实验九 培养基的制作及病原
物的分离培养
一、实验目的
病原物的生长发育都需要一定的营养，
在人工培养微生物时，为其生长发育提
供所需营养的基质，称为培养基。
病原菌通常是与其它微生物混生在一起
的，从病组织中将病原菌单独分选出来，
称为分离。
分离出的病原物在人工培养基上生长，
称为培养。
培养基配好之后，必须经过灭菌才能用
于微生物的分离培养。
本实验的目的是学习植物病理实验室中
常用的培养基的制作方法、高压灭菌锅
的使用方法、学习植物病原物分离培养
的原理和常用方法。
二、内容、材料和方法
(一 ) 培养基的配制
培养基按组成成分及对这些成分了解的
程度分为：
1,天然培养基：动植物的组织和它们的
煎汁、厩肥、土壤和土壤浸出液等配成
的培养基，称为天然培养基，其成分复
杂，几乎无法完全了解。
2,半组合培养基：由成分末知的天然物质
和成分已知的物质配成，如马铃薯蔗糖培
养液中的蔗糖是已知成分，而马铃薯是成
分末知的天然物质。
3,组合培养基：是成分和浓度完全已知的
培养基，是由成分已知的化学药品配成。
从物理性质上又可以分为液体培养基和
固体培养基：
液体培养基中加入适当的凝固剂，就成
为固体培养基，凝固剂有琼脂、明胶和
硅胶，最常用的是琼脂。
培养基的种类不同，配制方法也有差异，限于
时间，本次实验仅配制马铃薯葡萄糖琼脂培养
基 (PDA)，它属于半组合固体培养基。
成分：马铃薯 200g
葡萄糖 20g
琼脂 20g
水 1000ml
方法：将马铃薯洗净去皮切块，加热煮沸 30分
钟，用双层纱布滤去薯块，加入琼脂，加热熔
化，再加入葡萄糖，完全熔化后，趋热用纱布
过滤分装。
不同微生物对酸度的适应范围不同，真菌的适
应范围广，并且偏好微酸性。由于实验室常用
的培养基通常是微酸性的，所以在培养真菌时
往往不需要调节酸度；但培养细菌时要调节到
中性；培养放线菌时要调节到微碱性。
(二 ) 培养基的灭菌
1,灭菌：是指用物理或化学的方法完全杀
死器物表面及其内部的所有微生物。
2,消毒：是指消灭器物表面或植物组织表
面的某些微生物，而不是消灭所有的微
生物。
植物病理实验室学常用的灭菌方法有 干
热灭菌和湿热灭菌 两种,一般培养皿、
吸管等玻璃仪器用干热灭菌法进行灭菌；
而培养基和实验用的土壤，则用高压蒸
汽灭菌法进行湿热灭菌，具体灭菌方法
和步骤如下：
1,干热灭菌：
(1)将培养皿、吸管等玻璃器皿洗净干燥后，用
旧报纸包好，或装入特制的铁筒中 (每个吸管用
纸包好后装入铁筒 )，包纸时应将吸取的一端放
在取时先拆开的一端，以便取用时手勿触及要
求灭菌的一端。
(2)将包装好的玻璃仪器摆入电热烘箱中，彼此
间留有一定的空隙以便流通空气。
(3)关紧箱门，打开排气孔接上电源。
(4)待箱内空气排出到一定程度时，闭上排气孔，
继续加热至一定温度后，固定温度，灭菌温度
一般 165℃ ～ 175℃ 保持 1小时即可。
(5)待自然降温冷却后 (60℃ 以下 )才能开门取出
玻璃器皿，避免由于温度突然下降而引起玻璃
器皿碎裂。
2.湿热灭菌：使用高压灭菌锅，利用高
压来提高蒸汽的温度，达到完全灭菌的
目的。其操作步骤如下：
(1)关好排水阀门放入清水至标度为止，
注意水量一定要加足，否则容易造成事
故。
(2)将要灭菌的培养基、灭菌水等装入铁
丝笼中，并用牛皮纸盖好后放入灭菌锅
中，关上器盖，旋紧螺旋时，先将每个
螺旋旋转到一定程度 (不要太紧 )，然后再
