第四章 微生物农药微生物农药是利用微生物及其基因表达的生物活性成分，制备出防治植物病虫害、环卫害虫、杂草、鼠害，以及调节植物生长的制剂的总称。
随着生物防治的推广应用，微生物农药的研究与生产逐渐成为生物防治的支柱产业。
一,微生物防治基本原理与方法——1、利用天然发生的昆虫疾病；2、把某种病原引进昆虫种群，作为一种长久控制因子；3、加工成微生物杀虫剂二,昆虫疾病与昆虫流行病昆虫疾病：昆虫的行动、行为、取食、蜕皮、交尾、产卵、孵化等偏离了健康状态，就是罹病的状态。
原因：物理、化学因素
生物因素：病原微生物、寄生性与捕食性昆虫、遗传因素及营养因素等。
病原微生物——引起昆虫致病的病原微生物主要有真菌、细菌、病毒、线虫（属多细胞动物）、立克次氏体和原生动物（微孢子虫）。
全部昆虫种类，至少要遭受一个微生物类群的侵袭，许多昆虫种类受到几个微生物类群的感染，并出现相应的病症和症状。
自然界，昆虫出生后未达性成熟而死亡的达80%至99.8%之间。
病症（sign）：指结构上的变化，如解剖系统的形态和结构异常，虫体颜色的变化、附器、体壁或体躯构造的畸形。
症状（symptom）：表示行为和机能的异常，如行动失常、对刺激反应不正常，发育受阻，消化障碍，不能产卵，呼吸与心律不整及早期死亡等。
传染病的感染：
病原体可由病虫通过各种途径传入健虫，从而导致传染病的发生与蔓延。
病原体传染的途径,1、接触传染,真菌孢子；2、伤口传染：机械损伤、相互残食、天敌叮咬；3、食入传染：取食；4、胚胎传染：病原体侵入生殖系统三、昆虫感染病的建立害虫微生物防治涉及生物学（微生物学）、昆虫病理学、昆虫生理学等方面的知识。主要是从病理学的角度研究感染病的建立，致病机理及病原微生物的生物学特征及其在害虫防治的应用。
昆虫疾病的建立必须有病原微生物、寄主以及适宜的环境条件。从三个因素来分析,1、病原生物对昆虫寄主的侵染和致病； 2、昆虫对病原物的防御和抵抗； 3、染病和致病的环境条件病原对昆虫的侵染和致病感染,包括病原侵入寄主体腔，并在体腔 中存留和稳定下来两个方面。但感染不一定都能发病，这一过程叫侵染期。病原体侵入寄主后直到发病，即出现疾病症状的期间叫潜伏期。此后各种疾病症状（病症）逐渐表现出来为病变期。
感染病建立的结果大都导致寄主昆虫的死亡。
昆虫疾病症状类型：（1）发育不良：虫体萎缩，发育迟缓；（2）行动异常,感病早期昆虫焦躁不安，后期呆滞，对刺激反应不敏感，处于昏睡状态；（3）体色变化：①由于病原体的存在而造成感病昆虫体色变化，如金龟子乳状病菌大量充满孢子的孢子囊使虫体呈乳白色；真菌的分生孢子常常有鲜艳的颜色，使虫体表行为白僵病、黄僵病、绿僵病等。②微生物产生的色素，如粘质沙氏杆菌，产生红色色素而使虫尸变为红色。③昆虫防御系统的黑素化反应，在真菌的侵入部位形成黑斑。⑷消化异常：食欲减退或拒绝进食；⑸组织及细胞病变：虫酶菌首先破坏昆虫的脂肪体使脂肪细胞干 枯变性而被分解；NPV感染的细胞核异常肥大；CPV使昆虫中肠肿胀，多角体形成于细胞质中；⑹其他,生殖紊乱；体液变化…
侵染途径,1、经消化道侵入,中肠是防御系统的薄弱环节，多种病原微生物（细菌、病毒、原生动物、立克次体和一些线虫）从中肠侵入。2、自体壁侵入,真菌以分生孢子附着在昆虫体表，吸水后萌发出芽管侵入体内。表皮薄的昆虫体表的那一部分都能侵入，体表厚的只能从节间膜侵入。
