液相色谱的方法开发
第一步干什么?
?想办法得到各种信息
?向同行了解是否做过此类样品，或有否类似
样品的分析方法
?查文献，如 CA(化学文摘 )
?对色谱柱有足够的了解
?掌握分离机理，自己开发方法
?充分了解您自己的样品
分析时要了解哪方面的情况？
?灵敏度的要求有多高?
?样品的本底是否很复杂?
?有多少组份要分析?
?对分析的精密度、准确度等有多高要求?
?是否因是日常检验，而要求方法容易使用?
分离时要了解哪方面的情况？
?要分离（即制备）的样品量有多大?
?要分离的组份在样品中的含量很高? 还是
微量?
?是否需要保持生物活性?
?对分离产物纯度的要求有多高?
?纯度或活性的鉴定如何完成?
一般的具体步骤
?先用一根短的色谱柱
?用相对较高的流速
?使用尽可能纯度高的标准品
?先用高强度的洗脱液
?调节柱长度改变柱效及分离速度 请记住∶
每次改变一个参数
使用文献方法
?色谱柱填料的种类、品牌是否相同?
?注意文献方法的流动相
?是否损害色谱柱?
?如色谱填料品牌不同，需要调整流动相
?注意色谱柱的规格：内径、柱长
?需要调整流速、进样量
反相色谱的方法开发
?开发过程实例
?色谱条件 ∶
?色谱柱,C18,4mm× 30mm
?流动相：乙腈 /水，不同的溶剂强度,60/40、
50/50,40/60，由强渐弱
?流速,2ml/min
?样品：
① 对羟基苯甲酸甲酯 (Methyl Paraben)
② 对羟基苯甲酸丙酯 (Propyl Paraben)
③ 对羟基苯甲酸丁酯 (Butyl Paraben)
改变容量因子 K'
60/40
50/50 40/60
①
②
③
①
② ②
③ ③
①
谱图
改变选择性 ∶ a
?通过改变流动相改变选择性
?同样强度的不同溶剂
?改变色谱柱
①②③ 62:38/ 42:58/
72:28/
23
2
2
，③
，②
，①
OHCNCH
OHM e O H
OHT H F
离子型化合物的分离方式
?使用离子交换柱 ∶ 离子交换法
?主要用于“强”阴、阳离子
?使用反相柱
?离子抑制色谱法
?通过改变流动相的 pH值，使样品成中性
?离子对色谱法
?加入“对离子”，使样品呈中性
离子抑制色谱
?离子型化合物在反相色谱柱上不保留
?改变流动相的 pH值，抑制样品离子的电离
?适用于弱酸性化合物的分离
?降低流动相的 pH值，使样品降低离子化
?使用条件应在填料基质的范围内
?硅胶柱的 pH在 2-8（较保险值 3-7）内
常用缓冲液及其 pH值
离子抑制色谱实例
? 在乙腈 /水及 pH=7时，
多数保留时间很短，无
法完全分离。
C H O
O H
O C H 3
C O O N a C H O C O O H
O C H 3
1 2 3 4
离子抑制色谱的使用范围
如果：
一些酸在 pH低于 2时还保持离子化
一些碱在 pH高于 7时还保持离子化
?可以有以下的选择
?离子交换色谱
?使用聚合物反相柱，在 pH高于 7时用离子抑
制法
?使用“离子对色谱法”
离子对色谱法
?在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂
?与样品中可电离的组份形成“对离子”
?在反相色谱柱上分离离子型化合物
?离子对试剂的类型
?PIC A：磷酸季丁铵，适用于弱酸
?PIC B：烷基磺酸盐，适用于弱碱
离子对色谱机理
结论
?充分用已知样品结构确定以哪种方法开始
?普通反相? 离子抑制? 离子对? 还是其他
?观察流动相条件改变时色谱峰的移动
?根据变化的方向及大小决定下一步干什么
?改变参数时要合理，每次只改动其中一个
变量！
?色谱柱的改变影响最大
第一步干什么?
