谱法测定分子结构
64
仪器 鉴定 率
? 肽质量指纹谱 MALDI ~50%
(Peptide Mass Fingerprinter,PMF )
? 多肽序列标签 LC/MS/MS ~80%
(Peptide Sequence Tag,PST)
? 从新测序 LC/MS/MS > 80%
(De Novo)
蛋白质及混合物的定量分析：
同位素编码亲和标记 (Isotope-Coded Affinity Tags,ICAT)
蛋白质序列研究的三个层次
第五章：质谱法测定分子结构
65
蛋白质组研究技术路线
样品 (组织、细胞等 )
凝胶图象分析
蛋白质鉴定
二维数据库
酶解
HPLC-MS,MS/MS
数据库检索
二维凝胶电泳
酶解
肽混合物
MS,MS/MS
肽指纹谱 肽序列标签 从新测序
第五章：质谱法测定分子结构
66
一、肽质量指纹谱 (Peptide Mass Fingerprinter,PMF)
?PMF测定速度快。
?PMF灵敏。
?PMF需要完整和准确的蛋白质序列数据库。
第五章：质谱法测定分子结构
67
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 m /z0
100
%
1619.2 8968.6 4
836.5 8
893.6 7
1251.9 3
969.7 0
970.6 9
1013.8 0
1060.2 3
1061.2 6
1252.9 7
1254.0 0
1570.1 7
1448.1 4
2313.6 9
2312.7 6
1621.1 4
1670.2 5
1671.2 4
1672.1 4
1873.4 6
1853.3 8 2019.5 71876.4 1 2271.8 3
2036.5 7
2314.7 5
2315.8 0
2366.8 3
2367.9 0
2368.8 5
2369.9 1 2718.0 9
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 m /z0
100
%
1619.2 8968.6 4
836.5 8
893.6 7
1251.9 3
969.7 0
970.6 9
13.8 0
1060.2 3
1061.2 6
1252.9 7
1254.0 0
1570.1 7
1448.1 4
2313.6 9
2312.7 6
1621.1 4
1670.2 5
1671.2 4
1672.1 4
1873.4 6
1853.3 8 2019.5 71876.4 1 2271.8 3
2036.5 7
2314.7 5
2315.8 0
2366.8 3
2367.9 0
2368.8 5
2369.9 1 2718.0 9
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 m /z0
100
%
1619.2 8968.6 4
836.5 8
893.6 7
1251.9 3
969.7 0
970.6 9
13.8 0
1060.2 3
1061.2 6
1252.9 7
1254.0 0
1570.1 7
1448.1 4
2313.6 9
2312.7 6
1621.1 4
1670.2 5
1671.2 4
1672.1 4
1873.4 6
1853.3 8 2019.5 71876.4 1 2271.8 3
2036.5 7
2314.7 5
2315.8 0
2366.8 3
2367.9 0
2368.8 5
2369.9 1 2718.0 9
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 m /z0
100
%
1619.2 8968.6 4
836.5 8
893.6 7
1251.9 3
969.7 0
970.6 9
13.8 0
1060.2 3
1061.2 6
1252.9 7
1254.0 0
1570.1 7
1448.1 4
2313.6 9
2312.7 6
1621.1 4
1670.2 5
1671.2 4
1672.1 4
1873.4 6
1853.3 8 2019.5 71876.4 1 2271.8 3
2036.5 7
2314.7 5
2315.8 0
2366.8 3
2367.9 0
2368.8 5
2369.9 1 2718.0 9
分离的酶解的蛋白质
96/384位样品靶
数据处理和数据库检索
质谱样品
的准备
MALDI质
谱分析
蛋白质
一级结
构结果
PMF方法的一般流程
第五章：质谱法测定分子结构
68
? 洗胶 /去污
? 脱水
? 减少 S-S键
? 洗涤 /脱水
1,In-gel 酶切 /消化
?Multiprobe (4x96 Well Plat)
?样品体积 0.5-100 ?L
?板上加热和冷却
?消化板加热 37oC
?肽存储在 -4oC冷却板
?酶试剂存储在 -4oC冷却板
?修正 -SH基
?加入 trypsin溶液
?5-12小时
?肽提取
2,质谱分析样品的制备
灵敏度,500fmoles BSA in-gel。
移液和消化时间 8小时 (1x96 well plat)。
最多可进行 4x96 well plat的同时消化。
基本能力
第五章：质谱法测定分子结构
69
3,质谱测定
设这检索的条件,不同软件有不同的参数和用法。
MALDI-TOF 质谱测定
4,数据库检索
parmeters 参数的选择样品 -1 样品 -2 样品 -3
Program used MS-Fit PeptIdent PeptIdent
pI range NO 3~7 3.7~7.7
Protein mass range 20~50kD 15~45kD 15~45kD
Specie searched MAMMALS MAMMALS MAMMALS
Digest used Trypsin Trypsin Trypsin
Peptide mass accuracy ± 2Da ± 0.5Da ± 0.5Da
Methionice is Oxidized Oxidized Oxidized
Cysteine is Carbamidomethylation(Cys-CAM)
Pepptide masses are Average Monoisotopic Monoisotopic
Mumber of peptides 5 5 5
Number of missed cleavages 1 1 1
Number of peptide used in search 11 17 15
第五章：质谱法测定分子结构
70
样品 1 样品 2
样品 3
数据库检索结果：
带 *号的峰为与数据库中的峰相匹配的峰。
样品 1：甘油醛 -3-磷酸脱氢酶
样品 2：遍在蛋白羧酸基末端水解同工酶
样品 3：丙糖磷酸异构酶
第五章：质谱法测定分子结构
71
PMF 实验，同一点上经常是蛋白质的混合物
Some proteins are identified with high confidence
Some proteins are identified with high confidence Some proteins are identified with low confidence
Row data
第五章：质谱法测定分子结构
72
And there are still peptides unassigned to a protein Final result
第五章：质谱法测定分子结构
73
特有的搜索引擎
第五章：质谱法测定分子结构
74
二、多肽序列标签 (Peptide Sequence Tag,PST)和肽阶梯序列
(Peptide Ladder Sequencing)
1、肽序列标签
蛋白质的常见氨基酸有 20 种，一般 3 个氨基酸的肽段碎片将有 8000种可能的排列
方式 4 个氨基酸将有 160000种排列方式，因此即使对于不是很大的原核生物的蛋白质
组来说，一个短的序列片段也具有很高的特异性。
肽序列标签：一个多肽的部分氨基酸序列和该肽的质量以及该肽未测序部分的质
量。
Mann M,et al,Anal,Chem.,1994,66,4390 for PST
Mann M,et al,Trands in Biochem,Sci.,1996,21,494.
H
2
N C H C N H
O
R
1 R
2
O
N HCC H
R
3 O
O HCC H
a
1
a
2
b
1
b
2
c
1
c
2
x
1
x
2 y 1
y
2 z 1z
2
H
2
N C H C N H
O
R
1 R
2
C H
a
2
b
2
c
2
H
2
N C H C N H
O
R
1 R
2
OCC H
H
2
N C H C N H
O
R
1 R
2
O
N H
3
+
CC H
+
+
C N H
R
2
O
N HCC H
R
3 O
O HCC HO
+
H
3
N
R
2
O
N HCC H
R
3 O
O HCC H
+
R
2
O
N HCC H
R
3 O
O HCC H+
x
2
y
2
z
2
第五章：质谱法测定分子结构
75
?例：马心肌红蛋白鉴定
马心肌红蛋白胰酶酶切产物的 ESI-Q-TOF肽指纹谱
第五章：质谱法测定分子结构
76
马心肌红蛋白胰酶酶切肽段 m/z908.4(双电荷离子 )的 MS/MS谱图
肽序列标签：
G— L— S— D— G— E— W— Q— Q— V— L— N— V — W— G— K
y10,1257.8 y3,390.3
C端N端
W— Q— Q— V— L— N— V — W
Y3,390.3y10,1257.8
检索结果：
第五章：质谱法测定分子结构
77
N端 Y— A— M— I— G— D — P— T— G— A— L— R C端
y10,1000.5 y
7,715.4
?例,m/z为 691.43Da(M2+),质量数为 1380.6Da。
MS/MS图
肽序列标签：
检索结果：来自乙醇脱氢酶
715.4(DGI)1000.5
第五章：质谱法测定分子结构
78
2、肽阶梯序列 (Peptide Ladder Sequencing)
梯状测序法 (ladder sequencing),用化学探针或酶解使蛋白或肽从 N端或 C端逐一降
解下氨基酸残基，相互间差一个氨基酸残基的系列肽，经质谱检测，由相邻峰的质量
差知道相应氨基酸残基，与 Edman法相似。
AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn
PTC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -Aan
PC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn
PITC + 5% PIC
ATZ(AA1) + AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn
PC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn
Acid (TFA)
after m cycles
Further cycles (without
separation)
PC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn
PC- AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn
PC-AA3-AA4-AA5- -AAn
PC-AA4-AA5- -AAn
PC-AAm- -AAn
一步 MALDI-MS 阶梯序列数据
B,Chait et al.,Science 262,89,1993.