3、经卵传入:,垂直传递” 。许多病毒经卵传递。经卵传递有两种方式：病毒经过卵的内部传递给子代，称为胚种传递；病毒附着在卵的表面，孵化后幼虫吞食卵壳而感染，成为卵表传递。
致病机理——1、对寄主呼吸的影响——引起寄主生理饥饿，感病个体耗氧量增加。2、病原物质代谢对寄主的影响——大量增殖的病原体对组织器官的破坏和堵塞；3、毒素的作用——酶或酶的抑制剂。
昆虫对病原生物的抵抗：1、体壁防御——体壁的屏障作用及低级脂肪酸的抗菌作用；2、消化道防御——消化道的屏障作用及消化液的抗菌抗病毒物质；3、血腔内的防御——①细胞性防御,血细胞（浆细胞、颗粒细胞）的吞噬作用和被囊化；②液性成分的防御——A、溶菌酶、酚氧化酶系统；B、抗菌物质和细胞凝聚性蛋白（外源凝聚素）等获得性防御环境条件对感染的影响——1、对昆虫感受疾病的影响（温度、湿度）；2、对病原物致病的影响（温度、日光、湿度）；3、对昆虫疾病的影响四、昆虫病原细菌的利用应具备的特点：①毒力强且能形成芽孢；②生长快，营养简单，易于培养；③发病期短，使用安全；④使用范围较广昆虫细菌病的特点——昆虫感病后不大活动，食欲减退，口腔与肛门常有排泄物。病原菌侵入体腔后引起败血症，死后虫体颜色加深，迅速变成褐色或黑色。有点虫体软化腐烂，内部组织常溃烂成粘着状，死虫一般都有臭味。因此，昆虫细菌病一般统称软化病应用与研究的杀虫细菌：苏云金芽孢杆菌、乳状病芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌,粘质赛氏杆菌五、苏云金芽孢杆菌
1、形态特征
周鞭(无鞭)、G+、杆状、产芽孢与晶体、H抗原、O抗原
芽孢,不易着色，石碳酸复红、孔雀绿可染色； 芽孢高抗逆，菌株保存方式
晶体：晶体典型为菱形、也有圆形、方形、椭圆形、不规则形，1个（几个)毒素、无毒
生长：芽孢与晶体形成(录像1，2，3 ）
2、作用机理
晶体在害虫碱性中肠内融解，并在昆虫酶的作用下分解成有毒的成分δ－内毒素（δ－Endotoxin ），与中肠上皮细胞特异受体结合，引起膜穿孔，毒素与芽孢进入血淋巴组织，使害虫因饥饿和出现败血症而死亡。
Bt晶体毒素引发昆虫疾病的过程——0阶段：0-30min，幼虫活动正常，但停止取食。血淋巴pH和K+浓度上升。中肠上皮不出现明显的组织病理变化。Ⅰ阶段：30-120min，幼虫运动缓慢，足部偶尔发生痉挛，心跳渐渐变慢，中肠停止蠕动。此阶段末幼虫呕吐和腹泻。中肠前端1/3处的柱状细胞发生早期病变，血淋巴pH和K+浓度继续上升。Ⅱ阶段：2-3h，幼虫受到机械刺激时，不能自主运动，中肠前端病变细胞达到整个中肠的20-30%，柱状细胞膨胀向肠腔突出，杯状细胞的杯状腔变大。血淋巴的K+浓度仍在上升。Ⅲ阶段：3-4h，幼虫无反射运动，心跳完全停止。12-24h后，虫体皮肤出现许多斑点，上皮细胞的病变已占40%左右。柱状和杯状细胞极度空泡化。血液中的K+浓度几乎达到正常肠液K+浓度的一半。 最后幼虫死亡，临时时虫体伸展，不久发黑，并呈腐烂状
3、生物活性物质应用范围,(1) 蔬菜(2) 棉花 (3) 水 (4) 玉米、高梁、小麦 (5) 果树、茶叶、花卉 (6) 烟草和油料害虫 (7) 森林害虫 (8) 仓贮害虫 (9) 卫生昆虫
4、生理生化:
碳 源,淀粉、糊精、麦芽糖、葡萄糖 ； N 源,牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、花生饼粉、豆饼粉、鱼粉、玉米浆； 无机盐,K2HPO4、MgSO4、CaCO3。主要元素有磷、硫、镁、钾、钠、钙，微量元素锰、锌、硅、铁，所需甚微，水杂质即可满足，多了有毒。 温 度,10-40℃，28-32℃适。pH：微碱性条件 氧,好氧 抗生素及化学物,放线菌素D、氯霉素、红霉素。
