1Good Morning
2
第 7章
细胞培养
3
?获得单细胞的方法
?悬浮培养
?单细胞培养
细胞培养内容包括两方面
悬浮培养
单细胞培养
促进细胞生长和生物合成
促进细胞生长和形成完整植株
4
植物组织培养探索阶段（ 1902-1929年）
Haberlandt：
观点：
首次进行离体细胞培养
高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞
小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞
5
,关于 单离植物细胞培养 实验,
?我愿意指出：在我的培养实验中，虽然经常
观察到细胞的明显生长，但从未观察到细胞分
裂。发现 单细胞培养的条件,将是未来培养试
验的 难题 。
1,取材问题－高度分化的细胞。
2,培养基问题－过于简单，没有诱导成熟细胞
分裂所必须的生长激素
6
一、单细胞的分离
?由完整的植物器官分离单细胞
?由培养组织中分离单细胞
7
1,由完整的植物器官分离单细胞
机械法
酶解法
叶片是分离单细胞的最好材料
8
1-1,机械法
Ball&Joshi (1965)、
Noggle (1967),Joshi
&Ball (1968)
研究者和时间：
研究材料,花生成熟叶片
第一种方法：用刀片刮叶片
9
具体方法
撕去下表皮
露出叶肉细胞
用解剖刀刮下细胞
10
第二种方法：叶片研碎、离心
研碎成粉加研磨介质
过滤、离心
11
只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点
很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得
成功。
12
1-2,酶解法
Takebe等（ 1968）最早报道：用果胶酶处
理可以分离大量的叶肉细胞
加果胶酶
过滤、离心
13
1-3,机械法和酶解法比较
机械法
酶解法
1,细胞不受到酶的伤害；
2,不用质壁分离；
3,细胞产量低；
4,细胞易破。
1,细胞受到酶的伤害；
2,要质壁分离；
3,细胞产量高；
4,细胞不易破。
14
2,由培养组织分离单细胞
茎段
步骤：
1 诱导产生愈伤组织；
2 愈伤组织反复继代，
使组织不断增殖，提
高愈伤组织的松散性；
15
步骤,摇床用于振荡
继代 悬浮
3（ Suspension culture)
将愈伤组织在液体培养
基中培养，建立悬浮培
养物
优点：细胞团成小
细胞团或单细胞；
在培养基中均匀分
布；有空气交流。
16
注意,大麦，小麦和玉米，很难通过酶解
法使细胞分离。（ 叶肉细胞伸长，并在许
多地方收缩，细胞间链状互锁结构 ）
17
二、悬浮培养 Suspension culture
特点
1,细胞可以不断增殖，形成高密度的细
胞群体，适于大规模培养；
2,能够提供大量较为均匀的细胞，为研
究细胞的生长、分化创造方法和条件。
必须指出
悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。
18
1、起始悬浮液的制备
愈伤组织 液体培养基 摇床振荡
悬浮培养
质地疏松，细胞分散程度大；
质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养
转速 30-150rpm
2-3cm冲程
防细胞破裂
19
20
2、悬浮培养的基本形式
分批培养
连续培养
21
2-1、分批培养 /成批培养（ Batch culture）
2.1.1 含义,将愈伤组织培养在一
定容积的 密闭容器中 进行培养。它
是进行细胞生 长和细胞分裂的生理
生化研究常用的培养方法。
但要进行下一批培养，则生长一定
时间后，需要继代转移。
22
2.1.2 特点
? 培养基体积固定
? 培养过程中，细胞生长，其数
目不断发生变化，呈 S增长。
? 必须适当搅拌
23
2.1.3 继代的方法和最佳时期
? 继代方法, 用注射器或移管吸取
一定量的含单细胞和小细胞团的悬
浮培养物，并移到含有新鲜培养基
的培养瓶里，继续进行培养。
24
继代
25
最佳继代时期,了解细胞数目增长
变化 S形曲线后，选择 对数生长期
和 直线 生长期 ！
26
2.1.4 细胞生长曲线
? 在整个培养过程中，细胞数目
不断发生变化，呈现出明显的由慢
到快，再到慢，最后增长停止的细
胞周期。细胞的生长呈 S型曲线
27培养时间
培
养
细
胞
数
目
1 2
3
4
5
S形曲线
28
细胞生长各个时期的特点：
?缓慢期
?滞后期（延迟期） 细胞很少分裂，其长短与接种量大
小和继代时原种细胞所处的生长期有关
