第三章
环境毒理学的基本研究方法
?毒理学试验
?调查研究
毒理学
实验基础
研究方法 流行病学研究 受控的临床研究 毒理学体内试验 毒理学体外试验
优点 · 真实的暴露条件 · 规定的限定暴露条 · 易于控制暴露条件 · 影响因素少，易于控
· 在各化学物之间发生相 · 在人群中测定反应 · 能测定多种效应 制
互作用 · 对某组人群 (如哮喘 ) · 能评价宿主特征的作用 · 可进行某些深入的研
· 测定在人群的作用 的研究是有力的 (如：性别、年龄、遗 究 (如：机制，代谢 )
· 表示全部的人敏感性 · 能测定效应的强度 传特征等和其他调控因 · 人力物力花费较少
素饮食等 )
· 能评价机制
缺点 · 耗资、耗时多 · 耗资多 · 动物暴露与人暴露相关 · 不能全面反映毒作用
· 多为回顾性，无健康 · 较低浓度和较短时 的不确定性 不能作为毒性评价和
保护 间的暴露 · 受控的饲养条件与人的 危险性评价的最后依
· 难以确定暴露，有混杂 · 限于较少量的人群 实际情况不一致 据
暴露问题 (一般 <50) · 暴露的浓度和时间的模 · 难以观察慢性毒作用
· 可检测的危险性增加必 · 限于暂时、微小,式显著地不同于人群的
需达到 2倍以上 可逆的效应 暴露
· 测定指标较粗 (发病率,· 一般不适于研究最
死亡率 ) 敏感的人群
毒理学研究方法的优缺点
1 实验动物和人对外源化学物的反应敏感
性不同, 有时甚至存在着质的差别
2 高剂量向低剂量外推的不确定性
3 小数量实验动物到大量人群外推的不确
定性
4 成年健康动物向年老体弱及患病个体外
推的不确定性
实验动物的毒理学实验资料外推到
人群接触的安全性时的不确定性
1 化学物在实验动物产生的作用, 可以外推
于人 。 基本假设 ① 人是最敏感的动物物
种； ② 人和实验动物的生物学过程与体重
(或体表面积 )相关 。
2 实验动物必须暴露于高剂量, 这是发现对
人潜在危害的必需的和可靠的方法 。
3 成年的健康 (雄性和雌性未孕 )实验动物和
人可能的暴露途径是基本的选择 。
描述毒理学试验的基本原则
1 受试物毒作用的表现和性质
2 剂量 —反应 (效应 )研究
3 确定毒作用的靶器官
4 确定损害的可逆性
毒理学毒性评价试验的基本目的
实验动物 （ laboratory animal）
指经人工培育, 对其携带微生物
实行控制, 遗传背景明确, 来源
清楚, 可用于科学研究的动物 。
实验动物的选择
实验动物的选择
物种选择
选择对外液化学物的毒性反应及代谢
特点与人类接近的物种；
选择自然寿命不太长的物种；
选择易于饲养和实验操作的物种；
选择经济并易于获得的物种 。
近交系动物 连续 20代以上兄妹交配或亲子交配培育
突变系动物 突变的基因可世代相传并保持遗传基因特性
杂交群动物 两个不同近交系之间有目的进行交配, 所产
生的第一代动物, 亦称杂交一代动物 。
封闭群动物 5年以上不从外部引进新血缘, 仅由同一品系
的动物在固定场所保存繁殖的动物群
实验动物的选择
品系选择
无菌动物 体内外均无任何微生物和寄生虫
无特定病原体动物 （ SPF） 体内无特定微生物和寄
生虫存在的动物 (无传染病 )。 饲养于封闭的系统 。
清洁动物 与 SPF的不同：抗体检查常有脑脊髓炎病
毒, 鼠肝炎病毒等抗体滴度, 但不应有临床症状,
病理改变及自然死亡 。 饲养在半屏蔽系统 。
微生物控制的选择
实验动物的选择
个体选择
1 年龄
2 性别
3 生理状态
4 健康状况
实验动物的选择
品 系
周龄 Wistar SD
雌性 雄性 雌性 雄性
3 54 56 50 52
4 91 97 86 101
5 134 134 130 150
6 166 187 172 206
7 209 233 210 262
8 214 297 240 318
9 232 325 258 365
10 246 370 272 399
大鼠体重与周龄的关系
小鼠体重与周龄的关系
品 系
周龄 昆明 BALB/c C57BL/6 615
雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性
0 1.95 2.10 1.40 1.46 1.40 1.44 1.58 1.58
1 5.54 5.82 3.35 3.50 3.42 3.50 4.64 4.64
2 7.90 8.35 5.50 5.60 5.55 5.60 7.96 7.96
3 13.55 14.80 7.32 7.40 6.40 6.90 9.83 9.83
4 21.35 22.60 11.60 12.45 12.20 12.57 15.75 19.00
5 27.90 33.25 14.75 16.10 16.90 18.10 20.75 22.58
6 32.80 39.25 15.60 17.40 18.40 20.50 21.88 25.96
7 34.70 39.90 16.10 18.65 19.00 21.60 23.12 27.96
8 34.80 40.05 18.16 20.25 20.25 22.40 24.16 28.83
1 未处理对照组 (空白对照组 )：本底值,
质量控制
2 阴性 (溶剂／赋形剂 )对照：与染毒组比
较的基础
3 阳性对照：检测试验体系的有效性
4 历史性对照：检查试验体系的稳定性,
即进行实验室质量控制和保证
毒理学试验常用对照
