Posttranslation Processing
翻译水平的调控
一,mRNA运输控制 （ transport control） 是对转录物从细胞核运送到细胞质中的数量进行调节 ;
二,mRNA翻译的控制
三,mRNA的结构和翻译的效率
四,翻译的起始调节
五,选择性翻译
六,反义 RNA调控
七,翻译的自我调节起始因子的修饰与翻译起始调控
eIF-2磷酸化对翻译起始的影响。用兔网织红细胞粗抽提液研究蛋白质合成时发现，如果不向这一体系中添加氯高铁血红素，几分钟之内蛋白质合成活性急剧下降，直到完全消失。这就是说，当没有氯高铁血红素存在时，
网织红细胞粗抽提液中的蛋白质合成抑制剂就被活化，从而抑制蛋白质合成。现已查明，该抑制剂 HCI是受氯高铁血红素调节的，它其实是 eIF-2的激酶，可以使 eIF-2的 α 亚基磷酸化，并由活性型变成非活性型
mRNA翻译的控制在高等真核生物中转运铁蛋白受体（ TfR）和铁蛋白负责铁吸收和铁解毒。这两个 mRNA上存在相似的顺式作用元件，称为铁应答元件 iron responsive element,
IRE,IRE与 IRE结合蛋白 IREBP
相互作用控制了这两个 mRNA的翻译效率。当细胞处于缺铁或高铁水平时，能产生两个数量级的蛋白水平差异，却没有在 mRNA
水平上发现存在显著差异。研究表明，位于 5’非翻译区的 IRE控制了铁蛋白 mRNA的翻译效率，
去掉这个非翻译区 IRE，可造成铁蛋白的永久性高水平翻译。当细胞缺铁时,IREBP与 IRE具有高亲和力，两者的结合有效地阻止了铁蛋白 mRNA的翻译，与此同时,TfR mRNA上 3'非翻译区中的 IRE也与 IREBP特异结合，
有效地阻上 TfR mRNA的降解，
促进 TfR蛋白的合成
Post-translation Processing in eukaryote
翻译后加工
蛋白质的分捡 Sorting
蛋白质的修饰 Modification
蛋白质的折叠 Folding
蛋白质的降解 Degradation
Protein Sorting
真核生物细胞被各种膜分成几个区域如：核仁、
线粒体等。不同的区域存在不同的蛋白质。蛋白质分子的这种分布是由遗传信息控制的。
真核生物细胞中蛋白质分子是在细胞质中合成的。
一些分子将留在细胞质中，另一些将转运到核仁、
线粒体等其它细胞器中，这个过程称为 蛋白质定位 (targeting),蛋白质分检 (Protin sorting),蛋白质易位 translocation等
蛋白质分子在细胞中的定位是由其序列中一段特定的序列决定的，这段序列称为 信号肽 signal
peptide或 前导肽 Leader
留在胞液中翻译后转运 ( 游离核糖体 ) 核依靠导肽 线粒体蛋白质转运 越 膜 叶绿体其它细胞器共翻译转运 依靠信号肽
( 膜结合核糖体 ) 越 膜图 1 5 - 2 8 蛋白质合成后的转运，定位及分泌
ER 糖基化修饰 分拣 高尔基体 溶酶体留在 ER 中 留在高尔基体分泌到胞外 质膜 包被在泡囊质膜中嵌在膜上翻译后转运 post-translation translocation
共翻译转运 co-translatonal translocation
Protein translocation
Movement of the secreted protein
proteins synthesized on
the rough ER are
extruded into the
space in between the
two membranes of the
ER?golgi complex
secretory vesicles
release of the
proteins to the outside
of the cell
信号肽位于 N端，一般由 13-36个残基组成，至少含一个带正电荷的氨基酸；在其后有一个 10-15个残基组成的疏水核；最后是较小的氨基酸如 Ala。
Positively charged residue Neutral residueHydrophobic core
Signal Peptides
Signal recognition particle
信号识别颗粒 SRP
Signal recognition particle 是由 7S snRNA和
proteins组成的 rRNP，能够识别信号肽序列
SRP结合于内质网膜外侧的受体上，此受体称为 停靠蛋白 docking protein。
蛋白质分子在穿过内质网腔时，信号肽被 信号肽酶 signal peptidase切除。
在 Golgi装置内,蛋白质分子被修饰，通常为糖基化修饰。不同的糖基化修饰可能控制着蛋白质的最终定位。
The structure of SRP
The 7S RNA of the SRP particle is divided into two parts,The 100 bases at the
5 end and 45 bases at the 3 end are closely related to the sequence of ALU
RNA,a common mammalian small RNA,They therefore define the ALU
domain,The remaining part of the RNA comprises the S domain,Five of the
six proteins bind directly to the 7S RNA,Each function of the SRP is associated
with a particular protein(s).