原理：
第五章：质谱法测定分子结构
79
血纤维蛋白肽,
Protein ladder Sequencing
[Glu1]fibrinopeptide B
第五章：质谱法测定分子结构
80
传统的低能量 CADMS/MS 质谱图
第五章：质谱法测定分子结构
81
MALDI PSD 与高能 CID的比较
第五章：质谱法测定分子结构
82
可选择性的碎裂方式：
?光诱导解离 (UV-193nm)
相当于高能 CID。
?多光子电离 (IR-10.6μm)
相当于低能 CAD。
?表面解离 (SID)
相当于低能 CAD。
?电子捕获解离 (ECD)
c和 z类型碎片增强。
注：这些方法在自动化大批量实验中并不是常规的方法。
数据库搜索为什么会失败
?蛋白质不在数据库里或者不正确的搜索参数 (酶特征, 分类法等等 )。
?在数据库里蛋白质表达不正确 (DNA核苷酸序列, 基因内区序列等等预测失败 )。
?蛋白质变性,
- 变性的氨基酸残基
- N端和 C端的变化：蛋氨酸的形成, 序列信号变化, C链缩短
- 可变的序列 (同族以及选择性结合的变体 )
- 后修饰变化 (糖基化，磷酸化等 )
- 不希望的化学诱导修饰 (在尿素中氨甲酰化 )
?搜索引擎不够完善成熟。
第五章：质谱法测定分子结构
83
三、重新测序 (De novo sequence)
? 数据库中没有的蛋白质分析
? 样品来源于非序列化基因组
? 蛋白质经多重高度修饰
? 在实际生物体中，非同寻常的酶活性
? 处理古生物样本，样品处理时肽被修饰 (污染 )
? 合成肽
?重新测序的原因
?谱图的预处理
?多电荷峰转化成单电荷峰
?多同位素峰转化成担同位素峰
?简化谱图提高信噪比
第五章：质谱法测定分子结构
84
谱图处理
谱图分析
第五章：质谱法测定分子结构
85
? 16O/18O C端标记
为了提高对串联质谱数据的解读能力，尤其是对 y和 b型离子系列的辨别能力，
用化学修饰方法使辨别更容易。
16O/18O C端标记,在蛋白质酶解时，酶解液中 H218O和 H216O各占 50%，酶解后
肽段羧基端上的羟基氧 18O/16O的 (M+2/M)同位素丰度比高于正常的峰强度，据此可
以分辨出 y系列离子。
给出 C-端离子的唯一特征碎片离子
第五章：质谱法测定分子结构
86
?de novo 序列解释
? 马尔可夫链蒙特卡洛 (Markov chain Monte Carlo) de novo 序列
产生算法
? 贝叶斯规则 (Bayesian)断裂方式和谱图匹配算法
Beta 牛乳糖 m/z 841.5 的 MS/MS谱
第五章：质谱法测定分子结构
87
T rue V V Q P N A T A WS E A G HI S A WQ Q WR
Ra nk % P rob,
1 6 11 16 21
1 62, 48 V V Q P N A T A WS E A G H L SA ( GE ) Q K G E R
2 20, 21 V V Q P N A T A WS E A G H L S A WQ K GE R
3 8,73 V V Q P N A T A WS E A G H L SA ( GE ) Q K DA R
4 3,99 V V Q P A A T A WS E A G H L S A WQ K DA R
5 2,33 VV GA P NA T A W S E A G H L SA ( GE ) Q K G E R
6 2,27 VV GA P NA T A W S E A G H L S A WQ K G E R
m/z 841.5 MS/MS 谱的测序结果
第五章：质谱法测定分子结构
88
同位素亲和端,
? ICAT试剂，重氢和正常氢的样品。
? 细胞中蛋白质被还原后，分别用含重氢和正常氢的 ICAT试剂与之作用，
ICAT试剂标记蛋白质中的半胱氨酸的巯基。
? 将两份蛋白质溶液混合，然后用任何方法提取分离。
? 蛋白质用胰蛋白酶酶切。亲和色谱对肽分离。
? 用各种质谱方法 (MS,MS/MS等 )分析。
? 通过同位素比例进行定量分析，通过碎片分布提供鉴定信息。
四、同位素编码亲和标记 (Isotope-Coded Affinity Tags,ICAT)
第五章：质谱法测定分子结构
89
使用可分裂的 ICAT试剂对蛋白质的定量和鉴定分析
MS
Dat
a
第五章：质谱法测定分子结构
90
混合后胰酶消化
细胞状态一 细胞状态二
提取蛋白，还原后用 ICAT的轻链 12C标记 提取蛋白,还原后用 ICAT的重链 13C标记
典型的 ICAT试剂工作流程
第五章：质谱法测定分子结构
91
基于稳定同位素标记定量的标记蛋白质方法
? 化学标记 (ICAT,N末端,以及其他残留物末端 )
－ 优点：一般都能适用 (组织结构，细胞等 )
? 同位素富集的生长机理 (15N)
－ 不需要任何化学干涉,但不能应用于组织样品，峰对之间的质量
差可变 。
? 新陈代谢标记（ 12C精氨酸）
－ 不需要任何化学干涉，但不能应用于组织样品。
第五章：质谱法测定分子结构
92
五、蛋白组学方法的应用
1、生物的蛋白质组及其数据库
? 简单生物的蛋白质组：完全测定或大部分测定蛋白质序列，如细菌、支
原体、酵母等。
? 相对复杂的高等生物：线虫、水稻、
? 小鼠及人类：局部或功能蛋白质组学。
? 相关的数据库的建立和完善。 Langen建立了流感嗜血杆菌的双向数据库。
2、生物过程生理机制的研究
? 大肠杆菌中蛋白质折叠的过程中新生肽段与分子伴侣的作用：首先利用
免疫共沉淀得到胞质中所有的与分子伴侣 GroEL结合的肽链，然后用双
向电泳等方法对这些肽链进行鉴定。
? 吞噬体的蛋白组分析, 140种蛋白，其在细胞吞饮 /吞噬作用途径中的作
用是以前人们所未曾预料到的。
第五章：质谱法测定分子结构
93
3、蛋白质的相互作用
作为细胞蛋白复合物和传导途径的基本要素，蛋白之间的相互作用对
蛋白的功能实现起着关键的作用。
? 用酵母双杂交系统研究线虫生殖器的发育过程。利用 27 种已知的与线
虫发育有关的蛋白，通过大规模地研究其相互作用，确证了 100多个
蛋白间相互作用。
? 人类胃病病原体幽门螺旋杆菌的大规模蛋白间相互作用图谱。基于蛋
白组学高通量的筛选策略，利用酵母双杂交系统筛选了 261种幽门螺
旋杆菌蛋白，确认了蛋白间的 1200种相互作用，从而将 46%的蛋白组
有机地联系起来。
? 用酵母双杂交技术对酵母的近 6000种蛋白之间的相互作用进行了大规
模的全面研究。通过阵列筛选和文库筛选结果的对比，发现前者更为
有效而后者通量更大。对酵母蛋白间的 2709 种相互作用进行了全面的
分析，建立了一个包含 1548种蛋白以及 2358种蛋白间作用方式的巨大
网络。
第五章：质谱法测定分子结构
94
4、疾病研究
? 肝癌：分析人肝肿瘤细胞系 HCC-M的蛋白组，鉴定其中 400种蛋白。
结合正常人肝组织的蛋白组图谱，可寻找到差异蛋白。 BEL-7404对
人肝癌细胞系与正常人肝细胞系 L-02的双向电泳图谱的差异分析，
找到了 99个差异蛋白点，用离子阱质谱对其中的 12个点进行鉴定。
? 前列腺癌肿瘤：人体组织和体外培养前列腺细胞系的蛋白组进行对
比，通过差异谱分析寻找差异蛋白，为寻找前列腺癌的治疗靶蛋白
和标记蛋白打下了良好基础。
第五章：质谱法测定分子结构
95
化学 表面 –蛋白质 表达剖析,
(反 相疏水 ) (阴 离子 ) (金属 离子 ) (正相 亲水 )(阳 离子 )
(PS-1 or PS-2)
(抗体 – 抗原 ) (受体 -配体 ) (DNA – 蛋白质 )
生物 表面 –蛋白质相互 作用检测,
六、蛋白芯片 -蛋白指纹图
第五章：质谱法测定分子结构
96
Or
ga
nic
De
ter
ge
nt
Sa
lt
W
ate
r
pHUr
ea
CH
AP
S
Im
ida
zo
l
洗脱条件
Wash Conditions
芯片表面类型
Su
rfa
ce
Ty
pe
飞行质谱检测
Measured m/z
2500 5000 7500 10000
0
20
40
60
5807.5
化学表面芯片的蛋白质剖析：三维分离
第五章：质谱法测定分子结构
97
血清白蛋白的分离鉴定
0 5 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0
0 5 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0
FCS 1:30 ph4.5 tx100 sp2
FCS 1:30 ph5.5 tx100 sp3
FCS 1:30 ph8.5 tx100 sp7
0 50000 100000 150000
0
25
50
75
0 50000 100000 150000
0
25
50
75
0 50000 100000 150000
0
25
50
75 pH4.5
pH5.5
pH8.5
Albumin
Transferrin
? 血清白蛋白 pI ~ 5.5
– pH 4.5 + 净电荷
– pH 5.5 no 净电荷
– pH 8.5 - 净电荷
? Transferrin铁传递蛋白 pI ~ 6.5
– pH 4.5 + 净电荷
– pH 5.5 + 净电荷
– pH 8.5 - 净电荷
Transferrin
第五章：质谱法测定分子结构
98
De
tect
or
TOF-MS
5 0 0 0 7 5 0 0 1 0 0 0 0 1 2 5 0 0
5 0 0 0 7 5 0 0 1 0 0 0 0 1 2 5 0 0
W eak c at ion ex c ha nge pH
4,5 w as h
0
5
10
5000 7500 10000 12500
Trace View
5 0 0 0 7 5 0 0 1 0 0 0 0 1 2 5 0 0
5 0 0 0 7 5 0 0 1 0 0 0 0 1 2 5 0 0
W ea k c a t io n e x c h a n ge p H 4, 5 w a s h
5000 7500 10000 12500
Gel View
5 0 0 0 7 5 0 0 1 0 0 0 0 1 2 5 0 0
5 0 0 0 7 5 0 0 1 0 0 0 0 1 2 5 0 0
W eak c at ion ex c ha nge pH
4,5 w as h
0
5
10
5000 7500 10000 12500
Map View
蛋白指纹图谱仪－芯片阅读器
?电离的蛋白质可以通过飞行时间质谱仪精确地测定质量
?分析范围广，敏感性高
第五章：质谱法测定分子结构
99
2 5 0 0 5 0 0 0 7 5 0 0 1 0 0 0 0 1 2 5 0 0
2 5 0 0 5 0 0 0 7 5 0 0 1 0 0 0 0 1 2 5 0 0
R et M ap 1-4
R et M ap 1-3
R et M ap 1-4 (2)
R et M ap 1-3 (2)
c om p1
2500 5000 7500 10000 12500
0
2
4
6
3
9
9
7
.