? 对各个毒理学试验应该用同一种, 同一批号受
试物
? 受试物成分和配方必须固定
? 如是异构体混合物, 异构体比例必须固定
? 活性成分的百分含量和可检测的杂质的浓度也
应固定
? 受试物在贮存期内稳定性和在饲料中的稳定性
必须进行研究并报告
? 受试物应一次备齐全部实验的用量
受试样品
毒理学试验设计的统计学要求
随机, 重复, 对照原则
对常规毒理学试验资料的统计学方法
计量资料,一般用 t检验或 ANOVA
记数资料,卡方检验
毒理学试验的统计学
1 处理组与对照组比较差别有无显著性
2 有无剂量 -反应关系
3 是否伴有其他相关参数的改变
4 是否在, 正常, 值范围
实验结果的判断
第一节 急性毒性试验
一、急性毒性试验的目的,
1、确定供试化学物急性毒性的剂量 — 反应关系和中毒
特征；
2、求 LD50或 LC50,为急性毒性评价提供依据。
3、研究毒物的毒动学和毒效学过程。
表示急性毒性大小,
LD50(对受试物
的个体感受性影响较
小，有更高的重现性 )
二、试验程序与评价
1．动物选择, 首选受试物在体内代谢情况与人体内相近的
或对受试物最敏感的品系。
一般：以哺乳动物为主，常用大鼠、小鼠；
经皮：兔、豚鼠、猪
应对两种性别、成年和幼年动物进行测定。
选择两种以上的实验动物，最好一为啮齿类，一为非
啮齿类。 (目的：核对种间差异 )
2．染毒途径与方式, 一般与人的接触途径相同。
(1)经口染毒,常用灌胃法，也可将受试物放在饮水中
由动物自由摄取。
(2)经呼吸道染毒,将实验动物放在有毒气或粉尘的
染毒柜内进行染毒。急性吸入染毒采用静式染毒瓶 (柜 )，
染毒 2— 4h。
(3)经皮肤染毒,主要用于化学物经皮 (或粘膜 )吸收所
引起的急性毒性。正式给药前 24h，背部脱毛，勿伤皮
肤。将受试物均匀涂布于皮肤表面，用纱布覆盖，共敷
24h。
3．试验程序,
（ 1）剂量与分组
①预试验,找出受试物大致致死量范围 (死亡率为
10%~90%)；
例：欲做化合物 A的经口预试验。
化合物 B的化学结构与 A相似，已知 B的 =LD50 =40(预期
毒性中值 )。
则预试验取 2.5,10,40,160,640 (上下各推 1~2组，
组距应较大，初始 4倍差 )
③ 求 LD50正式试验：在 LD100与 LD0之间设 5— 7个剂量组。
组距 (对数 )
或
式中,n------设计的剂量组数
（ 2）症状观察
时间,24h或两周内的反应
1
lglg 1090
?
??
n
LDLDi
1
lglg 0100
?
??
n
LDLDi
三,LD50的计算与结果评价
计算方法,概率单位法 和 寇氏法 。
LD50值愈小，毒性愈大。
概率单位法
?存在正态曲线关系。
?标准正态差 d=(x-μ)/δ
式中,x—— 剂量对数；
μ—— 剂量对数均数
δ —— 标准差
d=0，左边面积 (死亡率 )为 50％，右边面积 (存活率 )50％
d=1，死亡率为 84.13％,
d=2，死亡率为 97.73％,
d＞ 2，死亡率接近 100％。
d=一 1，死亡率为 15.87％。
d=一 2，死亡率为 2.27％。
d＜一 3，死亡率接近 0。
?从上表，可以任一死亡率换算为相应的概
率单位。
? A：剂量对数 ~死亡百分率
? B：剂量对数 ~概率单位
LC50计算步骤如下,
? a.根据死亡率查概率单位 (死亡率为 100％ 或 0％
不计 )
? b.绘图求回归方程 。
? c.求 y=5的浓度对数 （ m）, 其反对数即为 LC50
y=2.78x-2.76
同理可得 LC5,
LC10,……
? d.求 LC50的可信限
先求 LC50的标准误差 (Sm),
S(校准差 )=1/k
本例中,S=1/2.78
2
4?
SS
m ?
平均致死量法（又名寇氏法）
试验要求,
?① 每个试验组动物数相同；
?② 各组剂量按等比级数分组；
?③ 最大剂量的死亡率最好为 100％ 或与之
接近, 最小剂量的死亡率最好为 0％ 或与
之接近 。
式中,
? Xm—— 最大剂量的对数值；
? i— 相邻剂量比值的对数；
? —— 各组死亡率的总和 （ 以小数表示 ） 。
?p
?p
?例小鼠腹腔注射致百虫急性毒性试验结果
如下表所示, 求 LD50
式中,
? p—— 一个组死亡率；
? q—— 一个组存活率；
? i—— 相邻剂量比值的对数；
? h—— 各组动物数 。
第二节 亚慢性和慢性毒性试验
一、蓄积试验及其方法,
（一）蓄积作用,某些物质以较小剂量反复作用于机体，
可使机体对该物质的反应性增强，即一次染毒不引起明显
中毒反应或死亡的剂量，经分次重复染毒后，可引起明显
中毒或死亡，此种现象称为 蓄积作用 (accumulation)。
可分两种,
物质蓄积,毒物在体内的排出量小于进入量，以致毒
物在体内的贮留量增多为物质蓄积；
功能蓄积, 毒物进入机体后，并未发现在体内明显贮
留，但可引起机体功能改变的逐渐累积，导致对该毒物的
反应性增强。
耐受性 (tolerance),机体多次接触化学物质后．对该物质
产生反应性减弱的现象，显示不易发生慢性中毒。
（二）蓄积作用的测定方法
有多种，常用 蓄积系数法 。
蓄积系数 (accumulation coefficient)K,
ED50(n) —— 多次染毒使半数动物出现某种效应的总剂量 ;
ED50(1) —— 一次染毒引起同一效应半数效量。
)1(50
)(50
ED
ED
K n?