Protein transported into
mitochondria and chloroplasts
前导肽通常是疏水的，约 20aa，由非电负性氨基酸构成，中间夹有碱性氨基酸，而没有酸性氨基酸，羟基氨基酸含量高
易形成双亲?螺旋轮 amphiphilic
helix
不同的前导肽缺乏同源性，这意味着和识别有关的信号不是一极结构，
而是二级或三级结构
在细胞器的内外膜上都发现前导肽的受体
前导肽的切除是由导肽酶 transit
peptidase完成的
Two kinds of signal
The leader of yeast
cytochrome c1 contains
an N-terminal region
that targets the protein
to the mitochondrion,
followed by a region
that targets the (cleaved)
protein to the inner
membrane,The leader
is removed by two
cleavage events.
螺旋轮
酵母细胞色素氧化酶 C亚基先导肽形成的两亲螺旋结构新生蛋白质通过同步转运途径进入内质网内腔的过程
① 核糖体组装、翻译起始；②位于蛋白质 N-端的信号肽序列首先被翻译；③ SRP
与核糖体 GTP以及带有信号肽的新生蛋白质相结合，暂时中止肽链延伸；④核糖体 -SRP复合物与膜上的受体相结合；⑤ GTP水解，释放 SRP并进入新一轮循环；
⑥肽链更新开始延伸并不断向内腔运输；⑦信号肽被切除；⑧多肽合成结束核糖体解离并恢复到翻译起始前的状态膜蛋白形成过程细胞核的进出
核内蛋白是在胞内合成的，然后再运送到核内如 Histones,Nonhistones、
Ribosomal proteins(核糖核酸蛋白体 )
在核内装配的一些成分如 Ribosomal
subunit及 mRNA等，需转运到核外
核膜是双层膜，分为内膜和外膜，膜上有核孔，跨越内外膜
物质的转运是经过核孔完成的一些重要物质使用孔的频率核孔的模型
A model for the
nuclear pore shows
8-fold symmetry,
Two rings form the
upper and lower
surfaces (shown in
yellow); they are
connected by the
spokes (shown in
green on the inside
and blue on the
outside),
Transport receptors carry cargo
proteins through the pore
Exportins 是将底物 cargo由核内运转到细胞质中的运输容器或载体蛋白 transport receptors,carrier.
Importins是将底物 cargo由核外运转到核内的运输容器 transport receptors.
Transprotins是一种转运 hnRNP的运输容器
Nucleoporin 是指组成核孔复合物的基本成分载体蛋白
Importins
和底物结合，带底物穿过核孔，然后返回核中，
循环使用。
核输出信号具有输出和输入信号的蛋白出入核的多种途径
Nuclear localization signals核定位信号
无保守序列；
有一段短的碱性氨基酸序列；
常存在 Pro,可抑制碱性氨基酸的上游形成?螺旋；
有的 NLS有两个分开的短的簇
向核内运输 Nuclear import可分为两个过程，停泊和转运取决于胞质的成分。模型暗示了定位包括了一系列的停泊与非停泊反应。
某些核孔蛋白有一些简单肽重复序列
GKFG,FG,FXFG，而且包括该序列的核孔蛋白部分能结合 Importins的?亚基 。表明 Importins将底物蛋白带入孔，
它的?亚基结合底物,?亚基结合核孔蛋白。
支持转运的胞浆部分有两个活性成分。
一个是小 GTP酶，称 Ran，另一个还未知，可能与转移 Ran入核孔有关。与单体 GTP结合蛋白相同，变换鸟核苷酸需要其他蛋白 (即，用 GTP代替 GDP再产生 GTP酶的活性形式 )。
Nuclear import
Importins包含两个亚基?
和?,?亚基结合有 NLS
序列的蛋白,?亚基结合核孔
GTP和 Ran的状态控制核蛋白是“进”还是
“出”。通常 Ran-GTP存在于核内，有助 export
complexes的稳定,Ran-
GDP存在于胞内，有助于 import complexes 的稳定；因此
import complexes 在核外形成而在核内解离，
export complexes刚好相反
Importins
Nuclear export signal
许多出核蛋白有一个相同的 核输出信号 序列 Neuclear export signal
NES。
NES通常由 10左右的氨基酸，仅有的共同点为一个保守的 Leu序列分布 pattern
一个亚基上的 NES可使另一个蛋白从核中转运带有一个 NES的蛋白可使一个 RNA
从核中转运出
Exportins
Exportin-1的序列类似于 importin-?