旋紧相对的两个螺旋，以达到平衡旋紧，
否则易造成漏气，达不到彻底灭菌的目
的。
(3)通电加温，同时打开排气阀门，排尽
锅内的空气，即阀门冲出的全部是蒸气时
则表示彻底，此时可关闭排气阀门，如果
过早关闭阀门，排气不彻底，也达不到彻
底灭菌的目的。通常先关闭阀门，当压力
表指针升至 5磅时，打开排气阀门放气，
降至零点，再关闭阀门。
(4)压力表的指针上升时，锅内温度也逐
渐升高，当压力表指针升至 15磅时，蒸
气温度相当于 120℃ ～ 121℃ (等于一个大
气压 )，此时开始计算灭菌时间，控制热
源，使处于 15磅压力保持 30分钟，即能
达到完全灭菌的目的，然后停止加温。
(5)稍微打开一点排气活门，使锅内蒸汽
缓慢排除，然后逐渐开大活门，气压徐
徐下降，注意勿使排气过快，否则会使
锅内的培养基沸腾而冲脱或沾湿棉花塞，
但排气太慢又使培养基在锅内，受高温
处理时间过长，这样对培养基也是不利
的。一般从排气到打开锅盖以 10分钟左
右为好。
(6)当压力表指针降到零、锅内蒸气完全
排尽时，打开锅盖取出培养基，如需制
备固体斜面培养基时，则应趁热将试管
斜放在桌上，上面盖上报纸以免落灰尘，
(7)最后将高压灭菌器内的剩余水排出。
全
自
动
高
压
灭
菌
锅
全
自
动
高
压
灭
菌
锅
(三 ) 病原物的分离培养
分离材料的选择对分离培养的成败有着决定
的影响，因为在感病植物受害部位的内外，
要有多种腐生菌，为减少腐生菌的污染，分
离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好
在病、健交接处选材取样。病、健交接处，
除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的
生活力强、比较活跃，容易分离成功。
病原菌分离的方法因材料不同而异，植
病实验室最常见的方法有组织分离法和
稀释分离法两种：
1,稀释分离法：
适用于细菌、土壤菌及产生孢子多的真
菌等病原菌的分离，本次实验以大白菜
软腐病作为材料进行分离。
大白菜软腐病最易伴生腐生细菌，分离时需以病
组织接种健康菜帮上，经数次接种予以纯化，其
纯化方法是将菜帮经多次换水冲洗后，再用无菌
水洗三次，切成适当大小，放在 15厘米直径的培
养皿中，菜帮下衬以吸水纸保温。用无菌解剖刀
挑取病组织少许抹在菜帮的人为伤口上，在 20～
25℃ 下培养，经 1天左右呈现腐烂，如此反复接种
几次，至病斑纯净为止。
分离时，在新的水烂斑边缘挑取少量病
组织在无菌水试管中配成菌悬液，取灭
菌培养皿 3副，标好次序，其内各置无菌
水 1毫升，用移置环移取菌悬液一环，放
在第 1皿水中混合均匀，从中挑取一环稀
释液至第 2皿，再以同法稀释成第 3皿。
取熔化后冷至 45℃ 左右的 (一般将化好的
培养基瓶靠近鼻尖，以不烫为度 )牛肉膏
蛋白胨培养基，每皿倒约 15毫升，沿着
桌面轻轻摇匀，凝固后倒置于 26～ 28℃
的温箱中培养。
1～ 2日后可见白色，圆形或近圆形直径
为 1～ 2毫米的菌落，从中选典型菌落用
移植环（划线法）移入牛肉膏蛋白胨斜
面培养基上培养，每组转 4～ 5管，注意
过早出现的大型菌落多为腐生细菌。
以上分离实验也可以划线法进行，方法是
先取两付灭菌培养皿，每皿倒入约 15毫升熔
化的牛肉膏蛋白胨培养基，沿桌面轻轻摇匀，
制成平板。
然后用移置环沾取一环稀释好的菌悬液，
