诱变突变复制的忠实性物理诱变剂化学诱变剂直接诱变间接诱变突变突变 — DNA碱基序列水平上永久性的、可遗传的改变。
产生突变的原因
DNA复制或减数分裂重组过程中的自发性错误
物理损伤
化学试剂损伤点突变一个单一碱基的改变
转换：嘌呤与嘌呤之间，嘧啶与嘧啶之间
颠换：嘌呤与嘧啶之间点突变的表现型沉默基因 —点突变发生在 DNA的非编码区、非调节区或密码子的第三个碱基位置，不会影响到掺进蛋白质的氨基酸；
错义突变 —点突变改变了基因产物的一个氨基酸；
可能是无效的，也可能是致死的
取决于被影响的氨基酸的重要性突变类型
Substitution
Deletion
insertion
Substitution
In the substitution mutation,one or more nucleotides are substituted by
the same number of different nucleotides,In most cases,only one
nucleotide is changed,Based on the change in the nucleotide type,the
substitution mutation may be divided into transition and transversion
mutations,Based on the consequence of mutation,the substitution
mutation may be grouped into silent,missense and nonsense mutations.
Deletion
Exon Skipping
内含子序列改变，
启动子结合蛋白无法正常识别复制的忠实性
DNA复制的错配率极低保证 DNA复制高度忠实性的机制有：
只有当进入活性位点的核苷酸与模板核苷酸满足正确的碱基配对原则时,DNA聚合酶才能够将其掺进来；
聚合酶的 3’－ 5’外切酶活性可以检测出偶发错误，并在下一个核苷酸掺入前从 3’端去掉错配的核苷酸，从而保证碱基的正确插入；
物理诱变剂高能离子化辐射（ X射线）
会引起目标分子失去电子，导致 DNA发生广泛的化学变异，包括断链、碱基或五碳糖的损伤；
非离子化辐射
引起在目标分子内的分子振动，或促进电子进入较高能级，导致形成新的化学键
紫外线 —可导致相邻嘧啶碱基产生二聚体化学诱变剂碱基类似物
是改变碱基配对特性的正常碱基衍生物，可诱发直接诱变
亚硝酸 —诱导胞嘧啶脱氨形成尿嘧啶，从而导致复制中发生的 G.C向 A.U转换；腺嘌呤脱氨变成鸟嘌呤，使复制中发生的 A.T向 G.C转换；
烷化剂 —甲烷磺酸甲酯、乙基亚硝基脲及芳基化试剂
*绝大部分化学诱变剂均为致癌剂
DNA损伤损伤是 DNA正常的化学或物理结构的改变
损伤的产生：是由于碱基杂环上的 N,C原子及一些环外功能基团（酮基或氨基）的化学活性。许多外源性物质（化学试剂）或射线均能引起这些位点的改变，将导致碱基不能配对或错配；
损伤的固定
直接诱变
间接诱变直接诱变直接诱变 起因于 DNA中存在稳定的、具有改变了的配对特性的、未修复的碱基。
正是 DNA的复制使得这种非永久性损伤固定下来，变为永久性的、可遗传的 突变突变的固定
5-溴尿嘧啶的酮基异构体
5-溴尿嘧啶的烯醇式异构体腺嘌呤 (A)
鸟嘌呤 (G)
配对配对
T
C
配对配对间接诱变一些损伤 DNA聚合酶在复制时为了保证染色体的完整性，在损伤对应的位点上插入碱基 ——是对损伤的容忍，而不是转移或修复
DNA损伤的分类
氧化性损伤 ——在所有需氧细胞中由于超氧化物、氢过氧化物及羟基自由基等活性氧的存在，
会导致碱基在正常条件下发生氧化损伤；
烷基化 ——在烷基化试剂的作用下，将烷基加入到碱基各位点；
聚化加合物 ——相邻碱基之间的聚合或碱基与某些外源试剂的聚合形成聚合物（如紫外线诱导的相邻嘧啶碱之间的 C5,C6环化）；
紫外诱导的 DNA结构变化
DNA Repair
All Cells Have Multiple DNA Repair
Systems
Direct repair----光复活
Excision repair
Base-excision repair
Nucleotide-excision repair
Mismatch repair
光复活在可见光存在下,DNA光解酶可将环丁烷嘧啶二聚体再分解为单体切除修复碱基切除修复核苷酸切除修复碱基切除修复
DNA 糖基化酶识别修饰碱基切除修饰碱基与糖基之间的 N-糖苷键，留下一个脱嘌呤或脱嘧啶位点（ AP位）
AP内切核酸酶在该位点切开 DNA，其外切酶活性可以继续切出一个缺口缺口可由 DNA Pol1（ E.Coli）或 DNA Polβ
（真核生物）填补核苷酸切除修复核酸内切酶在损伤部位两侧各切除精确数目的碱基；
包含损伤的寡核苷酸被切除并留下一个缺口；
缺口可由 DNA聚合酶 1填补（ E.Coli）或
DNA Polδ 或 ε （ 真核生物 ） 完成 ；
磷酸二酯键的形成由 DNA连接酶完成错配修复是切除修复的一种特定形式，用于在复制过程中错配并漏过校正检验的任何碱基