8
6
4
4
6
7
.
6
+
H
4
8
4
3
.
6
+
H
6
2
2
6
.
7
6
6
4
1
9
.
1
1
6
6
0
5
.
2
7
7
7
0
0
.
0
5
7
9
0
7
.
1
1
8
0
9
2
.
4
+
H
8
7
1
1
.
4
1
8906
9
2
2
7
.
0
3
9
7
8
1
.
5
1
9
9
7
5
.
5
2500 5000 7500 10000 12500
0
2
4
6
3
0
2
8
.
2
+
H
3
9
9
4
.
8
9
4
4
6
9
.
8
9
6
2
2
9
.
7
3
6
4
2
2
.
1
2
6
6
1
5
.
9
4
7
5
1
6
.
7
8
7
6
9
9
.
2
2
7
9
1
2
.
9
3
8
0
9
8
.
4
6
8
9
0
8
.
6
6
9
2
3
4
.
2
8
9
4
0
4
.
6
2
2500 5000 7500 10000 12500
-2, 5
0
2, 5
5
7, 5
Difference map
Patient
Control
GelViewTM
蛋白指纹图谱的发现
1
有机质谱原理及应用
第五章：质谱法测定分子结
构 (II),大分子
第五章：质谱法测定分子结构
2
?方法,ESI和 MALDI两种电离方法。
?对象：带有官能团的可溶解高分子。
1988年,Tanaka,最早报道聚乙烯醇 (PEG),~22,000。
1992年,Danis,MALDI,聚丙烯酸和聚苯乙烯磺酸,~30,000。
M,Karas & F.Hillenkamp MALDI,聚苯乙烯 ~70ku,PEG ~40ku。
1996年,C,Fenselau,聚苯乙烯 ~1500ku。
§ 5.1 高聚物质谱分析
第五章：质谱法测定分子结构
3
一、质谱方法分析高聚物的特点
1、人工合成高聚物的复杂性
? 合成高分子是混合物，分子量是一种分布。
? 不同的引发和终止反应所得的高分子有不同的端基。
? 在随机共聚物中，高分子链的组成呈现某种化学分布。
? 在嵌段共聚物中存在着不同的嵌段长度和顺序。
? 非线性高分子，如环状、支链和树枝状高聚物。
2、质谱分析高聚物的特色
? 样品用量少、耗时短、速度快。
? 仪器分辨率高．使单体分析和端基分析成为可能。
? 直接测定绝对分子量，而不是相对分子量，精度高于光散射和膜渗透方法。
? 测定分子量时，不需要标准品或 Mark-Houwink常数。
? 由分子量分布可获得聚合反应的链增长常数。
第五章：质谱法测定分子结构
4
二,MALDI-TOF方法测定高聚物影响因素
1、基质
基质的作用：
? 从激光脉冲中吸收能量。要求：基质对激光光源必须有很强的吸收。
? 使被测分子分离成单分子状态。要求：基质和被测高分子具有很好的
相容性，同时不能有强的分于间的相互作用。
? 使用不同种类的激光 (IR,UV)电离，需要用不同类型的基质。
? 紫外激光解离的基质
蒽三酚和银盐的混合是分析聚苯乙烯的首选，但是这个混合物不稳定，
见表格。
? 红外激光解离的基质
YAG激光 (3.27?m,相当于 3050 cm-1) 激发 C-H的伸缩振动。应用于 UV-
MALDI的基质也可用于 IR-MALDI。
第五章：质谱法测定分子结构
5
Matrices Polymers
Hydrophilic
2,5-dihydroxybenzoic acid Polypropylene glycol
?-Cyano-hydroxycinnamic acid Polyvinyl acetate
Ferulic acid Polytetramethylene glycol
Indoleacrylic acid Polymethylmethacrylate
Dithranol Polystyrene
all trans-Retinoic acid Polybutadiene
Diphenylbutadiene Polydimethylsiloxane
Hydrophobic
红外激光与紫外激光电离的比较：
红外激光有较强的穿透能力，一次红外激光照射能够解吸更多的样品，因此
在一个样品点上获得的质谱图较少，要经常更换激光照射点。
红外激光的脉冲较长。一般在 10～ 20 ?s,而通常的紫外激光的脉冲约在
3～ 5 ?s,这导致了 IR-MALDI的分辨率较差。一般来讲，紫外激光器更适于分
析合成高分子，红外激光器可用于一些卤代高分予的分析。
基质的选取：极性相似原则！
常见基质的极性比较
第五章：质谱法测定分子结构
6
基质 Mr ? /cm-1(at 337nm) PA(kJ/mol)
2,5-DHB 154 0.79?105
-
841~866
854 ± 14
854 ± 16
?-CHCA 189 0.79 ?105
-
841
933 ± 9
766 ± 8
芥子酸 (SA) 224 1.10 ?105
-
887
894 ± 13
蒽三酚 226 - 874 ± 8
IAA 187 - 900 ± 16
HABA 242 - 943
766 ± 8
UV-MALDI基质的理化性质
第五章：质谱法测定分子结构
7
2、盐效应
高分子测定过程中的阳离子化不是质子转移反应，而是金属离子与高分子发
生阳离子化反应，形成加合的高分子正离子。一般用 Na+,K+等作为加合离子。有
时不需要特别加入这些金属，亦可以得到加合的正离子，这是由于容器上的 Na+或
K+所致。
? 具有杂原子的合成高分子，在加钠盐、钾盐后产生加合金属阳离子的正离
子。聚醚、聚酯、聚丙烯酸酯、聚酷胺等。
? 没有杂原子的非极性合成高分子，如聚苯乙烯、聚丁二烯、聚异戊二烯在
加入银盐或铜盐后能够成功的离子化，这些金属阳离于与高分子中的双键
发生了作用。
? 没有杂原子和双键的合成高分子．如聚乙烯和聚丙烯目前仍较难被 MAIDI
分析，因为它们的金属阳离子结合能极低。
第五章：质谱法测定分子结构
8
3、样品制备
? 简单混合法：
在使用一个特定的样品制备方法时，必须先选择适用于基质、样品和阳离子
化盐的溶剂，最理想的情况是使用一种溶剂．这样可以减少样品在靶上结晶时分
层的危险。然而，盐类几乎不溶于用于非极性合成高分子的有机溶剂。一般来讲，
盐可以先溶于一个中间溶剂．如丙醇中，然后再用用于基质和样品的溶剂稀释。
制备样品时，应选择适当的溶剂、合适的浓度及配比，才能获得较好的结果。
? 电喷雾法
一个很有前途的样品制备方法是电喷雾沉积法，比起传统的干点甚或薄层法，
电喷雾法的优点在于它可以形成小而均匀的结晶体。电喷雾沉积法制得样品的点
点之间重复性好，并且信号强度较大，层式的电喷雾效果更好一些。
? 压片法
对于不溶的高分子样品，如聚氨酯和大的多环芳香化台物，发展了一砷新的
制样方法 —压片法．即将样品和基质按一定比例混合后用球磨机研磨均匀，压成
薄片进行 MALDI-TOF-MS分析。
第五章：质谱法测定分子结构
9
三,MALDI-TOF方法测定高聚物的应用
1、分子量的测定及分子量的分布
计算公式：
nw
ii
ii
w
i
ii
n
MMPD
Mn
Mn
M
n
Mn
M
/
2
?
?
?
?
?
?
?