在第一个培养皿平面培养基的左方长方
形区内划平行线 5～ 7条，再以此移置环
继续向右 (和左方小区内的几条平行线成
一定角度 )划 5～ 7条平行线，依此法划两
皿，倒置于 26～ 28℃ 温箱中培养,1～ 2
日后挑单个典型菌落移到斜面培养基上，
培养待用。
2,组织分离法：
这种方法适用于大部分病菌的分离，以
玉米大斑病为试材进行：
取玉米大斑病病叶，在病、健交界处剪
取 2～ 3毫米长的病组织，在 70%的酒精
中浸 2～ 3秒种，目的是在表面消毒的同
时，驱除病组织表面的气泡，使病组织
与升汞溶液能够充分接触发挥消毒作用。
按无菌操作法将病组织移入 0.1%升汞溶液
中表面消毒 3～ 5分钟，时间长短依病组织
不同而异。然后在无菌水中连续漂洗 3次，
除去残留的消毒剂后，直接移至 PDA平板
培养基上 (为防止细菌污染，可在培养基中
加入 1000ppm链霉素 10毫升 )，每皿放 4～
5块，倒置于 20～ 25℃ 室温下，一般 3～ 4
天后观察待分离菌生长结果。
待菌落长出后挑取前缘菌丝，回接于
PDA斜面培养基上，在 25℃ 温箱中培养，
待菌落颜色变深后，在无菌条件下镜检
是否是玉米大斑病菌，若仅有玉米大斑
病菌的孢子，则说明已获得了纯培养，
否则，则需要继续转至斜面培养基上进
行纯化，直至获得纯培养。
分离工作应
在无菌条件
下进行，无
菌室和超净
工作台是分
离不可缺少
的设施。
若限于条件，实验只能在普通房间进行
时，必须对房间进行彻底扫除，清洁环
境、搞好卫生。地上多洒些水，以消除
室内尘埃，分离开始前准备好一切用品，
避免工作过程中频繁走动，破坏环境带
来杂菌，工作台上铺好湿毛巾，点燃酒
精灯。
物的分离培养
一、实验目的
病原物的生长发育都需要一定的营养，
在人工培养微生物时，为其生长发育提
供所需营养的基质，称为培养基。
病原菌通常是与其它微生物混生在一起
的，从病组织中将病原菌单独分选出来，
称为分离。
分离出的病原物在人工培养基上生长，
称为培养。
培养基配好之后，必须经过灭菌才能用
于微生物的分离培养。
本实验的目的是学习植物病理实验室中
常用的培养基的制作方法、高压灭菌锅
的使用方法、学习植物病原物分离培养
的原理和常用方法。
二、内容、材料和方法
(一 ) 培养基的配制
培养基按组成成分及对这些成分了解的
程度分为：
1,天然培养基：动植物的组织和它们的
煎汁、厩肥、土壤和土壤浸出液等配成
的培养基，称为天然培养基，其成分复
杂，几乎无法完全了解。
2,半组合培养基：由成分末知的天然物质
和成分已知的物质配成，如马铃薯蔗糖培
养液中的蔗糖是已知成分，而马铃薯是成
分末知的天然物质。
3,组合培养基：是成分和浓度完全已知的
培养基，是由成分已知的化学药品配成。
从物理性质上又可以分为液体培养基和
固体培养基：
液体培养基中加入适当的凝固剂，就成
为固体培养基，凝固剂有琼脂、明胶和
硅胶，最常用的是琼脂。
培养基的种类不同，配制方法也有差异，限于
时间，本次实验仅配制马铃薯葡萄糖琼脂培养
基 (PDA)，它属于半组合固体培养基。
成分：马铃薯 200g
葡萄糖 20g
琼脂 20g
水 1000ml
方法：将马铃薯洗净去皮切块，加热煮沸 30分
钟，用双层纱布滤去薯块，加入琼脂，加热熔
化，再加入葡萄糖，完全熔化后，趋热用纱布
过滤分装。
不同微生物对酸度的适应范围不同，真菌的适