错配的碱基对由 MutS和 MutL蛋白复合体识别并与之结合
该复合体随后再与 MutH内切核酸酶结合，后者在子代链 GATC附近的位点上产生特异性缺刻
该缺刻启动了对含有错误碱基区域的切除修复基因重组同源重组位点特异性重组转座作用同源重组亦称一般重组，该过程涉及两个 DNA分子间同源区域的交换对于双倍体真核生物而言，同源重组经常发生在减数分裂过程中。减数分裂中期同源复制的染色单体平行排列，非姐妹染色单体互换相对应的区域，这样在有丝分裂结束后，产生的单倍体配子就包含来源于父本和母本两方面的遗传信息，可保证个体继承多方面的遗传信息单倍体细菌也可以进行重组
常发生于部分已经复制 DNA之间或发生在染色体 DNA与获取的外源 DNA（质粒或噬菌体）
之间
E.coli同源 DNA的重组及 Holliday结构
a,Two DNA molecules that are
homologous in a eukaryotic cell
that are about to undergo crossing
over
b,An endonulcease (recBCD
endonuclease in E,coli)
introduces single-strand nicks into
each of the strands,The arrows on
the strands of each double helix are
meant to indicate the 5' to 3'
direction of each strand
c,The crossing over event is a strand
exchange or strand invasion,Since
these are homologous
chromosomes,the strands can base
pair readily with each other,This
strand exchange requires a protein
call rec A.
d,The single strand nicks are now
sealed by DNA ligase.
e,The cross-over point can undergo a
branch migration,meaning that
more of each strand becomes a part
of the opposite molecule (shown
here in blue and red),Notice that
this results in the formation of a
region that is a heteroduplex,where
the two DNA strands are slightly
difference,You can see the the "B"
allele is not opposite the sequence
for the "b" allele,Remember that
alleles need only differ by one base
pair.
f,If this structure is rotated in three
dimensions (sometimes this is hard to
envision) it can be isomerized to give what
is called the Holliday structure shown
here,The Holliday structure is now
"resolved" by cutting with endonuclease
(resolvase,the product of ruvC) and
ligation with DNA ligase,There are two
possible ways to resolve the structure,
shown by the dotted lines,The resulting
products are shown below
g,Cut#1 produces products that are
recombinants (notice that the upper
molecule as the "A" allele now on the
same DNA as the "c" allele),In addition,
these molecules also have heteroduplex
regions where the crossover took place.
h,Cut#2 produces molecules that are not
recombinants but do have heteroduplex
regions.
The Holliday model for homologous genetic recombination,
Helicase and
nuclease activities
of the RecBCD
enzyme.