5、应用
Bt制剂构建工程菌（生物囊制剂、Bt蓝藻、转Bt枯草杆菌及其它高效、广谱工程菌）
转Bt抗虫作物植物抗虫基因的显著优点——1、育种期限短，目的性强；2、连续性保护，任何时期作用，避免反复多次；3、喷洒农药，不受气候影响和环境干扰；4、仅对取食转基因作物的那些害虫才有效；5、对非靶生物没有影响；6、抗虫物质只存在于植物体内，在土壤和地下水中无残留，不存在环境问题。7、能保护那些难以喷洒到的植物部位如根部与发展新型杀虫剂相比，投资较少。
已成功转化的Bt植物
1.烟草——繁殖系数高、双子叶植物；第一种Bt工程植物
2.棉花——美国（Monsanto）。多种单价、双价基因：豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)、大豆胰蛋白酶抑制剂、慈菇蛋白酶抑制剂、水稻胱氨酸蛋白酶抑制剂、豌豆外源凝集素等；中国是继美国之后第二个具有抗虫转基因棉花的国家
3.水稻——中国第一
4.玉米——YieldGard
5个策略:抗性检测；基因的高表达量；改造基因； 提供昆虫庇护地；害虫综合治理。
5.番茄和马铃薯 6.蔬菜 7.杨树等
8.甘蔗——美国农业部、夏威夷农业研究中心和Monsanto公司合作工程菌研究出发菌杀虫谱不广、毒力效价不高细胞融合、基因重组
●杀虫假单孢工程菌的构建
Bt菌在土壤中不稳定，难防治土壤害虫; 寿命短，需重复使用荧光假单孢菌(P,fluorescens)是植物根围和土壤中常见的有益细菌，对环境适应性强、同植物亲和性好、对人畜安全，不少菌株还防病增产。
美国孟山都公司：HD-1 ICP基因整合到玉米根际菌上美国的Mycogen公司：CellCap,较长的持效期、防止紫外线对ICP的破坏。M-Trak和M-peril
中国农科院植保所：荧光假单孢菌P303，防治禾谷类全蚀病。
美国威斯康辛大学：整合到植物根部和叶部的定居菌洋葱假单孢菌(P,cepacia)
●以蓝细菌等构建Bt杀蚊工程菌蚊子：疟疾、黄热病、登革热和丝虫病等疾病传播媒介，
幼虫以微生物水藻和细菌为食蓝细菌(Cyanobacterium)：一种生活在水体表面，对营养要求不高，容易为蚊子幼虫摄食的光能细菌。一些种能适应淡水和盐水环境，对温度耐性亦较宽。它们容易用染色体或质粒转化。
两大难题需予克服:一是有效性，二为安全性
●以枯草杆菌和其它芽孢菌构建的工程菌
不同亚种ICP基因克隆以构建高效广谱的杀虫工程菌
杀虫、抗病、除草、增产、固氮
有待解决的问题—— 重组菌的基因表达量、能否产生足够的ICP；工程菌的中试及生产工艺； 安全性和持效性评价
6、Bt发展历史
7、Bt研究——1、基因鉴定（cry/chi/vip/aii/ihnA/cyt) 2、克隆、表达3、构建工程菌（细胞工程、基因工程）4、转基因植物
Bt基因的表达和修饰原核生物基因表达调控系统具有原核生物特性，真核生物不能识别和运用这套表达调控系统
Bt毒蛋白基因在转基因植物中的表达与其长度有关； mRNA不稳定和翻译效率低基因修饰——置换核苷酸残基广泛修饰：66.6％密码子第三位的A或T碱基被G或C取代密码子偏爱(codon preference)