?想办法得到各种信息
?向同行了解是否做过此类样品，或有否类似
样品的分析方法
?查文献，如 CA(化学文摘 )
?对色谱柱有足够的了解
?掌握分离机理，自己开发方法
?充分了解您自己的样品
分析时要了解哪方面的情况？
?灵敏度的要求有多高?
?样品的本底是否很复杂?
?有多少组份要分析?
?对分析的精密度、准确度等有多高要求?
?是否因是日常检验，而要求方法容易使用?
分离时要了解哪方面的情况？
?要分离（即制备）的样品量有多大?
?要分离的组份在样品中的含量很高? 还是
微量?
?是否需要保持生物活性?
?对分离产物纯度的要求有多高?
?纯度或活性的鉴定如何完成?
一般的具体步骤
?先用一根短的色谱柱
?用相对较高的流速
?使用尽可能纯度高的标准品
?先用高强度的洗脱液
?调节柱长度改变柱效及分离速度 请记住∶
每次改变一个参数
使用文献方法
?色谱柱填料的种类、品牌是否相同?
?注意文献方法的流动相
?是否损害色谱柱?
?如色谱填料品牌不同，需要调整流动相
?注意色谱柱的规格：内径、柱长
?需要调整流速、进样量
反相色谱的方法开发
?开发过程实例
?色谱条件 ∶
?色谱柱,C18,4mm× 30mm
?流动相：乙腈 /水，不同的溶剂强度,60/40、
50/50,40/60，由强渐弱
?流速,2ml/min
?样品：
① 对羟基苯甲酸甲酯 (Methyl Paraben)
② 对羟基苯甲酸丙酯 (Propyl Paraben)
③ 对羟基苯甲酸丁酯 (Butyl Paraben)
改变容量因子 K'
60/40
50/50 40/60
①
②
③
①
② ②
③ ③
①
谱图
改变选择性 ∶ a
?通过改变流动相改变选择性
?同样强度的不同溶剂
?改变色谱柱
①②③ 62:38/ 42:58/
72:28/
23
2
2
，③
，②
，①
OHCNCH
OHM e O H
OHT H F
离子型化合物的分离方式
?使用离子交换柱 ∶ 离子交换法
?主要用于“强”阴、阳离子
?使用反相柱
?离子抑制色谱法
?通过改变流动相的 pH值，使样品成中性
?离子对色谱法
?加入“对离子”，使样品呈中性
离子抑制色谱
?离子型化合物在反相色谱柱上不保留
?改变流动相的 pH值，抑制样品离子的电离
?适用于弱酸性化合物的分离
?降低流动相的 pH值，使样品降低离子化
?使用条件应在填料基质的范围内
?硅胶柱的 pH在 2-8（较保险值 3-7）内
常用缓冲液及其 pH值
离子抑制色谱实例
? 在乙腈 /水及 pH=7时，
多数保留时间很短，无
法完全分离。
C H O
O H
O C H 3
C O O N a C H O C O O H
O C H 3
1 2 3 4
离子抑制色谱的使用范围
如果：
一些酸在 pH低于 2时还保持离子化
一些碱在 pH高于 7时还保持离子化
?可以有以下的选择
?离子交换色谱
?使用聚合物反相柱，在 pH高于 7时用离子抑
制法
?使用“离子对色谱法”
离子对色谱法
?在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂
?与样品中可电离的组份形成“对离子”
?在反相色谱柱上分离离子型化合物
?离子对试剂的类型
?PIC A：磷酸季丁铵，适用于弱酸
?PIC B：烷基磺酸盐，适用于弱碱
离子对色谱机理
结论
?充分用已知样品结构确定以哪种方法开始
?普通反相? 离子抑制? 离子对? 还是其他
?观察流动相条件改变时色谱峰的移动
?根据变化的方向及大小决定下一步干什么
?改变参数时要合理，每次只改动其中一个
变量！
?色谱柱的改变影响最大