若以死亡为毒效应指标, 上式为
K越小, 受试化合物的蓄积毒性越大 。
)1(50
)(50
LD
LDK n?
K 蓄积作用强度
＜ 1 高度蓄积
1~3 明显蓄积
3~5 中度蓄积
＞ 5 轻度蓄积
1．固定剂量法, 固定每天染毒剂量为 1/20— 1/5
LD50，连续染毒，直至实验动物半数死亡。如果染毒剂
量累计已达 5个 LD50 动物死亡仍末达半数，实验均可告
结束，计算蓄积系数，作出评价。
2．递增剂量法, 先测定 LD50（ 1）,然后对另一组动
物每天染毒，以 4天为一期，开始给予 0.1LD50。以后每
期按 1.5倍递增剂量，直至动物半数死亡，或实验已达
28天，可结束实验，计算系数。
3,二十天试验法, 选用大鼠或小鼠每个剂量组雌雄
各 10只，以 1/2,l/5,1/10,1/20 LD50分别对每组进行
染毒，每日 1次，共 20天。如 l/20LD50组动物有死亡，且
有剂量 — 反应关系，则有较强蓄积作用；如 1/20 LD50组
无死亡，则为弱蓄积。
蓄积系数的测定
二、亚慢性毒性作用及其试验方法,
1、目的,确定化学物亚慢性毒性的阈剂量和 NOEL。
2、试验期限,3-6月；
呼吸道吸收,30-90天；
皮肤毒性,30天。
3、试验动物的选择、饲养环境及染毒途径,
试验动物选择,对受试化学物敏感的物种或品系；
环境,营养合理，饮水清洁、充足、温、光、湿适宜；
染毒途径,尽量模拟人类在环境中接触受试化学物的途径，
与急性毒性试验相似。
4、剂量选择与分组
剂量,1／ 80— I／ 50LD50，对于在体内不产生蓄积作
用而排泄又快的物质可适当加大剂量，反之则可减少
剂量。
设 3— 4个实验组和 1个对照组。
实验组要求,在实验结束时
最低剂量组 不产生可观察到的毒性反应；
最高剂量组 能引起明显毒性反应，但不引起死亡；
中间剂量组 产生轻微毒性反应。
5、症状观察
(1) 一般性指标 (非特异 )
① 一般综合性指标,
动物体重增长率、食物消耗率、活动能力等。
②一般化验性指标,主要指血和肝、肾功能的检测。
(2)特异指标,
测定特异性反应。
更确切阐明该物质的阈剂量 (浓度 )及无作用剂量 (浓度 )。
(3) 病理组织学检查,
实验中死亡动物的病理检查及实验结束时的尸检。
三、慢性毒性作用及其试验方法
1、目的,评价化学物在长期小剂量作用的条件下对机体产
生的损害及其特点．确定阈剂量和最大无作用剂量。
2、试验方法,
（ 1） 动物选择、染毒方法、观察指标等与亚慢性毒性试验
相似；
（ 2）染毒期限,1-2年或终身染毒，也有人提出 6月。
（ 3）剂量分组,
3个染毒组和一个对照组。
高剂量组,1/5— 1/2亚慢性试验阈值；
中间剂量,1/50— 1/10；
低剂量组,1/100。
第四节 致突变实验
一、目的
确定外源化学物对生物体是否具有致突变作用。
基因点突变试验、染色体畸变试验,DNA损伤试
验。
二、供试生物,
微生物、动物细胞、昆虫、动物或植物
三、试验方法
体外基因突变试验、细胞遗传学试验、体内基因
突变试验,DNA损伤试验
（一）体外基因突变试验
1,Ames试验（鼠伤寒沙门氏菌 /动物肝细胞微粒体试
验）
（ 1）原理,
利用一种突变微生物菌株与被检测化学物接触，
使突变型微生物回复突变，重新成为野生型微生物。
营养缺陷）突变型微生物（组氨酸回复突变正向突变野生型沙氏菌
突变型微生物不具备合成组氨酸的能力，不能在
不含（或低浓度）组氨酸培养基上生长。
（ 2）方法,
将 突变型沙氏菌在不含（或低浓度）组氨
酸培养基上培养,以其生长状况作为指标。
在培养基中加入哺乳动物的肝细胞微粒体：
提高灵敏度。
（ 3）特点,
优点,
? 简便、灵敏、快速（ 48h）、费用低；
? 检测结果与对动物的致癌性的相符率达约 90%。
缺点,
? 利用微生物作为供试物，不能全面反映哺乳动物的遗
传信息，仅 1/6；
? 微生物的 DNA修复系统与动物有差异；
? 微生物无免疫功能。
2、哺乳动物体细胞突变试验
（ 1）方法原理与微生物突变类似。
常用的细胞株,
中国地鼠肺细胞 V79
中国地鼠肺卵巢细胞 (CHO）
小鼠淋巴瘤 L5178Y细胞株。
V79,CHO细胞株
?正常细胞,缺乏利用嘌呤碱的酶 HGPRT，不能
在加入类嘌呤碱类物质的培养基上生长；
?突变细胞,可在加入类嘌呤碱类物质的培养基
上生长。
L5178Y突变细胞株
?正常细胞,缺乏胸苷激酶（ TK），不可在含有
细胞毒物 5-溴脱氧尿苷的培养基上生长。
?突变细胞,可在此种培养基上生长。
（二）细胞遗传学试验
1,染色体畸变试验,
直接在显微镜下观察染色体结构和数目的改变情况。
生殖细胞或体细胞、体外或体内试验。
体外,CHO细胞, 分裂快、数目适中、形态清晰；人
类外周血淋巴细胞
体内：受试动物骨髓细胞或其他（胸腺、脾、精原
细胞）染色体畸变率的变化。
（ 1）试验方法,
a,体外培养,
CHO细胞或人类外周血淋巴细胞与化学物，在细胞培
