11 重组 DNA技术
11.1 重组 DNA技术是基因工程的核心技术
11.2 获得需要的目的基因 （ 外源基因 ）
11.3 构建重组质粒和基因克隆
11.4 转化受体细胞和转化子的筛选
11.5 转化子的分析 —— Southern杂交
? 重组 DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴
起, 并很快产生了许多生命科学的高技术产业 。
? 重组 DNA技术, 又称为基因或分子克隆技术, 是基
因工程的核心技术 。 该技术包括了一系列的分子生
物学操作步骤 。
? 所谓 基因工程 (genetic engineering)就是有意识
地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物
体中, 使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产
物 。
11.1 重组 DNA技术是基因工程的核心技术
? 重组 DNA操作一般步骤：
（ 1）获得目的基因；
（ 2）与克隆载体连接，形
成新的重组 DNA分子；
（ 3）用重组 DNA分子转化
受体细胞，并能在受体
细胞中复制和遗传；
（ 4）对转化子筛选和鉴定；
（ 5）对获得外源基因的细
胞或生物体通过培养，
获得所需的遗传性状或
表达出所需要的产物。
?获得需要的目的基因常用的方法：
（ 1） 直接从生物体中提取总 DNA,构建基因文库
(gene library),从中调用目的基因；
（ 2） 以 mRNA为模板, 反转录合成互补的 DNA片段；
（ 3） 利用聚合酶链式反应 （ PCR） 特异性地扩增所需
要的目的基因片段, 等等 。
11.2 获得需要的目的基因（外源基因）
? 细胞内总 DNA的提取分离与基因文库的构建
? 细胞内总 DNA的提取分离程序
? 紫外分光光度计测定 DNA溶液的纯度和浓度 。
? 基因文库的构建
将总 DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬
菌体载体上, 便构成了该生物的基因文库 。
? 反转录人工合成互补 DNA
? 构建基因文库获取目的
基因存在的问题 ——
费时费事
内含子序列
? 反转录人工合成互补 DNA
方法的优势 ——
获取的 DNA片段往往是具有
特定功能的目的基因
? 聚合酶链式反应 （ PCR）
? PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量
扩增（包括分离）一段目的基因的技术。
? 加入 4种物质：
（ 1） 作为模板的 DNA序列；
（ 2）与被分离的目的基因两条链 各自 5’端序列相互补的
DNA引物（ 20个左右碱基的短 DNA单链）；
（ 3） TaqDNA聚合酶；
（ 4） dNTP（ dATP,dTTP,dGTP和 dCTP）。
? 聚合酶链式反应 （ PCR）
?变性、退火、延伸
三步曲
?变性,双链 DNA解链
成为单链 DNA
?退火,部分引物与
模板的单链 DNA的特
定互补部位相配对
和结合
?延伸,以目的基因
为模板，合成互补
的新 DNA链
? 聚合酶链式反应 （ PCR）
?每一轮聚合酶链式反应可
使目的基因片段增加一倍
?30轮循环可获得 ——
230（ 1.07× 109)个基因片
段
? PCR技术的发明
? PCR的发明是 DNA操作技术的革命
? 美国 Mullis教授 开汽车时的联想
逶迤崎岖的山路 —— DNA双螺旋
行驶的汽车 —— 一小段 DNA引物
……
1988年发明了 PCR技术
1993年获得诺贝尔奖
? 基因重组和克隆操作最重要的工具是限制性内切酶,
载体和宿主菌 。
? 微量的目的基因必须经过基因克隆获得大量的拷贝
后, 才能实现进一步的重组, 转化和表达等操作 。
11.3 构建重组质粒和基因克隆
? 限制性内切酶
? 限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶,
可以识别并切开核酸序列特定位点 —— 分子手术刀
? Arber,Smith和 Nathans因为在发现限制性内切酶
方面开创性工作而共同获得了 1978年的诺贝尔奖 。
? 限制性内切酶
? 已经发现和鉴定了 200多种
? EcoRI特异识别
GAATTC及其互补
碱基组成的双链
片段
? 粘性末端
? T4连接酶
? 载体
? 载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具, 目
