第三章 环境毒理学的基本研究方法 实验动物的选择： 物种选择： 选择对外液化学物的毒性反应及代谢特点与人类接近的物种； 选择自然寿命不太长的物种； 选择易于饲养和实验操作的物种； 选择经济并易于获得的物种。 品系选择： 近交系动物 采用连续20代以上兄妹交配或亲子交配而培育的纯品系动物。如津白、津白、615， BALB／C， C3H、C57B／6J小鼠等。 突变系动物 动物在生长繁殖过程中，通过自然突变或人工定向突变的办法，使其某基因发生突变，并丧失了原有的正常功能。这种突变的基因可以世代相传并保持遗传基因特性的品系动物。 杂交群动物 两个不同近交系之间有目的进行交配，所产生的第一代动物， 亦称杂交一代动物。 封闭群动物 一个动物种群，在5年以上不从外部引进新血缘，仅由同一品系的动物在固定场所保存繁殖的动物群如昆明种小鼠、NIH小鼠、LACA小鼠、Wistar大鼠SD大鼠、青紫蓝兔、新西兰兔等。 微生物控制的选择： 无菌动物 体内外均无任何微生物和寄生虫的动物 无特定病原体动物（SPF）体内无特定的微生物和寄生虫存在的动物。实际上是无传染病的动物，容许携带非特定微生物。饲养于封闭的系统中。 清洁动物 有程最低限度疾病动物，动物体内外不携带人畜共患的病原体或动物传染病病原体，与SPF动物不同的是，抗体检查常有脑脊髓炎病毒、鼠肝炎病毒等抗体滴度，但不应有临床症状、病理改变及自然死亡。饲养在半屏蔽系统 第一节 急性毒性试验 一、急性毒性试验的目的： 概念：研究化学物大剂量一次染毒或24小时内多次染毒动物后所引起的毒作用试验。 主要根据人体可能的暴露途径，选择经口、经皮、经呼吸道的染毒途径进行急性毒性试验，获得 LD50或LC50。农药等有可能与皮肤或眼接触的化学物需进行皮肤刺激试验、眼刺激试验和皮肤变态反应试验。对呼吸道有刺激作用的化学物还应进行吸入刺激阈浓度试验。通过急性毒性试验，可对化学物的毒性作出初步的估计并确定其急性毒作用特征，为急性毒性定级、进一步试验的剂量设计和毒性判定指标的选择提供依据。 目的：在短期内了解该物质的毒性大小和特点，并为进一步开展其他毒性试验提供设计依据。 1、确定供试化学物急性毒性的剂量—反应关系和中毒特征； 2、求LD50或LE50,为急性毒性评价提供依据。 3、研究毒物的毒动学和毒效学过程。 用来表示急性毒性大小的是LD50:对受试物的个体感受性影响较小，有更高的重现性；从剂量反应曲线上看它处于曲线的中段，是死亡率对剂量敏感的部位，有60％一70％死亡动物集中在LD50附近。 见p505表22-5，22-6 二、试验程序与评价 1．动物选择 首先选择受试物在体内代谢情况与人体内相近的或对受试物最敏感的品系。 啮齿类：大鼠、小鼠； 兔、猪、狗。 应对两种性别、成年和幼年动物进行测定。 2．染毒途径与方式： 一般应与人的接触途径相同。常用的有以下几种： (1)经口染毒 常用灌胃法，也可将受试物放在饮水中由动物自由摄取。将化学物与饲料混和．具有剂量不准确的缺点，而且常会影响吸收，降低化学物的毒性。 为了便于染毒常需用溶剂来溶解受试物或将其配成混悬液，溶剂本身应无毒，且不与受试物起反应。溜胃容积一般大鼠不超过3m1，小鼠不超过o．5m1，当染毒剂量过大时，可分几次给药。 (2)经呼吸道染毒 将实验动物放在有毒气或粉尘的染毒柜内进行染毒。急性吸入染毒采用静式染毒瓶(20—25L)或染毒拒(25—50L)，加入定量受试物形成所需浓度的空气环境，让动物自由吸入，染毒2—4h。 (3)经皮肤染毒 本法主要用于化学物如化妆品农药经皮(或粘膜)吸收所引起的急性毒性。常用动物是成年家免或脉鼠，有时也用大鼠和小鼠。在正式给药前24h，给动物背部脱毛，注意勿伤皮肤。将受试物均匀涂布于皮肤表面，用纱布覆盖，共敷24h。 