RecA 蛋白的作用位点特异性重组非同源性 DNA特异片断之间的交换，由能够识别特异 DNA序列的蛋白质所介导，
并不需要 RecA或单链 DNA
位点特异性重组
λ 噬菌体整合到大肠杆菌基因组中的过程转座作用转座子或转座元件
是一些较短的 DNA序列，可以转移进细胞基因组的任何位置转座作用亦称为异常重组
特点
无需序列间具有同源性
也不是位点特异的
效率极低
最简单的转座子 —E.coli的 IS元件或插入序列
DNA克隆简介
DNA克隆宿主与载体亚克隆
DNA文库筛选文库克隆分析
DNA克隆
DNA克隆是指这样一种技术
将某一细胞基因组中携带有目的基因或其他相关序列的较小片段连接到一段可以自主复制的 DNA，即载体上，形成通常可以在另一宿主中进行复制的重组 DNA，这种复制是独立于原始基因组的。 该操作过程称之为 DNA
克隆
带有重组 DNA的宿主细胞的增殖构成了一群具有遗传一致性的个体，称为 单克隆一个完整的基因克隆过程包括以下步骤：
１,获得待克隆的 DNA片段 （ 基因 ） ；
２,目的基因与载体在体外连接；
３,重组 DNA分子导入宿主细胞；
４,筛选,鉴定阳性重组子；
５,重组子的扩增与／或表达 。
宿主和载体常用的宿主 —大肠杆菌载体必须具备的性质
自身必须能够独立于宿主细胞基因组之外进行复制与分离
应包括一个选择标记，即一个能使含有该载体的宿主细胞区别于不含该载体的细胞，使筛选更加便利
最常用的大肠杆菌载体
环状质粒
多种噬菌体 —可用于克隆较大的 DNA片段亚克隆将已经克隆的 DNA片段从一个载体向另一个载体的转移，是最简单的克隆技术
含有目标克隆序列的质粒 DNA的提取
用限制性内切酶将质粒酶切成不连续片段
琼脂糖电泳分离
纯化目标片段
将目标片段连接到一个新的质粒上，形成新的重组分子
将连接好的质粒转入某一大肠杆菌菌株
转化细菌的筛选
重组质粒的分子
DNA文库是一套 DNA克隆，每个克隆中均插入了不同
DNA片段的载体，在宿主细胞中扩增后的产物
基因组文库 — 是用基因组 DNA的随机片段制备而成的，其用于克隆某一基因时效率低下（真核生物的基因组十分庞大，而且其中充满了大量的非编码
DNA）
cDNA文库 — 用来自表达目的基因的 mRNA作为来源构建的文库，其作法是将 mRNA经反转录合成 cDNA
后，插入载体构建成 cDNA文库，这对于克隆目的基因是十分有效的，但克隆的仅仅是编码区，并不包括编码区以外的基因组序列
These RNA fragments can now serve as primers for DNA
synthesis by E,coli Pol I,This enzyme will also translate
the "nicks" to effectively remove the RNA primers
筛选文库用于筛选 DNA文库中含有目的基因的克隆其方法为：用一段与目的基因序列的某一区域互补或部分互补的放射性或荧光标记的 DNA探针，通过杂交来检测该基因探针的制备通常采用聚合酶链式反应克隆分析当含有目的基因的克隆被确定以后，
就可以通过限制性内切酶来进一步分析 DNA片段，并最终对 DNA全长片段进行测序，然后可以通过全长序列与数据库中其他已知序列进行比较，确定出其产物蛋白的完整序列
产生突变的原因
DNA复制或减数分裂重组过程中的自发性错误
物理损伤
化学试剂损伤点突变一个单一碱基的改变
转换：嘌呤与嘌呤之间，嘧啶与嘧啶之间
颠换：嘌呤与嘧啶之间点突变的表现型沉默基因 —点突变发生在 DNA的非编码区、非调节区或密码子的第三个碱基位置，不会影响到掺进蛋白质的氨基酸；
错义突变 —点突变改变了基因产物的一个氨基酸；
可能是无效的，也可能是致死的
取决于被影响的氨基酸的重要性突变类型
Substitution
Deletion
insertion
Substitution
In the substitution mutation,one or more nucleotides are substituted by
the same number of different nucleotides,In most cases,only one
nucleotide is changed,Based on the change in the nucleotide type,the
substitution mutation may be divided into transition and transversion
mutations,Based on the consequence of mutation,the substitution
mutation may be grouped into silent,missense and nonsense mutations.