前最常用的载体包括细菌质粒, l噬菌体, cosmid
质粒等 。
? 质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复
制的一段环状 DNA分子 。 进入到宿主细胞中的一个
质粒可以大量增加其拷贝数 。
1,该质粒比较小, 可以插入一段较长的 DNA片段 。
2,进入宿主细菌细胞后, pUC18在每个细胞中可复制
形成大约 500个拷贝 。
3,在 pUC18中有一小段人为设计和插入的具有多种限
制性酶切位点的序列, 即多克隆位点
? 细菌质粒 pUC18
pUC118质粒的多克隆位
点整合在 lacZ基因中, 该位点如果
没有插入外源目的基因, lacZ基因
便可表达出 ?半乳糖苷酶, 如果平
板培养基中含有 IPTG和 X-gal,X-
gal便会被 ?半乳糖苷酶水解成兰
色, 大肠杆菌形成蓝色克隆 。
在多克隆位点插入外源目的基
因，破坏了 lacZ基因的结构，大肠
杆菌形成白色的克隆
4,利用 lacZ基因的插入失活筛选重组质粒
5,pUC18还携带了氨卞青霉素
抗性基因, 可 筛选重组质粒 。
? 以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆
? 将目的基因克隆到大肠杆
菌细胞中的操作步骤：
1,获得目的基因和质粒载体；
2,形成重组质粒；
3,制备感受态细胞, 用重组质粒
转化大肠杆菌细胞；
4,培养大肠杆菌, 让重组质粒及
外源目的基因形成大量拷贝；
5,筛选含重组质粒的大肠杆菌细
胞, 进行检查或鉴定 。
? 一般克隆基因的检查和鉴定方法
? 琼脂糖凝胶电泳
分离鉴定大小不
等的酶解片段：
磷酸基团带负电荷
酶解片段 向阳极移动
电场驱动力和凝胶阻力
——不同迁移率
分子量标准参照物
? 酶切和电泳方法
? 32P标记的 DNA分子探针
? 杂交
? 放射自显影法
? DNA杂交直接鉴定
? 基因克隆获得大量目的基因后, 就要使其在合适的
宿主细胞中表达, 产生需要的基因表达产物或使宿
主生物具备所需的性状, 同时目的基因还能在宿主
细胞中稳定遗传 。 这一过程就是遗传转化 。
? 若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白, 可
对转化的大肠杆菌进行培养使目的基因大量表达和
积累 。 对表达产物分离纯化便可获得想要的产品 。
? 通过 DNA体外重组技术构建的重组质粒还可以直接
用以转化蓝藻等原核生物或其他一些原生生物
11.4 转化受体细胞和转化子的筛选
? 构建缺失 chlL基因的蓝细菌突变株
? 遗传转化常用的方法
? 载体法转化 —— 农杆菌介导法
? 基因的直接转移
（ 1） 高压电脉冲电激穿孔
（ 2） 基因枪法
（ 3） 微注射法
? 纪念发明者 Edward
Southern
（ 1） 提取总 DNA
（ 2） 酶解
（ 3） 电泳
（ 4） 转移到滤膜
（ 5） 变性解链
（ 6） DNA探针及杂交
（ 7） 洗脱
（ 8） 放射自显影
（ 9） 比较分析
11.5 转化子的分析 —— Southern杂交
?Southern杂交分析示例
A,DNA体外重组实验
B,抗生素筛选转化子细胞
C,培养突变株细胞
D,Southern杂交实验结果
显示, 外源目的基因已经转
入突变株细胞中
? 1973年, 由美国斯坦福大学教授 Cohn和美国加州大学教授
Boyer带领各自的研究组几乎同时分别完成了 DNA体外重组,
一举打开了基因工程学大门 。
重组 DNA技术的一般操作步骤有,(1)获得目的基因； (2)构建重
组质粒； (3)转化受体细胞； (4)筛选和鉴定转化子； (5)培养转化细
胞获得所需性状或所需产物。
获得目的基因的方法有：提取总 DNA构建基因文库并从中调用；
以 mRNA为模板合成互补 DNA片段；利用 PCR特异性扩增所需目的基因片
段等。用紫外分光光度计测定 DNA溶液的纯度和浓度。
用限制性内切酶识别并切开核酸序列特定位点，将外源基因插入
到载体中，用重组载体转化宿主细胞，外源基因将随宿主的繁殖而复
制，这种过程称为基因的克隆。
凝胶电泳是用于分离、纯化和鉴定 DNA片段最常规的实验技术。
可依据 DNA分子的大小来使其分离。还可以利用 DNA杂交技术直接鉴定
带有重组质粒的细菌克隆。
利用载体法或基因直接转移等技术将外源目的基因转入合适的宿
主细胞中进行表达，获得所需表达产物或所需性状。用 Southern杂交
对转基因生物外源目的基因进行检测分析。
本章摘要
11.1 重组 DNA技术是基因工程的核心技术
