第五章 生物氧化
(Biological oxidation)
第一节 概 论一、生物氧化的概念和特点物质在生物体内进行的脱氢,加氧等氧化反应,并有ATP的生成的过程称为生物氧化(biological oxidation)。
按照生理意义不同,生物氧化可分为两大类,一类主要是将代谢物或药物和毒物等通过氧化反应进行生物转化,这类反应不伴;另一类(主要)是糖、脂肪和蛋白质等营养物质通过氧化反应进行分解,生成H2O和CO2,同时伴有ATP生物能的生成,供生命活动之需,其余能量主要以热能形式释放,可用于维持体温。这类反应进行过程中细胞要摄取O2,释放CO2,故又形象地称之为细胞呼吸(cellular respiration)。
体内大部分物质都可进行氧化反应,在生物体内进行的氧化反应与体外氧化反应有许多共同之处:它们都遵循氧化反应的一般规律,常见的氧化方式有脱电子、脱氢和加氧等类型;最终氧化分解产物是CO2和H2O,同时释放能量。
但是生物氧化反应又有其特点:
1)体外氧化反应主要以热能形式释放能量;而生物氧化主要以生成ATP方式释放能量,为生物体所利用。
2)最大区别在于:体外氧化往往在高温,强酸,强碱或强氧化剂的催化下进行;而生物氧化是在恒温(37℃)和中性pH环境下进行,催化氧化反应的催化剂是酶。
代谢物在体内的氧化可以分为三个阶段:
首先是糖、脂肪和蛋白质经过分解代谢生成乙酰CoA中的乙酰基;
接着乙酰CoA进入三羧酸循环脱氢,生成CO2,并使NAD+和FAD还原成NADH+H+、FADH2;
第三阶段是NADH+H+和FADH2中的氢经呼吸链将电子传递给氧生成水,氧化过程中释放出来的能量用于ATP合成。从广义来讲,上述三个阶段均为生物氧化,狭义地说只有第三个阶段才算是生物氧化,这是体内能量生成的主要阶段。
二、自由能与高能化合物
1,自由能生物体能量代谢同整个自然界一样要服从热力学定律,主要是热力学第一定律(能量守恒定律),指能量既不能创造也不能消灭,只能从一种形式转变为另一种形式。
热力学第一定律不能预测某一反应能否自发进行。
热力学第二定律是指热的传导只能由高温物体传至低温物体。
热力学第二定律是指任何一种物理或化学的过程都自发地趋向于增加体系与环境的总熵。对生命机体所发生的各种生化反应来说,最重要的热力学函数是自由能。自由能是生物体(或恒温恒压下)用来作功的能量。在没有作功条件时,自由能将转变为热能丧失。熵是指混乱度或无序性,是一种无用的能。在恒温恒压条件(生物体系内)下,自由能变化ΔG、总热能变化ΔH、总体滴的改变ΔS,三者间关系可用下式表示:
ΔG=ΔH-TΔS
该方程式表明:
ΔG<0时,体系的反应能自发进行(为放能反应);
ΔG>0时,反应不能自发进行,当给体系补充自由能时,才能推动反应进行(为吸能反应);
ΔG= 0时,表明体系已处于平衡状态。
在25℃,101325Pa(1个大气压),反应物浓度lmol/L时,反应系统自由能变化为标准自由能变化,用ΔGo表示;因生物体内的pH接近7,用ΔGo’表示生物体内的标准自由能变化,单位为KJ/mol。
研究反应体系自由能的变化,对于了解生物体内进行的反应有重要作用。对于任何一化学反应:
A+B?C+D (1)
其自由能变化ΔG遵循下式:
这表明,某一反应能否进行取决于ΔG,而ΔG决定于标准状况下,产物自由能与反应物自由能之差ΔGo,并与反应物与产物的浓度,反应体系的温度有关。
当反应处于平衡,即ΔG=0时,(2)式可改写为:
式中R为气体常数(R=8.315J/mol一度),T为绝对温度,InK为平衡常数的自然对数。ΔGo可以由在平衡时所测定的反应物与产物的浓度计算出来。这种从已知平衡常数,计算反应自由能变化的方法,在生物化学中有较大的实际意义。以A?B反应为例,若平衡常数K大于1时,ΔGo为一负值,反应趋向于生成B的方向进行。若平衡常数大小于1时,则ΔGo为正值。
表:K和ΔGo之间的关系
在生物体系内,用ΔGo’代替ΔGo,则:
ΔGo’=-2.303RTlgK (5)
应注意的是,一反应系统的ΔG只取决于产物与反应物的自由能之差,而与反应历程无关。例如葡萄糖在体外燃烧与体内氧化分解成CO2和H2O,反应历程截然不同,但却释放相同的ΔG。葡萄糖在体内氧化总的自由能变化等于各步反应自由能变化的代数和。
2.高能化合物在生化反应中,含自由能特多的某些化合物,即随水解反应或基因转移反应可放出大量自由能的称高能化合物。高能化合物一般对酸、碱和热不稳定。
机体内存在着各种磷酸化合物,它们所含的自由能多少不等,含自由能特多的磷酸化合物称为高能磷酸化合物,当磷酰基水解时,释放出大量的自由能。含自由能高的磷酸化合物水解时,每摩尔化合物放出的自由能高达30~67kJ,含自由能少的磷酸化合物如葡糖-6-磷酸、甘油磷酸等水解时,每摩尔仅释放出8~20kJ自由能。高能磷酸化合物常用~P或~ 来表示。
生物体中常见的高能化合物,根据结构的特点,可以分成几种类型(见下表)。
表:高能化合物类型
高能磷酸化合物是最多、最常见的高能化合物,此外尚有硫酯型、甲硫型等化合物。
高能化合物水解产生的自由能多,其结构特点有哪些规律?从大多数情况看来,是由于水解产物自由能大大降低,远较原来化合物稳定。至于促成产物稳定的因素,因不同化合物可能不完全相同,目前虽已有些解释,尚不够肯定。
在上表中,ATP的作用最重要。从低等的单细胞生物到高等的人类,能量的释放、贮存和利用都是以ATP为中心的。
3.ATP的结构基础
ATP是由位于线粒体内膜上的ATP合成酶催化ADP与Pi合成的。在细胞的产能和需能过程中起着重要的桥梁作用。是由腺嘌呤、核糖和一个三磷酸单位组成的核苷酸。ATP的活化形式通常为ATP与Mg2+(或Mn2+)的复合物。ATP中的2个磷酸基团(βγ磷酸)可从γ端依次移去而生成腺苷二磷酸(ADP)和腺苷一磷酸(AMP)。
机体在物质氧化的某些过程释放出的大量自由能往往先形成高能磷酸化合物ATP,再由ATP水解为ADP和无机磷酸而释放出大量自由能供给需能反应。在pH=7环境中,ATP分子中的三个磷酸基团完全解离成带4个负电荷的离子形式(ATP4-),具有较大势能,加之水解产物稳定,因而水解自由能很大(ΔG°′=-30.5千焦/摩尔)。
一般将水解时释放20.92KJ/mol以上自由能的化合物称为高能化合物。ATP的磷酸酐键称为高能键。
(区别:化学上的键能是断裂一个键所需要的能量,而生物化学中的高能化合物是水解该键时反应的ΔG,而不是指断裂该键所需要的能量)
ATP是生物细胞内能量代谢的偶联剂。由于ATP+H2O→ADP+Pi其ΔGo’=-30.5lkJ/mol;当ADP+Pi→ATP时,也需吸收30.51kJ/mo1的自由能。ATP可以把分解代谢的放能反应与合成代谢的吸能反应偶联在一起。利用ATP水解释的自由能可以驱动各种需能的生命活动。例如原生质的流动、肌肉的运动、电鳗放出的电能、萤火虫放出的光能,以及动植物分泌、吸收的渗透能,都靠ATP供给(下图)。
图,ATP的生理功能体内有些合成反应不一定都直接利用ATP供能,而可以用其他核苷三磷酸。例如UTP用于多糖合成、CTP用于磷脂合成、GTP用于蛋白质合成等。但物质氧化时释放的能量大都是必须先合成ATP,然后ATP可使UDP、CDP或GDP生成相应的UTP、CTP或GTP。
ATP是能量的携带者或传递者,但严格地说不是能量的贮存者。在可兴奋组织,如肌肉、神经组织,肌酸磷酸是能量的贮存形式。当ATP合成迅速时,在肌酸磷酸激酶催化下,ATP将能量和磷酰基传给肌酸生成肌酸磷酸,肌酸磷酸含有的能量不能直接为生物体利用,而必须把能量传给ADP生成ATP后再利用。
三、生物氧化酶类体内催化氧化反应的酶有许多种,按照其催化氧化反应方式不同可分为三大类:
(一) 脱氢氧化酶类这一类中依据其反应受氢体或氧化产物不同,又可以分为三种:
1,氧化酶类(oxidases)
氧化酶直接作用于底物,以O2作为受氢体或受电子体,生成产物是H2O。氧化酶均为结合蛋白质,辅基常含有Cu2+,如细胞色素氧化酶、酚氧化酶、抗坏血酸氧化酶等。如抗坏血酸氧化酶可催化下述反应:
2,需氧脱氢酶类(aerobic dehydrogenases)
需氧脱氢酶以FAD或FMN为辅基,以氧为直接受氢体,产物为H2O2或超氧离子(O2-)。某些色素如甲烯蓝(methylene blue,MB)、铁氰化钾([K3Fe(CN)6]、二氯酚靛酚可以作为这类酶的人工受氢体。如D-氨基酸氧化酶(辅基FAD)、L-氨基酸氧化酶(辅基FMN)、黄嘌呤氧化酶(辅基FAD)、醛脱氢酶(辅基FAD)、单胺氧化酶(辅基FAD)、二胺氧化酶等。
2,需氧脱氢酶类(aerobic dehydrogenases)
粒细胞中NADH氧化酶和NADPH氧化酶也是需氧脱氢酶,它们催化下述反应:
超氧离子在超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)催化下生成H2O2与O2:
3,不需氧脱氢酶类(anaerobic dehydrogenases)
这是人体内主要的脱氢酶类,其直接受氢体不是O2,而只能是某些辅酶(NAD+、NADP+)或辅基(FAD、FMN),辅酶或辅基还原后又将氢原子传递至线粒体氧化呼吸链,最后将电子传给氧生成水,在此过程中释放出来的能量使ADP磷酸化生成ATP,如3-磷酸甘油醛脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素酶等。
(二)加氧酶类(oxygenases)
顾名思义,加氧酶催化加氧反应。根据向底物分子中加入氧原子的数目,又可分为加单氧酶(monooxygenase)和加双氧酶(dioxygenase)。
1,加单氧酶又称为多功能氧化酶、混合功能氧化酶(mixed function oxidase)、羟化酶(hydroxylase)。加单氧酶催化O2分子中的一个原子加到底物分子上使之羟化,另一个氧原子被NADPH+H+提供的氢还原生成水,在此氧化过程中无高能磷酸化合物生成,反应如下:
加单氧酶实际上是含有黄素酶及细胞色素的酶体系,常常是由细胞色素P450、NADPH细胞色素P450还原酶、NADPH和磷脂组成的复合物。细胞色素P450是一种以血色素为辅基的b族细胞色素,其中的Fe3+可被Na2S2O3等还原为Fe2+,还原型的细胞色素P450与CO结合后在450nm有最大吸收峰,故名细胞色素P450,它的作用类似于细胞色素aa3,能与氧直接反应,将电子传递给O2,因此也是一种终末氧化酶。
加单氧酶主要分布在肝、肾组织微粒体中,少数加单氧酶也存在于线粒体中,加单氧酶主要参与类固醇激素(性激素、肾上腺皮质激素)、胆汁酸盐、胆色素、活性VD的生成和某些药物、毒物的生物转化过程。加单氧酶可受底物诱导,而且细胞色素P450基质特异性低,一种基质提高了加单氧酶的活性便可同时加快几种物质的代谢速度,这与体内的药物代谢关系十分密切,例如以苯巴比妥作诱导物,可以提高机体代谢胆红素、睾酮、氢化可地松、香豆素、洋地黄毒苷的速度,临床用药时应予考虑。
2,加双氧酶
此酶催化O2分子中的两个原子分别加到底物分子中构成双键的两个碳原子上,如色氨酸吡咯酶(色氨酸加双氧酶)、胡萝卜素加双氧酶分别催化下列反应:
(三) 过氧化氢酶和过氧化物酶前已叙及需氧脱氢酶和超氧化物歧化酶催化的反应中有H2O2生成。过氧化氢具有一定的生理作用,粒细胞和吞噬细胞中的H2O2可杀死吞噬的细菌,甲状腺上皮细胞和粒细胞中的H2O2可使I氧化生成I2,进而使蛋白质碘化,这与甲状腺素的生成和消灭细菌有关。但是H2O2也可使巯基酶和蛋白质氧化失活;还能氧化生物膜磷脂分子中的多不饱和脂肪酸,损伤生物膜结构、影响生物膜的功能;还能破坏核酸和粘多糖。人体某些组织如肝、肾、中性粒细胞及小肠粘膜上皮细胞中的过氧化物酶体内含有过氧化氢酶(触酶)和过氧化物酶,可利用或消除细胞内的H2O2和过氧化物,防止其含量过高而起保护作用。
1,过氧化氢酶(Catalase)
此酶催化两个H2O2分子的氧化还原反应,生成H2O并释放出O2。
过氧化氢酶的催化效率极高,每个酶分子在0℃每分钟可催化264万个H2O2分子分解,因此人体一般不会发生H2O2的蓄积中毒。
2,过氧化物酶(Peroxidase)
此酶催化H2O2或过氧化物直接氧化酚类或胺类物质。
R + H2O2 ——→ RO + H2O 或RH2+H2O2——→ R + 2H2O
某些组织的细胞中还有一种含硒(Se)的谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase),可催化下述反应:
H2O2 + 2G-SH → 2H2O + GSSG
ROOH + 2G-SH → ROH + GSSG + H2O
生成的GSSG又可在谷胱甘肽还原酶催化下由NADPH+H+供氢还原生成G-SH:
临床工作中判定粪便、消化液中是否有隐血时,就是利用血细胞中的过氧化物酶活性将愈创木酯或联苯胺氧化成蓝色化合物。
第二节 呼吸链呼吸链(respiratory chain,或电子传递链)是由一系列的递氢体(hydrogen transfer)和递电子体(eletron transfer)按一定的顺序排列所组成的连续反应体系,它将代谢物脱下的成对H原子交给O2生成H2O,同时有ATP生成。实际上呼吸链的作用代表着线粒体最基本的功能,呼吸链中的递氢体和递电子体就是能传递H原子或电子的载体,由于氢原子可以看作是由H+和e组成的,所以递氢体也是递电子体。递氢体和递电子体的本质是酶、辅酶、辅基或辅因子。
一、呼吸链的递氢体和递电子体构成呼吸链的递氢体和递电子体主要分为以下五类:
1,尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或称辅酶I(CoI)。
为体内很多脱氢酶的辅酶,是连接作用物与呼吸链的重要环节,分子中除含尼克酰胺(维生素PP)外,还含有核糖、磷酸及一分子腺苷酸(AMP),其结构如左:
NAD+的主要功能是接受从代谢物上脱下的2H(2H+ + 2e),然后传给另一传递体黄素蛋白。
在生理pH条件下,尼克酰胺中的氮(吡啶氮)为五价的氮(N5+),它能可逆地接受电子而成为三价氮(N3+),与氮对位的碳也较活泼,能可逆地加氢还原,故可将NAD+视为递氢体。反应时,NAD+的尼克酰胺部分可接受一个氢原子及一个电子,尚有一个质子(H+)留在介质中。
此外,亦有不少脱氢酶的辅酶为尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+),又称辅酶Ⅱ(CoⅡ),它与NAD+不同之处是在腺苷酸部分中核糖的2′位碳上羟基的氢被磷酸基取代而成(如下图)。
当此类酶催化代谢物脱氢后,其辅酶NADP+接受氢而被还原生成NADPH+H+,它须经吡啶核苷酸转氢酶(pyridine nucleotide transhydrogenase)作用将还原当量转移给NAD+,然后再经呼吸链传递,但NADPH+H+一般是为合成代谢或羟化反应提供氢。
2,黄素蛋白(flavo proteins,FP)
黄素蛋白种类很多,其辅基有两种,一种为黄素单核苷酸(FMN),另一种为黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD),两者均含核黄素(维生素B2),此外FMN尚含一分子磷酸,而FAD则比FMN多含一分子腺苷酸(AMP),其结构如下:
在FAD、FMN分子中的异咯嗪部分可以进行可逆的脱氢加氢反应:
FAD或FMN与酶蛋白部分之间是通过非共价键(有的甚至是共价键)相连,但结合牢固,因此氧化与还原(即电子的失与得)都在同一个酶蛋白上进行。故黄素核苷酸的氧化还原电位取决于与它们结合的蛋白质,所以有关的标准还原电位指的是特定的黄素蛋白,而不是游离的FMN或FAD;在电子转移反应中它们只是在黄素蛋白的活性中心部分,而其本身不能作为作用物或产物,这和NAD+不同,NAD+与酶蛋白结合疏松,当与某酶蛋白结合时可以从代谢物接受氢,而被还原为NADH,NADH可以游离,再与另一种酶蛋白结合,释放氢后又被氧化为NAD+。
多数黄素蛋白参与呼吸链组成,与电子转移有关,如NADH脱氢酶(NADH dehydrogenase)以FMN为辅基,是呼吸链的组分之一,介于NADH与其它电子传递体之间;琥珀酸脱氢酶,线粒体内的甘油磷酸脱氢酶(glycerol phosphate dehydrogenase)的辅基为FAD,它们可直接从作用物转移还原当量H++ e到呼吸链,此外脂肪酰CoA脱氢酶与琥珀酸脱氢酶相似,亦属于以FAD为辅基的黄素蛋白类,也能将还原当量从作用物传递进呼吸链中,但中间尚需另一电子传递体—电子转移黄素蛋白(electron transferring flavo protein,ETFP,辅基为FAD)的参与才能完成。
3,铁硫蛋白(iron sulfur proteins,Fe-S)
又称铁硫中心,其特点是含Fe原子。铁是与无机硫原子或是蛋白质肽链上半胱氨酸残基的硫相结合,常见的铁硫蛋白有三种组合方式:
(a)单个铁原子与4个半胱氨酸残基上的巯基硫相连。
(b)两个铁原子、两个无机硫原子组成(2Fe-2S),其中每个铁原子还各与两个半胱氨酸残基的巯基硫相结合。
(c)由4个铁原子与4个无机硫原子相连(4Fe-4S),铁与硫相间排列在一个正六面体的8个顶角端;此外4个铁原子还各与一个半胱氨酸残基上的巯基硫相连。铁硫蛋白中的铁可以呈2价(还原型),也可呈3价(氧化型),由于铁的氧化、还原而达到传递电子作用。在呼吸链中它多与黄素蛋白或细胞色素b结合存在。
4,泛醌(ubiquinone,UQ)
亦称辅酶Q(coenzyme Q,CoQ,Q),为一脂溶性苯醌,带有一很长的侧链,是由多个异戊二烯(isoprene)单位构成的,不同来源的泛醌其异戊二烯单位的数目不同,在哺乳类动物组织中最多见的泛醌其侧链由10个异戊二烯单位组成。CoQ和FMN都是NADH-CoQ还原酶的辅酶。
泛醌接受一个电子和一个质子还原成半醌,再接受一个电子和质子则还原成二氢泛醌,后者又可脱去电子和质子而被氧化恢复为泛醌。
5,细胞色素(cytochrome,Cyt)体系
1926年Keilin首次使用分光镜观察昆虫飞翔肌振动时,发现有特殊的吸收光谱,因此把细胞内的吸光物质定名为细胞色素。细胞色素是一类含有铁卟啉辅基的色蛋白,属于递电子体。线粒体内膜中有细胞色素b、c1、c、aa3,肝、肾等组织的微粒体中有细胞色素P450。细胞色素b、c1、c为红色细胞素,细胞色素aa3为绿色细胞素。不同的细胞色素具有不同的吸收光谱,不但其酶蛋白结构不同,辅基的结构也有一些差异。
细胞色素c为一外周蛋白,位于线粒体内膜的外侧。细胞色素c比较容易分离提纯,其结构已清楚。哺乳动物的Cyt-c由104个氨基酸残基组成,并从进化的角度作了许多研究。Cyt-c的辅基血红素(亚铁原卟啉)通过共价键(硫醚键)与酶蛋白相连(见下图),其余各种细胞色素中辅基与酶蛋白均通过非共价键结合。
细胞色素a和a3不易分开,统称为细胞色素aa3。和细胞色素P450、b、c1、c不同,细胞色素aa3的辅基不是血红素,而是血红素A。细胞色素aa3可将电子直接传递给氧,因此又称为细胞色素氧化酶。
铁卟啉辅基所含Fe2+可有Fe2+ ←→ Fe3+ + e的互变,因此起到传递电子的作用。铁原子可以和酶蛋白及卟啉环形成6个配位键。细胞色素aa3和P450辅基中的铁原子只形成5个配位键,还能与氧再形成一个配位键,将电子直接传递给O2,也可与CO、氰化物、H2S或叠氮化合物形成一个配位键。细胞色素aa3与氰化物结合就阻断了整个呼吸链的电子传递,引起氰化物中毒。
二、氧化呼吸链
1,NADH氧化呼吸链人体内大多数脱氢酶都以NAD+作辅酶,在脱氢酶催化下底物SH2脱下的氢交给NAD+生成NADH+H+,在NADH脱氢酶作用下,NADH+H+将两个氢原子传递给FMN生成FMNH2,再将氢传递至CoQ生成CoQH2,此时两个氢原子解离成2H+ +2e,2H+游离于介质中,2e经Cyt-b、c1、c、aa3传递,最后将2e传递给1/2O2,生成O2-,O2与介质中游离的2H+结合生成水。上述传递过程可用下图表示:
2,琥珀酸氧化呼吸链琥珀酸在琥珀酸脱氢酶作用下脱氢生成延胡索酸,FAD接受两个氢原子生成FADH2,然后再将氢传递给CoQ,生成CoQH2,此后的传递和NADH氧化呼吸链相同,整个传递过程可用下图表示:
三、胞浆中NADH的转移体内很多物质氧化分解产生NADH,反应发生在线粒体内,则产生的NADH可直接通过呼吸链进行氧化磷酸化,但亦有不少反应是在线粒体外进行的,如3-磷酸甘油醛脱氢反应,乳酸脱氢反应及氨基酸联合脱氨基反应等等。由于所产生的NADH存在于线粒体外,而真核细胞中,NADH不能自由通过线粒体内膜,因此,必须借助某些能自由通过线粒体内膜的物质才能被转入线粒体,这就是所谓穿梭机制,体内主要有两种穿梭机制。
1,苹果酸穿梭(malate aspartate shuttle)
这种穿梭机制主要在肝、肾、心中发挥作用,其穿梭机制比较复杂,不仅需借助苹果酸、草酰乙酸的氧化还原,而且还要借助α-酮戊二酸与氨基酸之间的转换,才能使胞液中来的NADH的还原当量转移进入线粒体氧化,具体过程如下图:
图:苹果酸-草酰乙酸穿梭作用当胞液中NADH浓度升高时,首先还原草酰乙酸成为苹果酸,此反应由苹果酸脱氢酶催化,胞液中增多的苹果酸可通过内膜上的二羧酸载体系统与线粒体内的α-酮戊二酸交换;进入线粒体的苹果酸,经苹果酸脱氢酶催化又氧化生成草酰乙酸并释出NADH,还原当量从复合体I进入呼吸链经CoQ、复合体Ⅲ、Ⅳ传递,最后给氧,所以仍可产生2.5分子ATP,与在线粒体内产生的NADH氧化相同。与此同时线粒体内的α-酮戊二酸由于与苹果酸交换而减少,需要补充,于是在转氨酶作用下由谷氨酸与草酰乙酸进行转氨基反应,生成α酮戊二酸和天冬氨酸,天冬氨酸借线粒体膜上的谷氨酸天冬氨酸载体转移系统与胞液的谷氨酸交换,从而补充了线粒体内谷氨酸由于转氨基作用而造成的损失,进入胞液的天冬氨酸再与胞液中α-酮戊二酸进行转氨基,重新又产生草酰乙酸以补充最初的消耗,从而完成整个穿梭过程。
2,α-磷酸甘油穿梭(glycerol α-phosphate shuttle)
该穿梭机制主要在脑及骨骼肌中,它是借助于α-磷酸甘油与磷酸二羟丙酮之间的氧化还原转移还原当量,使线粒体外来自NADH的还原当量进入线粒体的呼吸链氧化,当胞液中NADH浓度升高时,胞液中的磷酸二羟丙酮首先被NADH还原成α-磷酸甘油(3-磷酸甘油),反应由甘油磷酸脱氢酶(辅酶为NAD+)催化,生成的α-磷酸甘油可再经位于线粒体内膜近外侧部的甘油磷酸脱氢酶催化氧化生成磷酸二羟丙酮。线粒体与胞液中的甘油磷酸脱氢酶为同工酶,两者不同在于线粒体内的酶是以FAD为辅基的脱氢酶,而不是NADH+,FAD所接受的质子、电子可直接经泛醌、复合体Ⅲ、Ⅳ传递到氧,这样线粒体外的还原当量就被转运到线粒体氧化了,但通过这种穿梭机制果只能生成1.5分子ATP,而不是2.5分子ATP。
图:α-磷酸甘油穿梭作用第三节 氧化磷酸化作用
ATP为一游离核苷酸,由腺嘌呤、核糖与三分子磷酸构成(见下图),磷酸与磷酸间借磷酸酐键相连,当这种高能磷酸化合物水解时(磷酸酐键断裂)自由能变化(G)为30.5KJ/mol,而一般的磷酸酯水解时(磷酸酯键断裂)自由能的变化只有8-12KJ/mol,因此曾称此磷酸酐键为高能磷酸键,但实际上这样的名称是不够确切的,因为一种化合物水解时释放自由能的多少取决于该化合物整个分子的结构,以及反应的作用物自由能与产物自由能的差异,而不是由哪个特殊化学键的破坏所致,但为了叙述及解释问题方便,高能磷酸键的概念至今仍被生物化学界采用。
ATP水解时首先将其分子的一部分,如磷酸(Pi)或腺苷酸(AMP)转移给作用物,或与催化反应的酶形成共价结合的中间产物,以提高作用物或酶的自由能,最终被转移的AMP或Pi将被取代而放出,ATP多以这种通过磷酸基团等转移的方式,而非单独水解的方式,参加酶促反应提供能量,用以驱动需要加入自由能的吸能反应,ATP水解反应的总结如下:
ATP → ADP + Pi 或 ATP → AMP + PPi(焦磷酸)
ATP几乎是生物组织细胞能够直接利用的唯一能源,在糖、脂类及蛋白质等物质氧化分解中释放出的能量,相当大的一部分能使ADP磷酸化成为ATP,从而把能量保存在ATP分子内。
一、ATP的生成方式体内ATP生成有两种方式:
1,底物水平磷酸化(substrate level phosphorylation)
底物分子中的能量直接以高能键形式转移给ADP生成ATP,这个过程称为底物水平磷酸化,这一磷酸化过程在胞浆和线粒体中进行,包括有:
通过作用物(底物)水平磷酸化生成的ATP在体内所占比例很小,如1mol葡萄糖彻底氧化产生的32molATP中,只有4 mol由作用物(底物)水平磷酸化生成,其余ATP均通过氧化磷酸化产生。
2.氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)
氧化和磷酸化是两个不同的概念。氧化是底物脱氢或失电子的过程,而磷酸化是指ADP与Pi合成ATP的过程。在结构完整的线粒体中氧化与磷酸化这两个过程是紧密地偶联在一起的。代谢物在生物氧化过程中释放出的自由能用于合成ATP(ADP+Pi→ATP),这种氧化放能和ATP生成(磷酸化)相偶联的过程就是氧化磷酸化,氧化是磷酸化的基础,而磷酸化是氧化的结果。
氧化过程为放能反应或分解代谢,磷酸化则为吸能反应或合成代谢,所以体内的吸能与放能反应总是偶联进行的,一个吸能反应无法独立进行。 如果只有代谢物的氧化过程,而不伴有ADP磷酸化的过程,称为氧化磷酸化解偶联。
氧化磷酸化发生的部位:线粒体机体代谢过程中能量的主要来源是线粒体,既有氧化磷酸化,也有底物水平磷酸化,以前者为主要来源。胞液中底物水平磷酸化也能获得部分能量,实际上这是酵解过程的能量来源。对于酵解组织、红细胞和组织相对缺氧时的能量来源是十分重要的。
二、氧化磷酸化偶联部位的测定确定氧化磷酸化偶联部位通常用2种方法:
1,P/O值测定
P/O值是指在氧化磷酸化过程中,消耗一分子氧所要消耗的无机磷的分子数(或者所生成的ATP的分子数)。在氧化磷酸化过程中,每传递一对电子消耗一个氧原子,而每生成一分子ATP消耗一分子Pi。P/O值实质上指的是呼吸过程中磷酸化的效率。
测定P/O方法通常是在一密闭的容器中加的底物、ADP、Pi、氧饱和的缓冲液,再加入线粒体制剂时就会有氧化磷酸化进行。反应终了时测定O2消耗量(可用氧电极法)和Pi消耗量(或ATP生成量)就可以计算出P/O值。
在反应系统中加入不同的底物(β-羟丁酸、琥珀酸、抗坏血酸、细胞色素c),可测得各自的P/O值,结合我们所了解的呼吸链的传递顺序,就可以分析出大致的偶联部位了。
2,根据氧化还原电位计算电子传递释放的能量是否满足ATP合成的需要氧化还原反应中释放的自由能△G'O与反应底物和产物标准氧化还原电位差值(△E'O)之间存在下述关系:△G'O=nF△E'O
式中n为氧化还原反应中电子转移数目,F为法拉弟常数(23.062千卡/克分子·伏特,或96500库仑/克分子)。
一分子ATP水解生成ADP与Pi所释放的能量为7.3千卡,凡氧化过程中释放的能量大于7.3千,均有可能生成一分子ATP,就是说可能存在有一个偶联部位,根据上式计算,当n=2时,△E'O=0.1583V时可释放7.3千卡能量,所以反应底物与生成物的标准氧化还原电位的变化大于0.1583V的部位均可能存在着一个偶联部位。
从下图可以看出,在NAD→CoQ,Cytb→Cytc和Cytaa3→O2处可能存在着偶联部位。必须明确,这种计算的基础是反应处在热力学平衡状态,温度为25℃,pH为7.0,反应底物和产物的浓度均为1克分子,这种条件在体内是不存在的。因此这一计算结果只能供参考。
综上所述,呼吸链中电子传递和磷酸化的偶联部位可用下图表示:
呼吸链磷酸化的全过程方程式:
NADH+H+ + 3ADP + 3Pi + 1/2O2 → NAD+ + 3ATP + 4H2O
FADH2 + 2ADP + 2Pi + 1/2O2 → FAD + 2ATP + 3H2O
三、氧化磷酸化中ATP生成的结构基础
ATP是由位于线粒体内膜上的ATP合成酶催化ADP与Pi合成的。ATP合成酶是一个大的膜蛋白质复合体,分子量在48000kD,是由两个主要组成(或称因子)构成,一是疏水的F0,另一是亲水的F1,又称F0F1复合体。在电子显微镜下观察线粒体时,可见到线粒体内膜基质侧有许多球状颗粒突起,这就是ATP合成酶,其中球状的头与茎是F1部分,分子量为350—380kD,由α3、β3、γ、δ、ε等9种多肽亚基组成,β与α亚基上有ATP结合部位;γ亚基被认为具有控制质子通过的闸门作用;δ亚基是F1与膜相连所必需,其中中心部分为质子通路;ε亚基是酶的调节部分,F0是由3个大小不一的亚基组成,其中有一个亚基称为寡霉素敏感蛋白质(oligomycinsensitivityconferringprotein,OSCP),此外尚有一个蛋白质部分为分子量28kD的因子,F0主要构成质子通道(见下图)。
旋转催化理论认为质子流通过Fo引起亚基III 寡聚体和γ及ε亚基一起转动,这种旋转配置α/β亚基之间的不对称的相互作用,引起催化位点性质的转变,γ亚基的中心α-螺旋被认为是转子,亚基I和II与δ亚基组合在一起组成定子,它压住α/β异质六聚体。
四、氧化磷酸化的偶联机制有关氧化磷酸化作用与电子传递相偶联的机理已经作了许多研究,目前氧化磷酸化的偶联机理还不完全清楚,50年代Slater及Lehninger提出了化学偶联学说,1964年Boear又提出了构象变化偶联学说,这两种学说的实验依据不多,支持这两种观点的人已经不多了。
目前多数人支持化学渗透学说(chemiosmotic hypothesis),这是英国生化学家P.Mitchell于1961年提出的,当时没有引起人们的重视,1966年他根据逐步积累的实验证据和生物膜研究的进展,逐步地完善了这一学说。
(一)氧化磷酸化的化学渗透学说的基本观点是(化学偶联学说、构象变化偶联学说自学):
1,线粒体的内膜中电子传递与线粒体释放H+是偶联的,即呼吸链在传递电子过程中释放出来的能量不断地将线粒体基质内的H+逆浓度梯度泵出线粒体内膜,这一过程的分子机理还不十分清楚(见下图)。