高等植物有38个偏爱的单子叶植物密码子，它们大多数第三位密码子为G或C,有44个偏爱的双子叶植物密码子，其中第三位为A或T。
Btδ-内毒素基因中A+T的平均含量为64％，单子叶植物和双子叶植物中则分别为44％和55％。
碱基组成的差异可能引起基因转录后异常加工大部分δ-内毒素偏爱的氨基酸密码子往往是植物最不喜爱的密码子，尤其是在GC含量极高的单子叶植物如玉米。因此，Btδ-内毒素基因中密码子用法的改造会导致单子叶植物和双子叶植物上异源基因表达的增强。
面临问题——工程植物的安全性、基因的表达量、基因的定位表达、昆虫的抗性
研究机构：
美国：Ecogen公司：9000株 农业部Brownsville Lab，HD-X系列 Ohio州立大学，大量突变株。
法国：巴斯德研究所（WHO昆虫病原细菌参考中心）3500株英国：温室作物研究所H.Burges博士HB-X系列日本：九州大学Aizawa和Ohha博士、北海道大学 IIZUKA教授国内：华中农大、中国林业科学院、湖北农科院,中科院武汉病毒所、南开大学、福建农大
8、Bt生产
（1）、概况
（2）产品标准化芽孢生物测定：初孵家蚕、菜青虫、棉铃虫、小菜蛾蛋白晶体
（3）安全性问题
（4）剂型—— (1) 液剂,普遍、方便。有水剂、乳剂、油剂。(2) 可湿性粉剂,主产品，保存、包装、运输方便⑶胶囊剂,防止阳光、高温、干燥对芽孢和晶体的破坏，又使毒性成分逐渐释放，保护剂可防止紫外辐射的伤害
（5）我国Bt生产现状
有机食品论证：Bt已通过，阿维菌素不行
Bt复配 ——①北（7）、福建（6）为主；②要和阿维（35个产品），也有和病毒（菜青虫、斜纹夜蛾等）以及化学（杀虫丹最多，吡虫啉等）复配质量标准化
问题,1、厂家多、规模小、质量难保证：2、种剂型单一：3、水平相对落后，后处理简单：4、质检5、提纯
随着生物防治的推广应用，微生物农药的研究与生产逐渐成为生物防治的支柱产业。
一,微生物防治基本原理与方法——1、利用天然发生的昆虫疾病；2、把某种病原引进昆虫种群，作为一种长久控制因子；3、加工成微生物杀虫剂二,昆虫疾病与昆虫流行病昆虫疾病：昆虫的行动、行为、取食、蜕皮、交尾、产卵、孵化等偏离了健康状态，就是罹病的状态。
原因：物理、化学因素
生物因素：病原微生物、寄生性与捕食性昆虫、遗传因素及营养因素等。
病原微生物——引起昆虫致病的病原微生物主要有真菌、细菌、病毒、线虫（属多细胞动物）、立克次氏体和原生动物（微孢子虫）。
全部昆虫种类，至少要遭受一个微生物类群的侵袭，许多昆虫种类受到几个微生物类群的感染，并出现相应的病症和症状。
自然界，昆虫出生后未达性成熟而死亡的达80%至99.8%之间。
病症（sign）：指结构上的变化，如解剖系统的形态和结构异常，虫体颜色的变化、附器、体壁或体躯构造的畸形。
症状（symptom）：表示行为和机能的异常，如行动失常、对刺激反应不正常，发育受阻，消化障碍，不能产卵，呼吸与心律不整及早期死亡等。
传染病的感染：
病原体可由病虫通过各种途径传入健虫，从而导致传染病的发生与蔓延。
病原体传染的途径,1、接触传染,真菌孢子；2、伤口传染：机械损伤、相互残食、天敌叮咬；3、食入传染：取食；4、胚胎传染：病原体侵入生殖系统三、昆虫感染病的建立害虫微生物防治涉及生物学（微生物学）、昆虫病理学、昆虫生理学等方面的知识。主要是从病理学的角度研究感染病的建立，致病机理及病原微生物的生物学特征及其在害虫防治的应用。