Exportin-1对 snRNAs、一些 proteins、可能还有某些 mRNAs
从核内输出是必需的
Exportin-1有可以和 Ran-GTP,NES motif以及 nucleoporins
的结合位点。在 Ran-GTP有存在时,Exportin-1能够和三者结合形成复合物； 当 GTP水解生成 Ran-GDP 时。复合物也随之解离。
因此 Export过程也受到 Ran-GTP的控制,在核内 Ran-GTP含量高，复合物形成；输出到细胞质后 Ran-GTP变成 Ran-
GDP，复合物解体，这个过程刚好和 Improt相反类型 途径 目标 蛋白种类 结构和功能触动因子分子伴 侶 G ro E L,细菌的热休克蛋白，可稳定蛋白构型，是折叠调节器
Sec B,1 6 K d a,和前体结合阻止折叠，和 Se c A 结合将前体转运到膜外围膜蛋白 S e c A 1 0 7 K d a,和 S e c Y 亲和，有 A T P 酶活性共翻译转运 普遍性途径 越过内膜 S e c E,有 3 个跨膜区膜本体 复合体，有转运功能，是一种转运器蛋白 S e c Y,有 10 个跨膜区细菌的 导肽酶：切除导肽分泌 S R P 同源蛋白,4,5 S R N A + 4 8 K d a 蛋白。和新生肽的导肽结合，保持其构象分泌蛋白,H l y A,1 0 7 K D a,C 端信号供 H l y B 和 H l y D 识别，有拓扑顺序翻译后转运 孔经途径 越过内外膜 内膜蛋白,H l y B,7 7 K D a,C 端保守有 A T P 结合位点跨膜蛋白,H l y D,5 4 K D a,在 E,c o l i 膜粘连区形成孔道跨膜蛋白,T o l C,在外膜形成孔道图 1 5 -4 5 细菌分泌的不同途径细菌中蛋白质的越膜转运细菌中蛋白质的越膜转运导肽酶 导肽酶 导肽酶
S e c S e c
E Y
S e c A S e c A
新生肽 S e c B
S e c B 与新生肽结合蛋白转移到 S e c A 上
S e c B 再循环图 15 - 细菌中蛋白质的转运
Protein Folding
一些蛋白质分子具有自发折叠成有活性构象的能力，成为自装配 self-assembly,但是很多蛋白不能自我装配，而需要一个伴侣分子的帮助才能获得一个稳定的构象
分子伴侣 Chaperonin是能够介导靶蛋白正确装配的蛋白质分子，它能够限定靶蛋白分子只形成某一种构象而排除了其它可能的构象
分子伴侣通过与靶蛋白某些暴露的表面相互作用，而防止了这些表面与其它区域结合形成不正确的构象
Two major groups of chaperones
Hsp70 system由 Hsp70,Hsp40,and GrpE组成，主要作用于新合成的蛋白、穿膜运输蛋白以及在极端条件下变性的蛋白。 Hsp70和 Hsp40分别结合于各自的底物
Chaperonin system由大的寡聚物装配而成的复合体。这个复合体的结构使未折叠的蛋白分子能够插入其中
The Hsp70 family is ubiquitous
DnaJ和 DnaK在一个蛋白新生时结合上去的情形 。 当蛋白质链增长的时候,
DnaK会脱离结合点,然后与另一个结合,这样,释放底物蛋白的一部分,
使它正确而有序地折叠,最后,完整的蛋白从核糖体上释放出来,折叠成它成熟的构象,释放 DanK是在 DnaJ和 GrpE帮助下完成的 。 DnaJ和 GrpE
可以激活 Hsp70的 ATP酶活性 。
Hsp70的真核变种以同样的方式发生作用 。 它们可能要在 Hsp40的帮助下进行 (相当于 DnaJ)。 不同的 Hsp70作用在相应的靶蛋白上 。 胞液蛋白作用于从核糖体新生的蛋白 。 在内质网变种,线粒体或是染色质中对蛋白质产生更简单的作用,就像它们穿过膜而到达器官内部一样 。
Chaperonin system
Chaperonin system Hsp60一族组成一个大的包含两个亚基的容器。 Hsp60(大肠杆菌中的 GroEL)形成的结构包含 14个亚基，这些亚基以两个分别由７个亚基组成的环内翻，在各自的顶端连接。这意味着这双环的顶部和底部的表面相同，
而它们中心的是直连通的，这整个结构就像一中空的圆柱。 Hsp60/GroEL在指导折叠中起了必不可少的作用，有时也被叫作伴侣分子，而 Hsp10/GroES又是
Hsp60/ GroEL发挥作用所必需的，因此被叫做辅伴侣分子
Hsp60/GroEL
forms an oligomeric
ring structure
蛋白质分子包藏于柱状结构中，在被控制的环境下进行折叠或降解
Hsp60/GroEL
forms an oligomeric
ring structure
Hsp60/GroEL的两个环背靠背连接，形成中空的柱状结构。
Hsp10/GroES七聚体形成一个圆顶结构，覆盖在中心空上。
蛋白质分子结合于远端环的孔中
Hsp60/GroEL forms an
oligomeric ring structure
Hsp60/GroEL作用有 两种模型。一种推测是它提供了一个让蛋白质在其中进行自我装配的保护性环境。另一种模型认为它发挥类似 Hsp70的引导作用。现在发现的证据支持后一种模型，即直接影响折叠。
ATP水解在 GroeEL/ES的行为中发挥着重要作用。和 GroES相结合的 GroEL环上的每一个亚基都有一个 ATP分子,GroES的结合伴随着 7分子 ATP的水解。这种
GroEL/ES复合物在 ADP-bound形式下是稳定的。 GroEL远侧环上的亚基也结合有
ATP。这些 ATP分子的水解是和邻近环上
ADP的取代相结合的。这种交换释放
GroES
Misfolding of proteins can be caused by
What can go wrong?