养液（ DMEM,RPM,1640或 1999）中,370C下培养
24h(CHO)或 72h(人类细胞）。观察前 2h加入秋水仙碱（中
期分裂阻断剂），制片，镜检观察。
b,体内染色体畸变分析：大鼠、小鼠，染毒饲养，观察
骨髓细胞染色体畸变情况。
第四节 环境流行病学方法
一、概念和特点,
? 流行病学：研究特定人群中有关健康的状态和事
件的分布以及影响这些分布的决定因素；
? 环境流行病学：应用流行病学的原理和方法，重
点研究人们在生活和工作环境中各种因素与人群
健康的关系。
一般流行病学研究的内容是疾病在人群中的
分布，它要回答三个问题,
? (1)疾病在时间、地点、不同人群中是怎样分布的?
? (2)什么因素是该病的主要决定因素?
? (3)怎样控制该病的流行?
环境流行病学除了上述一般内容，还有它本身的特点。
(1)它不仅研究疾病的分布规律，而且更经常地研究疾病前的状态，即包括无
异常 〔 健康 )、微弱的功能改变、疾病的前期 (亚临床状态 )等各种健康状况，揭
示环境污染或某些微量元素的健康效应。
(2)环境流行病学研究的暴露因素主要是理化因素。
①已知暴露因素，研究其对健康的影响；环境毒理学工作者所进行的大量工作
就属于这种。例如金属冶炼厂铅污染大气对居民健康影响，磷肥厂氟污染大气
对居民健康影响的调查等。
②出现健康异常，追究引起异常的暴露因素，这属于探讨病因的研究。例如，
近年来我国学者对于鼻咽癌、食道癌病因的研究，对克山病、大骨节病病因的
研究，均属于此种类型。日本的水误病和痛痛病的病因是重金属污染造成的公
害病领域里的研究成果，影响深远。
(3) 环境流行病学研究的最终日的是为消除污染、改造环境、保护居民健康服
务。
(4)直接以人群为研究对象，研究结果最具有说服力。
二、环境流行病学研究的内容
环境流行病学主要研究两方面的内容．一
是暴露，二是健康；同时还要研究二者的
联系。
(一 ) 暴露测量,
环境暴露水平是人群接触的环境因素的平
均水平，是通过对环境因子在环境中的时
空分布的实测结果求出的平均值。
暴露水平是估算人体接触剂量的依据，因此要求测量结果
精确、可靠、有代表性。暴露测量可分为两类：环境测量
和生物测量。
1．环境测量 通常采用对暴露的环境因素进行抽样测量的
方法，估计个人暴露量。要考虑到所有可能摄入选径，估
计总暴露量。
2．生物监测 暴露水乎的测量由于变异因素太多而很难达
到精确的要求。测量人体组织、体液中的有害物质或微量
元素的浓度以代表人体的暴露水平，称为“生物剂量”，
也称“体内负荷”，这比环境测量的精确性高，虽然体内
负荷也存在着变异。
体内负荷的测量对于化学性质稳定，有蓄积倾向的物质尤
为适宜。对于在体内被转化和易代谢的物质，则可测定其
代谢产物在体内的水平、以估计该物质的体内负荷。
? (二 )健康效应测量
? 探讨发现早期健康损害的敏感和特异的指标。
? 对敏感人群和高危人群的健康调查是早期发现环
境不利因素危害的重要途径。
? 敏感人群：易受侵害的人群。例如，婴幼儿对
铅和甲基汞等神经毒物特别敏感，婴幼儿就是铅
污染或甲基汞污染的敏感人群。
? 高危人群，就是暴露于某种可能引起持殊健康
损害的污染物人群。例如铅冶炼厂的工人患铅中
毒的危险性比一般居民大。国内把这两种情况统
称为高危险人群。高危险人群是环境流行病学研
究的重点人群。
三、环境流行病学研究方法
一般流行病学研究方法有描述性的 (包括分布的描述和
现况研究 )、分析性的 (包括病例 — 对照和群组研究 )、实
验性的和理论的研究。
由于环境流行病学研究的内容有其本身的特点，在采
用这些基本方法时应有所选择。
(1)如暴露因素已知，欲研究其健康效应，可以采用现
况研究设计和群组研究设计，或实验研究设计。在选择
观察指标时，应当注意人群总体的健康效应谱，即除了
研究疾病状态，还应研究没有表现出临床症状的暴露人
群。
(2)在出现健康异常状态后，为追究其病因，可以来用
病例 — 对照研究或现况研究得病因线索后，再选用群组
研究或实验研究证实。
环境毒理学的基本研究方法
?毒理学试验
?调查研究
毒理学
实验基础
研究方法 流行病学研究 受控的临床研究 毒理学体内试验 毒理学体外试验
优点 · 真实的暴露条件 · 规定的限定暴露条 · 易于控制暴露条件 · 影响因素少，易于控
· 在各化学物之间发生相 · 在人群中测定反应 · 能测定多种效应 制
互作用 · 对某组人群 (如哮喘 ) · 能评价宿主特征的作用 · 可进行某些深入的研
· 测定在人群的作用 的研究是有力的 (如：性别、年龄、遗 究 (如：机制，代谢 )
· 表示全部的人敏感性 · 能测定效应的强度 传特征等和其他调控因 · 人力物力花费较少
素饮食等 )
· 能评价机制
缺点 · 耗资、耗时多 · 耗资多 · 动物暴露与人暴露相关 · 不能全面反映毒作用
· 多为回顾性，无健康 · 较低浓度和较短时 的不确定性 不能作为毒性评价和
保护 间的暴露 · 受控的饲养条件与人的 危险性评价的最后依