当分子量的分散度小于 1.2时．可获得符合 Poisson分布的质谱图，与 GPC的
结果一致。
Mn,数均分子量
Mw,重均分子量
PD,分布常数
ni,第 i个寡聚物的相对丰度
Mi,第 i个寡聚物的质量
PS 2800的 MALDI-TOF质谱图 PEG 2000的 MALDI-TOF质谱图
第五章：质谱法测定分子结构
10
PEG 3100的 MALDI-TOF质谱图 PS 29ku 的 MALDI-TOF质谱图
聚合物 数均分子量 M
n
重均分子量
Mw
分子量分布
PD 测定方法
PS46000 46760 47319 1.01 MALDI-TOF
42000 43500 1.03 GPC
PS70000 73914 74518 1.01 MALDI-TOF
66000 67500 1.03 GPC
PEG12600 12426 12492 1.01 MALDI-TOF
11843 12320 1.04 GPC
PEG230200 22115 22105 1.01 MALDI-TOF
20240 21228 1.06 GPC
MALDI-TOF-MS方法与 GPC方法所测分予量的比较
第五章：质谱法测定分子结构
11
2、末端基分析
S
S
N NC 10 H 21
C 10 H 21
n]
[
S
N N
R
[
] n
R = C 6 H 13
C 8 H 17
C 10 H 21
1
2
3
含有联吡啶 的共轭高分子结构
聚合物的 MALDI-TOF质谱
(a) IAA为基质,(b) IAA为基质。并加入细 AgTFA
第五章：质谱法测定分子结构
12
高分子化合物 3(n=5),环状寡聚物的实验结果 (左 )和理论同位素分布 (右 )
(a),[(C28H32N2S)5+H]+ (b),[(C28H32N2S)5+Ag]+
选取 2142.1u的单同位素峰来计算端基的质量。重复单元的质量是 428.2,
代入 2142.1/428.2＝ 5，即 428.2 ? 5＝ 2141。 这个峰的质荷比等于 5个重复单
元加 1个质子比时带上的氢原子的质量，因此可以椎测这个系列的高分子为
环状高分子．没有端基。
第五章：质谱法测定分子结构
13
N
NN
O C
2
H
5
N
C l
N
O C
2
H
5
N N
N
H
H
C l
[ ]
n
N
NN
O C
2
H
5
N
C l
N
O C
2
H
5
N N
N
H
H
O H
[ ]
n
N
NN
O C
2
H
5
N
H O
N
O C
2
H
5
N N
N
H
H
O H
[ ]
n
N
NN
O C 2 H 5
C l C l
H 2 N N H 2
35u + 158u + H + 237u ? 6 = 1616u
35u + 140u + H + 237u ? 6 = 1598u
17u + 140u + H + 237u ? 6 = 1580u
n=6
?一种寡聚物的 MALDI-TOF质谱分析
两种单体：
三嗪聚胺的 MALDI-TOF的质谱
第五章：质谱法测定分子结构
14
3、高分子混合物分析
用 MALDI分析不同种类的高分子混合物的文章很少．也许是因为离
子化效率的显著不同和其他一些歧视固素。例如二两种窄分布的标准品
PS10200和和 PMMA9200分别溶解在 THF中，以几种体积比混合，接着以
IAA为基质加甲酸钠或以蒽三酚为基质加三氟乙酸银。在第一套实验方案
中,PS和 PMMA的体积比从 0:1增加到 199:1，基质是 IAA/Na,也就是对
PMMA是最佳条件，试验结果十分令入惊奇，甚至 PMMA是以 0 5％的不
纯物存在干 PS中，质谱图仍然是 PMMA的 [M＋ Na]+峰为主要峰。在第二套
实验中,PS和 PMMA的体积比从 1:0到 1:9，基质是蒽三酚 /Ag,也就是 PS
的最优化条件。在所有混合物实验中,PMMA是主要离子，而 PS仅以相对
干 PMMA为 10%的峰出现，质谱图上主要是 PMMA的峰。
当然，这种有利于 PMMA的歧视效应也许可以用来检测 PS中中痕量的
PMMA,但是从这些结果中也可看出，用 MALDI分析高分子混合物还要
走很远的一段路。
第五章：质谱法测定分子结构
15
4、嵌段型高分子分析
嵌段共聚物之中嵌段和组成分布对于聚合物的最终性能有重要的影响。
MALDI-TOF-MS也可以成功地应用于嵌段型高分子的研究。 Dams等人用 MALDI
分析了 ?-甲基苯乙烯和乙烯基吡啶的嵌段共聚物。 Wilezek-Vera等 MALDI-TOF MS
与 1H NMR相结合，对苯乙烯 /?-甲基苯乙烯嵌段共聚物进行研究，测定了该共果物
的组成分布和嵌段长度，我们研究组研究了荣乙二醇和聚苯乙烯的嵌段共聚物。
用 MALDI/TOF测得的分子量和以 GPC测定的结果参见表。
从表中可以青出，对干这类窄分布的高分子化合物,MALDI/TOF所得结果与
GPC法所得结果比较接近。但是 MALDI/TOF法更加迅速、方便，具有显著的优越
性 。
Mn Mw PD
共聚物 GPC 3577 3756 1.05
No.1 MALDI/TOF 3207 3560 1.11
共聚物 GPC 5719 6348 1.11
No.1 MALDI/TOF 6142 6528 1.06
GPC法和 MALD/TOF MS法测得的分子量比较
第五章：质谱法测定分子结构
16
§ 5.2 药物的质谱分析
一、生物活性物质分析
1、天然产物分析
各种提取物的分析,HPLC/MS联用分析
Roots
Leaves,Bark
+ Solvent Filter
Concentrate
LC-MSn
Where are there biologically active compounds?
第五章：质谱法测定分子结构
17
Methanolic 根部提取物
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
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11.9411.088.703.172.07
18.02
13.46 18.54
14.07
18.83
16.92 19.00
15.13
19.42
1.60
? 水 - 甲醇梯度
? 0.25 mL/min,C-18 Column
? 20 uL 进样
LC-UV (215 nm)
第五章：质谱法测定分子结构
18
LC-MS,基峰离子流图
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
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9.49
4.81
4.58
17.88
11.89
6.72
19.08
19.553.16 17.0114.39
13.692.14 15.408.10 10.87 20.026.25 7.975.093.54
21.421.07
Unknow
O
O
OH
O H
O
OH
O H
OH
O H
? 水 -甲醇梯度
? 0.25 mL/min,C-18 Column
? 20 uL 进样
第五章：质谱法测定分子结构
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un
da
nce
473.1
493.7460.8386.5300.2
487.1
400.3
RT,9.21-9.61
AV,8 NL,1.28E6
RT,11.78-11.94
AV,4 NL,7.42E5?
O
O
OH
O H
O
OH
O H
OH
O H
(M-H)
(M-H)
负离子 ESI全扫描质谱图 (Full Scan MS)
Δ +14 u
Unknown 1
第五章：质谱法测定分子结构
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Ab
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nce 293.1
179.1149.2 311.9219.1
180.5169.0 294.2 327.9121.1 195.3144.9
211.7 275.2225.8164.0 255.9244.5 281.5
324.9
293.3307.2
193.3
325.8
219.2179.3 294.3 308.3131.5 200.5159.9 276.1
265.4233.3 334.5246.5155.0 285.1
m/z 293
310.9
O
O
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
Negative Ion ESI Data Dependant MS/MS Spectra
Unknown 1
Δ +14 u
m/z 179
第五章：质谱法测定分子结构
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473.1
493.7460.8386.5300.2
487.1
400.3
RT,9.21-9.61
AV,8 NL,1.28E6
RT,11.78-11.94
AV,4 NL,7.42E5O
O
OH
O H
O
OH
O H
OH
O H
O
O
OH
O H
O
OH
O H
OH
O H
(M-H)
(M-H)
Proposed Echinacoside Structure at m/z 487
增加一个
亚甲基
第五章：质谱法测定分子结构
22
RT,0.11 - 21.82
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
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9.49
4.81
4.58
17.88
11.89
6.72
11.39 19.08
19.553.16 17.0114.39
13.692.14 15.408.10 10.876.25 7.975.093.54
21.421.07
O
O
OH
O H
O
OH
O H
OH
O H
O
O
OH
O H
O
OH
O H
OH
O H
Proposed EchinacosidesConfirmed Echinacoside
On-The-Fly Analysis !
第五章：质谱法测定分子结构
23
大脑促眠素的发现与确证
从猫脑袋中取出脑髓液，用液相色谱分离各组分，用电喷雾串联质谱、气质
联用、薄层层析、红外及核磁确定各组分的化学结构,目的 是找出与睡眠规律有关
的物质。
? 在猫睡眠周期的不同时间点采取脑髓液样品，测定各样品的紫外吸收光谱，
发现猫在处于即将入睡状态时，脑髓液试样有一个特别显著的紫外吸收峰。
? 电喷雾四极杆串联质谱分析各样品的色谱峰中有显著差异的组分，发现
m/z282的离子。并证明是 MH+离子，用快原子轰击磁质谱测得其分子式为
C18H35NO。
? CID实验,m/z282的 MS2和 MS3。在低质量范围,m/z282的子离子谱显示长
链烷烃的特征。质量数为 17和 35的中性丢失是母离子 m/z282电离产生子离
子 m/z265,m/z247时产生的。
? 在以上质谱分析的基础上，综合其它分析手段的表征结果，初步推测出这
种催眠素的结构为 顺 -9,10-十八碳烯酰胺。该化合物的合成和结构表征证实
这一结构推测是正确的。
第五章：质谱法测定分子结构
24
大脑促眠素的 MS/MS
质谱确定大脑促眠素的 化学结构
脑髓液中分离
出的促眠素化
学结构
第五章：质谱法测定分子结构
25
? 结构分析：确定代谢途径，微量
条件下进行。
? 定量分析：确定生物利用度等，
在复杂本底的条件下测定。
OC H3
N
H
Cl
O
S
N
H
N
H
O O O
H +
OH
parent
? 例：一种非胰岛素依赖型糖尿病药物的代谢分析 (Non insulin
dependent diabetes drug)
代谢物是有效的还是有害的?