?对数生长期 细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长
速率保持不变
?直线生长期 细胞生长和发育最明显的时期
生长逐渐缓慢：培养液消耗将尽，
有毒代谢物质增多，氧气减少
?静止期 生长几乎处于停止状态，细胞数目增加
极少，甚至开始死亡。
29
滞后期
对数生长期
直线生长期
缓慢期
静止期
培养时间
培
养
细
胞
数
目
1 2
3
4
5
1
2
3
4
5
30
讨论 ? （ 1） 滞后期的长短 主要取决于在继
代时原种培养细胞所处的 生长期 和转入 细胞数
量 的多少。
（ 2） 加入 条件培养基 可以缩短滞后期。
条件培养基,曾培养过一段时间组织或细胞的
培养基。
（ 3） 缩短 两次继代时间 间隔,则可使悬浮培
养的细胞一直保持对数生长期。
（ 4） 如果使处在 静止期 的细胞悬浮液保持时
间太长，则会引起细胞的大量 死亡和解体 。
31
操作注意事项：
对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径
要小，只能通过单细胞或小细胞团（ 2-
4细胞），使用吸管或注射器。
继代前，培养容器静置短时间，大细胞
团沉降，再吸上层悬浮液。
依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培
养物。
32
观察细胞染色体
? 在对数生长期
18 chromosomes
33
2-2,连续培养（ Continuous culture）
加入培养基
排出培养基及其培养物二者体积相等
分,开放式连续培养（ Open C.C）
封闭式连续培养（ Closed C.C）
34
开放式和封闭式区别
?封闭式中,排出液中的细胞用机械方法
收集后，又放入原培养基，所以其培养 细
胞数目不断增加 ；
?开放式中：在注入新鲜培养基的同时，
培养细胞随同培养液一起流出,培养细胞
数目保持恒定 ； 通过调节流入和流出的速
度，使培养物的生长速度永远保持接近最
高值的恒定水平上 。
35
连续培养意义：
植物细胞代谢调节的研究（某种生长限速
浓度－细胞生长的影响）；
次生物质的大量生产。
36
3、悬浮培养中细胞生长量的计算
?细胞计数
?细胞密实体积（ PCV）
5％铬酸或 0.25％果胶酶使悬浮细胞团分散
用血球计数板进行。
将体积已知、均匀分散的悬浮液放入一
个 15ml 的离心管中,2000转下离心,用
每 ml培养液中细胞总体积的 ml数表示 。
?细胞鲜重
?细胞干重
37
细胞鲜重,细胞培养物过滤，洗去培养
基，真空抽虑，称重。
细胞干重,以每毫升培养物或 106个细
胞的重量表示。
60℃ 干燥 12小时，称重。
38
4、培养细胞活力的测定
?相差显微术法
?TTC法（ 2,3,5-氯化三苯基四氮唑）
?FDA法（荧光素双醋酸酯法）
?伊凡蓝法
观察细胞质环流和细胞核存在与否,环流正
常、核存在表明有活力 ；
在 活 细胞中,TTC被还原成 红色甲鐟,提取
分光光度计检测。
活力受损的细胞能够摄取，完整的活细胞则
不能,凡染蓝色的细胞是不具有活力的细胞
互补
39
FDA法的原理
?FDA本身不具有极性, 不能发出荧光, 可以
自由出入细胞膜 。
?在 活 细胞中, FDA被酯酶 裂解, 释放出有 极
性的荧光素 。
?荧光素 不能自由穿越 质膜, 在活细胞中积累 。
?荧光素在 死细胞中不能积累 。
?在 UV照射下, 活细胞中的荧光素发出 绿色荧
光 。
40
FDA
荧光素
活细胞
死细胞
请思考
活细胞 死细胞
FDA先用丙酮配成 0.5%的母液，终浓度为 0.01%
41
三、单细胞培养（ Single cell culture）
?液体浅层培养法
?固体平板培养法
?看护培养法
?微室培养法
42
1、液体浅层培养法
将悬浮在培养液中的细胞过滤，得到游离单细
胞和小细胞团
培养在浅层液体培养基中
液体培养基
用途：主要用来增殖细胞。
43
特点：
?有利于有毒物质的扩散；
?有利于气体交换；
?不利于定点观察；
?单细胞生长、分裂后，难以得到单
细胞系。
44
2、固体平板培养法
? 2-1 含义及用途：
? 含义,是将单个细胞与融化的琼脂
培养基均匀混合后平铺一薄层在培
养皿底上的培养方法。该方法是
Bergmann(1960年 )首创。
? 用途,是为了分离单细胞无性系，
研究其生理、生化遗传上的差异而
设计的一种单细胞培养技术。广泛
应用于细胞、原生质体及融合产物
的培养。
45
Think over what the advantages and disadvantages
are for it.