昆虫疾病的建立必须有病原微生物、寄主以及适宜的环境条件。从三个因素来分析,1、病原生物对昆虫寄主的侵染和致病； 2、昆虫对病原物的防御和抵抗； 3、染病和致病的环境条件病原对昆虫的侵染和致病感染,包括病原侵入寄主体腔，并在体腔 中存留和稳定下来两个方面。但感染不一定都能发病，这一过程叫侵染期。病原体侵入寄主后直到发病，即出现疾病症状的期间叫潜伏期。此后各种疾病症状（病症）逐渐表现出来为病变期。
感染病建立的结果大都导致寄主昆虫的死亡。
昆虫疾病症状类型：（1）发育不良：虫体萎缩，发育迟缓；（2）行动异常,感病早期昆虫焦躁不安，后期呆滞，对刺激反应不敏感，处于昏睡状态；（3）体色变化：①由于病原体的存在而造成感病昆虫体色变化，如金龟子乳状病菌大量充满孢子的孢子囊使虫体呈乳白色；真菌的分生孢子常常有鲜艳的颜色，使虫体表行为白僵病、黄僵病、绿僵病等。②微生物产生的色素，如粘质沙氏杆菌，产生红色色素而使虫尸变为红色。③昆虫防御系统的黑素化反应，在真菌的侵入部位形成黑斑。⑷消化异常：食欲减退或拒绝进食；⑸组织及细胞病变：虫酶菌首先破坏昆虫的脂肪体使脂肪细胞干 枯变性而被分解；NPV感染的细胞核异常肥大；CPV使昆虫中肠肿胀，多角体形成于细胞质中；⑹其他,生殖紊乱；体液变化…
侵染途径,1、经消化道侵入,中肠是防御系统的薄弱环节，多种病原微生物（细菌、病毒、原生动物、立克次体和一些线虫）从中肠侵入。2、自体壁侵入,真菌以分生孢子附着在昆虫体表，吸水后萌发出芽管侵入体内。表皮薄的昆虫体表的那一部分都能侵入，体表厚的只能从节间膜侵入。
3、经卵传入:,垂直传递” 。许多病毒经卵传递。经卵传递有两种方式：病毒经过卵的内部传递给子代，称为胚种传递；病毒附着在卵的表面，孵化后幼虫吞食卵壳而感染，成为卵表传递。
致病机理——1、对寄主呼吸的影响——引起寄主生理饥饿，感病个体耗氧量增加。2、病原物质代谢对寄主的影响——大量增殖的病原体对组织器官的破坏和堵塞；3、毒素的作用——酶或酶的抑制剂。
昆虫对病原生物的抵抗：1、体壁防御——体壁的屏障作用及低级脂肪酸的抗菌作用；2、消化道防御——消化道的屏障作用及消化液的抗菌抗病毒物质；3、血腔内的防御——①细胞性防御,血细胞（浆细胞、颗粒细胞）的吞噬作用和被囊化；②液性成分的防御——A、溶菌酶、酚氧化酶系统；B、抗菌物质和细胞凝聚性蛋白（外源凝聚素）等获得性防御环境条件对感染的影响——1、对昆虫感受疾病的影响（温度、湿度）；2、对病原物致病的影响（温度、日光、湿度）；3、对昆虫疾病的影响四、昆虫病原细菌的利用应具备的特点：①毒力强且能形成芽孢；②生长快，营养简单，易于培养；③发病期短，使用安全；④使用范围较广昆虫细菌病的特点——昆虫感病后不大活动，食欲减退，口腔与肛门常有排泄物。病原菌侵入体腔后引起败血症，死后虫体颜色加深，迅速变成褐色或黑色。有点虫体软化腐烂，内部组织常溃烂成粘着状，死虫一般都有臭味。因此，昆虫细菌病一般统称软化病应用与研究的杀虫细菌：苏云金芽孢杆菌、乳状病芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌,粘质赛氏杆菌五、苏云金芽孢杆菌
1、形态特征
周鞭(无鞭)、G+、杆状、产芽孢与晶体、H抗原、O抗原
芽孢,不易着色，石碳酸复红、孔雀绿可染色； 芽孢高抗逆，菌株保存方式
晶体：晶体典型为菱形、也有圆形、方形、椭圆形、不规则形，1个（几个)毒素、无毒
生长：芽孢与晶体形成(录像1，2，3 ）
2、作用机理