二、药物代谢分析
LC/MS/MS
技术
第五章：质谱法测定分子结构
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e
23.87
8.72
10.65
11.89
13.01
16.79
Glyburide 代谢物
10x
On-line LC-MSn
第五章：质谱法测定分子结构
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100 150 200 250 300 350 400 450 500 550
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510
512
222199
279241
123
391 532176 399
369
Full scan MS Spectrum of peak at 8.72 min
On-line Data-Dependant LC-MSn Trigger Mass
第五章：质谱法测定分子结构
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150 200 250 300 350 400 450 500
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371
395
352 492
m/z 510 > MS2
On-line Data-Dependant LC-MS2
第五章：质谱法测定分子结构
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100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360
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171
304
306
288
m/z 510 > m/z 369 > MS3
On-line Data-Dependant LC-MS3
第五章：质谱法测定分子结构
30
m/z 369
OCH3
N
H
Cl
O
S
NH2
O O
H +
m/z 395
OCH3
N
H
Cl
O
S
N
H
O O O
+
m/z 352
OCH3
N
H
Cl
O
S
O O
+
m/z 304
OC H3
N
H
Cl
O
NH2
+
m/z 288
OCH 3
N
H
Cl
O
+
m/z 169
O
OCH3
Cl +
m/z 510
OCH3
N
H
Cl
O
S
N
H
N
H
O O O
H +
OH
m/z 492
+
OCH3
N
H
Cl
O
S
NH N
H
O O O
H
MS1
MS2
MS3
Fragmentation Scheme
第五章：质谱法测定分子结构
31
三、远电荷碎裂反应 (Charge-Remote Fragmentation)
远电荷碎裂：断裂发生在远离电荷的位臵，与质谱解析一章中裂解均与
电荷或自由基有关不同。主要原因是这种远电荷碎裂反应发生在具有较长的
碳链化合物中，如长链脂肪酸、胆汁酸、类固醇等。
远电荷碎裂反应在蛋白质分析中有时也会发生。
研究方法：高能、中能、低能碰撞诱导解离 MS/MS质谱。
?高能碰撞,2~10kV,磁质谱仪上,TOF/TOF等。
? 低能碰撞, 100V以内，四极杆质谱仪，离子阱质谱仪。
? 中能碰撞,100~1000V,扇形电场磁场 /TOF联用质谱 (特制质谱 )。
第五章：质谱法测定分子结构
32
1、远电荷碎裂的主要反应机理
?长链饱和化合物
? 1,4氢消除反应 (1)
? 两步均裂反应 (2)
产生荷基异位离子
末端不饱和离子
?长链不饱和化合物
(a) 近烯丙基键，记作 "Ap断裂，
Proximal allyl bond。
(b) 远烯丙基 -乙烯基键
distal allyl–vinyl bond,"Avd
(c) 近烯丙基 -乙烯基键，记作 Avp断裂，
proximal allyl–vinyl bond。
X = O+ 或 OLi2+。
第五章：质谱法测定分子结构
33
13-羰基 -十八烷酸,12-羰基 -十八烷酸的远电荷碎裂谱图
第五章：质谱法测定分子结构
34
十八烷酸 CID-MIKES谱图,[M-Ht2Li]+
(A) 4,7-二烯十八烷酸,m/z 293
(B) 6,9-二烯十八烷酸 m/z 293
高能碰撞,6kV
给出较多的信息，常用的远电荷碎裂的方法。
第五章：质谱法测定分子结构
35
长链脂肪酸 [M-H]+离子的 ES-MS/MS 谱图
(a) 硬脂酸,m/z 283; (b) 油酸,m/z 281; (c)
亚油酸,m/z 279,谱图采自于 AutoSpec-
OATOF仪器。碰撞能量 400eV,Xe用作碰
撞气体。
中能碰撞,400eV
特殊设计的仪器上实现，有较多的信息。
第五章：质谱法测定分子结构
36
低能 CID谱,[M-Ht2Li]+,(4,7,10,13,16,19)-六烯
二十二烷酸 (docosahexaenoic acid,m/z341)。
低能碰撞,400eV
信息较少，特殊情况使用。
第五章：质谱法测定分子结构
37
§ 5.3 糖类的质谱分析
糖：生命体的能源供给者，传统的认识。
糖的生物活性：
?与蛋白质、脂质、磷酸脂结合成“糖复合物” (glycoconjugate)，
血浆、酶、激素及细胞外膜均有含糖蛋白。糖复合物参与细胞的识
别、增生、分异；维持生物体的免疫系统、生殖系统、神经系统和
新陈代谢平衡。
?寡糖和多糖具有增强免疫力，抗辐射、抗肿瘤活性，成为药物，
中药应用，生物多糖，保健药物，保健品。
糖结构的复杂性：
?单糖的组成为 CnH2nOn (n=3~9),其中 n=5和 6最为常见。每个单糖
有多个手性碳原子。有链式结构和环式结构。
?寡糖和多糖的糖链是由含多元羟基的环状己糖或戊糖通过苷键连
接而成。各羟基环上有顺反异构体，各单糖分子上有五个手性碳，
连接的位臵和构型多种多样。
第五章：质谱法测定分子结构
38
糖类分析的困难性：
? 强极性，分离难,HPLC峰形不好。
? 连接方式复杂，立体化学复杂。
? 同系物多，糖苷键弱，复杂混合体系。
? 电离效率不高、种类有限。
16种单糖的常见结构
一、单糖及多糖的结构
1,核糖
?-D-呋喃核糖
Rib
2,阿戊糖
?-L-吡喃阿戊糖
Ara
3,戊醛糖
?-D-呋喃 戊醛 糖
Xyl
4,葡萄糖
?-D-吡喃 葡萄 糖
Glc
5,甘露糖
?-D-吡喃 甘露 糖
Man
6,半乳糖
?-D-吡喃半乳糖
Gal
7,海藻糖
L-吡喃 海藻 糖
Fuc
8,乙酰氨基葡萄糖
N-乙酰基 -(?-D-吡喃 葡萄糖酰胺 )
GlcNAc
第五章：质谱法测定分子结构
39
9,葡萄糖醛酸
GlcA
10,鼠李糖
L-吡喃鼠李糖
Rha
11,乙酰神经氨糖酸
NeuNAc
12,胞壁酸
2-氨基 -3-氧 -(1-羧乙基 )-2-脱氧 -?-
D-葡萄糖 Mur
14,鸡纳糖
6-脱氧 - ?-D-葡萄糖
15,泰威糖
Tyv 16,D-果糖Fru
一个典型的双触角氮连接多糖的结构特征
触角
核心区
第五章：质谱法测定分子结构
40
二、质谱分析
电离方式：
? FAB,传统的电离方法，主要集中于低聚寡糖的分析。
? ESI,对于常规的 ESI,天然多糖的电离不如肽和蛋白，纳升喷雾可以
改善电离效率，可以达到与肽和蛋白相当的程度。寡糖的亲水性限制
了 ESI雾滴的表面活性，灵敏度低。纳喷雾雾滴小，可以突破亲水性
的限制，灵敏度显著升高。多糖的衍生化，减小亲水性，可提高灵敏
度，导致灵敏度提高的是表面活性的增加，而不是样品的挥发性。
? MALDI,低聚物糖的电离效率基本与分子量无关。由于糖的不稳定
性,MALDI电离时会产生某些分解，尤其会产生亚稳离子分解，可
以用源后解离 (PSD)技术测定亚稳离子，但会使谱图变得复杂。
多糖碎片代号表示法
非还原端用 A,B,C表示。
还原端用 X,Y,Z表示。
左上角标表示，环中两根断裂键
所连碳原子的编号 (从环上氧原子
开始计数，红色数字 ),右下角的
数字表示残基的序号。
Z 0Y
0Z 1Y 1Z 2Y 2
B 1 C 1 B 2 C 2 B 3 C 3A
1
0,2
X 1
1,5
H O C H 2
ROO
O H
O H
C H 2 O H
O
O
O H
O H
O H
C H 2 O H
O
O H
O H
O
还原端 非还原端
1
2
3
4
5
0
第五章：质谱法测定分子结构
41
O
O
O
O H
O
H O O H H O O H
O H
O
H
+
.,
O
O H
O
H O O H
.,
O
H O O H
O H
OH O
+
+
L o w ac t i v at i o n
b ar r i er
O
O
O
O
O
H O O H H O O H
O H
O
M
+
.,
H
O
O
O
O
O
H O O H H O O H
O H
O
M
+
.,
H
H i g h ac t i v at i o n
b ar r i er
X -
+
第五章：质谱法测定分子结构
42
H O
O H
O H
O H
O
O O
O H
O H
O H
O H
H O
O H
O H
O H
O
O O H
O H
O
H
H
O H
H O
H
+
M
+
C r o s s - r i n g
c l eav ag e
( c )
H O
O H
O H
O H
O
O O
O H
O H
O H
O H
+ M
+
H O
O H
O H
O H
O
O
H O
O H
O H
O H
O H
O
M
+
+
( a)
M et al i o n l o s s
G l y c o s i d i c - b o n d
c l eav ag e
( b )
M
+
第五章：质谱法测定分子结构
43
第五章：质谱法测定分子结构
44
Human Genome Project
§ 5.4 核苷酸 (Oligonucleotide)的质谱分析
Understanding The Genome
To Fight The Disease Y2K
Drug Design
第五章：质谱法测定分子结构
45
500 600 700 800 900 1000 1100 1200
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Re
lat
ive
A
bu
nd
an
ce
919.1
915.4
1098.6
1102.9
787.8
1107.3
922.5784.5
686.1
790.6
817.1
1147.9689.1 851.6
691.7 956.7609.9
1070.7
1064.7905.3768.7617.3
1153.7
1061.7720.3 959.3
664.8 901.7 1174.31040.0590.0
549.1522.1
Negative Ion ESI Of 18 mer (200 fg/uL)
? 进样速度,3 uL/min
? 乙腈 -甲醇 -丙酮 (70:20:10,v/v/v,5% TEA)
? 毛细管温度, 100° C
OLIGO22 # 209-213 RT,1.96-1.99 AV,5 NL:1.49E5
T,- p Full ms [ 450.00-1200.00]
第五章：质谱法测定分子结构
46
OLIGO22 #217-225 RT,2.03-2.09 AV:8 NL,1.63E5
T,- p Full ms [ 450.00-1200.00]
650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Re
lat
ive
A
bu
nd
an
ce
1102.9
1098.6
918.8
915.4
787.5
784.5
689.3
686.4
611.2
-5
-6
-7
-8
Negative Ion Charge States of 18 mer
第五章：质谱法测定分子结构
47
# 1 RT,0.00 P,- NL,3.85E5
T,- p Full ms [ 450.00-1200.00]
4800 5000 5200 5400 5600 5800 6000 6200
mass
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Re
lat
ive
A
bu
nd
an
ce
5520.0
5498.0
5541.0
5565.0 5745.0
4788.0 5972.05579.05385.05017.0 5221.04908.0 5116.0
6086.05762.0 6206.0
4821.0
GATTCGTAGCTACGAATC
Reported Avg,Mol,Wt,5500
Monoisotopic Mass,5497.7
Negative Ion Deconvoluted Spectra
第五章：质谱法测定分子结构
48
Negative Ion MS2 Spectra of the - 5
and -7 Charge States
OLIGO22 # 435-444 RT,4.86-4.98 AV,10 NL:1.29E5
T,- c Full ms2 1098.00@35.00 [ 305.00-2000.00]
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
m/z
0
20
40
60
80
100
Re
lat
ive
Ab
un
da
nce
926.8 1071.5
1134.41068.5
1236.0
817.9
1290.81167.9
782.6610.1
1009.9 1347.1
1636.1850.3
617.7 1388.0770.2 1480.0 1637.0481.2 1854.3
506.1426.1 1997.7
OLIGO22 # 495-507 RT,5.62-5.79 AV,13 NL:2.65E5
T,- c Full ms2 784.00@35.00 [ 215.00-2000.00]
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
m/z
0
20
40
60
80
100
Re
lat
ive
Ab
un
da
nce
765.3
886.7
875.8
617.8
923.2 1134.3610.3 860.1
673.6 1014.8
1135.1461.5 1347.1549.3
1636.11235.1426.2 1413.1 1485.3306.3 1782.0 1880.2
GATTCGTAGCTACGAATC
GATTCGTAGCTACGAATC
第五章：质谱法测定分子结构
49
§ 5.5 蛋白质分析
一、氨基酸和小肽
小肽断裂碎片离子定义
第五章：质谱法测定分子结构
50
研究小肽的结构,MS/MS分析
?例：一个五肽的分析
具有保护基的五肽的一级结构：
BOC－ Gly－ Ala－ D－ Val－ Leu－ Ile－ OBz
BOC = t-Butyloxy carbony,Bzl = benzyl.