2-2 特点
?可以定点观察；
?分离单细胞系比液体浅层培养容易；
?培养细胞气体交换不畅。
One of the most widely used method for single cell cultrue
固体培养基
46
2-3 平板培养的基本技术
(1)、培养基配制 1.4%琼脂基本培养基 +等
量细胞培养液 =0.7 % 琼脂条件培养基。
（ 2）悬浮细胞密度的调制
平板培养要求最初细胞密度 （ 即初始植板
密度） 为 1× 10 3~ 100× 10 3 个 /ml 。
?初始植板密度,单细胞固体平板培养时，细
胞悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度。
47
?调制方法,若悬浮液中细胞密度高，
则加培养液稀释；若悬浮液中细胞密
度过低，则通过离心使细胞沉淀后，
取一定量的上清液使其达到所要求
的密度。
?若悬浮液与培养基以 1:4混合，
则应把悬浮液的细胞密度调到
5× 10 3~ 500× 10 3 个 /ml。
48
（ 3）制平板,细胞悬浮液与融化状态（ 35
℃ ）条件培养基按一定比例均匀混合，
倒成平板，盖上培养皿盖。用封口膜封
严培养皿。
(4) 培养,26℃ 置暗处培养 21天 。 低倍显
微镜观察,记数单细胞或小细胞团，计
算 置板效率（也称植板率） 。
49
?植板效率（或植板率）,已形成细胞团
的百分数（即每 100个铺在平板上的细胞
中有多少个能长出细胞团）。
? 每个平板上形成的细胞团数
植板效率 =
该平板上接种的细胞数
50
2-4 平板培养必须注意的方面
?（ 1）选用的培养基，无论是否条件培养
基，必须是能够在低的初始植板密度下
使细胞生长。
?（ 2）不要选用处在静止期过久的细胞。
因为处在分裂旺盛时期的细胞才有最高
的植板率。
?（ 3）在固体培养基中适宜的初始植板密
度因植物种类而不同。如：烟草细胞适
宜的为 5~10 × 10 3 个 /ml,若低于此数则植
板率显著下降。
?（ 4）接种时培养基的温度要控制，一般
不超过 35 ℃ 。
51
3、看护培养法
? 3-1 看护培养的含义及用途
?含义,指用一块活跃生长的愈伤组织来
看护单个细胞，并使其生长和增殖的方
法。
?用途 ； 诱导形成单细胞系。
? Muir(1954)首先用此法培养出烟草单细
胞株。 Sharp(1972)成功将此法用于番茄
的花粉培养，诱导花粉形成单倍体细胞
系。
52
看护培养（ Nurse culture）图示：
Nurse callus
Filter paper
Single cell
单细胞无性系
恒温
培养 1
个月
2~3月
用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使
其生长和增殖。这个愈伤组织称块为 看护愈伤组织
53
3-2 看护培养基本技术
?（ 1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固
体培养基，灭菌后备用。
?（ 2）在无菌的条件下，先将一小块
（ 1cm）活跃生长的愈伤组织接种到培
养基上，再在愈伤组织块上放一片
（ 1cm2）已灭菌的滤纸，然后放置一个
晚上。
?（ 3）将分离出的单个细胞接种到培养基
的滤纸上。
?（ 4）恒温培养。
54
3-3 要求：
?（ 1）看护愈伤组织处于活跃生长状态；
?（ 2）愈伤组织和所要培养的细胞可以是同
一个物种也可以不同。
离体单细胞在直接培养技术下不分裂，看
护培养下则分裂，为什么？
Nurse callus provides nutrition and other
substances that enhances cell division.