· 难以确定暴露，有混杂 · 限于较少量的人群 实际情况不一致 据
暴露问题 (一般 <50) · 暴露的浓度和时间的模 · 难以观察慢性毒作用
· 可检测的危险性增加必 · 限于暂时、微小,式显著地不同于人群的
需达到 2倍以上 可逆的效应 暴露
· 测定指标较粗 (发病率,· 一般不适于研究最
死亡率 ) 敏感的人群
毒理学研究方法的优缺点
1 实验动物和人对外源化学物的反应敏感
性不同, 有时甚至存在着质的差别
2 高剂量向低剂量外推的不确定性
3 小数量实验动物到大量人群外推的不确
定性
4 成年健康动物向年老体弱及患病个体外
推的不确定性
实验动物的毒理学实验资料外推到
人群接触的安全性时的不确定性
1 化学物在实验动物产生的作用, 可以外推
于人 。 基本假设 ① 人是最敏感的动物物
种； ② 人和实验动物的生物学过程与体重
(或体表面积 )相关 。
2 实验动物必须暴露于高剂量, 这是发现对
人潜在危害的必需的和可靠的方法 。
3 成年的健康 (雄性和雌性未孕 )实验动物和
人可能的暴露途径是基本的选择 。
描述毒理学试验的基本原则
1 受试物毒作用的表现和性质
2 剂量 —反应 (效应 )研究
3 确定毒作用的靶器官
4 确定损害的可逆性
毒理学毒性评价试验的基本目的
实验动物 （ laboratory animal）
指经人工培育, 对其携带微生物
实行控制, 遗传背景明确, 来源
清楚, 可用于科学研究的动物 。
实验动物的选择
实验动物的选择
物种选择
选择对外液化学物的毒性反应及代谢
特点与人类接近的物种；
选择自然寿命不太长的物种；
选择易于饲养和实验操作的物种；
选择经济并易于获得的物种 。
近交系动物 连续 20代以上兄妹交配或亲子交配培育
突变系动物 突变的基因可世代相传并保持遗传基因特性
杂交群动物 两个不同近交系之间有目的进行交配, 所产
生的第一代动物, 亦称杂交一代动物 。
封闭群动物 5年以上不从外部引进新血缘, 仅由同一品系
的动物在固定场所保存繁殖的动物群
实验动物的选择
品系选择
无菌动物 体内外均无任何微生物和寄生虫
无特定病原体动物 （ SPF） 体内无特定微生物和寄
生虫存在的动物 (无传染病 )。 饲养于封闭的系统 。
清洁动物 与 SPF的不同：抗体检查常有脑脊髓炎病
毒, 鼠肝炎病毒等抗体滴度, 但不应有临床症状,
病理改变及自然死亡 。 饲养在半屏蔽系统 。
微生物控制的选择
实验动物的选择
个体选择
1 年龄
2 性别
3 生理状态
4 健康状况
实验动物的选择
品 系
周龄 Wistar SD
雌性 雄性 雌性 雄性
3 54 56 50 52
4 91 97 86 101
5 134 134 130 150
6 166 187 172 206
7 209 233 210 262
8 214 297 240 318
9 232 325 258 365
10 246 370 272 399
大鼠体重与周龄的关系
小鼠体重与周龄的关系
品 系
周龄 昆明 BALB/c C57BL/6 615
雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性
0 1.95 2.10 1.40 1.46 1.40 1.44 1.58 1.58
1 5.54 5.82 3.35 3.50 3.42 3.50 4.64 4.64
2 7.90 8.35 5.50 5.60 5.55 5.60 7.96 7.96
3 13.55 14.80 7.32 7.40 6.40 6.90 9.83 9.83
4 21.35 22.60 11.60 12.45 12.20 12.57 15.75 19.00
5 27.90 33.25 14.75 16.10 16.90 18.10 20.75 22.58
6 32.80 39.25 15.60 17.40 18.40 20.50 21.88 25.96
7 34.70 39.90 16.10 18.65 19.00 21.60 23.12 27.96
8 34.80 40.05 18.16 20.25 20.25 22.40 24.16 28.83
1 未处理对照组 (空白对照组 )：本底值,
质量控制
2 阴性 (溶剂／赋形剂 )对照：与染毒组比
较的基础
3 阳性对照：检测试验体系的有效性
4 历史性对照：检查试验体系的稳定性,
即进行实验室质量控制和保证
毒理学试验常用对照
? 对各个毒理学试验应该用同一种, 同一批号受
试物
? 受试物成分和配方必须固定
? 如是异构体混合物, 异构体比例必须固定
? 活性成分的百分含量和可检测的杂质的浓度也
应固定
? 受试物在贮存期内稳定性和在饲料中的稳定性
必须进行研究并报告
? 受试物应一次备齐全部实验的用量
受试样品
毒理学试验设计的统计学要求
随机, 重复, 对照原则
对常规毒理学试验资料的统计学方法
计量资料,一般用 t检验或 ANOVA