Mutation in the DNA so that the amino acid sequence
differs from normal
Lack of an enzyme or chaperone needed to fold a protein
Correctly folded protein becoming misfolded by
accumulated damage due to oxidation or other chemical
reaction
Interaction with other misfolded protein
Misfolding can cause disease in several
ways
A protein is non-functional
A protein is in short supply
A protein is unable to get to the right place,due to inability
to fold correctly
The presence of protein aggregates,that have a damaging
effect on the cell
One important factor to keep in mind:
Defective and misfolded proteins are normally rapidly
degraded by proteolysis,It may therefore not always be
obvious that a protein is misfolding,it may look as if it
is absent,
Inherited Diseases
Usually a total absence of a protein will be lethal,so large deletions in the DNA will
usually alter the protein so drastically that the embryo does not survive,In general a
small change,such as the mutation of one amino acid or a small deletion will not
inactivate a protein unless it is in the active site of an enzyme,a ligand binding site or
in an essential structural position (such as a sharp turn where only certain
conformations can occur,or in amino acids involved in salt bridges in the interior of
the molecule),Many single amino acid mutations have little affect on the folding,but
in a number of cases it has been shown that a mutation produces a defect in folding,
that results in a less efficient,or unstable protein,In some others the effect is to cause
an abnormal interaction,so that a new type of structure is formed.
Inherited diseases have examples of all four types of consequences of misfolded protein,
Emphysema肺气肿 is due to a lack of?-anti-proteinase,
Osteogenesis imperfecta 不完全成骨 is due to an unstable fold,
Cystic fibrosis 囊性纤维 and familial hypercholesteremia 高胆固醇血症
may be due to a misfolded protein that cannot take up its proper position,
Familial amyloidosis淀粉样变性病 and Alzheimer's disease involve
aggregation of misfolded proteins.
Chaperonin
(分子伴侣 )
Protein Folding
1,Deacylation,acylation of N-terminus
2,Proteolysis
3,Methylation
4,Phosphorylation
5,Sidechain modification for cross-linking
6,Conversion of sidechains to prosthetic groups
7,Attachment of prosthetic groups
8,Attachment of lipids
9,glycosylation
74
Postranslational Modifications
Protein modification
微小的取代：氨基酸侧链的改变，共价修饰。
除了 Ala,Gly,Ile,Leu,Met and Val六种氨基酸外，其它氨基酸都可以被修饰。修饰的方式包括磷酸化 Phosphorylaton，乙酰化 acetylation，
甲基化 methylation，羟基化 hydroxylation，糖基化 glycosylation
增大：特定氨基酸残基上添加体积较大的基团或主链修饰
剪切从新生肽链上除去残基
修饰可能是永久的，也可以是可逆的氨基酸侧链的较小的取代
永久性并与蛋白质功能相关，如在胶原蛋白中
Pro的羟基化稳定了三股螺旋组成的三级结构；
甲状腺球蛋白的碘化；凝血酶原谷胺酰胺残基的
г-羧化。
分子内或分子间键的形成：很多细胞外蛋白中二硫键的形成，如胰岛素；免疫球蛋白
可逆性与活性修饰相关：如 TyrSerThr的羟基磷酸化调节酶的活性，酪氨酸激酶和细胞周期蛋白激酶；组蛋白赖氨酸残基的乙酰化可调节他们形成高级染色质结构的活性，并在染色质结构域的建立中起重要作用
75
76
O-linkage to GalNAc
N-linkage to GlcNAc
Posttranslation Modifications 1
Vitamin K-Dependent Modifications
Vitamin K is a cofactor in the
carboxylation of glutamine residues,
The result of this type of reaction is a g-
carboxyglutamate (called a gla residue),
The formation of gla residues within
several proteins of the blood clotting
cascade is critical for their normal
function,The presence of gla residues
allows the protein to chelate calcium
ions and thereby render an altered
conformation and biological activity to
the protein.