（营养物质和促进细胞分裂物质）
55
? 3-4 特点：
?（ 1）效果好，易于成功。
?（ 2）简便易行。
?（ 3）不能在显微镜下直接观察细胞的生
长过程。
? 注意,要得到单细胞系必须保证
? 接种材料是真正的单细胞。
56
4-1 微室培养的含义及用途
?含义,即将细胞培养在很少量的培养基
中。
?用途,主要用来观察细胞生长、分裂、
形成细胞团的过程。
4、微室培养法
57
微室培养（ Microculture）图示：
1滴含单细胞培养
液
周围加石蜡油凹穴载玻片 旁边加石蜡油
盖盖玻片盖盖玻片
平视图
置培养皿中 26~28 ℃ 恒
温培养
58
4-2 微室培养特点：
在培养过程中可以连续进行显微观察，
将一个细胞的生长、分裂和形成细胞团
的全部过程记录下来。
4-3 微室培养要求：
?（ 1）微室内不能有气泡。
?（ 2）最好微室的厚度不要超过 20微米，盖
玻片 的厚度要在 0.17~0.18毫米左右。
?（ 3）观察时要保持温度和培养时的一致。
59
1、培养基成份
2、初始细胞植板密度 (>临界密度 )
四、影响单细胞培养的因子
相互依赖
植板密度较高时，与悬浮培养中或愈伤组织
中相似的培养基即可；较低时，则成份非常
复杂,可加入椰子汁，水解酪蛋白或酵母浸
出液等化学不明确物质；
?临界密度,单细胞培养时，初始植板密度低
于某值培养细胞就不能进行分裂和发育成细胞
团，则该值就是临界密度。
?初始植板密度应根据培养基的营养状况而改
变，培养基越复杂则植板细胞的临界密度越低，
反之则相反。一般要求每毫升在 1000个细胞以
60
3、生长激素
加 1种 细胞分裂素 和几种氨基酸。 临界密度
只需 25-30细胞 /毫升。
? 4,pH
? 5,CO2
61
五、细胞培养的应用
1、选择突变体
Question
诱变处理的单倍体体细胞在
基本培养基中培养 96小时,
有营养缺陷的细胞不能继续
生长, 只有野生型细胞生长
旺盛 。 此时把 BUdR加入培养
基, 暗培养 36hr,BUdR只
能与活跃生长的细胞中的
DNA结合, 并使与其结合的
DNA获得光敏特性, 因此当
把培养物再转到光下时, 引
起在基本培养基上生长的那
些细胞 DNA严重损伤, 突变
细胞不结合 BUdR。 将两种细
胞转入完全培养基, 只有?
细胞 才能繁殖, 再经过二倍
化处理, 可得到纯合二倍体
突变系 。
哪种细胞是
突变细胞？
62
Production of anthocyanin
2、生产天然的植物成分
悬浮培养物的某些次生化合物含量有的比植物
体高出 2-5倍。
3、生物转化
细胞培养物给细胞提供一般情况下植物所不具
备的底物化合物；
提供植物天然产物的中间体，以期提高天然化
合物产量。
4、诱导多倍性
63
分离篱天剑叶肉细胞的机械方法
叶片消毒
匀浆
过滤
离心
植板
75％酒精，
7％次氯酸钠
10ml培养基
1.5克 1cm2叶片
低速，去碎屑，
游离细胞沉降
64
分离此叶肉细胞的酶解法
叶片消毒
无菌水冲洗，去下表皮
4 cm见方小块
2克叶片,20 ml
灭过菌的酶溶液
真空泵，去酶
25℃,摇
动 2小时
每 30分钟换
酶液，共 4次 培养基洗细胞 2次，进行培养
65
思考题：
1.如何得到单离细胞？
2.细胞培养有哪些方法？
3.如何测定培养细胞的活力？
4.如何计量培养细胞的数目？
5.FDA测活力的原理是什么？
6.如何获得同步化的培养细胞？
7.影响单细胞培养因素？
2
第 7章
细胞培养
3
?获得单细胞的方法
?悬浮培养
?单细胞培养
细胞培养内容包括两方面
悬浮培养
单细胞培养
促进细胞生长和生物合成
促进细胞生长和形成完整植株
4
植物组织培养探索阶段（ 1902-1929年）
Haberlandt：
观点：
首次进行离体细胞培养
高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞
小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞
5
,关于 单离植物细胞培养 实验,
?我愿意指出：在我的培养实验中，虽然经常
观察到细胞的明显生长，但从未观察到细胞分
裂。发现 单细胞培养的条件,将是未来培养试
验的 难题 。
1,取材问题－高度分化的细胞。
2,培养基问题－过于简单，没有诱导成熟细胞
分裂所必须的生长激素
6
一、单细胞的分离
?由完整的植物器官分离单细胞
?由培养组织中分离单细胞
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1,由完整的植物器官分离单细胞
机械法
酶解法
叶片是分离单细胞的最好材料
8
1-1,机械法