3．试验程序： （1）剂量与分组 首先应根据受试物的结构对比文献中类似化学物的致死量作初步估计，然后进行预试以找出粗略的LD50或LD0。正式试验可在LD100与LD0之间设5—7个剂量组。 （2）症状观察 时间：24h或两周内的反应。 观察内容：表现症状和解剖观察p504表22-4 三、 LD50的计算与结果评价 计算LD50及其标准误的方法：. 通常采用概率单位法和寇氏法。见p506。 根据所得结果，按前述急性毒性分级标准，评定其毒性大小。LD50值愈小，毒性愈大。各种化学物之间的毒性有明显的差异。 概率单位法 用正态曲线下的面积来表示死亡率的大小，其均数左右边的面积各为50%。将正态曲线横轴上的单位，用标准正态差为单位来计算：d=(x-μ)/δ 为消去负号，将其值一律加5，称为概率单位。 死亡率为50%时，概率单位为5，以此类推。 从表17-1百分率-概率单位换算表，可以任一死亡率换算为相应的概率单位。 经此换算，剂量对数与概率单位(即表示死亡率)，已不是S状曲线(A)而成为直线关系(B)。 LC50计算步骤如下： a．根据各组死亡率从表17-1百分率-概率单位换算表中查到各组的概率单位，如第一组 死亡率为80％，查得概率单位为5.84，余此类推。死亡率为100％或0％者，不列入计算。 b 用方格纸绘相关线，横轴表示浓度对数（x），纵轴表示概率单位（y），各级数值点在图上（图 17－7）。 C．顺着各点的分布趋势，用直尺绘出一条最适合于各点的直线，此线应尽量靠近概率单位为5及附近的点子。画线前可用透明尺或用一根黑线进行测试，为直线通过各点中间。 d．求概率单位与处的浓度对数（m），其反对数即为LC50 e.剂量-反应关系的回归方程的计算：可选两个相距较远的概率单位点y□和y2,求回归系数b。  代入回归方程 式中：  b为直线斜率 x为的剂量对数 为概率单位5的剂量对数 f.求LC50的可信限 先求LC50的标准误差(Sm)：  =4    平均致死量法（又名寇氏法） 此法计算LD50较为简便，但试验时要符合下列要求：①每个试验组动物数要相同；② 各组剂量要按等比级数分组；③最大剂量的死亡率最好为100％或与之接近，最小剂量的死 亡率最好为0％或与之接近。计算公式如下：  式中，Xm为最大剂量的对数值；i为相邻剂量比值的对数；为各组死亡率的总和（以小数表示）。 例小鼠腹腔注射致百虫急性毒性试验结果如表 17－4所示，求 LD50    式中，p为一个组死亡率；q为一个组存活率；i为相邻剂量比值的对数；h为各组动物数。    第二节 亚慢性和慢性毒性试验 了解长期反复接触低剂量化学物质可能引起的毒性效应。 需进行蓄积试验和亚慢性、慢性毒性试验。 一、蓄积试验及其方法： 环境化学物的蓄积作用是慢性中毒的基础。 （一）蓄积作用：某些物质以较小剂量反复作用于机体，可使机体对该物质的反应性增强，即一次染毒不引起明显中毒反应或死亡的剂量，经分次重复染毒后，可引起明显中毒或死亡，此种现象称为蓄积作用(accumulation)。可分两种： 物质蓄积，即毒物在体内的排出量小于进入量，以致毒物在体内的贮留量增多为物质蓄积； 功能蓄积：是毒物进入机体后，并末发现在体内明显贮留，但可引起机体功能改变的逐渐累积，导致对该毒物的反应性增强，此种现象称为功能蓄积。 但两者的划分是相对的，既有差别，又互有联系。功能蓄积可能是由于贮存于体内的化合物或代谢产物的数量极微，目前分析方法尚不能检出的一种物质蓄积，或是由于每次机体接触化合物之后所引起的损害累积所致。 耐受性(tolerance)是机体多次接触化学物质后．对该物质产生反应性减弱的现象，显示不易发生慢性中毒。 （二）蓄积作用的测定方法 有多种，常用蓄积系数法。 