Sulfation
Sulfate modification of proteins
occurs at tyrosine residues such as in fibrinogen
and in some secreted proteins (eg gastrin),The
universal sulfate donor is 3'-phosphoadenosyl-5'-
phosphosulphate (PAPS),
Since sulfate is added permanently it
is necessary for the biological activity and not
used as a regulatory modification like that of
tyrosine phosphorylation.
Posttranslation Modifications 2
Selenium is a trace element and is found as a
component of several prokaryotic and
eukaryotic enzymes that are involved in redox
reactions,The selenium in these selenoproteins
is incorporated as a unique amino acid,
selenocysteine,during translation,A particularly
important eukaryotic selenoenzyme is glutathione
peroxidase,This enzyme is required
during the oxidation of glutathione by hydrogen
peroxide (H2O2) and organic hydroperoxides.
Phosphorylation
Post-translational phosphorylation is one of the most
common protein modifications that occurs in animal
cells,The vast majority of phosphorylations occur as a
mechanism to regulate
the biological activity of a protein and as such are
transient,In other words a phosphate (or more than one
in many cases) is added and later removed,
The enzymes that phosphorylate proteins are termed
kinases and those that remove phosphates are termed
phosphatases,
ATP + protein <----> phosphoprotein + ADP
较大的侧链或主链修饰
侧链上添加与蛋白质功能有关的化学基团
– 酶活力所必需的核苷酸的增加，如大肠杆菌中谷胺酰胺合成酶中腺苷酸基团的添加； Hedgehog信号蛋白质上胆固醇的添加控制其扩散；细胞色素 C与珠蛋白上血红素辅基的添加
与蛋白质导向与加工有关的
– 半胱氨酸的酰化使蛋白质导向细胞膜
– 在 Asn-X-Ser/Thr序列中天冬氨酸残基的 N-糖基化使蛋白质进入分泌途径
– 蛋白质的泛肽化使蛋白质定向降解
末端残基修饰
– 许多胞浆蛋白 N端残基的酰化常常和蛋白质的转运有关，如 Ras的豆蔻酰化使其定向到细胞膜肽链的剪切
很多蛋白质起始的 Met通过共翻译或后翻译切除
分泌型蛋白质在穿越内质网膜的转运过程中信号肽被切除
非成熟蛋白质 -蛋白原 (proprotein,蛋白前体 )通过剪切成熟：如酶原 zymogens蛋白通过水解后活化 ;胰岛素原内部 C肽的去除
遗传信息的加工：脊髓灰质炎病毒基因组和哺乳类速激肽基因合成的多蛋白的剪切；内蛋白子
inteins的剪切
多蛋白：噬菌体、病毒的转录物以及许多真核生物编码激素的 mRNA翻译后先成为一条多肽链，
随后被特定的蛋白酶切割，结果可产生多种成熟的蛋白质分子。
Protein degradation
蛋白质的稳定性相差很大,半衰期从几分钟 (如很多调节蛋白 )到几个星期或更长 (如很多结构和储存蛋白：胶原蛋白,血红蛋白等 )
在细胞中存在着几种不同的降解途径,其活性根据营养状态和涉及蛋白质的修饰的其它细胞信号的不同
– 很多具有不稳定特征的蛋白质都含有 PEST位点 (PEST site),即富含 pro,glu,ser,thr的序列 。
– 另一些蛋白质可能通过翻译后修饰被定位到降解途径
– 也有的通过凡特定残基的化学修饰与小的蛋白 泛素 结合
N端法则 (N-end rule)：蛋白质的 N端残基及其修饰状态可能通过作为泛素形成潜在的靶位点,在蛋白质代谢的调节中起重要作用
– 稳定性高 Ala,Cys,Gly,Met,Pro,Ser,Thr,Val (t1/2>20h)
– 稳定性低 Arg,His,Ile,Leu,Lys,Phe,Trp,Tyr (t1/2~2-30min)
Proteases in Cell
一个细胞包含许多蛋白酶,有多种特性 。 可将其分为三类：
一些蛋白酶参与特殊的加工过程以产生成熟的蛋白,包括从分泌蛋白切信号序列,切胞液酶使成熟 。 caspase蛋白酶参与了细胞凋亡的过程
溶酶体 Lysosome是膜包围的细胞器,降解进入细胞的蛋白 。
蛋白酶体 proteasome是一个大的复合体,能够降解进入细胞液的蛋白,它作用于已与泛素肽链连接的底物蛋白和已形成多泛素链的蛋白,既参与普遍的降解 （ 将一个蛋白完全变成小片断 ）,也参与一些特殊加工事件 。
Proteasome蛋白酶体
Proteasome蛋白酶体有两种形式。一是 20S复合体 700KD，有蛋白酶活性。辅助蛋白可将复
20S转为 26S (2000Kd)的形式，它们的调节亚基有与泛素结合的特性。
20S向 26S的转换，肽链断裂，释放产物等过程都需要 ATP释放。
20S复合体是中空的圆柱状，由 7种不同?和?