Ball&Joshi (1965)、
Noggle (1967),Joshi
&Ball (1968)
研究者和时间：
研究材料,花生成熟叶片
第一种方法：用刀片刮叶片
9
具体方法
撕去下表皮
露出叶肉细胞
用解剖刀刮下细胞
10
第二种方法：叶片研碎、离心
研碎成粉加研磨介质
过滤、离心
11
只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点
很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得
成功。
12
1-2,酶解法
Takebe等（ 1968）最早报道：用果胶酶处
理可以分离大量的叶肉细胞
加果胶酶
过滤、离心
13
1-3,机械法和酶解法比较
机械法
酶解法
1,细胞不受到酶的伤害；
2,不用质壁分离；
3,细胞产量低；
4,细胞易破。
1,细胞受到酶的伤害；
2,要质壁分离；
3,细胞产量高；
4,细胞不易破。
14
2,由培养组织分离单细胞
茎段
步骤：
1 诱导产生愈伤组织；
2 愈伤组织反复继代，
使组织不断增殖，提
高愈伤组织的松散性；
15
步骤,摇床用于振荡
继代 悬浮
3（ Suspension culture)
将愈伤组织在液体培养
基中培养，建立悬浮培
养物
优点：细胞团成小
细胞团或单细胞；
在培养基中均匀分
布；有空气交流。
16
注意,大麦，小麦和玉米，很难通过酶解
法使细胞分离。（ 叶肉细胞伸长，并在许
多地方收缩，细胞间链状互锁结构 ）
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二、悬浮培养 Suspension culture
特点
1,细胞可以不断增殖，形成高密度的细
胞群体，适于大规模培养；
2,能够提供大量较为均匀的细胞，为研
究细胞的生长、分化创造方法和条件。
必须指出
悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。
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1、起始悬浮液的制备
愈伤组织 液体培养基 摇床振荡
悬浮培养
质地疏松，细胞分散程度大；
质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养
转速 30-150rpm
2-3cm冲程
防细胞破裂
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20
2、悬浮培养的基本形式
分批培养
连续培养
21
2-1、分批培养 /成批培养（ Batch culture）
2.1.1 含义,将愈伤组织培养在一
定容积的 密闭容器中 进行培养。它
是进行细胞生 长和细胞分裂的生理
生化研究常用的培养方法。
但要进行下一批培养，则生长一定
时间后，需要继代转移。
22
2.1.2 特点
? 培养基体积固定
? 培养过程中，细胞生长，其数
目不断发生变化，呈 S增长。
? 必须适当搅拌
23
2.1.3 继代的方法和最佳时期
? 继代方法, 用注射器或移管吸取
一定量的含单细胞和小细胞团的悬
浮培养物，并移到含有新鲜培养基
的培养瓶里，继续进行培养。
24
继代
25
最佳继代时期,了解细胞数目增长
变化 S形曲线后，选择 对数生长期
和 直线 生长期 ！
26
2.1.4 细胞生长曲线
? 在整个培养过程中，细胞数目
不断发生变化，呈现出明显的由慢
到快，再到慢，最后增长停止的细
胞周期。细胞的生长呈 S型曲线
27培养时间
培
养
细
胞
数
目
1 2
3
4
5
S形曲线
28
细胞生长各个时期的特点：
?缓慢期
?滞后期（延迟期） 细胞很少分裂，其长短与接种量大
小和继代时原种细胞所处的生长期有关
?对数生长期 细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长
速率保持不变
?直线生长期 细胞生长和发育最明显的时期
生长逐渐缓慢：培养液消耗将尽，
有毒代谢物质增多，氧气减少
?静止期 生长几乎处于停止状态，细胞数目增加
极少，甚至开始死亡。
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滞后期
对数生长期
直线生长期
缓慢期
静止期
培养时间
培
养
细
胞
数
目
1 2
3
4
5
1
2
3
4
5
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讨论 ? （ 1） 滞后期的长短 主要取决于在继
代时原种培养细胞所处的 生长期 和转入 细胞数
量 的多少。