应范围广，并且偏好微酸性。由于实验室常用
的培养基通常是微酸性的，所以在培养真菌时
往往不需要调节酸度；但培养细菌时要调节到
中性；培养放线菌时要调节到微碱性。
(二 ) 培养基的灭菌
1,灭菌：是指用物理或化学的方法完全杀
死器物表面及其内部的所有微生物。
2,消毒：是指消灭器物表面或植物组织表
面的某些微生物，而不是消灭所有的微
生物。
植物病理实验室学常用的灭菌方法有 干
热灭菌和湿热灭菌 两种,一般培养皿、
吸管等玻璃仪器用干热灭菌法进行灭菌；
而培养基和实验用的土壤，则用高压蒸
汽灭菌法进行湿热灭菌，具体灭菌方法
和步骤如下：
1,干热灭菌：
(1)将培养皿、吸管等玻璃器皿洗净干燥后，用
旧报纸包好，或装入特制的铁筒中 (每个吸管用
纸包好后装入铁筒 )，包纸时应将吸取的一端放
在取时先拆开的一端，以便取用时手勿触及要
求灭菌的一端。
(2)将包装好的玻璃仪器摆入电热烘箱中，彼此
间留有一定的空隙以便流通空气。
(3)关紧箱门，打开排气孔接上电源。
(4)待箱内空气排出到一定程度时，闭上排气孔，
继续加热至一定温度后，固定温度，灭菌温度
一般 165℃ ～ 175℃ 保持 1小时即可。
(5)待自然降温冷却后 (60℃ 以下 )才能开门取出
玻璃器皿，避免由于温度突然下降而引起玻璃
器皿碎裂。
2.湿热灭菌：使用高压灭菌锅，利用高
压来提高蒸汽的温度，达到完全灭菌的
目的。其操作步骤如下：
(1)关好排水阀门放入清水至标度为止，
注意水量一定要加足，否则容易造成事
故。
(2)将要灭菌的培养基、灭菌水等装入铁
丝笼中，并用牛皮纸盖好后放入灭菌锅
中，关上器盖，旋紧螺旋时，先将每个
螺旋旋转到一定程度 (不要太紧 )，然后再
旋紧相对的两个螺旋，以达到平衡旋紧，
否则易造成漏气，达不到彻底灭菌的目
的。
(3)通电加温，同时打开排气阀门，排尽
锅内的空气，即阀门冲出的全部是蒸气时
则表示彻底，此时可关闭排气阀门，如果
过早关闭阀门，排气不彻底，也达不到彻
底灭菌的目的。通常先关闭阀门，当压力
表指针升至 5磅时，打开排气阀门放气，
降至零点，再关闭阀门。
(4)压力表的指针上升时，锅内温度也逐
渐升高，当压力表指针升至 15磅时，蒸
气温度相当于 120℃ ～ 121℃ (等于一个大
气压 )，此时开始计算灭菌时间，控制热
源，使处于 15磅压力保持 30分钟，即能
达到完全灭菌的目的，然后停止加温。
(5)稍微打开一点排气活门，使锅内蒸汽
缓慢排除，然后逐渐开大活门，气压徐
徐下降，注意勿使排气过快，否则会使
锅内的培养基沸腾而冲脱或沾湿棉花塞，
但排气太慢又使培养基在锅内，受高温
处理时间过长，这样对培养基也是不利
的。一般从排气到打开锅盖以 10分钟左
右为好。
(6)当压力表指针降到零、锅内蒸气完全
排尽时，打开锅盖取出培养基，如需制
备固体斜面培养基时，则应趁热将试管
斜放在桌上，上面盖上报纸以免落灰尘，
(7)最后将高压灭菌器内的剩余水排出。
全
自
动
高
压
灭
菌
锅
全
自
动
高
压
灭
菌
锅
(三 ) 病原物的分离培养
分离材料的选择对分离培养的成败有着决定
的影响，因为在感病植物受害部位的内外，
要有多种腐生菌，为减少腐生菌的污染，分
离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好
在病、健交接处选材取样。病、健交接处，