亚基组成 的反向环结合而成，一个 19S的 cap结合于 20S复合体的一端或两端，形成 26S复合体。
泛素的定向作用
蛋白酶体降解蛋白分为两步：首先将蛋白定向,然后酶解 。 定向是由 泛素循环
ubiquitin cycle来完成的
泛素 ubiquitin一小段多肽,与将降解的底物蛋白共价连接 。 泛素化系统有三个组分 。
泛素活化酶 E1,利用水解 ATP,通过高能的硫酯键,连接半胱氨酸残基与泛素
C-末端的甘氨酸残基 。 然后泛素移向泛素结合酶 E2,由 E2将其与底物蛋白的赖氨酸的?氨基通过异肽键连接 。 蛋白连接酶 E3负责识别底物蛋白 。 泛素通过异肽酶从降解的底物上释放 。
Feature of hydrolytic mechanism of the
proteasome
Proteasome水解蛋白质的机制不同于其它蛋白酶，其催化中心是位于 N端的 Thr残基，由 Thr的羟基攻击底物蛋白质的肽键
Proteasome 有数种蛋白酶的活性，各有其特异性，可以分别攻击酸性、碱性和中性氨基酸，具有广泛性。
不同的水解酶活性和底物特性是由不同亚基提供的，
有时一种特异的酶活性由两种以上的亚基协同完成。
底物的降解是在中央小室内完成的，没有中间产物，
直到将底物蛋白分解到一定的大小以下，才将产物排出。
通常产物为 8-9个残基的小肽。
翻译水平的调控
一,mRNA运输控制 （ transport control） 是对转录物从细胞核运送到细胞质中的数量进行调节 ;
二,mRNA翻译的控制
三,mRNA的结构和翻译的效率
四,翻译的起始调节
五,选择性翻译
六,反义 RNA调控
七,翻译的自我调节起始因子的修饰与翻译起始调控
eIF-2磷酸化对翻译起始的影响。用兔网织红细胞粗抽提液研究蛋白质合成时发现，如果不向这一体系中添加氯高铁血红素，几分钟之内蛋白质合成活性急剧下降，直到完全消失。这就是说，当没有氯高铁血红素存在时，
网织红细胞粗抽提液中的蛋白质合成抑制剂就被活化，从而抑制蛋白质合成。现已查明，该抑制剂 HCI是受氯高铁血红素调节的，它其实是 eIF-2的激酶，可以使 eIF-2的 α 亚基磷酸化，并由活性型变成非活性型
mRNA翻译的控制在高等真核生物中转运铁蛋白受体（ TfR）和铁蛋白负责铁吸收和铁解毒。这两个 mRNA上存在相似的顺式作用元件，称为铁应答元件 iron responsive element,
IRE,IRE与 IRE结合蛋白 IREBP
相互作用控制了这两个 mRNA的翻译效率。当细胞处于缺铁或高铁水平时，能产生两个数量级的蛋白水平差异，却没有在 mRNA
水平上发现存在显著差异。研究表明，位于 5’非翻译区的 IRE控制了铁蛋白 mRNA的翻译效率，
去掉这个非翻译区 IRE，可造成铁蛋白的永久性高水平翻译。当细胞缺铁时,IREBP与 IRE具有高亲和力，两者的结合有效地阻止了铁蛋白 mRNA的翻译，与此同时,TfR mRNA上 3'非翻译区中的 IRE也与 IREBP特异结合，
有效地阻上 TfR mRNA的降解，
促进 TfR蛋白的合成
Post-translation Processing in eukaryote
翻译后加工
蛋白质的分捡 Sorting
蛋白质的修饰 Modification
蛋白质的折叠 Folding
蛋白质的降解 Degradation
Protein Sorting
真核生物细胞被各种膜分成几个区域如：核仁、
线粒体等。不同的区域存在不同的蛋白质。蛋白质分子的这种分布是由遗传信息控制的。
真核生物细胞中蛋白质分子是在细胞质中合成的。
一些分子将留在细胞质中，另一些将转运到核仁、
线粒体等其它细胞器中，这个过程称为 蛋白质定位 (targeting),蛋白质分检 (Protin sorting),蛋白质易位 translocation等
蛋白质分子在细胞中的定位是由其序列中一段特定的序列决定的，这段序列称为 信号肽 signal
peptide或 前导肽 Leader
留在胞液中翻译后转运 ( 游离核糖体 ) 核依靠导肽 线粒体蛋白质转运 越 膜 叶绿体其它细胞器共翻译转运 依靠信号肽
( 膜结合核糖体 ) 越 膜图 1 5 - 2 8 蛋白质合成后的转运，定位及分泌
ER 糖基化修饰 分拣 高尔基体 溶酶体留在 ER 中 留在高尔基体分泌到胞外 质膜 包被在泡囊质膜中嵌在膜上翻译后转运 post-translation translocation
共翻译转运 co-translatonal translocation
Protein translocation
Movement of the secreted protein
proteins synthesized on
the rough ER are
extruded into the
space in between the
two membranes of the
ER?golgi complex
secretory vesicles
release of the
proteins to the outside
of the cell
信号肽位于 N端，一般由 13-36个残基组成，至少含一个带正电荷的氨基酸；在其后有一个 10-15个残基组成的疏水核；最后是较小的氨基酸如 Ala。
Positively charged residue Neutral residueHydrophobic core
Signal Peptides
Signal recognition particle
信号识别颗粒 SRP
Signal recognition particle 是由 7S snRNA和