蓄积系数是指多次染毒使半数动物出现某种效应的总剂量(ED50(n))与一次染毒引起同一效应的剂量，即半数效量(ED50(1))的比值。  若以死亡为毒效应指标，上式为  蓄积系数的测定： 1．固定剂量法 由Kagan和s帕nkevic(I 954)提出，该法固定每天染毒剂量为1／20—1/5 LD50，连续染毒，直至实验动物半数死亡。如果染毒剂量累计已达5个LD50 动物死亡仍末达半数，实验均可告结束，计算蓄积系数，作出评价。 2．递增剂量法 由Lim等(1961)提出，先测定LD50（1），然后对另一组动物每天染毒，以4天为一期，开始给予0.1LD50。以后每期按1.5倍递增剂量，直至动物半数死亡，或实验已达24天，可结束实验，计算系数。 3. 二十天试验法 本法是我国《食品安全性毒理学评价程序》(1984)针对上述两法的利弊而提出的。选用大鼠或小鼠每个剂量组雌雄各10只，以1／2、l／5、1／10、1／20 LD50。分别对每组进行染毒，每日1次，共20天。如l／20LD50组动物有死亡，且有剂量—反应关系，则有较强蓄积作用；如1／20 LD50组无死亡，则为弱蓄积。 二、亚慢性毒性作用及其试验方法： 1、目的：确定化学物亚慢性毒性的阈剂量 和NOEL(最大无作用剂量或未观察到作用剂量)。 2、试验期限： 无完全统一认识，一般认为3-6月； 现有学者主张喂饲：90天，因有报道认为3个月毒性效应与更长时间基本相同。 呼吸道吸收：30或90天，每天6小时，每周5天。 皮肤毒性：30天。 3、试验动物的选择、饲养环境及染毒途径： 选择：急性毒性实验证明对受试化学物敏感的物种或品系； 环境：营养合理，饮水清洁、充足、温、光、湿适宜； 染毒途径：尽量模拟人类在环境中接触受试化学物的途径，与急性毒性试验相似。 4、剂量选择与分组 剂量：1／20—I／5LD50，对于在体内不产生蓄积作用而排泄又快的物质可适当加大剂量，反之则可减少剂量。 设3—4个实验组和1个对照组。 实验组要求： 要求在实验结束时，最低剂量组的动物不会产生可观察到的毒性反应，相当于亚慢性的最大无作用剂量； 最高剂量组要求能引起动物明显的毒性反应，但又不引起动物死亡； 中间剂量组应产生轻微的毒性反应，相当于亚慢性的阈剂量。 另设一对照组。 剂量选择可参照急性毒性和蓄积毒性的资料。如：以急性非致死性试验的阈剂量作为亚慢性试验的最高剂量。 5、症状观察 (1)一般性指标：如动物体重增长率、食物消耗率、活动能力等。为整体反应指标。体重明显下降常常是中毒或疾病的信号，也是一项比较敏感的指标。 (2) 化验指标： 特异指标：用以测定化学物作用于机体后所引起的特异性反应。因此，它能更确切地阐明该物质对动物产生有害影响的闻剂量(浓度)及无作用剂量(浓度)。例如： 有机磷农药：测定血中胆碱酯酶活性； 芳香族硝基化学物：可测定高铁血红蛋白； 无机F：可检查斑釉发生率及牙齿和骨氟含量。 功能指标：血、肝、肾功能指标：一些酶的测定来实现的，目前常用的有谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(吻)、碱性磷酸酶(AKP)、乳酸脱氢酶(LDH)及其同功酶、r—谷氨酰转耽酶(r—GTP)等活性测定。 有害物质在体内的分布、代谢及排泄指标：生物材料(血、尿、毛发等)中有害物质(汞、镉、铅、砷、氟等)含量测定。 三、慢性毒性作用及其试验方法： 慢性毒性试验是检测在较长时间内，以小剂量反复染毒后所引起损害作用的试验。 1、目的： 评价化学物在长期小剂量作用的条件下对机体产生的损害及其特点．确定其慢性毒作用阈剂量和最大无作用剂量。 