Deletion
Exon Skipping
内含子序列改变，
启动子结合蛋白无法正常识别复制的忠实性
DNA复制的错配率极低保证 DNA复制高度忠实性的机制有：
只有当进入活性位点的核苷酸与模板核苷酸满足正确的碱基配对原则时,DNA聚合酶才能够将其掺进来；
聚合酶的 3’－ 5’外切酶活性可以检测出偶发错误，并在下一个核苷酸掺入前从 3’端去掉错配的核苷酸，从而保证碱基的正确插入；
物理诱变剂高能离子化辐射（ X射线）
会引起目标分子失去电子，导致 DNA发生广泛的化学变异，包括断链、碱基或五碳糖的损伤；
非离子化辐射
引起在目标分子内的分子振动，或促进电子进入较高能级，导致形成新的化学键
紫外线 —可导致相邻嘧啶碱基产生二聚体化学诱变剂碱基类似物
是改变碱基配对特性的正常碱基衍生物，可诱发直接诱变
亚硝酸 —诱导胞嘧啶脱氨形成尿嘧啶，从而导致复制中发生的 G.C向 A.U转换；腺嘌呤脱氨变成鸟嘌呤，使复制中发生的 A.T向 G.C转换；
烷化剂 —甲烷磺酸甲酯、乙基亚硝基脲及芳基化试剂
*绝大部分化学诱变剂均为致癌剂
DNA损伤损伤是 DNA正常的化学或物理结构的改变
损伤的产生：是由于碱基杂环上的 N,C原子及一些环外功能基团（酮基或氨基）的化学活性。许多外源性物质（化学试剂）或射线均能引起这些位点的改变，将导致碱基不能配对或错配；
损伤的固定
直接诱变
间接诱变直接诱变直接诱变 起因于 DNA中存在稳定的、具有改变了的配对特性的、未修复的碱基。
正是 DNA的复制使得这种非永久性损伤固定下来，变为永久性的、可遗传的 突变突变的固定
5-溴尿嘧啶的酮基异构体
5-溴尿嘧啶的烯醇式异构体腺嘌呤 (A)
鸟嘌呤 (G)
配对配对
T
C
配对配对间接诱变一些损伤 DNA聚合酶在复制时为了保证染色体的完整性，在损伤对应的位点上插入碱基 ——是对损伤的容忍，而不是转移或修复
DNA损伤的分类
氧化性损伤 ——在所有需氧细胞中由于超氧化物、氢过氧化物及羟基自由基等活性氧的存在，
会导致碱基在正常条件下发生氧化损伤；
烷基化 ——在烷基化试剂的作用下，将烷基加入到碱基各位点；
聚化加合物 ——相邻碱基之间的聚合或碱基与某些外源试剂的聚合形成聚合物（如紫外线诱导的相邻嘧啶碱之间的 C5,C6环化）；
紫外诱导的 DNA结构变化
DNA Repair
All Cells Have Multiple DNA Repair
Systems
Direct repair----光复活
Excision repair
Base-excision repair
Nucleotide-excision repair
Mismatch repair
光复活在可见光存在下,DNA光解酶可将环丁烷嘧啶二聚体再分解为单体切除修复碱基切除修复核苷酸切除修复碱基切除修复
DNA 糖基化酶识别修饰碱基切除修饰碱基与糖基之间的 N-糖苷键，留下一个脱嘌呤或脱嘧啶位点（ AP位）
AP内切核酸酶在该位点切开 DNA，其外切酶活性可以继续切出一个缺口缺口可由 DNA Pol1（ E.Coli）或 DNA Polβ
（真核生物）填补核苷酸切除修复核酸内切酶在损伤部位两侧各切除精确数目的碱基；
包含损伤的寡核苷酸被切除并留下一个缺口；
缺口可由 DNA聚合酶 1填补（ E.Coli）或
DNA Polδ 或 ε （ 真核生物 ） 完成 ；
磷酸二酯键的形成由 DNA连接酶完成错配修复是切除修复的一种特定形式，用于在复制过程中错配并漏过校正检验的任何碱基
错配的碱基对由 MutS和 MutL蛋白复合体识别并与之结合
该复合体随后再与 MutH内切核酸酶结合，后者在子代链 GATC附近的位点上产生特异性缺刻
该缺刻启动了对含有错误碱基区域的切除修复基因重组同源重组位点特异性重组转座作用同源重组亦称一般重组，该过程涉及两个 DNA分子间同源区域的交换对于双倍体真核生物而言，同源重组经常发生在减数分裂过程中。减数分裂中期同源复制的染色单体平行排列，非姐妹染色单体互换相对应的区域，这样在有丝分裂结束后，产生的单倍体配子就包含来源于父本和母本两方面的遗传信息，可保证个体继承多方面的遗传信息单倍体细菌也可以进行重组
常发生于部分已经复制 DNA之间或发生在染色体 DNA与获取的外源 DNA（质粒或噬菌体）
之间
E.coli同源 DNA的重组及 Holliday结构
a,Two DNA molecules that are
homologous in a eukaryotic cell
that are about to undergo crossing
over
b,An endonulcease (recBCD
endonuclease in E,coli)
introduces single-strand nicks into
each of the strands,The arrows on
the strands of each double helix are
meant to indicate the 5' to 3'
direction of each strand
c,The crossing over event is a strand
exchange or strand invasion,Since
these are homologous
chromosomes,the strands can base
pair readily with each other,This
strand exchange requires a protein
call rec A.
d,The single strand nicks are now
sealed by DNA ligase.