（ 2） 加入 条件培养基 可以缩短滞后期。
条件培养基,曾培养过一段时间组织或细胞的
培养基。
（ 3） 缩短 两次继代时间 间隔,则可使悬浮培
养的细胞一直保持对数生长期。
（ 4） 如果使处在 静止期 的细胞悬浮液保持时
间太长，则会引起细胞的大量 死亡和解体 。
31
操作注意事项：
对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径
要小，只能通过单细胞或小细胞团（ 2-
4细胞），使用吸管或注射器。
继代前，培养容器静置短时间，大细胞
团沉降，再吸上层悬浮液。
依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培
养物。
32
观察细胞染色体
? 在对数生长期
18 chromosomes
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2-2,连续培养（ Continuous culture）
加入培养基
排出培养基及其培养物二者体积相等
分,开放式连续培养（ Open C.C）
封闭式连续培养（ Closed C.C）
34
开放式和封闭式区别
?封闭式中,排出液中的细胞用机械方法
收集后，又放入原培养基，所以其培养 细
胞数目不断增加 ；
?开放式中：在注入新鲜培养基的同时，
培养细胞随同培养液一起流出,培养细胞
数目保持恒定 ； 通过调节流入和流出的速
度，使培养物的生长速度永远保持接近最
高值的恒定水平上 。
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连续培养意义：
植物细胞代谢调节的研究（某种生长限速
浓度－细胞生长的影响）；
次生物质的大量生产。
36
3、悬浮培养中细胞生长量的计算
?细胞计数
?细胞密实体积（ PCV）
5％铬酸或 0.25％果胶酶使悬浮细胞团分散
用血球计数板进行。
将体积已知、均匀分散的悬浮液放入一
个 15ml 的离心管中,2000转下离心,用
每 ml培养液中细胞总体积的 ml数表示 。
?细胞鲜重
?细胞干重
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细胞鲜重,细胞培养物过滤，洗去培养
基，真空抽虑，称重。
细胞干重,以每毫升培养物或 106个细
胞的重量表示。
60℃ 干燥 12小时，称重。
38
4、培养细胞活力的测定
?相差显微术法
?TTC法（ 2,3,5-氯化三苯基四氮唑）
?FDA法（荧光素双醋酸酯法）
?伊凡蓝法
观察细胞质环流和细胞核存在与否,环流正
常、核存在表明有活力 ；
在 活 细胞中,TTC被还原成 红色甲鐟,提取
分光光度计检测。
活力受损的细胞能够摄取，完整的活细胞则
不能,凡染蓝色的细胞是不具有活力的细胞
互补
39
FDA法的原理
?FDA本身不具有极性, 不能发出荧光, 可以
自由出入细胞膜 。
?在 活 细胞中, FDA被酯酶 裂解, 释放出有 极
性的荧光素 。
?荧光素 不能自由穿越 质膜, 在活细胞中积累 。
?荧光素在 死细胞中不能积累 。
?在 UV照射下, 活细胞中的荧光素发出 绿色荧
光 。
40
FDA
荧光素
活细胞
死细胞
请思考
活细胞 死细胞
FDA先用丙酮配成 0.5%的母液，终浓度为 0.01%
41
三、单细胞培养（ Single cell culture）
?液体浅层培养法
?固体平板培养法
?看护培养法
?微室培养法
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1、液体浅层培养法
将悬浮在培养液中的细胞过滤，得到游离单细
胞和小细胞团
培养在浅层液体培养基中
液体培养基
用途：主要用来增殖细胞。
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特点：
?有利于有毒物质的扩散；
?有利于气体交换；
?不利于定点观察；
?单细胞生长、分裂后，难以得到单
细胞系。
44
2、固体平板培养法
? 2-1 含义及用途：
? 含义,是将单个细胞与融化的琼脂
培养基均匀混合后平铺一薄层在培
养皿底上的培养方法。该方法是
Bergmann(1960年 )首创。
? 用途,是为了分离单细胞无性系，
研究其生理、生化遗传上的差异而
设计的一种单细胞培养技术。广泛
应用于细胞、原生质体及融合产物
的培养。
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Think over what the advantages and disadvantages
are for it.