晶体在害虫碱性中肠内融解，并在昆虫酶的作用下分解成有毒的成分δ－内毒素（δ－Endotoxin ），与中肠上皮细胞特异受体结合，引起膜穿孔，毒素与芽孢进入血淋巴组织，使害虫因饥饿和出现败血症而死亡。
Bt晶体毒素引发昆虫疾病的过程——0阶段：0-30min，幼虫活动正常，但停止取食。血淋巴pH和K+浓度上升。中肠上皮不出现明显的组织病理变化。Ⅰ阶段：30-120min，幼虫运动缓慢，足部偶尔发生痉挛，心跳渐渐变慢，中肠停止蠕动。此阶段末幼虫呕吐和腹泻。中肠前端1/3处的柱状细胞发生早期病变，血淋巴pH和K+浓度继续上升。Ⅱ阶段：2-3h，幼虫受到机械刺激时，不能自主运动，中肠前端病变细胞达到整个中肠的20-30%，柱状细胞膨胀向肠腔突出，杯状细胞的杯状腔变大。血淋巴的K+浓度仍在上升。Ⅲ阶段：3-4h，幼虫无反射运动，心跳完全停止。12-24h后，虫体皮肤出现许多斑点，上皮细胞的病变已占40%左右。柱状和杯状细胞极度空泡化。血液中的K+浓度几乎达到正常肠液K+浓度的一半。 最后幼虫死亡，临时时虫体伸展，不久发黑，并呈腐烂状
3、生物活性物质应用范围,(1) 蔬菜(2) 棉花 (3) 水 (4) 玉米、高梁、小麦 (5) 果树、茶叶、花卉 (6) 烟草和油料害虫 (7) 森林害虫 (8) 仓贮害虫 (9) 卫生昆虫
4、生理生化:
碳 源,淀粉、糊精、麦芽糖、葡萄糖 ； N 源,牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、花生饼粉、豆饼粉、鱼粉、玉米浆； 无机盐,K2HPO4、MgSO4、CaCO3。主要元素有磷、硫、镁、钾、钠、钙，微量元素锰、锌、硅、铁，所需甚微，水杂质即可满足，多了有毒。 温 度,10-40℃，28-32℃适。pH：微碱性条件 氧,好氧 抗生素及化学物,放线菌素D、氯霉素、红霉素。
5、应用
Bt制剂构建工程菌（生物囊制剂、Bt蓝藻、转Bt枯草杆菌及其它高效、广谱工程菌）
转Bt抗虫作物植物抗虫基因的显著优点——1、育种期限短，目的性强；2、连续性保护，任何时期作用，避免反复多次；3、喷洒农药，不受气候影响和环境干扰；4、仅对取食转基因作物的那些害虫才有效；5、对非靶生物没有影响；6、抗虫物质只存在于植物体内，在土壤和地下水中无残留，不存在环境问题。7、能保护那些难以喷洒到的植物部位如根部与发展新型杀虫剂相比，投资较少。
已成功转化的Bt植物
1.烟草——繁殖系数高、双子叶植物；第一种Bt工程植物
2.棉花——美国（Monsanto）。多种单价、双价基因：豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)、大豆胰蛋白酶抑制剂、慈菇蛋白酶抑制剂、水稻胱氨酸蛋白酶抑制剂、豌豆外源凝集素等；中国是继美国之后第二个具有抗虫转基因棉花的国家
3.水稻——中国第一
4.玉米——YieldGard
5个策略:抗性检测；基因的高表达量；改造基因； 提供昆虫庇护地；害虫综合治理。
5.番茄和马铃薯 6.蔬菜 7.杨树等
8.甘蔗——美国农业部、夏威夷农业研究中心和Monsanto公司合作工程菌研究出发菌杀虫谱不广、毒力效价不高细胞融合、基因重组
●杀虫假单孢工程菌的构建
Bt菌在土壤中不稳定，难防治土壤害虫; 寿命短，需重复使用荧光假单孢菌(P,fluorescens)是植物根围和土壤中常见的有益细菌，对环境适应性强、同植物亲和性好、对人畜安全，不少菌株还防病增产。