离子类型 MH+ [MH-56]+ [MH-100]+ y4" y3" y2" y1" b4 b3 b2 b1
m/z 662 606 562 505 434 335 222 441 328 229 158
( C H 3 ) 2
C H
C H 2
O
N H C H C O B z l
O
CC HN H
O
B O C N H C H 2 C N H C H C N H C H
O
C H 3
O
C H
C
( C H 3 ) 2
b 1 b 2 b 3 b 4
y 1y 2y 3y 4
yn" = yn
第五章：质谱法测定分子结构
51
各离子的生成途径
?[MH-56]+
McLafferty重排
?[MH-100]+
m / z 6 0 6
C
C H 2
+ C
O H
N H C C
OR
HO
N
O
C
O
H
N H C C
OR
H
N H + H
+
m / z5 6 2
C H 3 C O C N
C H 3
C H 3
O
H
+ N
O
O
C H 2
H
+
C C H 2 + C O 2 H N H
+
+
第五章：质谱法测定分子结构
52
?bn系列离子
B O C N H C
C
N H 2
C
C
O B z l
O
R 2
HO
R 1
H
+
B O C N H C
C
O
R 1
H
+ N H 2
C
C
O B z l
O
R 2
H
+
b n
?yn"系列离子,yn" = yn + 2
B O C N H C
C
N H C C O B z l
O
R 2
H
O
R 1
H
H
+
B O C N H C C O
R 1
+
y n "
+
N H 3 C C O B z l
O
R 2
H
第五章：质谱法测定分子结构
53
?bn和 yn"系列离子生成的另一种机理
[ N - 端 ] N C H C N
R O H
HH
[ C - 端 ]
[ N - 端 ] N C H C
R
H
O
[ C - 端 ] [ N - 端 ] N
C O
C H R
[ C - 端 ]
N H 2
H N
H
H
+
+
+
+ +
1
2
1 2
b n 系列离子
y n " 系列离子
第五章：质谱法测定分子结构
54
氨基酸名称 单同位素相 对分子量 羟胺正离 子质量 氨基酸名称 单同位素相 对分子量 羟胺正离 子质量
甘氨酸 (glycine,Gly/G) 57.02146 30 天冬氨酸 (aspartic acid,Asp/D) 115.02694 87
丙氨酸 (alanine,Ala/A) 71.03711 44 谷氨酰胺 (glutamine,Gln/Q) 128.05858 101
丝氨酸 (serine,Ser/S) 87.03203 60 赖氨酸 (lysine,Lys/K) 128.09496 101
脯氨酸 (proline,Pro/ P) 97.05276 70 谷氨酸 (glutamic acid,Glu/E) 129.04259 102
缬氨酸 (valine,Val/V) 99.06841 72 甲硫氨酸 (methionine,Met/M) 131.04049 104
苏氨酸 (threonine,Thr/T) 101.04768 74 组氨酸 (histidine,His/H) 137.05891 110
半胱氨酸 (cysteine,Cys/C) 103.00919 76 苯丙氨酸 (phenylalanine,Phe/F) 147.06841 120
异亮氨酸 (isoleucine,Ile/I) 113.08406 86 精氨酸 (arginine,Arg/R) 156.10111 129
亮氨酸 (leucine,Leu/L) 113.08406 86 酪氨酸 (tyrosine,Tyr/Y) 163.06333 136
天冬酰氨 (asparagine,Asn/N) 114.04293 88 色氨酸 (tryptophan,Trp/W) 186.07931 159
20种氨基酸残基（ NH-HCR-C=O） 和羟胺正离子的质量
第五章：质谱法测定分子结构
55
500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800m/z0
100
%
998.2
942.7
893.2
848.6
808.3
616.2 771.5
738.0
617.2
1060.5
999.6
1131.1
1061.8
1211.8
1132.5
1137.5
1305.0
1413.7 1541.9
1696.3
16000 17000 18000
m/z0
100
%
16951.4
去卷积
deconvolution
20 fmole 马心肌红蛋白 (Horse Heart Myoglobin) ESI 质谱图
二、蛋白质分析
第五章：质谱法测定分子结构
56
原始数据
去卷积
混合物：主要两种
beta lactuglobulin
第五章：质谱法测定分子结构
57
人血红蛋白 MALDI-TOF 质谱图
第五章：质谱法测定分子结构
58
鸡蛋溶菌酶 ESI质谱图
第五章：质谱法测定分子结构
59
m/z1 = 895
m/z2 = 945
肌红蛋白 ESI质谱图
第五章：质谱法测定分子结构
60
§ 5.6 蛋白质组学及应用
? 什么是蛋白质组？
由基因组，细胞或组织所表达的所有蛋白质成分。
? 蛋白质组的重要性
研究基因组功能的重要途径。
药物目标 - 在分子水平研究健康和疾病的相关。
蛋白质组学是一门在整体水平上研究细胞内蛋白质组成及其活
动规律的新兴学科。
蛋白质组学的终极目标是测定生物物种的所有生命活动中的所
有蛋白质。
Why蛋白质组学?
?mRNA表达水平不能预测蛋白质表达水平
?蛋白质的修饰和加工不能从基因序列直接推导
?蛋白质组是动态的并反映生物系统的状态
第五章：质谱法测定分子结构
61
? 蛋白质组学面临的挑战
? 蛋白质没有可进行量的放大方法 (如 DNR的 PCR方法 )。
? 在生物处理过程中蛋白质是高度动态变化的。
? 物理化学性质的多样性。
? 动态范围的挑战：相对含量超过 106范围 (血清中可达 1012)
?质谱测量在蛋白质组学中的作用
? 质谱是肽 (不是蛋白质 )的一级序列分析的最普遍和最有效的工具。
? 质谱是一种精确的定量工具，尤其是内标法定量 (如对同位素比的
测量 )。
? 质谱在确定蛋白质高级结构时不是很有效。
? 质谱对已知肽和蛋白质重复定量分析不是很有效。
第五章：质谱法测定分子结构
62
经典的氨基酸序列分析方法
? N–端氨基酸单元的分析
最常用的有下列两种方法：
? 桑格尔 (Sanger F)方法：利用肽链 N–端游离氨基与 2,4–二硝基氟苯 (DNP)发生
芳香亲核取代反应，而将 肽链上的氨基酸逐个分解。
? 埃德曼 (Edman)方法：用异硫氰酸苯酯 (PITC)和 N–端的 游离氨基反应, 将肽
链上的氨基酸逐个分解 。
? C–端氨基酸单元的分析：通过羧肽酶催化水解
? 用特定的酶催化使含某种氨基酸的肽键部位水解
? 经典分析方法的缺点
工作量大、测序速度慢、样品用量大。
第五章：质谱法测定分子结构
63
蛋白质的二维分离
第五章：质谱法测定分子结构
64
仪器 鉴定 率
? 肽质量指纹谱 MALDI ~50%
(Peptide Mass Fingerprinter,PMF )
? 多肽序列标签 LC/MS/MS ~80%
(Peptide Sequence Tag,PST)
? 从新测序 LC/MS/MS > 80%
(De Novo)
蛋白质及混合物的定量分析：
同位素编码亲和标记 (Isotope-Coded Affinity Tags,ICAT)
蛋白质序列研究的三个层次
第五章：质谱法测定分子结构
65
蛋白质组研究技术路线
样品 (组织、细胞等 )
凝胶图象分析
蛋白质鉴定
二维数据库
酶解
HPLC-MS,MS/MS
数据库检索
二维凝胶电泳
酶解
肽混合物
MS,MS/MS
肽指纹谱 肽序列标签 从新测序
第五章：质谱法测定分子结构
66
一、肽质量指纹谱 (Peptide Mass Fingerprinter,PMF)
?PMF测定速度快。
?PMF灵敏。
?PMF需要完整和准确的蛋白质序列数据库。
第五章：质谱法测定分子结构
67
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 m /z0
100
%
1619.2 8968.6 4
836.5 8
893.6 7
1251.9 3
969.7 0
970.6 9
1013.8 0
1060.2 3
1061.2 6
1252.9 7
1254.0 0
1570.1 7
1448.1 4
2313.6 9
2312.7 6
1621.1 4
1670.2 5
1671.2 4
1672.1 4
1873.4 6
1853.3 8 2019.5 71876.4 1 2271.8 3
2036.5 7
2314.7 5
2315.8 0
2366.8 3
2367.9 0
2368.8 5
2369.9 1 2718.0 9
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 m /z0
100
%
1619.2 8968.6 4
836.5 8
893.6 7
1251.9 3
969.7 0
970.6 9
13.8 0
1060.2 3
1061.2 6
1252.9 7
1254.0 0
1570.1 7