2-2 特点
?可以定点观察；
?分离单细胞系比液体浅层培养容易；
?培养细胞气体交换不畅。
One of the most widely used method for single cell cultrue
固体培养基
46
2-3 平板培养的基本技术
(1)、培养基配制 1.4%琼脂基本培养基 +等
量细胞培养液 =0.7 % 琼脂条件培养基。
（ 2）悬浮细胞密度的调制
平板培养要求最初细胞密度 （ 即初始植板
密度） 为 1× 10 3~ 100× 10 3 个 /ml 。
?初始植板密度,单细胞固体平板培养时，细
胞悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度。
47
?调制方法,若悬浮液中细胞密度高，
则加培养液稀释；若悬浮液中细胞密
度过低，则通过离心使细胞沉淀后，
取一定量的上清液使其达到所要求
的密度。
?若悬浮液与培养基以 1:4混合，
则应把悬浮液的细胞密度调到
5× 10 3~ 500× 10 3 个 /ml。
48
（ 3）制平板,细胞悬浮液与融化状态（ 35
℃ ）条件培养基按一定比例均匀混合，
倒成平板，盖上培养皿盖。用封口膜封
严培养皿。
(4) 培养,26℃ 置暗处培养 21天 。 低倍显
微镜观察,记数单细胞或小细胞团，计
算 置板效率（也称植板率） 。
49
?植板效率（或植板率）,已形成细胞团
的百分数（即每 100个铺在平板上的细胞
中有多少个能长出细胞团）。
? 每个平板上形成的细胞团数
植板效率 =
该平板上接种的细胞数
50
2-4 平板培养必须注意的方面
?（ 1）选用的培养基，无论是否条件培养
基，必须是能够在低的初始植板密度下
使细胞生长。
?（ 2）不要选用处在静止期过久的细胞。
因为处在分裂旺盛时期的细胞才有最高
的植板率。
?（ 3）在固体培养基中适宜的初始植板密
度因植物种类而不同。如：烟草细胞适
宜的为 5~10 × 10 3 个 /ml,若低于此数则植
板率显著下降。
?（ 4）接种时培养基的温度要控制，一般
不超过 35 ℃ 。
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3、看护培养法
? 3-1 看护培养的含义及用途
?含义,指用一块活跃生长的愈伤组织来
看护单个细胞，并使其生长和增殖的方
法。
?用途 ； 诱导形成单细胞系。
? Muir(1954)首先用此法培养出烟草单细
胞株。 Sharp(1972)成功将此法用于番茄
的花粉培养，诱导花粉形成单倍体细胞
系。
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看护培养（ Nurse culture）图示：
Nurse callus
Filter paper
Single cell
单细胞无性系
恒温
培养 1
个月
2~3月
用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使
其生长和增殖。这个愈伤组织称块为 看护愈伤组织
53
3-2 看护培养基本技术
?（ 1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固
体培养基，灭菌后备用。
?（ 2）在无菌的条件下，先将一小块
（ 1cm）活跃生长的愈伤组织接种到培
养基上，再在愈伤组织块上放一片
（ 1cm2）已灭菌的滤纸，然后放置一个
晚上。
?（ 3）将分离出的单个细胞接种到培养基
的滤纸上。
?（ 4）恒温培养。
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3-3 要求：
?（ 1）看护愈伤组织处于活跃生长状态；
?（ 2）愈伤组织和所要培养的细胞可以是同
一个物种也可以不同。
离体单细胞在直接培养技术下不分裂，看
护培养下则分裂，为什么？
Nurse callus provides nutrition and other
substances that enhances cell division.