2,H+不能自由透过线粒体内膜,结果使得线粒体内膜外侧H+浓度增高,基质内H+浓度降低,在线粒体内膜两侧形成一个质子跨膜梯度,线粒体内膜外侧带正电荷,内膜内侧带负电荷,这就是跨膜电位△ψ。由于线粒体内膜两侧H+浓度不同,内膜两侧还有一个pH梯度△pH,膜外侧pH较基质pH约低1.0单位,底物氧化过程中释放的自由能就储存于△ψ和△pH中,若以△P表示总的质子移动力,那么三者的关系可用下式表示:
△P=△ψ-59△pH
3,线粒体外的H+可以通过线粒体内膜上的三分子体顺着H+浓度梯度进入线粒体基质中,这相当于一个特异的质子通道,H+顺浓度梯度方向运动所释放的自由能用于ATP的合成,寡霉素能与OSCP结合,特异阻断这个H+通道,从而抑制ATP合成。有关ATP合成的分子机制目前还不十分清楚。
4,解偶联剂的作用是促进H+被动扩散通过线粒体内膜,即增强线粒体内膜对H+的通透性,解偶联剂能消除线粒体内膜两侧的质子梯度,所以不能再合成ATP。
化学渗透假说示意图总之,化学渗透学说认为在氧化与磷酸化之间起偶联作用的因素是H+的跨膜梯度。每对H+通过三分子体回到线粒体基质中可以生成一分子ATP。以NADH+H+作底物,其电子沿呼吸链传递在线粒体内膜中形成三个回路,所以生成2.5分子ATP。以FADH2为底物,其电子沿琥珀酸氧化呼吸链传递在线粒体内膜中形成两个回路,所以生成1.5个ATP分子。
(二)氧化磷酸化的偶联机理
1、ATP酶作用机理
五、氧化磷酸化抑制剂氧化磷酸化抑制剂可分为三类,即呼吸抑制剂、磷酸化抑制剂和解偶联剂。
1,呼吸抑制剂这类抑制剂抑制呼吸链的电子传递,也就是抑制氧化,氧化是磷酸化的基础,抑制了氧化也就抑制了磷酸化。呼吸链某一特定部位被抑制后,其底物一侧均为还原状态,其氧一侧均为氧化态,这很容易用分光光度法(双波长分光光度计)检定,重要的呼吸抑制剂有以下几种。鱼藤酮(rotenone)系从植物中分离到的呼吸抑制剂,专一抑制NADH→CoQ的电子传递;抗霉素A(actinomycin A)由霉菌中分离得到,专一抑制CoQ→Cyt-c的电子传递;CN、CO、NaN3和H2S均抑制细胞色素氧化酶(示意如下)。
2,磷酸化抑制剂这类抑制剂抑制ATP的合成,抑制了磷酸化也一定会抑制氧化。
寡霉素(oligomycin)可与F0的OSCP结合,阻塞氢离子通道,从而抑制ATP合成。
二环己基碳二亚胺(dicyclohexyl carbodiimide,DCC)可与F0的DCC结合蛋白结合,阻断H+通道,抑制ATP合成。
栎皮酮(quercetin)直接抑制参与ATP合成的ATP酶。
3,解偶联剂(uncoupler)
解偶联剂使氧化和磷酸化脱偶联,氧化仍可以进行,而磷酸化不能进行,解偶联剂作用的本质是增大线粒体内膜对H+的通透性,消除H+的跨膜梯度,因而无ATP生成。解偶联剂只影响氧化磷酸化而不干扰底物水平磷酸化。解偶联剂的作用使氧化释放出来的能量全部以热的形式散发。动物棕色脂肪组织线粒体中有独特的解偶联蛋白,使氧化磷酸化处于解偶联状态,这对于维持动物的体温十分重要。
常用的解偶联剂有2,4-二硝基酚(dinitrophenol,DNP),羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼(FCCP),双香豆素(dicoumarin)等,过量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶联,从而使体温升高。
2,4-二硝基苯酚的解偶联作用过量的甲状腺素也有解偶联作用,甲状腺素诱导细胞膜上Na+-K+-ATP酶的合成,此酶催化ATP分解,释放的能量将细胞内的Na+泵到细胞外,而K+进入细胞,Na+-K+-ATP酶的转换率为100个分子ATP/秒,酶分子数增多,单位时间内分解的ATP增多,生成的ADP又可促进磷酸化过程。甲亢病人表现为多食、无力、喜冷怕热,基础代谢率(BMR)增高,因此也有人将甲状腺素看作是调节氧化磷酸化的重要激素。
六、氧化磷酸化的调节机体的氧化磷酸化主要受细胞对能量需求的调节
1,ATP/ADP值对氧化磷酸化的直接影响 线粒体内膜中有腺苷酸转位酶,催化线粒体内ATP与线粒体外ADP的交换,ATP分子解离后带有4个负电荷,而ADP分子解离后带有3个负电荷,由于线粒体内膜内外有跨膜电位(△ψ),内膜外侧带正电,内膜内侧带负电,所以ATP出线粒体的速度比进线粒体速度快,而ADP进线粒体速度比出线粒体速度快。Pi进入线粒体也由磷酸转位酶催化,磷酸转位酶催化OH与Pi交换,磷酸-二羧酸转位酶催化Pi2-与二羧酸(如苹果酸)交换。
当线粒体中有充足的氧和底物供应时,氧化磷酸化就会不断进行,直至ADP+Pi全部合成ATP,此时呼吸降到最低速度,若加入ADP,耗氧量会突然增高,这说明ADP控制着氧化磷酸化的速度,人们将ADP的这种作用称为呼吸受体控制。
机体消耗能量增多时,ATP分解生成ADP,ATP出线粒体增多,ADP进线粒体增多,线粒体内ATP/ADP值降低,使氧化磷酸化速度加快,ADP+Pi接受能量生成ATP。机体消耗能量少时,线粒体内ATP/ADP值增高,线粒体内ADP浓度减低就会使氧化磷酸化速度减慢。
2,ATP/ADP值的间接影响
ATP/ADP值增高时,使氧化磷酸化速度减慢,结果NADH氧化速度减慢,NADH浓度增高,从而抑制了丙酮酸脱氢酶系、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶系和柠檬酸合成酶活性,使糖的氧化分解和TCA循环的速度减慢。
3,ATP/ADP值对关键酶的直接影响
ATP/ADP值增高会抑制体内的许多关键酶,如变构抑制磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶和异柠檬酸脱氢酶,还能抑制丙酮酸脱羧酶、α-酮戊二酸脱氢酶系,通过直接反馈作用抑制糖的分解和TCA循环。
七、物质的储存和利用无论是底物水平磷酸化还是氧化磷酸化,释放的能量除一部分以热的形式散失于周围环境中之外,其余部分多直接生成ATP,以高能磷酸键的形式存在,同时,ATP也是生命活动利用能量的主要直接供给形式。
1,高能化合物人体存在多种高能化合物,但这些高能化合物的能量并不相同。体外实验中,在pH7.0,25℃条件下,每克分子ATP水解生成ADP+Pi时释放的能量为7.1千卡或30.4千焦耳,在体内,pH7.4,37℃,ATP、ADP+Pi、Mg2+均处于细胞内生理浓度的情况下,每克分子ATP水解生成ADP+Pi时释放的能量为33.5-50千焦耳或8-12千卡。磷酸烯醇式丙酮酸为-62.11千焦耳/克分子,3-二磷酸甘油酸为-49.5千焦耳/克分子,磷酸肌酸为-43.9千焦耳/克分子,乙酰CoA为-31.4千焦耳/克分子,S-腺苷蛋氨酸为-29.3千焦耳/克分子,F-6-P为-15.6千焦耳/克分子,G-6-P为-13.48千焦耳/克分子。
ATP在能量代谢中之所以重要,就是因为ATP水解时的标准自由能变化位于多种物质水解时标准自由能变化的中间,它能从具有更高能量的化合物接受高能磷酸键,如接受PEP、1,3-二磷酸甘油、磷酸肌酸分子中的~Pi生成ATP,ATP也能将~Pi转移给水解时标准自由能变化较小的化合物,如转移给葡萄糖生成G-6-P。
2,ATP能量的转移
ATP是细胞内的主要磷酸载体,ATP作为细胞的主要供能物质参与体内的许多代谢反应,还有一些反应需要UTP或CTP作供能物质,如UTP参与糖元合成和糖醛酸代谢,GTP参与糖异生和蛋白质合成,CTP参与磷脂合成过程,核酸合成中需要ATP、CTP、UTP和GTP作原料合成RNA,或以dATP、dCTP、dGTP和dTTP作原料合成DNA。
作为供能物质所需要的UTP、CTP和GTP可经下述反应再生:
UDP + ATP → UTP + ADP
GDP + ATP → GTP + ADP
CDP + ATP → CTP + ADP
dNTP由dNDP的生成过程也需要ATP供能:
dNDP + ATP → dNTP + ADP
3,磷酸肌酸
ATP是细胞内主要的磷酸载体或能量传递体,人体储存能量的方式不是ATP而是磷酸肌酸。肌酸主要存在于肌肉组织中,骨骼肌中含量多于平滑肌,脑组织中含量也较多,肝、肾等其它组织中含量很少。
磷酸肌酸的生成反应如下:
肌细胞线粒体内膜和胞液中均有催化该反应的肌酸激酶,它们是同工酶。线粒体内膜的肌酸激酶主要催化正向反应,生成的ADP可促进氧化磷酸化,生成的磷酸肌酸逸出线粒体进入胞液,磷酸肌酸所含的能量不能直接利用;胞液中的肌酸激酶主要催化逆向反应,生成的ATP可补充肌肉收缩时的能量消耗,而肌酸又回到线粒体用于磷酸肌酸的合成。肌肉中磷酸肌酸的浓度为ATP浓度的5倍,可储存肌肉几分钟收缩所急需的化学能,可见肌酸的分布与组织耗能有密切关系。
4,ATP的生成、储存和利用可用下图表示
5.电子传递和水的生成
6,葡萄糖彻底氧化生成ATP的总结算葡萄糖分解通过糖酵解和柠檬酸循环形成的ATP或GTP的分子数,根据化学计算可以得到明确的答复。但是氧化磷酸化产生的ATP分子数并不十分准确,因为质子泵、ATP的合成以及代谢物的转运过程并不需要是完整的数值甚至不需要是固定值,根据当前最新测定,H+经NADH-Q还原酶、细胞色素还原酶和细胞色素氧化酶从线粒体内膜基质泵出到膜外的细胞液侧时,一对电子泵出的质子数依次为4、2和4。合成一个ATP分子是由3个H+通过ATP合酶所驱动,多余的一个H+,可能用于将ATP从基质运往膜外细胞溶胶。因此一对电子从NADH传至02,所产生的 ATP分子数是2.5个。在细胞色素还原酶的水平进人电子传递链的电子,如琥珀酸,或细胞液中的NADH,它们的电子对只产生1.5个ATP分子。这样,当一分于葡萄糖彻底氧化为CO2和水所得到的ATP分子数和过去传统的统计数(36个ATP)少了6个ATP分子,成为30个。
八、其它氧化系统通过线粒体细胞色素系统进行氧化的体系是一切动物、植物、微生物主要氧化途径,它与ATP的生成紧密相关。除此以外,生物体内还存在一些其它氧化系统,其特点是从底物脱氢到H2O的生成是经过其它末端氧化酶完成的,与ATP的生成无关,但各自具有重要的生理功能。
生物体内主要的其它氧化系统如下:
1.多酚氧化酶系统
2.抗坏血酸氧化酶系统
3.黄素蛋白氧化酶系统
4.超氧化物歧化酶氧化系统
5.植物抗氰氧化酶系统