记数资料,卡方检验
毒理学试验的统计学
1 处理组与对照组比较差别有无显著性
2 有无剂量 -反应关系
3 是否伴有其他相关参数的改变
4 是否在, 正常, 值范围
实验结果的判断
第一节 急性毒性试验
一、急性毒性试验的目的,
1、确定供试化学物急性毒性的剂量 — 反应关系和中毒
特征；
2、求 LD50或 LC50,为急性毒性评价提供依据。
3、研究毒物的毒动学和毒效学过程。
表示急性毒性大小,
LD50(对受试物
的个体感受性影响较
小，有更高的重现性 )
二、试验程序与评价
1．动物选择, 首选受试物在体内代谢情况与人体内相近的
或对受试物最敏感的品系。
一般：以哺乳动物为主，常用大鼠、小鼠；
经皮：兔、豚鼠、猪
应对两种性别、成年和幼年动物进行测定。
选择两种以上的实验动物，最好一为啮齿类，一为非
啮齿类。 (目的：核对种间差异 )
2．染毒途径与方式, 一般与人的接触途径相同。
(1)经口染毒,常用灌胃法，也可将受试物放在饮水中
由动物自由摄取。
(2)经呼吸道染毒,将实验动物放在有毒气或粉尘的
染毒柜内进行染毒。急性吸入染毒采用静式染毒瓶 (柜 )，
染毒 2— 4h。
(3)经皮肤染毒,主要用于化学物经皮 (或粘膜 )吸收所
引起的急性毒性。正式给药前 24h，背部脱毛，勿伤皮
肤。将受试物均匀涂布于皮肤表面，用纱布覆盖，共敷
24h。
3．试验程序,
（ 1）剂量与分组
①预试验,找出受试物大致致死量范围 (死亡率为
10%~90%)；
例：欲做化合物 A的经口预试验。
化合物 B的化学结构与 A相似，已知 B的 =LD50 =40(预期
毒性中值 )。
则预试验取 2.5,10,40,160,640 (上下各推 1~2组，
组距应较大，初始 4倍差 )
③ 求 LD50正式试验：在 LD100与 LD0之间设 5— 7个剂量组。
组距 (对数 )
或
式中,n------设计的剂量组数
（ 2）症状观察
时间,24h或两周内的反应
1
lglg 1090
?
??
n
LDLDi
1
lglg 0100
?
??
n
LDLDi
三,LD50的计算与结果评价
计算方法,概率单位法 和 寇氏法 。
LD50值愈小，毒性愈大。
概率单位法
?存在正态曲线关系。
?标准正态差 d=(x-μ)/δ
式中,x—— 剂量对数；
μ—— 剂量对数均数
δ —— 标准差
d=0，左边面积 (死亡率 )为 50％，右边面积 (存活率 )50％
d=1，死亡率为 84.13％,
d=2，死亡率为 97.73％,
d＞ 2，死亡率接近 100％。
d=一 1，死亡率为 15.87％。
d=一 2，死亡率为 2.27％。
d＜一 3，死亡率接近 0。
?从上表，可以任一死亡率换算为相应的概
率单位。
? A：剂量对数 ~死亡百分率
? B：剂量对数 ~概率单位
LC50计算步骤如下,
? a.根据死亡率查概率单位 (死亡率为 100％ 或 0％
不计 )
? b.绘图求回归方程 。
? c.求 y=5的浓度对数 （ m）, 其反对数即为 LC50
y=2.78x-2.76
同理可得 LC5,
LC10,……
? d.求 LC50的可信限
先求 LC50的标准误差 (Sm),
S(校准差 )=1/k
本例中,S=1/2.78
2
4?
SS
m ?
平均致死量法（又名寇氏法）
试验要求,
?① 每个试验组动物数相同；
?② 各组剂量按等比级数分组；
?③ 最大剂量的死亡率最好为 100％ 或与之
接近, 最小剂量的死亡率最好为 0％ 或与
之接近 。
式中,
? Xm—— 最大剂量的对数值；
? i— 相邻剂量比值的对数；
? —— 各组死亡率的总和 （ 以小数表示 ） 。
?p
?p
?例小鼠腹腔注射致百虫急性毒性试验结果
如下表所示, 求 LD50
式中,
? p—— 一个组死亡率；
? q—— 一个组存活率；
? i—— 相邻剂量比值的对数；
? h—— 各组动物数 。
第二节 亚慢性和慢性毒性试验
一、蓄积试验及其方法,
（一）蓄积作用,某些物质以较小剂量反复作用于机体，
可使机体对该物质的反应性增强，即一次染毒不引起明显
中毒反应或死亡的剂量，经分次重复染毒后，可引起明显
中毒或死亡，此种现象称为 蓄积作用 (accumulation)。
可分两种,
物质蓄积,毒物在体内的排出量小于进入量，以致毒
物在体内的贮留量增多为物质蓄积；
功能蓄积, 毒物进入机体后，并未发现在体内明显贮
留，但可引起机体功能改变的逐渐累积，导致对该毒物的
反应性增强。
耐受性 (tolerance),机体多次接触化学物质后．对该物质
产生反应性减弱的现象，显示不易发生慢性中毒。
（二）蓄积作用的测定方法
有多种，常用 蓄积系数法 。
蓄积系数 (accumulation coefficient)K,
ED50(n) —— 多次染毒使半数动物出现某种效应的总剂量 ;
ED50(1) —— 一次染毒引起同一效应半数效量。
)1(50
)(50
ED
ED
K n?