proteins组成的 rRNP，能够识别信号肽序列
SRP结合于内质网膜外侧的受体上，此受体称为 停靠蛋白 docking protein。
蛋白质分子在穿过内质网腔时，信号肽被 信号肽酶 signal peptidase切除。
在 Golgi装置内,蛋白质分子被修饰，通常为糖基化修饰。不同的糖基化修饰可能控制着蛋白质的最终定位。
The structure of SRP
The 7S RNA of the SRP particle is divided into two parts,The 100 bases at the
5 end and 45 bases at the 3 end are closely related to the sequence of ALU
RNA,a common mammalian small RNA,They therefore define the ALU
domain,The remaining part of the RNA comprises the S domain,Five of the
six proteins bind directly to the 7S RNA,Each function of the SRP is associated
with a particular protein(s).
Protein transported into
mitochondria and chloroplasts
前导肽通常是疏水的，约 20aa，由非电负性氨基酸构成，中间夹有碱性氨基酸，而没有酸性氨基酸，羟基氨基酸含量高
易形成双亲?螺旋轮 amphiphilic
helix
不同的前导肽缺乏同源性，这意味着和识别有关的信号不是一极结构，
而是二级或三级结构
在细胞器的内外膜上都发现前导肽的受体
前导肽的切除是由导肽酶 transit
peptidase完成的
Two kinds of signal
The leader of yeast
cytochrome c1 contains
an N-terminal region
that targets the protein
to the mitochondrion,
followed by a region
that targets the (cleaved)
protein to the inner
membrane,The leader
is removed by two
cleavage events.
螺旋轮
酵母细胞色素氧化酶 C亚基先导肽形成的两亲螺旋结构新生蛋白质通过同步转运途径进入内质网内腔的过程
① 核糖体组装、翻译起始；②位于蛋白质 N-端的信号肽序列首先被翻译；③ SRP
与核糖体 GTP以及带有信号肽的新生蛋白质相结合，暂时中止肽链延伸；④核糖体 -SRP复合物与膜上的受体相结合；⑤ GTP水解，释放 SRP并进入新一轮循环；
⑥肽链更新开始延伸并不断向内腔运输；⑦信号肽被切除；⑧多肽合成结束核糖体解离并恢复到翻译起始前的状态膜蛋白形成过程细胞核的进出
核内蛋白是在胞内合成的，然后再运送到核内如 Histones,Nonhistones、
Ribosomal proteins(核糖核酸蛋白体 )
在核内装配的一些成分如 Ribosomal
subunit及 mRNA等，需转运到核外
核膜是双层膜，分为内膜和外膜，膜上有核孔，跨越内外膜
物质的转运是经过核孔完成的一些重要物质使用孔的频率核孔的模型
A model for the
nuclear pore shows
8-fold symmetry,
Two rings form the
upper and lower
surfaces (shown in
yellow); they are
connected by the
spokes (shown in
green on the inside
and blue on the
outside),
Transport receptors carry cargo
proteins through the pore
Exportins 是将底物 cargo由核内运转到细胞质中的运输容器或载体蛋白 transport receptors,carrier.
Importins是将底物 cargo由核外运转到核内的运输容器 transport receptors.
Transprotins是一种转运 hnRNP的运输容器
Nucleoporin 是指组成核孔复合物的基本成分载体蛋白
Importins
和底物结合，带底物穿过核孔，然后返回核中，
循环使用。
核输出信号具有输出和输入信号的蛋白出入核的多种途径
Nuclear localization signals核定位信号
无保守序列；
有一段短的碱性氨基酸序列；
常存在 Pro,可抑制碱性氨基酸的上游形成?螺旋；
有的 NLS有两个分开的短的簇
向核内运输 Nuclear import可分为两个过程，停泊和转运取决于胞质的成分。模型暗示了定位包括了一系列的停泊与非停泊反应。
某些核孔蛋白有一些简单肽重复序列
GKFG,FG,FXFG，而且包括该序列的核孔蛋白部分能结合 Importins的?亚基 。表明 Importins将底物蛋白带入孔，
它的?亚基结合底物,?亚基结合核孔蛋白。
支持转运的胞浆部分有两个活性成分。
一个是小 GTP酶，称 Ran，另一个还未知，可能与转移 Ran入核孔有关。与单体 GTP结合蛋白相同，变换鸟核苷酸需要其他蛋白 (即，用 GTP代替 GDP再产生 GTP酶的活性形式 )。
Nuclear import
Importins包含两个亚基?