(Biological oxidation)
第一节 概 论一、生物氧化的概念和特点物质在生物体内进行的脱氢,加氧等氧化反应,并有ATP的生成的过程称为生物氧化(biological oxidation)。
按照生理意义不同,生物氧化可分为两大类,一类主要是将代谢物或药物和毒物等通过氧化反应进行生物转化,这类反应不伴;另一类(主要)是糖、脂肪和蛋白质等营养物质通过氧化反应进行分解,生成H2O和CO2,同时伴有ATP生物能的生成,供生命活动之需,其余能量主要以热能形式释放,可用于维持体温。这类反应进行过程中细胞要摄取O2,释放CO2,故又形象地称之为细胞呼吸(cellular respiration)。
体内大部分物质都可进行氧化反应,在生物体内进行的氧化反应与体外氧化反应有许多共同之处:它们都遵循氧化反应的一般规律,常见的氧化方式有脱电子、脱氢和加氧等类型;最终氧化分解产物是CO2和H2O,同时释放能量。
但是生物氧化反应又有其特点:
1)体外氧化反应主要以热能形式释放能量;而生物氧化主要以生成ATP方式释放能量,为生物体所利用。
2)最大区别在于:体外氧化往往在高温,强酸,强碱或强氧化剂的催化下进行;而生物氧化是在恒温(37℃)和中性pH环境下进行,催化氧化反应的催化剂是酶。
代谢物在体内的氧化可以分为三个阶段:
首先是糖、脂肪和蛋白质经过分解代谢生成乙酰CoA中的乙酰基;
接着乙酰CoA进入三羧酸循环脱氢,生成CO2,并使NAD+和FAD还原成NADH+H+、FADH2;
第三阶段是NADH+H+和FADH2中的氢经呼吸链将电子传递给氧生成水,氧化过程中释放出来的能量用于ATP合成。从广义来讲,上述三个阶段均为生物氧化,狭义地说只有第三个阶段才算是生物氧化,这是体内能量生成的主要阶段。
二、自由能与高能化合物
1,自由能生物体能量代谢同整个自然界一样要服从热力学定律,主要是热力学第一定律(能量守恒定律),指能量既不能创造也不能消灭,只能从一种形式转变为另一种形式。
热力学第一定律不能预测某一反应能否自发进行。
热力学第二定律是指热的传导只能由高温物体传至低温物体。
热力学第二定律是指任何一种物理或化学的过程都自发地趋向于增加体系与环境的总熵。对生命机体所发生的各种生化反应来说,最重要的热力学函数是自由能。自由能是生物体(或恒温恒压下)用来作功的能量。在没有作功条件时,自由能将转变为热能丧失。熵是指混乱度或无序性,是一种无用的能。在恒温恒压条件(生物体系内)下,自由能变化ΔG、总热能变化ΔH、总体滴的改变ΔS,三者间关系可用下式表示:
ΔG=ΔH-TΔS
该方程式表明:
ΔG<0时,体系的反应能自发进行(为放能反应);
ΔG>0时,反应不能自发进行,当给体系补充自由能时,才能推动反应进行(为吸能反应);
ΔG= 0时,表明体系已处于平衡状态。
在25℃,101325Pa(1个大气压),反应物浓度lmol/L时,反应系统自由能变化为标准自由能变化,用ΔGo表示;因生物体内的pH接近7,用ΔGo’表示生物体内的标准自由能变化,单位为KJ/mol。
研究反应体系自由能的变化,对于了解生物体内进行的反应有重要作用。对于任何一化学反应:
A+B?C+D (1)
其自由能变化ΔG遵循下式:
这表明,某一反应能否进行取决于ΔG,而ΔG决定于标准状况下,产物自由能与反应物自由能之差ΔGo,并与反应物与产物的浓度,反应体系的温度有关。
当反应处于平衡,即ΔG=0时,(2)式可改写为:
式中R为气体常数(R=8.315J/mol一度),T为绝对温度,InK为平衡常数的自然对数。ΔGo可以由在平衡时所测定的反应物与产物的浓度计算出来。这种从已知平衡常数,计算反应自由能变化的方法,在生物化学中有较大的实际意义。以A?B反应为例,若平衡常数K大于1时,ΔGo为一负值,反应趋向于生成B的方向进行。若平衡常数大小于1时,则ΔGo为正值。
表:K和ΔGo之间的关系
在生物体系内,用ΔGo’代替ΔGo,则:
ΔGo’=-2.303RTlgK (5)
应注意的是,一反应系统的ΔG只取决于产物与反应物的自由能之差,而与反应历程无关。例如葡萄糖在体外燃烧与体内氧化分解成CO2和H2O,反应历程截然不同,但却释放相同的ΔG。葡萄糖在体内氧化总的自由能变化等于各步反应自由能变化的代数和。
2.高能化合物在生化反应中,含自由能特多的某些化合物,即随水解反应或基因转移反应可放出大量自由能的称高能化合物。高能化合物一般对酸、碱和热不稳定。
机体内存在着各种磷酸化合物,它们所含的自由能多少不等,含自由能特多的磷酸化合物称为高能磷酸化合物,当磷酰基水解时,释放出大量的自由能。含自由能高的磷酸化合物水解时,每摩尔化合物放出的自由能高达30~67kJ,含自由能少的磷酸化合物如葡糖-6-磷酸、甘油磷酸等水解时,每摩尔仅释放出8~20kJ自由能。高能磷酸化合物常用~P或~ 来表示。
生物体中常见的高能化合物,根据结构的特点,可以分成几种类型(见下表)。
表:高能化合物类型
高能磷酸化合物是最多、最常见的高能化合物,此外尚有硫酯型、甲硫型等化合物。
高能化合物水解产生的自由能多,其结构特点有哪些规律?从大多数情况看来,是由于水解产物自由能大大降低,远较原来化合物稳定。至于促成产物稳定的因素,因不同化合物可能不完全相同,目前虽已有些解释,尚不够肯定。
在上表中,ATP的作用最重要。从低等的单细胞生物到高等的人类,能量的释放、贮存和利用都是以ATP为中心的。
3.ATP的结构基础
ATP是由位于线粒体内膜上的ATP合成酶催化ADP与Pi合成的。在细胞的产能和需能过程中起着重要的桥梁作用。是由腺嘌呤、核糖和一个三磷酸单位组成的核苷酸。ATP的活化形式通常为ATP与Mg2+(或Mn2+)的复合物。ATP中的2个磷酸基团(βγ磷酸)可从γ端依次移去而生成腺苷二磷酸(ADP)和腺苷一磷酸(AMP)。
机体在物质氧化的某些过程释放出的大量自由能往往先形成高能磷酸化合物ATP,再由ATP水解为ADP和无机磷酸而释放出大量自由能供给需能反应。在pH=7环境中,ATP分子中的三个磷酸基团完全解离成带4个负电荷的离子形式(ATP4-),具有较大势能,加之水解产物稳定,因而水解自由能很大(ΔG°′=-30.5千焦/摩尔)。
一般将水解时释放20.92KJ/mol以上自由能的化合物称为高能化合物。ATP的磷酸酐键称为高能键。
(区别:化学上的键能是断裂一个键所需要的能量,而生物化学中的高能化合物是水解该键时反应的ΔG,而不是指断裂该键所需要的能量)
ATP是生物细胞内能量代谢的偶联剂。由于ATP+H2O→ADP+Pi其ΔGo’=-30.5lkJ/mol;当ADP+Pi→ATP时,也需吸收30.51kJ/mo1的自由能。ATP可以把分解代谢的放能反应与合成代谢的吸能反应偶联在一起。利用ATP水解释的自由能可以驱动各种需能的生命活动。例如原生质的流动、肌肉的运动、电鳗放出的电能、萤火虫放出的光能,以及动植物分泌、吸收的渗透能,都靠ATP供给(下图)。
图,ATP的生理功能体内有些合成反应不一定都直接利用ATP供能,而可以用其他核苷三磷酸。例如UTP用于多糖合成、CTP用于磷脂合成、GTP用于蛋白质合成等。但物质氧化时释放的能量大都是必须先合成ATP,然后ATP可使UDP、CDP或GDP生成相应的UTP、CTP或GTP。
ATP是能量的携带者或传递者,但严格地说不是能量的贮存者。在可兴奋组织,如肌肉、神经组织,肌酸磷酸是能量的贮存形式。当ATP合成迅速时,在肌酸磷酸激酶催化下,ATP将能量和磷酰基传给肌酸生成肌酸磷酸,肌酸磷酸含有的能量不能直接为生物体利用,而必须把能量传给ADP生成ATP后再利用。
三、生物氧化酶类体内催化氧化反应的酶有许多种,按照其催化氧化反应方式不同可分为三大类:
(一) 脱氢氧化酶类这一类中依据其反应受氢体或氧化产物不同,又可以分为三种:
1,氧化酶类(oxidases)
氧化酶直接作用于底物,以O2作为受氢体或受电子体,生成产物是H2O。氧化酶均为结合蛋白质,辅基常含有Cu2+,如细胞色素氧化酶、酚氧化酶、抗坏血酸氧化酶等。如抗坏血酸氧化酶可催化下述反应:
2,需氧脱氢酶类(aerobic dehydrogenases)
需氧脱氢酶以FAD或FMN为辅基,以氧为直接受氢体,产物为H2O2或超氧离子(O2-)。某些色素如甲烯蓝(methylene blue,MB)、铁氰化钾([K3Fe(CN)6]、二氯酚靛酚可以作为这类酶的人工受氢体。如D-氨基酸氧化酶(辅基FAD)、L-氨基酸氧化酶(辅基FMN)、黄嘌呤氧化酶(辅基FAD)、醛脱氢酶(辅基FAD)、单胺氧化酶(辅基FAD)、二胺氧化酶等。
2,需氧脱氢酶类(aerobic dehydrogenases)
粒细胞中NADH氧化酶和NADPH氧化酶也是需氧脱氢酶,它们催化下述反应:
超氧离子在超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)催化下生成H2O2与O2:
3,不需氧脱氢酶类(anaerobic dehydrogenases)
这是人体内主要的脱氢酶类,其直接受氢体不是O2,而只能是某些辅酶(NAD+、NADP+)或辅基(FAD、FMN),辅酶或辅基还原后又将氢原子传递至线粒体氧化呼吸链,最后将电子传给氧生成水,在此过程中释放出来的能量使ADP磷酸化生成ATP,如3-磷酸甘油醛脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素酶等。
(二)加氧酶类(oxygenases)
顾名思义,加氧酶催化加氧反应。根据向底物分子中加入氧原子的数目,又可分为加单氧酶(monooxygenase)和加双氧酶(dioxygenase)。
1,加单氧酶又称为多功能氧化酶、混合功能氧化酶(mixed function oxidase)、羟化酶(hydroxylase)。加单氧酶催化O2分子中的一个原子加到底物分子上使之羟化,另一个氧原子被NADPH+H+提供的氢还原生成水,在此氧化过程中无高能磷酸化合物生成,反应如下:
加单氧酶实际上是含有黄素酶及细胞色素的酶体系,常常是由细胞色素P450、NADPH细胞色素P450还原酶、NADPH和磷脂组成的复合物。细胞色素P450是一种以血色素为辅基的b族细胞色素,其中的Fe3+可被Na2S2O3等还原为Fe2+,还原型的细胞色素P450与CO结合后在450nm有最大吸收峰,故名细胞色素P450,它的作用类似于细胞色素aa3,能与氧直接反应,将电子传递给O2,因此也是一种终末氧化酶。
加单氧酶主要分布在肝、肾组织微粒体中,少数加单氧酶也存在于线粒体中,加单氧酶主要参与类固醇激素(性激素、肾上腺皮质激素)、胆汁酸盐、胆色素、活性VD的生成和某些药物、毒物的生物转化过程。加单氧酶可受底物诱导,而且细胞色素P450基质特异性低,一种基质提高了加单氧酶的活性便可同时加快几种物质的代谢速度,这与体内的药物代谢关系十分密切,例如以苯巴比妥作诱导物,可以提高机体代谢胆红素、睾酮、氢化可地松、香豆素、洋地黄毒苷的速度,临床用药时应予考虑。
2,加双氧酶
此酶催化O2分子中的两个原子分别加到底物分子中构成双键的两个碳原子上,如色氨酸吡咯酶(色氨酸加双氧酶)、胡萝卜素加双氧酶分别催化下列反应:
(三) 过氧化氢酶和过氧化物酶前已叙及需氧脱氢酶和超氧化物歧化酶催化的反应中有H2O2生成。过氧化氢具有一定的生理作用,粒细胞和吞噬细胞中的H2O2可杀死吞噬的细菌,甲状腺上皮细胞和粒细胞中的H2O2可使I氧化生成I2,进而使蛋白质碘化,这与甲状腺素的生成和消灭细菌有关。但是H2O2也可使巯基酶和蛋白质氧化失活;还能氧化生物膜磷脂分子中的多不饱和脂肪酸,损伤生物膜结构、影响生物膜的功能;还能破坏核酸和粘多糖。人体某些组织如肝、肾、中性粒细胞及小肠粘膜上皮细胞中的过氧化物酶体内含有过氧化氢酶(触酶)和过氧化物酶,可利用或消除细胞内的H2O2和过氧化物,防止其含量过高而起保护作用。
1,过氧化氢酶(Catalase)
此酶催化两个H2O2分子的氧化还原反应,生成H2O并释放出O2。
过氧化氢酶的催化效率极高,每个酶分子在0℃每分钟可催化264万个H2O2分子分解,因此人体一般不会发生H2O2的蓄积中毒。
2,过氧化物酶(Peroxidase)
此酶催化H2O2或过氧化物直接氧化酚类或胺类物质。
R + H2O2 ——→ RO + H2O 或RH2+H2O2——→ R + 2H2O
某些组织的细胞中还有一种含硒(Se)的谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase),可催化下述反应:
H2O2 + 2G-SH → 2H2O + GSSG
ROOH + 2G-SH → ROH + GSSG + H2O
生成的GSSG又可在谷胱甘肽还原酶催化下由NADPH+H+供氢还原生成G-SH:
临床工作中判定粪便、消化液中是否有隐血时,就是利用血细胞中的过氧化物酶活性将愈创木酯或联苯胺氧化成蓝色化合物。
第二节 呼吸链呼吸链(respiratory chain,或电子传递链)是由一系列的递氢体(hydrogen transfer)和递电子体(eletron transfer)按一定的顺序排列所组成的连续反应体系,它将代谢物脱下的成对H原子交给O2生成H2O,同时有ATP生成。实际上呼吸链的作用代表着线粒体最基本的功能,呼吸链中的递氢体和递电子体就是能传递H原子或电子的载体,由于氢原子可以看作是由H+和e组成的,所以递氢体也是递电子体。递氢体和递电子体的本质是酶、辅酶、辅基或辅因子。
一、呼吸链的递氢体和递电子体构成呼吸链的递氢体和递电子体主要分为以下五类:
1,尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或称辅酶I(CoI)。
为体内很多脱氢酶的辅酶,是连接作用物与呼吸链的重要环节,分子中除含尼克酰胺(维生素PP)外,还含有核糖、磷酸及一分子腺苷酸(AMP),其结构如左:
NAD+的主要功能是接受从代谢物上脱下的2H(2H+ + 2e),然后传给另一传递体黄素蛋白。
在生理pH条件下,尼克酰胺中的氮(吡啶氮)为五价的氮(N5+),它能可逆地接受电子而成为三价氮(N3+),与氮对位的碳也较活泼,能可逆地加氢还原,故可将NAD+视为递氢体。反应时,NAD+的尼克酰胺部分可接受一个氢原子及一个电子,尚有一个质子(H+)留在介质中。
此外,亦有不少脱氢酶的辅酶为尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+),又称辅酶Ⅱ(CoⅡ),它与NAD+不同之处是在腺苷酸部分中核糖的2′位碳上羟基的氢被磷酸基取代而成(如下图)。
当此类酶催化代谢物脱氢后,其辅酶NADP+接受氢而被还原生成NADPH+H+,它须经吡啶核苷酸转氢酶(pyridine nucleotide transhydrogenase)作用将还原当量转移给NAD+,然后再经呼吸链传递,但NADPH+H+一般是为合成代谢或羟化反应提供氢。
2,黄素蛋白(flavo proteins,FP)
黄素蛋白种类很多,其辅基有两种,一种为黄素单核苷酸(FMN),另一种为黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD),两者均含核黄素(维生素B2),此外FMN尚含一分子磷酸,而FAD则比FMN多含一分子腺苷酸(AMP),其结构如下:
在FAD、FMN分子中的异咯嗪部分可以进行可逆的脱氢加氢反应:
FAD或FMN与酶蛋白部分之间是通过非共价键(有的甚至是共价键)相连,但结合牢固,因此氧化与还原(即电子的失与得)都在同一个酶蛋白上进行。故黄素核苷酸的氧化还原电位取决于与它们结合的蛋白质,所以有关的标准还原电位指的是特定的黄素蛋白,而不是游离的FMN或FAD;在电子转移反应中它们只是在黄素蛋白的活性中心部分,而其本身不能作为作用物或产物,这和NAD+不同,NAD+与酶蛋白结合疏松,当与某酶蛋白结合时可以从代谢物接受氢,而被还原为NADH,NADH可以游离,再与另一种酶蛋白结合,释放氢后又被氧化为NAD+。
多数黄素蛋白参与呼吸链组成,与电子转移有关,如NADH脱氢酶(NADH dehydrogenase)以FMN为辅基,是呼吸链的组分之一,介于NADH与其它电子传递体之间;琥珀酸脱氢酶,线粒体内的甘油磷酸脱氢酶(glycerol phosphate dehydrogenase)的辅基为FAD,它们可直接从作用物转移还原当量H++ e到呼吸链,此外脂肪酰CoA脱氢酶与琥珀酸脱氢酶相似,亦属于以FAD为辅基的黄素蛋白类,也能将还原当量从作用物传递进呼吸链中,但中间尚需另一电子传递体—电子转移黄素蛋白(electron transferring flavo protein,ETFP,辅基为FAD)的参与才能完成。
3,铁硫蛋白(iron sulfur proteins,Fe-S)
又称铁硫中心,其特点是含Fe原子。铁是与无机硫原子或是蛋白质肽链上半胱氨酸残基的硫相结合,常见的铁硫蛋白有三种组合方式:
(a)单个铁原子与4个半胱氨酸残基上的巯基硫相连。
(b)两个铁原子、两个无机硫原子组成(2Fe-2S),其中每个铁原子还各与两个半胱氨酸残基的巯基硫相结合。
(c)由4个铁原子与4个无机硫原子相连(4Fe-4S),铁与硫相间排列在一个正六面体的8个顶角端;此外4个铁原子还各与一个半胱氨酸残基上的巯基硫相连。铁硫蛋白中的铁可以呈2价(还原型),也可呈3价(氧化型),由于铁的氧化、还原而达到传递电子作用。在呼吸链中它多与黄素蛋白或细胞色素b结合存在。
4,泛醌(ubiquinone,UQ)
亦称辅酶Q(coenzyme Q,CoQ,Q),为一脂溶性苯醌,带有一很长的侧链,是由多个异戊二烯(isoprene)单位构成的,不同来源的泛醌其异戊二烯单位的数目不同,在哺乳类动物组织中最多见的泛醌其侧链由10个异戊二烯单位组成。CoQ和FMN都是NADH-CoQ还原酶的辅酶。
泛醌接受一个电子和一个质子还原成半醌,再接受一个电子和质子则还原成二氢泛醌,后者又可脱去电子和质子而被氧化恢复为泛醌。
5,细胞色素(cytochrome,Cyt)体系
1926年Keilin首次使用分光镜观察昆虫飞翔肌振动时,发现有特殊的吸收光谱,因此把细胞内的吸光物质定名为细胞色素。细胞色素是一类含有铁卟啉辅基的色蛋白,属于递电子体。线粒体内膜中有细胞色素b、c1、c、aa3,肝、肾等组织的微粒体中有细胞色素P450。细胞色素b、c1、c为红色细胞素,细胞色素aa3为绿色细胞素。不同的细胞色素具有不同的吸收光谱,不但其酶蛋白结构不同,辅基的结构也有一些差异。
细胞色素c为一外周蛋白,位于线粒体内膜的外侧。细胞色素c比较容易分离提纯,其结构已清楚。哺乳动物的Cyt-c由104个氨基酸残基组成,并从进化的角度作了许多研究。Cyt-c的辅基血红素(亚铁原卟啉)通过共价键(硫醚键)与酶蛋白相连(见下图),其余各种细胞色素中辅基与酶蛋白均通过非共价键结合。
细胞色素a和a3不易分开,统称为细胞色素aa3。和细胞色素P450、b、c1、c不同,细胞色素aa3的辅基不是血红素,而是血红素A。细胞色素aa3可将电子直接传递给氧,因此又称为细胞色素氧化酶。
铁卟啉辅基所含Fe2+可有Fe2+ ←→ Fe3+ + e的互变,因此起到传递电子的作用。铁原子可以和酶蛋白及卟啉环形成6个配位键。细胞色素aa3和P450辅基中的铁原子只形成5个配位键,还能与氧再形成一个配位键,将电子直接传递给O2,也可与CO、氰化物、H2S或叠氮化合物形成一个配位键。细胞色素aa3与氰化物结合就阻断了整个呼吸链的电子传递,引起氰化物中毒。
二、氧化呼吸链
1,NADH氧化呼吸链人体内大多数脱氢酶都以NAD+作辅酶,在脱氢酶催化下底物SH2脱下的氢交给NAD+生成NADH+H+,在NADH脱氢酶作用下,NADH+H+将两个氢原子传递给FMN生成FMNH2,再将氢传递至CoQ生成CoQH2,此时两个氢原子解离成2H+ +2e,2H+游离于介质中,2e经Cyt-b、c1、c、aa3传递,最后将2e传递给1/2O2,生成O2-,O2与介质中游离的2H+结合生成水。上述传递过程可用下图表示:
2,琥珀酸氧化呼吸链琥珀酸在琥珀酸脱氢酶作用下脱氢生成延胡索酸,FAD接受两个氢原子生成FADH2,然后再将氢传递给CoQ,生成CoQH2,此后的传递和NADH氧化呼吸链相同,整个传递过程可用下图表示:
三、胞浆中NADH的转移体内很多物质氧化分解产生NADH,反应发生在线粒体内,则产生的NADH可直接通过呼吸链进行氧化磷酸化,但亦有不少反应是在线粒体外进行的,如3-磷酸甘油醛脱氢反应,乳酸脱氢反应及氨基酸联合脱氨基反应等等。由于所产生的NADH存在于线粒体外,而真核细胞中,NADH不能自由通过线粒体内膜,因此,必须借助某些能自由通过线粒体内膜的物质才能被转入线粒体,这就是所谓穿梭机制,体内主要有两种穿梭机制。
1,苹果酸穿梭(malate aspartate shuttle)
这种穿梭机制主要在肝、肾、心中发挥作用,其穿梭机制比较复杂,不仅需借助苹果酸、草酰乙酸的氧化还原,而且还要借助α-酮戊二酸与氨基酸之间的转换,才能使胞液中来的NADH的还原当量转移进入线粒体氧化,具体过程如下图:
图:苹果酸-草酰乙酸穿梭作用当胞液中NADH浓度升高时,首先还原草酰乙酸成为苹果酸,此反应由苹果酸脱氢酶催化,胞液中增多的苹果酸可通过内膜上的二羧酸载体系统与线粒体内的α-酮戊二酸交换;进入线粒体的苹果酸,经苹果酸脱氢酶催化又氧化生成草酰乙酸并释出NADH,还原当量从复合体I进入呼吸链经CoQ、复合体Ⅲ、Ⅳ传递,最后给氧,所以仍可产生2.5分子ATP,与在线粒体内产生的NADH氧化相同。与此同时线粒体内的α-酮戊二酸由于与苹果酸交换而减少,需要补充,于是在转氨酶作用下由谷氨酸与草酰乙酸进行转氨基反应,生成α酮戊二酸和天冬氨酸,天冬氨酸借线粒体膜上的谷氨酸天冬氨酸载体转移系统与胞液的谷氨酸交换,从而补充了线粒体内谷氨酸由于转氨基作用而造成的损失,进入胞液的天冬氨酸再与胞液中α-酮戊二酸进行转氨基,重新又产生草酰乙酸以补充最初的消耗,从而完成整个穿梭过程。
2,α-磷酸甘油穿梭(glycerol α-phosphate shuttle)
该穿梭机制主要在脑及骨骼肌中,它是借助于α-磷酸甘油与磷酸二羟丙酮之间的氧化还原转移还原当量,使线粒体外来自NADH的还原当量进入线粒体的呼吸链氧化,当胞液中NADH浓度升高时,胞液中的磷酸二羟丙酮首先被NADH还原成α-磷酸甘油(3-磷酸甘油),反应由甘油磷酸脱氢酶(辅酶为NAD+)催化,生成的α-磷酸甘油可再经位于线粒体内膜近外侧部的甘油磷酸脱氢酶催化氧化生成磷酸二羟丙酮。线粒体与胞液中的甘油磷酸脱氢酶为同工酶,两者不同在于线粒体内的酶是以FAD为辅基的脱氢酶,而不是NADH+,FAD所接受的质子、电子可直接经泛醌、复合体Ⅲ、Ⅳ传递到氧,这样线粒体外的还原当量就被转运到线粒体氧化了,但通过这种穿梭机制果只能生成1.5分子ATP,而不是2.5分子ATP。
图:α-磷酸甘油穿梭作用第三节 氧化磷酸化作用
ATP为一游离核苷酸,由腺嘌呤、核糖与三分子磷酸构成(见下图),磷酸与磷酸间借磷酸酐键相连,当这种高能磷酸化合物水解时(磷酸酐键断裂)自由能变化(G)为30.5KJ/mol,而一般的磷酸酯水解时(磷酸酯键断裂)自由能的变化只有8-12KJ/mol,因此曾称此磷酸酐键为高能磷酸键,但实际上这样的名称是不够确切的,因为一种化合物水解时释放自由能的多少取决于该化合物整个分子的结构,以及反应的作用物自由能与产物自由能的差异,而不是由哪个特殊化学键的破坏所致,但为了叙述及解释问题方便,高能磷酸键的概念至今仍被生物化学界采用。
ATP水解时首先将其分子的一部分,如磷酸(Pi)或腺苷酸(AMP)转移给作用物,或与催化反应的酶形成共价结合的中间产物,以提高作用物或酶的自由能,最终被转移的AMP或Pi将被取代而放出,ATP多以这种通过磷酸基团等转移的方式,而非单独水解的方式,参加酶促反应提供能量,用以驱动需要加入自由能的吸能反应,ATP水解反应的总结如下:
ATP → ADP + Pi 或 ATP → AMP + PPi(焦磷酸)
ATP几乎是生物组织细胞能够直接利用的唯一能源,在糖、脂类及蛋白质等物质氧化分解中释放出的能量,相当大的一部分能使ADP磷酸化成为ATP,从而把能量保存在ATP分子内。
一、ATP的生成方式体内ATP生成有两种方式:
1,底物水平磷酸化(substrate level phosphorylation)
底物分子中的能量直接以高能键形式转移给ADP生成ATP,这个过程称为底物水平磷酸化,这一磷酸化过程在胞浆和线粒体中进行,包括有:
通过作用物(底物)水平磷酸化生成的ATP在体内所占比例很小,如1mol葡萄糖彻底氧化产生的32molATP中,只有4 mol由作用物(底物)水平磷酸化生成,其余ATP均通过氧化磷酸化产生。
2.氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)
氧化和磷酸化是两个不同的概念。氧化是底物脱氢或失电子的过程,而磷酸化是指ADP与Pi合成ATP的过程。在结构完整的线粒体中氧化与磷酸化这两个过程是紧密地偶联在一起的。代谢物在生物氧化过程中释放出的自由能用于合成ATP(ADP+Pi→ATP),这种氧化放能和ATP生成(磷酸化)相偶联的过程就是氧化磷酸化,氧化是磷酸化的基础,而磷酸化是氧化的结果。
氧化过程为放能反应或分解代谢,磷酸化则为吸能反应或合成代谢,所以体内的吸能与放能反应总是偶联进行的,一个吸能反应无法独立进行。 如果只有代谢物的氧化过程,而不伴有ADP磷酸化的过程,称为氧化磷酸化解偶联。
氧化磷酸化发生的部位:线粒体机体代谢过程中能量的主要来源是线粒体,既有氧化磷酸化,也有底物水平磷酸化,以前者为主要来源。胞液中底物水平磷酸化也能获得部分能量,实际上这是酵解过程的能量来源。对于酵解组织、红细胞和组织相对缺氧时的能量来源是十分重要的。
二、氧化磷酸化偶联部位的测定确定氧化磷酸化偶联部位通常用2种方法:
1,P/O值测定
P/O值是指在氧化磷酸化过程中,消耗一分子氧所要消耗的无机磷的分子数(或者所生成的ATP的分子数)。在氧化磷酸化过程中,每传递一对电子消耗一个氧原子,而每生成一分子ATP消耗一分子Pi。P/O值实质上指的是呼吸过程中磷酸化的效率。
测定P/O方法通常是在一密闭的容器中加的底物、ADP、Pi、氧饱和的缓冲液,再加入线粒体制剂时就会有氧化磷酸化进行。反应终了时测定O2消耗量(可用氧电极法)和Pi消耗量(或ATP生成量)就可以计算出P/O值。
在反应系统中加入不同的底物(β-羟丁酸、琥珀酸、抗坏血酸、细胞色素c),可测得各自的P/O值,结合我们所了解的呼吸链的传递顺序,就可以分析出大致的偶联部位了。
2,根据氧化还原电位计算电子传递释放的能量是否满足ATP合成的需要氧化还原反应中释放的自由能△G'O与反应底物和产物标准氧化还原电位差值(△E'O)之间存在下述关系:△G'O=nF△E'O
式中n为氧化还原反应中电子转移数目,F为法拉弟常数(23.062千卡/克分子·伏特,或96500库仑/克分子)。
一分子ATP水解生成ADP与Pi所释放的能量为7.3千卡,凡氧化过程中释放的能量大于7.3千,均有可能生成一分子ATP,就是说可能存在有一个偶联部位,根据上式计算,当n=2时,△E'O=0.1583V时可释放7.3千卡能量,所以反应底物与生成物的标准氧化还原电位的变化大于0.1583V的部位均可能存在着一个偶联部位。
从下图可以看出,在NAD→CoQ,Cytb→Cytc和Cytaa3→O2处可能存在着偶联部位。必须明确,这种计算的基础是反应处在热力学平衡状态,温度为25℃,pH为7.0,反应底物和产物的浓度均为1克分子,这种条件在体内是不存在的。因此这一计算结果只能供参考。
综上所述,呼吸链中电子传递和磷酸化的偶联部位可用下图表示:
呼吸链磷酸化的全过程方程式:
NADH+H+ + 3ADP + 3Pi + 1/2O2 → NAD+ + 3ATP + 4H2O
FADH2 + 2ADP + 2Pi + 1/2O2 → FAD + 2ATP + 3H2O
三、氧化磷酸化中ATP生成的结构基础
ATP是由位于线粒体内膜上的ATP合成酶催化ADP与Pi合成的。ATP合成酶是一个大的膜蛋白质复合体,分子量在48000kD,是由两个主要组成(或称因子)构成,一是疏水的F0,另一是亲水的F1,又称F0F1复合体。在电子显微镜下观察线粒体时,可见到线粒体内膜基质侧有许多球状颗粒突起,这就是ATP合成酶,其中球状的头与茎是F1部分,分子量为350—380kD,由α3、β3、γ、δ、ε等9种多肽亚基组成,β与α亚基上有ATP结合部位;γ亚基被认为具有控制质子通过的闸门作用;δ亚基是F1与膜相连所必需,其中中心部分为质子通路;ε亚基是酶的调节部分,F0是由3个大小不一的亚基组成,其中有一个亚基称为寡霉素敏感蛋白质(oligomycinsensitivityconferringprotein,OSCP),此外尚有一个蛋白质部分为分子量28kD的因子,F0主要构成质子通道(见下图)。
旋转催化理论认为质子流通过Fo引起亚基III 寡聚体和γ及ε亚基一起转动,这种旋转配置α/β亚基之间的不对称的相互作用,引起催化位点性质的转变,γ亚基的中心α-螺旋被认为是转子,亚基I和II与δ亚基组合在一起组成定子,它压住α/β异质六聚体。
四、氧化磷酸化的偶联机制有关氧化磷酸化作用与电子传递相偶联的机理已经作了许多研究,目前氧化磷酸化的偶联机理还不完全清楚,50年代Slater及Lehninger提出了化学偶联学说,1964年Boear又提出了构象变化偶联学说,这两种学说的实验依据不多,支持这两种观点的人已经不多了。
目前多数人支持化学渗透学说(chemiosmotic hypothesis),这是英国生化学家P.Mitchell于1961年提出的,当时没有引起人们的重视,1966年他根据逐步积累的实验证据和生物膜研究的进展,逐步地完善了这一学说。
(一)氧化磷酸化的化学渗透学说的基本观点是(化学偶联学说、构象变化偶联学说自学):
1,线粒体的内膜中电子传递与线粒体释放H+是偶联的,即呼吸链在传递电子过程中释放出来的能量不断地将线粒体基质内的H+逆浓度梯度泵出线粒体内膜,这一过程的分子机理还不十分清楚(见下图)。