若以死亡为毒效应指标, 上式为
K越小, 受试化合物的蓄积毒性越大 。
)1(50
)(50
LD
LDK n?
K 蓄积作用强度
＜ 1 高度蓄积
1~3 明显蓄积
3~5 中度蓄积
＞ 5 轻度蓄积
1．固定剂量法, 固定每天染毒剂量为 1/20— 1/5
LD50，连续染毒，直至实验动物半数死亡。如果染毒剂
量累计已达 5个 LD50 动物死亡仍末达半数，实验均可告
结束，计算蓄积系数，作出评价。
2．递增剂量法, 先测定 LD50（ 1）,然后对另一组动
物每天染毒，以 4天为一期，开始给予 0.1LD50。以后每
期按 1.5倍递增剂量，直至动物半数死亡，或实验已达
28天，可结束实验，计算系数。
3,二十天试验法, 选用大鼠或小鼠每个剂量组雌雄
各 10只，以 1/2,l/5,1/10,1/20 LD50分别对每组进行
染毒，每日 1次，共 20天。如 l/20LD50组动物有死亡，且
有剂量 — 反应关系，则有较强蓄积作用；如 1/20 LD50组
无死亡，则为弱蓄积。
蓄积系数的测定
二、亚慢性毒性作用及其试验方法,
1、目的,确定化学物亚慢性毒性的阈剂量和 NOEL。
2、试验期限,3-6月；
呼吸道吸收,30-90天；
皮肤毒性,30天。
3、试验动物的选择、饲养环境及染毒途径,
试验动物选择,对受试化学物敏感的物种或品系；
环境,营养合理，饮水清洁、充足、温、光、湿适宜；
染毒途径,尽量模拟人类在环境中接触受试化学物的途径，
与急性毒性试验相似。
4、剂量选择与分组
剂量,1／ 80— I／ 50LD50，对于在体内不产生蓄积作
用而排泄又快的物质可适当加大剂量，反之则可减少
剂量。
设 3— 4个实验组和 1个对照组。
实验组要求,在实验结束时
最低剂量组 不产生可观察到的毒性反应；
最高剂量组 能引起明显毒性反应，但不引起死亡；
中间剂量组 产生轻微毒性反应。
5、症状观察
(1) 一般性指标 (非特异 )
① 一般综合性指标,
动物体重增长率、食物消耗率、活动能力等。
②一般化验性指标,主要指血和肝、肾功能的检测。
(2)特异指标,
测定特异性反应。
更确切阐明该物质的阈剂量 (浓度 )及无作用剂量 (浓度 )。
(3) 病理组织学检查,
实验中死亡动物的病理检查及实验结束时的尸检。
三、慢性毒性作用及其试验方法
1、目的,评价化学物在长期小剂量作用的条件下对机体产
生的损害及其特点．确定阈剂量和最大无作用剂量。
2、试验方法,
（ 1） 动物选择、染毒方法、观察指标等与亚慢性毒性试验
相似；
（ 2）染毒期限,1-2年或终身染毒，也有人提出 6月。
（ 3）剂量分组,
3个染毒组和一个对照组。
高剂量组,1/5— 1/2亚慢性试验阈值；
中间剂量,1/50— 1/10；
低剂量组,1/100。
第四节 致突变实验
一、目的
确定外源化学物对生物体是否具有致突变作用。
基因点突变试验、染色体畸变试验,DNA损伤试
验。
二、供试生物,
微生物、动物细胞、昆虫、动物或植物
三、试验方法
体外基因突变试验、细胞遗传学试验、体内基因
突变试验,DNA损伤试验
（一）体外基因突变试验
1,Ames试验（鼠伤寒沙门氏菌 /动物肝细胞微粒体试
验）
（ 1）原理,
利用一种突变微生物菌株与被检测化学物接触，
使突变型微生物回复突变，重新成为野生型微生物。
营养缺陷）突变型微生物（组氨酸回复突变正向突变野生型沙氏菌
突变型微生物不具备合成组氨酸的能力，不能在
不含（或低浓度）组氨酸培养基上生长。
（ 2）方法,
将 突变型沙氏菌在不含（或低浓度）组氨
酸培养基上培养,以其生长状况作为指标。
在培养基中加入哺乳动物的肝细胞微粒体：
提高灵敏度。
（ 3）特点,
优点,
? 简便、灵敏、快速（ 48h）、费用低；
? 检测结果与对动物的致癌性的相符率达约 90%。
缺点,
? 利用微生物作为供试物，不能全面反映哺乳动物的遗
传信息，仅 1/6；
? 微生物的 DNA修复系统与动物有差异；
? 微生物无免疫功能。
2、哺乳动物体细胞突变试验
（ 1）方法原理与微生物突变类似。
常用的细胞株,
中国地鼠肺细胞 V79
中国地鼠肺卵巢细胞 (CHO）
小鼠淋巴瘤 L5178Y细胞株。
V79,CHO细胞株
?正常细胞,缺乏利用嘌呤碱的酶 HGPRT，不能
在加入类嘌呤碱类物质的培养基上生长；
?突变细胞,可在加入类嘌呤碱类物质的培养基
上生长。
L5178Y突变细胞株
?正常细胞,缺乏胸苷激酶（ TK），不可在含有
细胞毒物 5-溴脱氧尿苷的培养基上生长。