2、试验方法： （1） 动物选择、染毒方法、观察指标等与亚慢性毒性试验相似； （2）染毒期限：1-2年或终身染毒，也有人提出6月。 （3）剂量分组： 3个染毒组和一个对照组。 高剂量组：1/5—1/2亚慢性试验阈值； 中间剂量：1/50—1/10； 低剂量组：1/100。 第四节 致突变实验 一般包括①原核细胞基因突变实验，如Ames试验或大肠杆菌试验或枯草杆菌试验；②真核细胞染色体畸变实验，如微核试验或骨髓细胞染色体畸变分析；如实验结果为阳性，可在DNA修复合成试验、显性致死试验、果蝇伴性隐性致死试验和体外细胞转化等试验中再选两项进行最后的综合评价。通过致突变试验，可对受试物的潜在遗传危害性作出评价并预测其致癌性。 一、目的 确定外源化学物对生物体是否具有致突变作用。 基因点突变试验、染色体畸变试验、DNA损伤试验。 二、供试生物： 微生物、动物细胞、昆虫、动物或植物 三、试验方法 体外基因突变试验、细胞遗传学试验、体内基因突变试验、DNA损伤试验 （一）体外基因突变试验 1、Ames试验（鼠伤寒沙门氏菌/动物肝细胞微粒体试验） （1）方法原理： 利用一种突变微生物菌株与被检测化学物接触，使突变型微生物回复突变，重新成为野生型微生物。 突变型微生物不具备合成组氨酸的能力，不能在不含（或低浓度）组氨酸培养基上生长。 （2）方法： 将突变型沙氏菌在不含（或低浓度）组氨酸培养基上培养,以其生长状况作为指标。 在培养基中加入哺乳动物的肝细胞微粒体：提高灵敏度。 （3）特点： 优点： 简便、灵敏、快速（48h）、费用低； 检测结果与对动物的致癌性的相符率达约90%。 缺点： 利用微生物作为供试物，不能全面反映哺乳动物的遗传信息，仅1/6； 微生物的DNA修复系统与动物有差异； 微生物无免疫功能。 2、哺乳动物体细胞突变试验 （1）方法原理与微生物突变类似。 常用的细胞株：中国地鼠肺细胞V79、中国地鼠肺卵巢细胞(CHO)、小鼠淋巴瘤L5178Y细胞株。 V79、CHO细胞株：缺乏利用嘌呤碱的一种酶——次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT）。 在培养基中加入某些类似嘌呤碱类物质：6-巯基嘌呤、6-硫代嘌呤、8-N杂鸟嘌呤，这些物质对正常细胞有毒性，不能在该培养基上生长； 而突变细胞株可利用类似嘌呤碱类物质而合成DNA, 在该培养基上生长良好。如待测化合物能引起回复突变，使突变细胞成为正常细胞，则中毒不能生长。 （二）细胞遗传学试验 鼠淋巴瘤L5178Y突变细胞株：缺乏胸苷激酶（TK），可在含有细胞毒物5-溴脱氧尿苷的培养基上生长。在突变物作用下产生回复突变成为正常细胞后，则不能生长。 （1）试验方法： a. 体外培养： CHO细胞或人类外周血淋巴细胞与化学物，在细胞培养液（DMEM, RPM, 1640或1999）中，370C下培养24h(CHO)或72h(人类细胞）。观察前2h加入秋水仙碱（中期分裂阻断剂），制片，镜检观察。 b. 体内染色体畸变分析：大鼠、小鼠，染毒饲养，观察骨髓细胞染色体畸变情况。 致畸试验用于确定受试物的胚胎毒作用以及对胎仔的致畸作用。生殖试验一般要求进行两代，以判断受试物对生殖过程的影响。代谢试验是了解化学物在体内的吸收、分布和排泄特点，有无蓄积性以及毒作用的可能靶器官和组织。 第四节 环境流行病学方法 一、概念和特点： 流行病学：研究特定人群中有关健康的状态和事件的分布以及影响这些分布的决定因素； 环境流行病学：应用流行病学的原理和方法，重点研究人们在生活和工作环境中各种因素与人群健康的关系。 一般流行病学研究的内容是疾病在人群中的分布，它要回答三个问题： (1)疾病在时间、地点、不同人群中是怎样分布的? (2)什么因素是该病的主要决定因素? (3)怎样控制该病的流行?