1448.1 4
2313.6 9
2312.7 6
1621.1 4
1670.2 5
1671.2 4
1672.1 4
1873.4 6
1853.3 8 2019.5 71876.4 1 2271.8 3
2036.5 7
2314.7 5
2315.8 0
2366.8 3
2367.9 0
2368.8 5
2369.9 1 2718.0 9
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 m /z0
100
%
1619.2 8968.6 4
836.5 8
893.6 7
1251.9 3
969.7 0
970.6 9
13.8 0
1060.2 3
1061.2 6
1252.9 7
1254.0 0
1570.1 7
1448.1 4
2313.6 9
2312.7 6
1621.1 4
1670.2 5
1671.2 4
1672.1 4
1873.4 6
1853.3 8 2019.5 71876.4 1 2271.8 3
2036.5 7
2314.7 5
2315.8 0
2366.8 3
2367.9 0
2368.8 5
2369.9 1 2718.0 9
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 m /z0
100
%
1619.2 8968.6 4
836.5 8
893.6 7
1251.9 3
969.7 0
970.6 9
13.8 0
1060.2 3
1061.2 6
1252.9 7
1254.0 0
1570.1 7
1448.1 4
2313.6 9
2312.7 6
1621.1 4
1670.2 5
1671.2 4
1672.1 4
1873.4 6
1853.3 8 2019.5 71876.4 1 2271.8 3
2036.5 7
2314.7 5
2315.8 0
2366.8 3
2367.9 0
2368.8 5
2369.9 1 2718.0 9
分离的酶解的蛋白质
96/384位样品靶
数据处理和数据库检索
质谱样品
的准备
MALDI质
谱分析
蛋白质
一级结
构结果
PMF方法的一般流程
第五章：质谱法测定分子结构
68
? 洗胶 /去污
? 脱水
? 减少 S-S键
? 洗涤 /脱水
1,In-gel 酶切 /消化
?Multiprobe (4x96 Well Plat)
?样品体积 0.5-100 ?L
?板上加热和冷却
?消化板加热 37oC
?肽存储在 -4oC冷却板
?酶试剂存储在 -4oC冷却板
?修正 -SH基
?加入 trypsin溶液
?5-12小时
?肽提取
2,质谱分析样品的制备
灵敏度,500fmoles BSA in-gel。
移液和消化时间 8小时 (1x96 well plat)。
最多可进行 4x96 well plat的同时消化。
基本能力
第五章：质谱法测定分子结构
69
3,质谱测定
设这检索的条件,不同软件有不同的参数和用法。
MALDI-TOF 质谱测定
4,数据库检索
parmeters 参数的选择样品 -1 样品 -2 样品 -3
Program used MS-Fit PeptIdent PeptIdent
pI range NO 3~7 3.7~7.7
Protein mass range 20~50kD 15~45kD 15~45kD
Specie searched MAMMALS MAMMALS MAMMALS
Digest used Trypsin Trypsin Trypsin
Peptide mass accuracy ± 2Da ± 0.5Da ± 0.5Da
Methionice is Oxidized Oxidized Oxidized
Cysteine is Carbamidomethylation(Cys-CAM)
Pepptide masses are Average Monoisotopic Monoisotopic
Mumber of peptides 5 5 5
Number of missed cleavages 1 1 1
Number of peptide used in search 11 17 15
第五章：质谱法测定分子结构
70
样品 1 样品 2
样品 3
数据库检索结果：
带 *号的峰为与数据库中的峰相匹配的峰。
样品 1：甘油醛 -3-磷酸脱氢酶
样品 2：遍在蛋白羧酸基末端水解同工酶
样品 3：丙糖磷酸异构酶
第五章：质谱法测定分子结构
71
PMF 实验，同一点上经常是蛋白质的混合物
Some proteins are identified with high confidence
Some proteins are identified with high confidence Some proteins are identified with low confidence
Row data
第五章：质谱法测定分子结构
72
And there are still peptides unassigned to a protein Final result
第五章：质谱法测定分子结构
73
特有的搜索引擎
第五章：质谱法测定分子结构
74
二、多肽序列标签 (Peptide Sequence Tag,PST)和肽阶梯序列
(Peptide Ladder Sequencing)
1、肽序列标签
蛋白质的常见氨基酸有 20 种，一般 3 个氨基酸的肽段碎片将有 8000种可能的排列
方式 4 个氨基酸将有 160000种排列方式，因此即使对于不是很大的原核生物的蛋白质
组来说，一个短的序列片段也具有很高的特异性。
肽序列标签：一个多肽的部分氨基酸序列和该肽的质量以及该肽未测序部分的质
量。
Mann M,et al,Anal,Chem.,1994,66,4390 for PST
Mann M,et al,Trands in Biochem,Sci.,1996,21,494.
H
2
N C H C N H
O
R
1 R
2
O
N HCC H
R
3 O
O HCC H
a
1
a
2
b
1
b
2
c
1
c
2
x
1
x
2 y 1
y
2 z 1z
2
H
2
N C H C N H
O
R
1 R
2
C H
a
2
b
2
c
2
H
2
N C H C N H
O
R
1 R
2
OCC H
H
2
N C H C N H
O
R
1 R
2
O
N H
3
+
CC H
+
+
C N H
R
2
O
N HCC H
R
3 O
O HCC HO
+
H
3
N
R
2
O
N HCC H
R
3 O
O HCC H
+
R
2
O
N HCC H
R
3 O
O HCC H+
x
2
y
2
z
2
第五章：质谱法测定分子结构
75
?例：马心肌红蛋白鉴定
马心肌红蛋白胰酶酶切产物的 ESI-Q-TOF肽指纹谱
第五章：质谱法测定分子结构
76
马心肌红蛋白胰酶酶切肽段 m/z908.4(双电荷离子 )的 MS/MS谱图
肽序列标签：
G— L— S— D— G— E— W— Q— Q— V— L— N— V — W— G— K
y10,1257.8 y3,390.3
C端N端
W— Q— Q— V— L— N— V — W
Y3,390.3y10,1257.8
检索结果：
第五章：质谱法测定分子结构
77
N端 Y— A— M— I— G— D — P— T— G— A— L— R C端
y10,1000.5 y
7,715.4
?例,m/z为 691.43Da(M2+),质量数为 1380.6Da。
MS/MS图
肽序列标签：
检索结果：来自乙醇脱氢酶
715.4(DGI)1000.5
第五章：质谱法测定分子结构
78
2、肽阶梯序列 (Peptide Ladder Sequencing)
梯状测序法 (ladder sequencing),用化学探针或酶解使蛋白或肽从 N端或 C端逐一降
解下氨基酸残基，相互间差一个氨基酸残基的系列肽，经质谱检测，由相邻峰的质量
差知道相应氨基酸残基，与 Edman法相似。
AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn
PTC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -Aan
PC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn
PITC + 5% PIC
ATZ(AA1) + AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn
PC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn
Acid (TFA)
after m cycles
Further cycles (without
separation)
PC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn
PC- AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn
PC-AA3-AA4-AA5- -AAn
PC-AA4-AA5- -AAn
PC-AAm- -AAn
一步 MALDI-MS 阶梯序列数据
B,Chait et al.,Science 262,89,1993.