2,H+不能自由透过线粒体内膜,结果使得线粒体内膜外侧H+浓度增高,基质内H+浓度降低,在线粒体内膜两侧形成一个质子跨膜梯度,线粒体内膜外侧带正电荷,内膜内侧带负电荷,这就是跨膜电位△ψ。由于线粒体内膜两侧H+浓度不同,内膜两侧还有一个pH梯度△pH,膜外侧pH较基质pH约低1.0单位,底物氧化过程中释放的自由能就储存于△ψ和△pH中,若以△P表示总的质子移动力,那么三者的关系可用下式表示:
△P=△ψ-59△pH
3,线粒体外的H+可以通过线粒体内膜上的三分子体顺着H+浓度梯度进入线粒体基质中,这相当于一个特异的质子通道,H+顺浓度梯度方向运动所释放的自由能用于ATP的合成,寡霉素能与OSCP结合,特异阻断这个H+通道,从而抑制ATP合成。有关ATP合成的分子机制目前还不十分清楚。
4,解偶联剂的作用是促进H+被动扩散通过线粒体内膜,即增强线粒体内膜对H+的通透性,解偶联剂能消除线粒体内膜两侧的质子梯度,所以不能再合成ATP。
化学渗透假说示意图总之,化学渗透学说认为在氧化与磷酸化之间起偶联作用的因素是H+的跨膜梯度。每对H+通过三分子体回到线粒体基质中可以生成一分子ATP。以NADH+H+作底物,其电子沿呼吸链传递在线粒体内膜中形成三个回路,所以生成2.5分子ATP。以FADH2为底物,其电子沿琥珀酸氧化呼吸链传递在线粒体内膜中形成两个回路,所以生成1.5个ATP分子。
(二)氧化磷酸化的偶联机理
1、ATP酶作用机理
五、氧化磷酸化抑制剂氧化磷酸化抑制剂可分为三类,即呼吸抑制剂、磷酸化抑制剂和解偶联剂。
1,呼吸抑制剂这类抑制剂抑制呼吸链的电子传递,也就是抑制氧化,氧化是磷酸化的基础,抑制了氧化也就抑制了磷酸化。呼吸链某一特定部位被抑制后,其底物一侧均为还原状态,其氧一侧均为氧化态,这很容易用分光光度法(双波长分光光度计)检定,重要的呼吸抑制剂有以下几种。鱼藤酮(rotenone)系从植物中分离到的呼吸抑制剂,专一抑制NADH→CoQ的电子传递;抗霉素A(actinomycin A)由霉菌中分离得到,专一抑制CoQ→Cyt-c的电子传递;CN、CO、NaN3和H2S均抑制细胞色素氧化酶(示意如下)。
2,磷酸化抑制剂这类抑制剂抑制ATP的合成,抑制了磷酸化也一定会抑制氧化。
寡霉素(oligomycin)可与F0的OSCP结合,阻塞氢离子通道,从而抑制ATP合成。
二环己基碳二亚胺(dicyclohexyl carbodiimide,DCC)可与F0的DCC结合蛋白结合,阻断H+通道,抑制ATP合成。
栎皮酮(quercetin)直接抑制参与ATP合成的ATP酶。
3,解偶联剂(uncoupler)
解偶联剂使氧化和磷酸化脱偶联,氧化仍可以进行,而磷酸化不能进行,解偶联剂作用的本质是增大线粒体内膜对H+的通透性,消除H+的跨膜梯度,因而无ATP生成。解偶联剂只影响氧化磷酸化而不干扰底物水平磷酸化。解偶联剂的作用使氧化释放出来的能量全部以热的形式散发。动物棕色脂肪组织线粒体中有独特的解偶联蛋白,使氧化磷酸化处于解偶联状态,这对于维持动物的体温十分重要。
常用的解偶联剂有2,4-二硝基酚(dinitrophenol,DNP),羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼(FCCP),双香豆素(dicoumarin)等,过量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶联,从而使体温升高。
2,4-二硝基苯酚的解偶联作用过量的甲状腺素也有解偶联作用,甲状腺素诱导细胞膜上Na+-K+-ATP酶的合成,此酶催化ATP分解,释放的能量将细胞内的Na+泵到细胞外,而K+进入细胞,Na+-K+-ATP酶的转换率为100个分子ATP/秒,酶分子数增多,单位时间内分解的ATP增多,生成的ADP又可促进磷酸化过程。甲亢病人表现为多食、无力、喜冷怕热,基础代谢率(BMR)增高,因此也有人将甲状腺素看作是调节氧化磷酸化的重要激素。
六、氧化磷酸化的调节机体的氧化磷酸化主要受细胞对能量需求的调节
1,ATP/ADP值对氧化磷酸化的直接影响 线粒体内膜中有腺苷酸转位酶,催化线粒体内ATP与线粒体外ADP的交换,ATP分子解离后带有4个负电荷,而ADP分子解离后带有3个负电荷,由于线粒体内膜内外有跨膜电位(△ψ),内膜外侧带正电,内膜内侧带负电,所以ATP出线粒体的速度比进线粒体速度快,而ADP进线粒体速度比出线粒体速度快。Pi进入线粒体也由磷酸转位酶催化,磷酸转位酶催化OH与Pi交换,磷酸-二羧酸转位酶催化Pi2-与二羧酸(如苹果酸)交换。
当线粒体中有充足的氧和底物供应时,氧化磷酸化就会不断进行,直至ADP+Pi全部合成ATP,此时呼吸降到最低速度,若加入ADP,耗氧量会突然增高,这说明ADP控制着氧化磷酸化的速度,人们将ADP的这种作用称为呼吸受体控制。
机体消耗能量增多时,ATP分解生成ADP,ATP出线粒体增多,ADP进线粒体增多,线粒体内ATP/ADP值降低,使氧化磷酸化速度加快,ADP+Pi接受能量生成ATP。机体消耗能量少时,线粒体内ATP/ADP值增高,线粒体内ADP浓度减低就会使氧化磷酸化速度减慢。
2,ATP/ADP值的间接影响
ATP/ADP值增高时,使氧化磷酸化速度减慢,结果NADH氧化速度减慢,NADH浓度增高,从而抑制了丙酮酸脱氢酶系、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶系和柠檬酸合成酶活性,使糖的氧化分解和TCA循环的速度减慢。
3,ATP/ADP值对关键酶的直接影响
ATP/ADP值增高会抑制体内的许多关键酶,如变构抑制磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶和异柠檬酸脱氢酶,还能抑制丙酮酸脱羧酶、α-酮戊二酸脱氢酶系,通过直接反馈作用抑制糖的分解和TCA循环。
七、物质的储存和利用无论是底物水平磷酸化还是氧化磷酸化,释放的能量除一部分以热的形式散失于周围环境中之外,其余部分多直接生成ATP,以高能磷酸键的形式存在,同时,ATP也是生命活动利用能量的主要直接供给形式。
1,高能化合物人体存在多种高能化合物,但这些高能化合物的能量并不相同。体外实验中,在pH7.0,25℃条件下,每克分子ATP水解生成ADP+Pi时释放的能量为7.1千卡或30.4千焦耳,在体内,pH7.4,37℃,ATP、ADP+Pi、Mg2+均处于细胞内生理浓度的情况下,每克分子ATP水解生成ADP+Pi时释放的能量为33.5-50千焦耳或8-12千卡。磷酸烯醇式丙酮酸为-62.11千焦耳/克分子,3-二磷酸甘油酸为-49.5千焦耳/克分子,磷酸肌酸为-43.9千焦耳/克分子,乙酰CoA为-31.4千焦耳/克分子,S-腺苷蛋氨酸为-29.3千焦耳/克分子,F-6-P为-15.6千焦耳/克分子,G-6-P为-13.48千焦耳/克分子。
ATP在能量代谢中之所以重要,就是因为ATP水解时的标准自由能变化位于多种物质水解时标准自由能变化的中间,它能从具有更高能量的化合物接受高能磷酸键,如接受PEP、1,3-二磷酸甘油、磷酸肌酸分子中的~Pi生成ATP,ATP也能将~Pi转移给水解时标准自由能变化较小的化合物,如转移给葡萄糖生成G-6-P。
2,ATP能量的转移
ATP是细胞内的主要磷酸载体,ATP作为细胞的主要供能物质参与体内的许多代谢反应,还有一些反应需要UTP或CTP作供能物质,如UTP参与糖元合成和糖醛酸代谢,GTP参与糖异生和蛋白质合成,CTP参与磷脂合成过程,核酸合成中需要ATP、CTP、UTP和GTP作原料合成RNA,或以dATP、dCTP、dGTP和dTTP作原料合成DNA。
作为供能物质所需要的UTP、CTP和GTP可经下述反应再生:
UDP + ATP → UTP + ADP
GDP + ATP → GTP + ADP
CDP + ATP → CTP + ADP
dNTP由dNDP的生成过程也需要ATP供能:
dNDP + ATP → dNTP + ADP
3,磷酸肌酸
ATP是细胞内主要的磷酸载体或能量传递体,人体储存能量的方式不是ATP而是磷酸肌酸。肌酸主要存在于肌肉组织中,骨骼肌中含量多于平滑肌,脑组织中含量也较多,肝、肾等其它组织中含量很少。
磷酸肌酸的生成反应如下:
肌细胞线粒体内膜和胞液中均有催化该反应的肌酸激酶,它们是同工酶。线粒体内膜的肌酸激酶主要催化正向反应,生成的ADP可促进氧化磷酸化,生成的磷酸肌酸逸出线粒体进入胞液,磷酸肌酸所含的能量不能直接利用;胞液中的肌酸激酶主要催化逆向反应,生成的ATP可补充肌肉收缩时的能量消耗,而肌酸又回到线粒体用于磷酸肌酸的合成。肌肉中磷酸肌酸的浓度为ATP浓度的5倍,可储存肌肉几分钟收缩所急需的化学能,可见肌酸的分布与组织耗能有密切关系。
4,ATP的生成、储存和利用可用下图表示
5.电子传递和水的生成
6,葡萄糖彻底氧化生成ATP的总结算葡萄糖分解通过糖酵解和柠檬酸循环形成的ATP或GTP的分子数,根据化学计算可以得到明确的答复。但是氧化磷酸化产生的ATP分子数并不十分准确,因为质子泵、ATP的合成以及代谢物的转运过程并不需要是完整的数值甚至不需要是固定值,根据当前最新测定,H+经NADH-Q还原酶、细胞色素还原酶和细胞色素氧化酶从线粒体内膜基质泵出到膜外的细胞液侧时,一对电子泵出的质子数依次为4、2和4。合成一个ATP分子是由3个H+通过ATP合酶所驱动,多余的一个H+,可能用于将ATP从基质运往膜外细胞溶胶。因此一对电子从NADH传至02,所产生的 ATP分子数是2.5个。在细胞色素还原酶的水平进人电子传递链的电子,如琥珀酸,或细胞液中的NADH,它们的电子对只产生1.5个ATP分子。这样,当一分于葡萄糖彻底氧化为CO2和水所得到的ATP分子数和过去传统的统计数(36个ATP)少了6个ATP分子,成为30个。
八、其它氧化系统通过线粒体细胞色素系统进行氧化的体系是一切动物、植物、微生物主要氧化途径,它与ATP的生成紧密相关。除此以外,生物体内还存在一些其它氧化系统,其特点是从底物脱氢到H2O的生成是经过其它末端氧化酶完成的,与ATP的生成无关,但各自具有重要的生理功能。
生物体内主要的其它氧化系统如下:
1.多酚氧化酶系统
2.抗坏血酸氧化酶系统
3.黄素蛋白氧化酶系统
4.超氧化物歧化酶氧化系统
5.植物抗氰氧化酶系统