11.2 获得需要的目的基因 （ 外源基因 ）
11.3 构建重组质粒和基因克隆
11.4 转化受体细胞和转化子的筛选
11.5 转化子的分析 —— Southern杂交
? 重组 DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴
起, 并很快产生了许多生命科学的高技术产业 。
? 重组 DNA技术, 又称为基因或分子克隆技术, 是基
因工程的核心技术 。 该技术包括了一系列的分子生
物学操作步骤 。
? 所谓 基因工程 (genetic engineering)就是有意识
地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物
体中, 使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产
物 。
11.1 重组 DNA技术是基因工程的核心技术
? 重组 DNA操作一般步骤：
（ 1）获得目的基因；
（ 2）与克隆载体连接，形
成新的重组 DNA分子；
（ 3）用重组 DNA分子转化
受体细胞，并能在受体
细胞中复制和遗传；
（ 4）对转化子筛选和鉴定；
（ 5）对获得外源基因的细
胞或生物体通过培养，
获得所需的遗传性状或
表达出所需要的产物。
?获得需要的目的基因常用的方法：
（ 1） 直接从生物体中提取总 DNA,构建基因文库
(gene library),从中调用目的基因；
（ 2） 以 mRNA为模板, 反转录合成互补的 DNA片段；
（ 3） 利用聚合酶链式反应 （ PCR） 特异性地扩增所需
要的目的基因片段, 等等 。
11.2 获得需要的目的基因（外源基因）
? 细胞内总 DNA的提取分离与基因文库的构建
? 细胞内总 DNA的提取分离程序
? 紫外分光光度计测定 DNA溶液的纯度和浓度 。
? 基因文库的构建
将总 DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬
菌体载体上, 便构成了该生物的基因文库 。
? 反转录人工合成互补 DNA
? 构建基因文库获取目的
基因存在的问题 ——
费时费事
内含子序列
? 反转录人工合成互补 DNA
方法的优势 ——
获取的 DNA片段往往是具有
特定功能的目的基因
? 聚合酶链式反应 （ PCR）
? PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量
扩增（包括分离）一段目的基因的技术。
? 加入 4种物质：
（ 1） 作为模板的 DNA序列；
（ 2）与被分离的目的基因两条链 各自 5’端序列相互补的
DNA引物（ 20个左右碱基的短 DNA单链）；
（ 3） TaqDNA聚合酶；
（ 4） dNTP（ dATP,dTTP,dGTP和 dCTP）。
? 聚合酶链式反应 （ PCR）
?变性、退火、延伸
三步曲
?变性,双链 DNA解链
成为单链 DNA
?退火,部分引物与
模板的单链 DNA的特
定互补部位相配对
和结合
?延伸,以目的基因
为模板，合成互补
的新 DNA链
? 聚合酶链式反应 （ PCR）
?每一轮聚合酶链式反应可
使目的基因片段增加一倍
?30轮循环可获得 ——
230（ 1.07× 109)个基因片
段
? PCR技术的发明
? PCR的发明是 DNA操作技术的革命
? 美国 Mullis教授 开汽车时的联想
逶迤崎岖的山路 —— DNA双螺旋
行驶的汽车 —— 一小段 DNA引物
……
1988年发明了 PCR技术
1993年获得诺贝尔奖
? 基因重组和克隆操作最重要的工具是限制性内切酶,
载体和宿主菌 。
? 微量的目的基因必须经过基因克隆获得大量的拷贝
后, 才能实现进一步的重组, 转化和表达等操作 。
11.3 构建重组质粒和基因克隆
? 限制性内切酶
? 限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶,
可以识别并切开核酸序列特定位点 —— 分子手术刀
? Arber,Smith和 Nathans因为在发现限制性内切酶
方面开创性工作而共同获得了 1978年的诺贝尔奖 。
? 限制性内切酶
? 已经发现和鉴定了 200多种
? EcoRI特异识别
GAATTC及其互补
碱基组成的双链
片段
? 粘性末端
? T4连接酶
? 载体
? 载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具, 目
前最常用的载体包括细菌质粒, l噬菌体, cosmid
