第七讲 色谱技术 6学时一、通过本章学习应掌握的问题
1、什么是色谱分离技术？
2、色谱分离技术的分类？
3、什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算理论塔板数？
4、什么是吸附色谱及其分类和基本原理？
5、什么是分配色谱？
6、离子交换色谱的分类及应用
7、凝胶色谱的分离原理及分类
8、离子交换及疏水作用层析的原理
9、高效液相色谱的分离原理及应用？
10、蛋白质分离的常用色谱方法有哪些？
二、什么是色谱技术（Chromatography）
概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离的目的。
简单的说，色谱技术是在特定的色谱柱当中，利用不同物质与固定相的亲和力差异而实现分离的一组技术。其优点是分辨率高，是生化产品纯化、分析的重要手段，这一切均源于其特殊的分离模式，即塔板理论三、色谱分离方法的分类色谱分离方法很多，种类有四、五十种。但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分，有以下几种：
1、吸附色谱
2、分配色谱
3、离子交换色谱
4、凝胶色谱四、色谱分离的基本概念
1、分配系数：可由Langmuir方程得出
Kd---分配系数
q、c---溶质在固相和液相中的浓度
2、保留时间（tR）和保留体积（VR）：反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一
3、色谱柱的理论塔板数、塔板高度反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系理论塔板数的计算方法：
N---理论塔板数 tR---保留时间
W1/2---半峰宽 Wb---峰底宽度理论塔板高度：
L---柱长五、吸附色谱
1、原理：利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差异而实现分离
2、关键要素：吸附剂（固定相）和展开剂（流动相）的选择
3、吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如-OH和-NH2
4、常用的吸附剂：
氧化铝、硅胶、活性炭、纤维素、聚酰胺、硅藻土
5、展开剂的选择展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果展开剂选择的原则：
（1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物质的极性略小
（2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力
6、吸附色谱的操作程序
（1）根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选择合适的固定相和流动相
（2）吸附操作：选择合适的操作条件（温度、pH值、流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样品含量以调整操作参数
（3）洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节pH值以及体系离子强度，最大限度地回收目标产物六、分配色谱
1、原理：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法
2、构成要素：固定相、载体、流动相载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体载体种类：
硅胶、硅藻土、纤维素、葡聚糖凝胶固定相：通常选取各组分溶解度大的溶剂作为固定相流动相可以是极性的（反相色谱法），也可以是非极性的（正相色谱）
*反相色谱 固定相是非极性的流动相是极性的
3、HPLC（High Performance Liquid Chromatography）
是一种典型的分配色谱，它是基于化合物在固定相和流动相之间分配系数的差异而实现分离的，由于经过了多次的吸附－解析－吸附的过程，其理论塔板数可高达数万（分析性HPLC）
4、反相液相色谱反相液相色谱分离多肽和蛋白质使基于蛋白质的疏水性，因此通常采用非极性的烷基固定相作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应最大限度地满足疏水的要求载体：微粒多孔硅胶（粒径5μm~20μm ）
Hypersil Spherosil XOB075
固定相：C18、C8烷基链，C8适于分离蛋白质
C18适于分离核酸苯基流动相的选择通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和四氢呋喃七、离子交换色谱
1、概念：以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法
2、常用的离子交换树脂
（1）葡聚糖凝胶型
DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25
（2）纤维素系列离子交换剂
DEAE-Sephacel Cellex系列
（3）琼脂糖系列离子交换剂
Sepharose系列 Sepharose CL-6B,Sepharose Fast Flow
Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂
（4）Source 系列离子交换剂特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低阳离子交换树脂 S系列阴离子交换树脂 Q系列
（5）MonoBeads 系列离子交换剂（Pharmacia）
特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。