（营养物质和促进细胞分裂物质）
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? 3-4 特点：
?（ 1）效果好，易于成功。
?（ 2）简便易行。
?（ 3）不能在显微镜下直接观察细胞的生
长过程。
? 注意,要得到单细胞系必须保证
? 接种材料是真正的单细胞。
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4-1 微室培养的含义及用途
?含义,即将细胞培养在很少量的培养基
中。
?用途,主要用来观察细胞生长、分裂、
形成细胞团的过程。
4、微室培养法
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微室培养（ Microculture）图示：
1滴含单细胞培养
液
周围加石蜡油凹穴载玻片 旁边加石蜡油
盖盖玻片盖盖玻片
平视图
置培养皿中 26~28 ℃ 恒
温培养
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4-2 微室培养特点：
在培养过程中可以连续进行显微观察，
将一个细胞的生长、分裂和形成细胞团
的全部过程记录下来。
4-3 微室培养要求：
?（ 1）微室内不能有气泡。
?（ 2）最好微室的厚度不要超过 20微米，盖
玻片 的厚度要在 0.17~0.18毫米左右。
?（ 3）观察时要保持温度和培养时的一致。
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1、培养基成份
2、初始细胞植板密度 (>临界密度 )
四、影响单细胞培养的因子
相互依赖
植板密度较高时，与悬浮培养中或愈伤组织
中相似的培养基即可；较低时，则成份非常
复杂,可加入椰子汁，水解酪蛋白或酵母浸
出液等化学不明确物质；
?临界密度,单细胞培养时，初始植板密度低
于某值培养细胞就不能进行分裂和发育成细胞
团，则该值就是临界密度。
?初始植板密度应根据培养基的营养状况而改
变，培养基越复杂则植板细胞的临界密度越低，
反之则相反。一般要求每毫升在 1000个细胞以
60
3、生长激素
加 1种 细胞分裂素 和几种氨基酸。 临界密度
只需 25-30细胞 /毫升。
? 4,pH
? 5,CO2
61
五、细胞培养的应用
1、选择突变体
Question
诱变处理的单倍体体细胞在
基本培养基中培养 96小时,
有营养缺陷的细胞不能继续
生长, 只有野生型细胞生长
旺盛 。 此时把 BUdR加入培养
基, 暗培养 36hr,BUdR只
能与活跃生长的细胞中的
DNA结合, 并使与其结合的
DNA获得光敏特性, 因此当
把培养物再转到光下时, 引
起在基本培养基上生长的那
些细胞 DNA严重损伤, 突变
细胞不结合 BUdR。 将两种细
胞转入完全培养基, 只有?
细胞 才能繁殖, 再经过二倍
化处理, 可得到纯合二倍体
突变系 。
哪种细胞是
突变细胞？
62
Production of anthocyanin
2、生产天然的植物成分
悬浮培养物的某些次生化合物含量有的比植物
体高出 2-5倍。
3、生物转化
细胞培养物给细胞提供一般情况下植物所不具
备的底物化合物；
提供植物天然产物的中间体，以期提高天然化
合物产量。
4、诱导多倍性
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分离篱天剑叶肉细胞的机械方法
叶片消毒
匀浆
过滤
离心
植板
75％酒精，
7％次氯酸钠
10ml培养基
1.5克 1cm2叶片
低速，去碎屑，
游离细胞沉降
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分离此叶肉细胞的酶解法
叶片消毒
无菌水冲洗，去下表皮
4 cm见方小块
2克叶片,20 ml
灭过菌的酶溶液
真空泵，去酶
25℃,摇
动 2小时
每 30分钟换
酶液，共 4次 培养基洗细胞 2次，进行培养
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思考题：
1.如何得到单离细胞？
2.细胞培养有哪些方法？
3.如何测定培养细胞的活力？
4.如何计量培养细胞的数目？
5.FDA测活力的原理是什么？
6.如何获得同步化的培养细胞？
7.影响单细胞培养因素？