美国孟山都公司：HD-1 ICP基因整合到玉米根际菌上美国的Mycogen公司：CellCap,较长的持效期、防止紫外线对ICP的破坏。M-Trak和M-peril
中国农科院植保所：荧光假单孢菌P303，防治禾谷类全蚀病。
美国威斯康辛大学：整合到植物根部和叶部的定居菌洋葱假单孢菌(P,cepacia)
●以蓝细菌等构建Bt杀蚊工程菌蚊子：疟疾、黄热病、登革热和丝虫病等疾病传播媒介，
幼虫以微生物水藻和细菌为食蓝细菌(Cyanobacterium)：一种生活在水体表面，对营养要求不高，容易为蚊子幼虫摄食的光能细菌。一些种能适应淡水和盐水环境，对温度耐性亦较宽。它们容易用染色体或质粒转化。
两大难题需予克服:一是有效性，二为安全性
●以枯草杆菌和其它芽孢菌构建的工程菌
不同亚种ICP基因克隆以构建高效广谱的杀虫工程菌
杀虫、抗病、除草、增产、固氮
有待解决的问题—— 重组菌的基因表达量、能否产生足够的ICP；工程菌的中试及生产工艺； 安全性和持效性评价
6、Bt发展历史
7、Bt研究——1、基因鉴定（cry/chi/vip/aii/ihnA/cyt) 2、克隆、表达3、构建工程菌（细胞工程、基因工程）4、转基因植物
Bt基因的表达和修饰原核生物基因表达调控系统具有原核生物特性，真核生物不能识别和运用这套表达调控系统
Bt毒蛋白基因在转基因植物中的表达与其长度有关； mRNA不稳定和翻译效率低基因修饰——置换核苷酸残基广泛修饰：66.6％密码子第三位的A或T碱基被G或C取代密码子偏爱(codon preference)
高等植物有38个偏爱的单子叶植物密码子，它们大多数第三位密码子为G或C,有44个偏爱的双子叶植物密码子，其中第三位为A或T。
Btδ-内毒素基因中A+T的平均含量为64％，单子叶植物和双子叶植物中则分别为44％和55％。
碱基组成的差异可能引起基因转录后异常加工大部分δ-内毒素偏爱的氨基酸密码子往往是植物最不喜爱的密码子，尤其是在GC含量极高的单子叶植物如玉米。因此，Btδ-内毒素基因中密码子用法的改造会导致单子叶植物和双子叶植物上异源基因表达的增强。
面临问题——工程植物的安全性、基因的表达量、基因的定位表达、昆虫的抗性
研究机构：
美国：Ecogen公司：9000株 农业部Brownsville Lab，HD-X系列 Ohio州立大学，大量突变株。
法国：巴斯德研究所（WHO昆虫病原细菌参考中心）3500株英国：温室作物研究所H.Burges博士HB-X系列日本：九州大学Aizawa和Ohha博士、北海道大学 IIZUKA教授国内：华中农大、中国林业科学院、湖北农科院,中科院武汉病毒所、南开大学、福建农大
8、Bt生产
（1）、概况
（2）产品标准化芽孢生物测定：初孵家蚕、菜青虫、棉铃虫、小菜蛾蛋白晶体
（3）安全性问题
（4）剂型—— (1) 液剂,普遍、方便。有水剂、乳剂、油剂。(2) 可湿性粉剂,主产品，保存、包装、运输方便⑶胶囊剂,防止阳光、高温、干燥对芽孢和晶体的破坏，又使毒性成分逐渐释放，保护剂可防止紫外辐射的伤害
（5）我国Bt生产现状
有机食品论证：Bt已通过，阿维菌素不行
Bt复配 ——①北（7）、福建（6）为主；②要和阿维（35个产品），也有和病毒（菜青虫、斜纹夜蛾等）以及化学（杀虫丹最多，吡虫啉等）复配质量标准化
问题,1、厂家多、规模小、质量难保证：2、种剂型单一：3、水平相对落后，后处理简单：4、质检5、提纯