同样分为Q系列和P系列八、分子筛凝胶色谱（Gel Penetration Chromatography,GPC）
1、概念：在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经体积的不同，使不同相对分子量的组分得以分离
2、特点：
操作简便
分离效果好，重复性高，回收率高
分离条件温和
应用广泛 适用于生物大分子的初级分离，脱盐
分辨率低
3、分子筛凝胶色谱原理
不同的化合物由于其大小差异，在流经GPC柱时，不同分子量的化合物流经体积不同（大分子不能或难以进入凝胶网格结构的内部，直接从凝胶颗粒之间穿过，保留时间短；而小分子恰恰相反，保留时间较长）而得以分离（如上图所示）
九、疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography,HIC）
原理：依据生物大分子疏水性差异实现分离由于不同蛋白质分子氨基酸组成差异，其疏水性也不尽相同，HIC技术是基于生物大分子的疏水性差异而实现分离的，该方法弥补了HPLC难以用于蛋白质等生物大分子的分离的不足。具体方法是：
在高盐环境下，蛋白质表面的疏水区域暴露，固定相表面修饰了一些疏水的基团，这样蛋白质的疏水部分即可与固定相发生较强的疏水相互作用，从而被结合在固定相表面，而一旦降低流动相的盐浓度即可实现蛋白质的洗脱（见下图），方便易行，是蛋白质分离的常用手段之一。
十、亲和色谱（Affinity chromatography）
所谓亲和色谱就是将亲和技术和色谱技术集成得到的一种高效分离手段，其原理与亲和吸附基本类似，所不同的是经过修饰的载体颗粒是填充在色谱柱中，以实现连续的色谱分离载体活化、配基连接、吸附、洗脱
十一、蛋白质分离常用的色谱方法
1、免疫亲和层析属于吸附色谱中的一种，利用抗原-抗体作用的高度专一性以及较强的吸附力，实现特殊蛋白质的分离免疫亲和层析介质的获得：
（1）获得抗体
（2）抗体连接到载体上
2、疏水层析在载体表面连接上疏水的直链碳链或其他疏水基团，如苯基，可以与蛋白质的某些疏水基团相互作用，从而实现多组分的分离。
3、离子交换色谱是最常用的蛋白质分离手段操作要点：
由于蛋白质是两性电解质，在不同的pH值下，其解离程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也可以用阴离子交换，可视具体情况而定由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗脱困难，通常采用弱阳或弱阴离子交换剂适当调节缓冲溶液的pH值，使蛋白质适当解离，通常采用的pH值靠近其等电点（不是等电点）
缓冲溶液的离子强度不能过高，通常在10~20m mol
层析方案的确定，需要视试验情况作适当调整洗脱方式：pH梯度
离子强度梯度十二、本章作业
1、色谱方法共分几类？常用的蛋白质分离方法有哪些？并简述其原理何为理论塔板高度和理论塔板数？如何计算？
简述高效反相液相色谱的工作原理？
试分析HPLC和HIC技术的异同
1、什么是色谱分离技术？
2、色谱分离技术的分类？
3、什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算理论塔板数？
4、什么是吸附色谱及其分类和基本原理？
5、什么是分配色谱？
6、离子交换色谱的分类及应用
7、凝胶色谱的分离原理及分类
8、离子交换及疏水作用层析的原理
9、高效液相色谱的分离原理及应用？
10、蛋白质分离的常用色谱方法有哪些？
二、什么是色谱技术（Chromatography）
概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离的目的。
简单的说，色谱技术是在特定的色谱柱当中，利用不同物质与固定相的亲和力差异而实现分离的一组技术。其优点是分辨率高，是生化产品纯化、分析的重要手段，这一切均源于其特殊的分离模式，即塔板理论三、色谱分离方法的分类色谱分离方法很多，种类有四、五十种。但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分，有以下几种：
1、吸附色谱
2、分配色谱
3、离子交换色谱
4、凝胶色谱四、色谱分离的基本概念
1、分配系数：可由Langmuir方程得出
Kd---分配系数
q、c---溶质在固相和液相中的浓度
2、保留时间（tR）和保留体积（VR）：反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一
3、色谱柱的理论塔板数、塔板高度反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系理论塔板数的计算方法：
N---理论塔板数 tR---保留时间
W1/2---半峰宽 Wb---峰底宽度理论塔板高度：
L---柱长五、吸附色谱
1、原理：利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差异而实现分离
2、关键要素：吸附剂（固定相）和展开剂（流动相）的选择
3、吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如-OH和-NH2
4、常用的吸附剂：
氧化铝、硅胶、活性炭、纤维素、聚酰胺、硅藻土
5、展开剂的选择展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果展开剂选择的原则：
（1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物质的极性略小
（2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力
6、吸附色谱的操作程序
（1）根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选择合适的固定相和流动相