?突变细胞,可在此种培养基上生长。
（二）细胞遗传学试验
1,染色体畸变试验,
直接在显微镜下观察染色体结构和数目的改变情况。
生殖细胞或体细胞、体外或体内试验。
体外,CHO细胞, 分裂快、数目适中、形态清晰；人
类外周血淋巴细胞
体内：受试动物骨髓细胞或其他（胸腺、脾、精原
细胞）染色体畸变率的变化。
（ 1）试验方法,
a,体外培养,
CHO细胞或人类外周血淋巴细胞与化学物，在细胞培
养液（ DMEM,RPM,1640或 1999）中,370C下培养
24h(CHO)或 72h(人类细胞）。观察前 2h加入秋水仙碱（中
期分裂阻断剂），制片，镜检观察。
b,体内染色体畸变分析：大鼠、小鼠，染毒饲养，观察
骨髓细胞染色体畸变情况。
第四节 环境流行病学方法
一、概念和特点,
? 流行病学：研究特定人群中有关健康的状态和事
件的分布以及影响这些分布的决定因素；
? 环境流行病学：应用流行病学的原理和方法，重
点研究人们在生活和工作环境中各种因素与人群
健康的关系。
一般流行病学研究的内容是疾病在人群中的
分布，它要回答三个问题,
? (1)疾病在时间、地点、不同人群中是怎样分布的?
? (2)什么因素是该病的主要决定因素?
? (3)怎样控制该病的流行?
环境流行病学除了上述一般内容，还有它本身的特点。
(1)它不仅研究疾病的分布规律，而且更经常地研究疾病前的状态，即包括无
异常 〔 健康 )、微弱的功能改变、疾病的前期 (亚临床状态 )等各种健康状况，揭
示环境污染或某些微量元素的健康效应。
(2)环境流行病学研究的暴露因素主要是理化因素。
①已知暴露因素，研究其对健康的影响；环境毒理学工作者所进行的大量工作
就属于这种。例如金属冶炼厂铅污染大气对居民健康影响，磷肥厂氟污染大气
对居民健康影响的调查等。
②出现健康异常，追究引起异常的暴露因素，这属于探讨病因的研究。例如，
近年来我国学者对于鼻咽癌、食道癌病因的研究，对克山病、大骨节病病因的
研究，均属于此种类型。日本的水误病和痛痛病的病因是重金属污染造成的公
害病领域里的研究成果，影响深远。
(3) 环境流行病学研究的最终日的是为消除污染、改造环境、保护居民健康服
务。
(4)直接以人群为研究对象，研究结果最具有说服力。
二、环境流行病学研究的内容
环境流行病学主要研究两方面的内容．一
是暴露，二是健康；同时还要研究二者的
联系。
(一 ) 暴露测量,
环境暴露水平是人群接触的环境因素的平
均水平，是通过对环境因子在环境中的时
空分布的实测结果求出的平均值。
暴露水平是估算人体接触剂量的依据，因此要求测量结果
精确、可靠、有代表性。暴露测量可分为两类：环境测量
和生物测量。
1．环境测量 通常采用对暴露的环境因素进行抽样测量的
方法，估计个人暴露量。要考虑到所有可能摄入选径，估
计总暴露量。
2．生物监测 暴露水乎的测量由于变异因素太多而很难达
到精确的要求。测量人体组织、体液中的有害物质或微量
元素的浓度以代表人体的暴露水平，称为“生物剂量”，
也称“体内负荷”，这比环境测量的精确性高，虽然体内
负荷也存在着变异。
体内负荷的测量对于化学性质稳定，有蓄积倾向的物质尤
为适宜。对于在体内被转化和易代谢的物质，则可测定其
代谢产物在体内的水平、以估计该物质的体内负荷。
? (二 )健康效应测量
? 探讨发现早期健康损害的敏感和特异的指标。
? 对敏感人群和高危人群的健康调查是早期发现环
境不利因素危害的重要途径。
? 敏感人群：易受侵害的人群。例如，婴幼儿对
铅和甲基汞等神经毒物特别敏感，婴幼儿就是铅
污染或甲基汞污染的敏感人群。
? 高危人群，就是暴露于某种可能引起持殊健康
损害的污染物人群。例如铅冶炼厂的工人患铅中
毒的危险性比一般居民大。国内把这两种情况统
称为高危险人群。高危险人群是环境流行病学研
究的重点人群。
三、环境流行病学研究方法
一般流行病学研究方法有描述性的 (包括分布的描述和
现况研究 )、分析性的 (包括病例 — 对照和群组研究 )、实
验性的和理论的研究。
由于环境流行病学研究的内容有其本身的特点，在采
用这些基本方法时应有所选择。
(1)如暴露因素已知，欲研究其健康效应，可以采用现
况研究设计和群组研究设计，或实验研究设计。在选择
观察指标时，应当注意人群总体的健康效应谱，即除了
研究疾病状态，还应研究没有表现出临床症状的暴露人
群。
(2)在出现健康异常状态后，为追究其病因，可以来用
病例 — 对照研究或现况研究得病因线索后，再选用群组
研究或实验研究证实。