除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的
生活力强、比较活跃，容易分离成功。
病原菌分离的方法因材料不同而异，植
病实验室最常见的方法有组织分离法和
稀释分离法两种：
1,稀释分离法：
适用于细菌、土壤菌及产生孢子多的真
菌等病原菌的分离，本次实验以大白菜
软腐病作为材料进行分离。
大白菜软腐病最易伴生腐生细菌，分离时需以病
组织接种健康菜帮上，经数次接种予以纯化，其
纯化方法是将菜帮经多次换水冲洗后，再用无菌
水洗三次，切成适当大小，放在 15厘米直径的培
养皿中，菜帮下衬以吸水纸保温。用无菌解剖刀
挑取病组织少许抹在菜帮的人为伤口上，在 20～
25℃ 下培养，经 1天左右呈现腐烂，如此反复接种
几次，至病斑纯净为止。
分离时，在新的水烂斑边缘挑取少量病
组织在无菌水试管中配成菌悬液，取灭
菌培养皿 3副，标好次序，其内各置无菌
水 1毫升，用移置环移取菌悬液一环，放
在第 1皿水中混合均匀，从中挑取一环稀
释液至第 2皿，再以同法稀释成第 3皿。
取熔化后冷至 45℃ 左右的 (一般将化好的
培养基瓶靠近鼻尖，以不烫为度 )牛肉膏
蛋白胨培养基，每皿倒约 15毫升，沿着
桌面轻轻摇匀，凝固后倒置于 26～ 28℃
的温箱中培养。
1～ 2日后可见白色，圆形或近圆形直径
为 1～ 2毫米的菌落，从中选典型菌落用
移植环（划线法）移入牛肉膏蛋白胨斜
面培养基上培养，每组转 4～ 5管，注意
过早出现的大型菌落多为腐生细菌。
以上分离实验也可以划线法进行，方法是
先取两付灭菌培养皿，每皿倒入约 15毫升熔
化的牛肉膏蛋白胨培养基，沿桌面轻轻摇匀，
制成平板。
然后用移置环沾取一环稀释好的菌悬液，
在第一个培养皿平面培养基的左方长方
形区内划平行线 5～ 7条，再以此移置环
继续向右 (和左方小区内的几条平行线成
一定角度 )划 5～ 7条平行线，依此法划两
皿，倒置于 26～ 28℃ 温箱中培养,1～ 2
日后挑单个典型菌落移到斜面培养基上，
培养待用。
2,组织分离法：
这种方法适用于大部分病菌的分离，以
玉米大斑病为试材进行：
取玉米大斑病病叶，在病、健交界处剪
取 2～ 3毫米长的病组织，在 70%的酒精
中浸 2～ 3秒种，目的是在表面消毒的同
时，驱除病组织表面的气泡，使病组织
与升汞溶液能够充分接触发挥消毒作用。
按无菌操作法将病组织移入 0.1%升汞溶液
中表面消毒 3～ 5分钟，时间长短依病组织
不同而异。然后在无菌水中连续漂洗 3次，
除去残留的消毒剂后，直接移至 PDA平板
培养基上 (为防止细菌污染，可在培养基中
加入 1000ppm链霉素 10毫升 )，每皿放 4～
5块，倒置于 20～ 25℃ 室温下，一般 3～ 4
天后观察待分离菌生长结果。
待菌落长出后挑取前缘菌丝，回接于
PDA斜面培养基上，在 25℃ 温箱中培养，
待菌落颜色变深后，在无菌条件下镜检
是否是玉米大斑病菌，若仅有玉米大斑
病菌的孢子，则说明已获得了纯培养，
否则，则需要继续转至斜面培养基上进
行纯化，直至获得纯培养。
分离工作应
在无菌条件
下进行，无
菌室和超净
工作台是分
离不可缺少
的设施。
若限于条件，实验只能在普通房间进行
时，必须对房间进行彻底扫除，清洁环
境、搞好卫生。地上多洒些水，以消除
室内尘埃，分离开始前准备好一切用品，
避免工作过程中频繁走动，破坏环境带
来杂菌，工作台上铺好湿毛巾，点燃酒
精灯。