（2）吸附操作：选择合适的操作条件（温度、pH值、流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样品含量以调整操作参数
（3）洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节pH值以及体系离子强度，最大限度地回收目标产物六、分配色谱
1、原理：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法
2、构成要素：固定相、载体、流动相载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体载体种类：
硅胶、硅藻土、纤维素、葡聚糖凝胶固定相：通常选取各组分溶解度大的溶剂作为固定相流动相可以是极性的（反相色谱法），也可以是非极性的（正相色谱）
*反相色谱 固定相是非极性的流动相是极性的
3、HPLC（High Performance Liquid Chromatography）
是一种典型的分配色谱，它是基于化合物在固定相和流动相之间分配系数的差异而实现分离的，由于经过了多次的吸附－解析－吸附的过程，其理论塔板数可高达数万（分析性HPLC）
4、反相液相色谱反相液相色谱分离多肽和蛋白质使基于蛋白质的疏水性，因此通常采用非极性的烷基固定相作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应最大限度地满足疏水的要求载体：微粒多孔硅胶（粒径5μm~20μm ）
Hypersil Spherosil XOB075
固定相：C18、C8烷基链，C8适于分离蛋白质
C18适于分离核酸苯基流动相的选择通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和四氢呋喃七、离子交换色谱
1、概念：以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法
2、常用的离子交换树脂
（1）葡聚糖凝胶型
DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25
（2）纤维素系列离子交换剂
DEAE-Sephacel Cellex系列
（3）琼脂糖系列离子交换剂
Sepharose系列 Sepharose CL-6B,Sepharose Fast Flow
Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂
（4）Source 系列离子交换剂特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低阳离子交换树脂 S系列阴离子交换树脂 Q系列
（5）MonoBeads 系列离子交换剂（Pharmacia）
特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。
同样分为Q系列和P系列八、分子筛凝胶色谱（Gel Penetration Chromatography,GPC）
1、概念：在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经体积的不同，使不同相对分子量的组分得以分离
2、特点：
操作简便
分离效果好，重复性高，回收率高
分离条件温和
应用广泛 适用于生物大分子的初级分离，脱盐
分辨率低
3、分子筛凝胶色谱原理
不同的化合物由于其大小差异，在流经GPC柱时，不同分子量的化合物流经体积不同（大分子不能或难以进入凝胶网格结构的内部，直接从凝胶颗粒之间穿过，保留时间短；而小分子恰恰相反，保留时间较长）而得以分离（如上图所示）
九、疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography,HIC）
原理：依据生物大分子疏水性差异实现分离由于不同蛋白质分子氨基酸组成差异，其疏水性也不尽相同，HIC技术是基于生物大分子的疏水性差异而实现分离的，该方法弥补了HPLC难以用于蛋白质等生物大分子的分离的不足。具体方法是：
在高盐环境下，蛋白质表面的疏水区域暴露，固定相表面修饰了一些疏水的基团，这样蛋白质的疏水部分即可与固定相发生较强的疏水相互作用，从而被结合在固定相表面，而一旦降低流动相的盐浓度即可实现蛋白质的洗脱（见下图），方便易行，是蛋白质分离的常用手段之一。
十、亲和色谱（Affinity chromatography）
所谓亲和色谱就是将亲和技术和色谱技术集成得到的一种高效分离手段，其原理与亲和吸附基本类似，所不同的是经过修饰的载体颗粒是填充在色谱柱中，以实现连续的色谱分离载体活化、配基连接、吸附、洗脱
十一、蛋白质分离常用的色谱方法
1、免疫亲和层析属于吸附色谱中的一种，利用抗原-抗体作用的高度专一性以及较强的吸附力，实现特殊蛋白质的分离免疫亲和层析介质的获得：
（1）获得抗体
（2）抗体连接到载体上
2、疏水层析在载体表面连接上疏水的直链碳链或其他疏水基团，如苯基，可以与蛋白质的某些疏水基团相互作用，从而实现多组分的分离。
3、离子交换色谱是最常用的蛋白质分离手段操作要点：
由于蛋白质是两性电解质，在不同的pH值下，其解离程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也可以用阴离子交换，可视具体情况而定由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗脱困难，通常采用弱阳或弱阴离子交换剂适当调节缓冲溶液的pH值，使蛋白质适当解离，通常采用的pH值靠近其等电点（不是等电点）
缓冲溶液的离子强度不能过高，通常在10~20m mol
层析方案的确定，需要视试验情况作适当调整洗脱方式：pH梯度
离子强度梯度十二、本章作业
1、色谱方法共分几类？常用的蛋白质分离方法有哪些？并简述其原理何为理论塔板高度和理论塔板数？如何计算？
简述高效反相液相色谱的工作原理？
试分析HPLC和HIC技术的异同