质粒等 。
? 质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复
制的一段环状 DNA分子 。 进入到宿主细胞中的一个
质粒可以大量增加其拷贝数 。
1,该质粒比较小, 可以插入一段较长的 DNA片段 。
2,进入宿主细菌细胞后, pUC18在每个细胞中可复制
形成大约 500个拷贝 。
3,在 pUC18中有一小段人为设计和插入的具有多种限
制性酶切位点的序列, 即多克隆位点
? 细菌质粒 pUC18
pUC118质粒的多克隆位
点整合在 lacZ基因中, 该位点如果
没有插入外源目的基因, lacZ基因
便可表达出 ?半乳糖苷酶, 如果平
板培养基中含有 IPTG和 X-gal,X-
gal便会被 ?半乳糖苷酶水解成兰
色, 大肠杆菌形成蓝色克隆 。
在多克隆位点插入外源目的基
因，破坏了 lacZ基因的结构，大肠
杆菌形成白色的克隆
4,利用 lacZ基因的插入失活筛选重组质粒
5,pUC18还携带了氨卞青霉素
抗性基因, 可 筛选重组质粒 。
? 以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆
? 将目的基因克隆到大肠杆
菌细胞中的操作步骤：
1,获得目的基因和质粒载体；
2,形成重组质粒；
3,制备感受态细胞, 用重组质粒
转化大肠杆菌细胞；
4,培养大肠杆菌, 让重组质粒及
外源目的基因形成大量拷贝；
5,筛选含重组质粒的大肠杆菌细
胞, 进行检查或鉴定 。
? 一般克隆基因的检查和鉴定方法
? 琼脂糖凝胶电泳
分离鉴定大小不
等的酶解片段：
磷酸基团带负电荷
酶解片段 向阳极移动
电场驱动力和凝胶阻力
——不同迁移率
分子量标准参照物
? 酶切和电泳方法
? 32P标记的 DNA分子探针
? 杂交
? 放射自显影法
? DNA杂交直接鉴定
? 基因克隆获得大量目的基因后, 就要使其在合适的
宿主细胞中表达, 产生需要的基因表达产物或使宿
主生物具备所需的性状, 同时目的基因还能在宿主
细胞中稳定遗传 。 这一过程就是遗传转化 。
? 若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白, 可
对转化的大肠杆菌进行培养使目的基因大量表达和
积累 。 对表达产物分离纯化便可获得想要的产品 。
? 通过 DNA体外重组技术构建的重组质粒还可以直接
用以转化蓝藻等原核生物或其他一些原生生物
11.4 转化受体细胞和转化子的筛选
? 构建缺失 chlL基因的蓝细菌突变株
? 遗传转化常用的方法
? 载体法转化 —— 农杆菌介导法
? 基因的直接转移
（ 1） 高压电脉冲电激穿孔
（ 2） 基因枪法
（ 3） 微注射法
? 纪念发明者 Edward
Southern
（ 1） 提取总 DNA
（ 2） 酶解
（ 3） 电泳
（ 4） 转移到滤膜
（ 5） 变性解链
（ 6） DNA探针及杂交
（ 7） 洗脱
（ 8） 放射自显影
（ 9） 比较分析
11.5 转化子的分析 —— Southern杂交
?Southern杂交分析示例
A,DNA体外重组实验
B,抗生素筛选转化子细胞
C,培养突变株细胞
D,Southern杂交实验结果
显示, 外源目的基因已经转
入突变株细胞中
? 1973年, 由美国斯坦福大学教授 Cohn和美国加州大学教授
Boyer带领各自的研究组几乎同时分别完成了 DNA体外重组,
一举打开了基因工程学大门 。
重组 DNA技术的一般操作步骤有,(1)获得目的基因； (2)构建重
组质粒； (3)转化受体细胞； (4)筛选和鉴定转化子； (5)培养转化细
胞获得所需性状或所需产物。
获得目的基因的方法有：提取总 DNA构建基因文库并从中调用；
以 mRNA为模板合成互补 DNA片段；利用 PCR特异性扩增所需目的基因片
段等。用紫外分光光度计测定 DNA溶液的纯度和浓度。
用限制性内切酶识别并切开核酸序列特定位点，将外源基因插入
到载体中，用重组载体转化宿主细胞，外源基因将随宿主的繁殖而复
制，这种过程称为基因的克隆。
凝胶电泳是用于分离、纯化和鉴定 DNA片段最常规的实验技术。
可依据 DNA分子的大小来使其分离。还可以利用 DNA杂交技术直接鉴定
带有重组质粒的细菌克隆。
利用载体法或基因直接转移等技术将外源目的基因转入合适的宿
主细胞中进行表达，获得所需表达产物或所需性状。用 Southern杂交
对转基因生物外源目的基因进行检测分析。
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