原理：
第五章：质谱法测定分子结构
79
血纤维蛋白肽,
Protein ladder Sequencing
[Glu1]fibrinopeptide B
第五章：质谱法测定分子结构
80
传统的低能量 CADMS/MS 质谱图
第五章：质谱法测定分子结构
81
MALDI PSD 与高能 CID的比较
第五章：质谱法测定分子结构
82
可选择性的碎裂方式：
?光诱导解离 (UV-193nm)
相当于高能 CID。
?多光子电离 (IR-10.6μm)
相当于低能 CAD。
?表面解离 (SID)
相当于低能 CAD。
?电子捕获解离 (ECD)
c和 z类型碎片增强。
注：这些方法在自动化大批量实验中并不是常规的方法。
数据库搜索为什么会失败
?蛋白质不在数据库里或者不正确的搜索参数 (酶特征, 分类法等等 )。
?在数据库里蛋白质表达不正确 (DNA核苷酸序列, 基因内区序列等等预测失败 )。
?蛋白质变性,
- 变性的氨基酸残基
- N端和 C端的变化：蛋氨酸的形成, 序列信号变化, C链缩短
- 可变的序列 (同族以及选择性结合的变体 )
- 后修饰变化 (糖基化，磷酸化等 )
- 不希望的化学诱导修饰 (在尿素中氨甲酰化 )
?搜索引擎不够完善成熟。
第五章：质谱法测定分子结构
83
三、重新测序 (De novo sequence)
? 数据库中没有的蛋白质分析
? 样品来源于非序列化基因组
? 蛋白质经多重高度修饰
? 在实际生物体中，非同寻常的酶活性
? 处理古生物样本，样品处理时肽被修饰 (污染 )
? 合成肽
?重新测序的原因
?谱图的预处理
?多电荷峰转化成单电荷峰
?多同位素峰转化成担同位素峰
?简化谱图提高信噪比
第五章：质谱法测定分子结构
84
谱图处理
谱图分析
第五章：质谱法测定分子结构
85
? 16O/18O C端标记
为了提高对串联质谱数据的解读能力，尤其是对 y和 b型离子系列的辨别能力，
用化学修饰方法使辨别更容易。
16O/18O C端标记,在蛋白质酶解时，酶解液中 H218O和 H216O各占 50%，酶解后
肽段羧基端上的羟基氧 18O/16O的 (M+2/M)同位素丰度比高于正常的峰强度，据此可
以分辨出 y系列离子。
给出 C-端离子的唯一特征碎片离子
第五章：质谱法测定分子结构
86
?de novo 序列解释
? 马尔可夫链蒙特卡洛 (Markov chain Monte Carlo) de novo 序列
产生算法
? 贝叶斯规则 (Bayesian)断裂方式和谱图匹配算法
Beta 牛乳糖 m/z 841.5 的 MS/MS谱
第五章：质谱法测定分子结构
87
T rue V V Q P N A T A WS E A G HI S A WQ Q WR
Ra nk % P rob,
1 6 11 16 21
1 62, 48 V V Q P N A T A WS E A G H L SA ( GE ) Q K G E R
2 20, 21 V V Q P N A T A WS E A G H L S A WQ K GE R
3 8,73 V V Q P N A T A WS E A G H L SA ( GE ) Q K DA R
4 3,99 V V Q P A A T A WS E A G H L S A WQ K DA R
5 2,33 VV GA P NA T A W S E A G H L SA ( GE ) Q K G E R
6 2,27 VV GA P NA T A W S E A G H L S A WQ K G E R
m/z 841.5 MS/MS 谱的测序结果
第五章：质谱法测定分子结构
88
同位素亲和端,
? ICAT试剂，重氢和正常氢的样品。
? 细胞中蛋白质被还原后，分别用含重氢和正常氢的 ICAT试剂与之作用，
ICAT试剂标记蛋白质中的半胱氨酸的巯基。
? 将两份蛋白质溶液混合，然后用任何方法提取分离。
? 蛋白质用胰蛋白酶酶切。亲和色谱对肽分离。
? 用各种质谱方法 (MS,MS/MS等 )分析。
? 通过同位素比例进行定量分析，通过碎片分布提供鉴定信息。
四、同位素编码亲和标记 (Isotope-Coded Affinity Tags,ICAT)
第五章：质谱法测定分子结构
89
使用可分裂的 ICAT试剂对蛋白质的定量和鉴定分析
MS
Dat
a
第五章：质谱法测定分子结构
90
混合后胰酶消化
细胞状态一 细胞状态二
提取蛋白，还原后用 ICAT的轻链 12C标记 提取蛋白,还原后用 ICAT的重链 13C标记
典型的 ICAT试剂工作流程
第五章：质谱法测定分子结构
91
基于稳定同位素标记定量的标记蛋白质方法
? 化学标记 (ICAT,N末端,以及其他残留物末端 )
－ 优点：一般都能适用 (组织结构，细胞等 )
? 同位素富集的生长机理 (15N)
－ 不需要任何化学干涉,但不能应用于组织样品，峰对之间的质量
差可变 。
? 新陈代谢标记（ 12C精氨酸）
－ 不需要任何化学干涉，但不能应用于组织样品。
第五章：质谱法测定分子结构
92
五、蛋白组学方法的应用
1、生物的蛋白质组及其数据库
? 简单生物的蛋白质组：完全测定或大部分测定蛋白质序列，如细菌、支
原体、酵母等。
? 相对复杂的高等生物：线虫、水稻、
? 小鼠及人类：局部或功能蛋白质组学。
? 相关的数据库的建立和完善。 Langen建立了流感嗜血杆菌的双向数据库。
2、生物过程生理机制的研究
? 大肠杆菌中蛋白质折叠的过程中新生肽段与分子伴侣的作用：首先利用
免疫共沉淀得到胞质中所有的与分子伴侣 GroEL结合的肽链，然后用双
向电泳等方法对这些肽链进行鉴定。
? 吞噬体的蛋白组分析, 140种蛋白，其在细胞吞饮 /吞噬作用途径中的作
用是以前人们所未曾预料到的。
第五章：质谱法测定分子结构
93
3、蛋白质的相互作用
作为细胞蛋白复合物和传导途径的基本要素，蛋白之间的相互作用对
蛋白的功能实现起着关键的作用。
? 用酵母双杂交系统研究线虫生殖器的发育过程。利用 27 种已知的与线
虫发育有关的蛋白，通过大规模地研究其相互作用，确证了 100多个
蛋白间相互作用。
? 人类胃病病原体幽门螺旋杆菌的大规模蛋白间相互作用图谱。基于蛋
白组学高通量的筛选策略，利用酵母双杂交系统筛选了 261种幽门螺
旋杆菌蛋白，确认了蛋白间的 1200种相互作用，从而将 46%的蛋白组
有机地联系起来。
? 用酵母双杂交技术对酵母的近 6000种蛋白之间的相互作用进行了大规
模的全面研究。通过阵列筛选和文库筛选结果的对比，发现前者更为
有效而后者通量更大。对酵母蛋白间的 2709 种相互作用进行了全面的
分析，建立了一个包含 1548种蛋白以及 2358种蛋白间作用方式的巨大
网络。
第五章：质谱法测定分子结构
94
4、疾病研究
? 肝癌：分析人肝肿瘤细胞系 HCC-M的蛋白组，鉴定其中 400种蛋白。
结合正常人肝组织的蛋白组图谱，可寻找到差异蛋白。 BEL-7404对
人肝癌细胞系与正常人肝细胞系 L-02的双向电泳图谱的差异分析，
找到了 99个差异蛋白点，用离子阱质谱对其中的 12个点进行鉴定。
? 前列腺癌肿瘤：人体组织和体外培养前列腺细胞系的蛋白组进行对
比，通过差异谱分析寻找差异蛋白，为寻找前列腺癌的治疗靶蛋白
和标记蛋白打下了良好基础。
第五章：质谱法测定分子结构
95
化学 表面 –蛋白质 表达剖析,
(反 相疏水 ) (阴 离子 ) (金属 离子 ) (正相 亲水 )(阳 离子 )
(PS-1 or PS-2)
(抗体 – 抗原 ) (受体 -配体 ) (DNA – 蛋白质 )
生物 表面 –蛋白质相互 作用检测,
六、蛋白芯片 -蛋白指纹图
第五章：质谱法测定分子结构
96
Or
ga
nic
De
ter
ge
nt
Sa
lt
W
ate
r
pHUr
ea
CH
AP
S
Im
ida
zo
l
洗脱条件
Wash Conditions
芯片表面类型
Su
rfa
ce
Ty
pe
飞行质谱检测
Measured m/z
2500 5000 7500 10000
0
20
40
60
5807.5
化学表面芯片的蛋白质剖析：三维分离
第五章：质谱法测定分子结构
97
血清白蛋白的分离鉴定
0 5 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0
0 5 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0
FCS 1:30 ph4.5 tx100 sp2
FCS 1:30 ph5.5 tx100 sp3
FCS 1:30 ph8.5 tx100 sp7
0 50000 100000 150000
0
25
50
75
0 50000 100000 150000
0
25
50
75
0 50000 100000 150000
0
25
50
75 pH4.5
pH5.5
pH8.5
Albumin
Transferrin
? 血清白蛋白 pI ~ 5.5
– pH 4.5 + 净电荷
– pH 5.5 no 净电荷
– pH 8.5 - 净电荷
? Transferrin铁传递蛋白 pI ~ 6.5
– pH 4.5 + 净电荷
– pH 5.5 + 净电荷
– pH 8.5 - 净电荷
Transferrin
第五章：质谱法测定分子结构
98
De
tect
or
TOF-MS
5 0 0 0 7 5 0 0 1 0 0 0 0 1 2 5 0 0
5 0 0 0 7 5 0 0 1 0 0 0 0 1 2 5 0 0
W eak c at ion ex c ha nge pH
4,5 w as h
0
5
10
5000 7500 10000 12500
Trace View
5 0 0 0 7 5 0 0 1 0 0 0 0 1 2 5 0 0
5 0 0 0 7 5 0 0 1 0 0 0 0 1 2 5 0 0
W ea k c a t io n e x c h a n ge p H 4, 5 w a s h
5000 7500 10000 12500
Gel View
5 0 0 0 7 5 0 0 1 0 0 0 0 1 2 5 0 0
5 0 0 0 7 5 0 0 1 0 0 0 0 1 2 5 0 0
W eak c at ion ex c ha nge pH
4,5 w as h
0
5
10
5000 7500 10000 12500
Map View
蛋白指纹图谱仪－芯片阅读器
?电离的蛋白质可以通过飞行时间质谱仪精确地测定质量
?分析范围广，敏感性高
第五章：质谱法测定分子结构
99
2 5 0 0 5 0 0 0 7 5 0 0 1 0 0 0 0 1 2 5 0 0
2 5 0 0 5 0 0 0 7 5 0 0 1 0 0 0 0 1 2 5 0 0
R et M ap 1-4
R et M ap 1-3
R et M ap 1-4 (2)
R et M ap 1-3 (2)
c om p1
2500 5000 7500 10000 12500
0
2
4
6
3
9
9
7
.
8
6
4
4
6
7
.
6
+
H
4
8
4
3
.
6
+
H
6
2
2
6
.
7
6
6
4
1
9
.
1
1
6
6
0
5
.
2
7
7
7
0
0
.
0
5
7
9
0
7
.
1
1
8
0
9
2
.
4
+
H
8
7
1
1
.
4
1
8906
9
2
2
7
.
0
3
9
7
8
1
.
5
1
9
9
7
5
.
5
2500 5000 7500 10000 12500
0
2
4
6
3
0
2
8
.
2
+
H
3
9
9
4
.
8
9
4
4
6
9
.
8
9
6
2
2
9
.
7
3
6
4
2
2
.
1
2
6
6
1
5
.
9
4
7
5
1
6
.
7
8
7
6
9
9
.
2
2
7
9
1
2
.
9
3
8
0
9
8
.
4
6
8
9
0
8
.
6
6
9
2
3
4
.
2
8
9
4
0
4
.
6
2
2500 5000 7500 10000 12500
-2, 5
0
2, 5
5
7, 5
Difference map
Patient
Control
GelViewTM
蛋白指纹图谱的发现