e,The cross-over point can undergo a
branch migration,meaning that
more of each strand becomes a part
of the opposite molecule (shown
here in blue and red),Notice that
this results in the formation of a
region that is a heteroduplex,where
the two DNA strands are slightly
difference,You can see the the "B"
allele is not opposite the sequence
for the "b" allele,Remember that
alleles need only differ by one base
pair.
f,If this structure is rotated in three
dimensions (sometimes this is hard to
envision) it can be isomerized to give what
is called the Holliday structure shown
here,The Holliday structure is now
"resolved" by cutting with endonuclease
(resolvase,the product of ruvC) and
ligation with DNA ligase,There are two
possible ways to resolve the structure,
shown by the dotted lines,The resulting
products are shown below
g,Cut#1 produces products that are
recombinants (notice that the upper
molecule as the "A" allele now on the
same DNA as the "c" allele),In addition,
these molecules also have heteroduplex
regions where the crossover took place.
h,Cut#2 produces molecules that are not
recombinants but do have heteroduplex
regions.
The Holliday model for homologous genetic recombination,
Helicase and
nuclease activities
of the RecBCD
enzyme.
RecA 蛋白的作用位点特异性重组非同源性 DNA特异片断之间的交换，由能够识别特异 DNA序列的蛋白质所介导，
并不需要 RecA或单链 DNA
位点特异性重组
λ 噬菌体整合到大肠杆菌基因组中的过程转座作用转座子或转座元件
是一些较短的 DNA序列，可以转移进细胞基因组的任何位置转座作用亦称为异常重组
特点
无需序列间具有同源性
也不是位点特异的
效率极低
最简单的转座子 —E.coli的 IS元件或插入序列
DNA克隆简介
DNA克隆宿主与载体亚克隆
DNA文库筛选文库克隆分析
DNA克隆
DNA克隆是指这样一种技术
将某一细胞基因组中携带有目的基因或其他相关序列的较小片段连接到一段可以自主复制的 DNA，即载体上，形成通常可以在另一宿主中进行复制的重组 DNA，这种复制是独立于原始基因组的。 该操作过程称之为 DNA
克隆
带有重组 DNA的宿主细胞的增殖构成了一群具有遗传一致性的个体，称为 单克隆一个完整的基因克隆过程包括以下步骤：
１,获得待克隆的 DNA片段 （ 基因 ） ；
２,目的基因与载体在体外连接；
３,重组 DNA分子导入宿主细胞；
４,筛选,鉴定阳性重组子；
５,重组子的扩增与／或表达 。
宿主和载体常用的宿主 —大肠杆菌载体必须具备的性质
自身必须能够独立于宿主细胞基因组之外进行复制与分离
应包括一个选择标记，即一个能使含有该载体的宿主细胞区别于不含该载体的细胞，使筛选更加便利
最常用的大肠杆菌载体
环状质粒
多种噬菌体 —可用于克隆较大的 DNA片段亚克隆将已经克隆的 DNA片段从一个载体向另一个载体的转移，是最简单的克隆技术
含有目标克隆序列的质粒 DNA的提取
用限制性内切酶将质粒酶切成不连续片段
琼脂糖电泳分离
纯化目标片段
将目标片段连接到一个新的质粒上，形成新的重组分子
将连接好的质粒转入某一大肠杆菌菌株
转化细菌的筛选
重组质粒的分子
DNA文库是一套 DNA克隆，每个克隆中均插入了不同
DNA片段的载体，在宿主细胞中扩增后的产物
基因组文库 — 是用基因组 DNA的随机片段制备而成的，其用于克隆某一基因时效率低下（真核生物的基因组十分庞大，而且其中充满了大量的非编码
DNA）
cDNA文库 — 用来自表达目的基因的 mRNA作为来源构建的文库，其作法是将 mRNA经反转录合成 cDNA
后，插入载体构建成 cDNA文库，这对于克隆目的基因是十分有效的，但克隆的仅仅是编码区，并不包括编码区以外的基因组序列
These RNA fragments can now serve as primers for DNA
synthesis by E,coli Pol I,This enzyme will also translate
the "nicks" to effectively remove the RNA primers
筛选文库用于筛选 DNA文库中含有目的基因的克隆其方法为：用一段与目的基因序列的某一区域互补或部分互补的放射性或荧光标记的 DNA探针，通过杂交来检测该基因探针的制备通常采用聚合酶链式反应克隆分析当含有目的基因的克隆被确定以后，
就可以通过限制性内切酶来进一步分析 DNA片段，并最终对 DNA全长片段进行测序，然后可以通过全长序列与数据库中其他已知序列进行比较，确定出其产物蛋白的完整序列