和?,?亚基结合有 NLS
序列的蛋白,?亚基结合核孔
GTP和 Ran的状态控制核蛋白是“进”还是
“出”。通常 Ran-GTP存在于核内，有助 export
complexes的稳定,Ran-
GDP存在于胞内，有助于 import complexes 的稳定；因此
import complexes 在核外形成而在核内解离，
export complexes刚好相反
Importins
Nuclear export signal
许多出核蛋白有一个相同的 核输出信号 序列 Neuclear export signal
NES。
NES通常由 10左右的氨基酸，仅有的共同点为一个保守的 Leu序列分布 pattern
一个亚基上的 NES可使另一个蛋白从核中转运带有一个 NES的蛋白可使一个 RNA
从核中转运出
Exportins
Exportin-1的序列类似于 importin-?
Exportin-1对 snRNAs、一些 proteins、可能还有某些 mRNAs
从核内输出是必需的
Exportin-1有可以和 Ran-GTP,NES motif以及 nucleoporins
的结合位点。在 Ran-GTP有存在时,Exportin-1能够和三者结合形成复合物； 当 GTP水解生成 Ran-GDP 时。复合物也随之解离。
因此 Export过程也受到 Ran-GTP的控制,在核内 Ran-GTP含量高，复合物形成；输出到细胞质后 Ran-GTP变成 Ran-
GDP，复合物解体，这个过程刚好和 Improt相反类型 途径 目标 蛋白种类 结构和功能触动因子分子伴 侶 G ro E L,细菌的热休克蛋白，可稳定蛋白构型，是折叠调节器
Sec B,1 6 K d a,和前体结合阻止折叠，和 Se c A 结合将前体转运到膜外围膜蛋白 S e c A 1 0 7 K d a,和 S e c Y 亲和，有 A T P 酶活性共翻译转运 普遍性途径 越过内膜 S e c E,有 3 个跨膜区膜本体 复合体，有转运功能，是一种转运器蛋白 S e c Y,有 10 个跨膜区细菌的 导肽酶：切除导肽分泌 S R P 同源蛋白,4,5 S R N A + 4 8 K d a 蛋白。和新生肽的导肽结合，保持其构象分泌蛋白,H l y A,1 0 7 K D a,C 端信号供 H l y B 和 H l y D 识别，有拓扑顺序翻译后转运 孔经途径 越过内外膜 内膜蛋白,H l y B,7 7 K D a,C 端保守有 A T P 结合位点跨膜蛋白,H l y D,5 4 K D a,在 E,c o l i 膜粘连区形成孔道跨膜蛋白,T o l C,在外膜形成孔道图 1 5 -4 5 细菌分泌的不同途径细菌中蛋白质的越膜转运细菌中蛋白质的越膜转运导肽酶 导肽酶 导肽酶
S e c S e c
E Y
S e c A S e c A
新生肽 S e c B
S e c B 与新生肽结合蛋白转移到 S e c A 上
S e c B 再循环图 15 - 细菌中蛋白质的转运
Protein Folding
一些蛋白质分子具有自发折叠成有活性构象的能力，成为自装配 self-assembly,但是很多蛋白不能自我装配，而需要一个伴侣分子的帮助才能获得一个稳定的构象
分子伴侣 Chaperonin是能够介导靶蛋白正确装配的蛋白质分子，它能够限定靶蛋白分子只形成某一种构象而排除了其它可能的构象
分子伴侣通过与靶蛋白某些暴露的表面相互作用，而防止了这些表面与其它区域结合形成不正确的构象
Two major groups of chaperones
Hsp70 system由 Hsp70,Hsp40,and GrpE组成，主要作用于新合成的蛋白、穿膜运输蛋白以及在极端条件下变性的蛋白。 Hsp70和 Hsp40分别结合于各自的底物
Chaperonin system由大的寡聚物装配而成的复合体。这个复合体的结构使未折叠的蛋白分子能够插入其中
The Hsp70 family is ubiquitous
DnaJ和 DnaK在一个蛋白新生时结合上去的情形 。 当蛋白质链增长的时候,
DnaK会脱离结合点,然后与另一个结合,这样,释放底物蛋白的一部分,
使它正确而有序地折叠,最后,完整的蛋白从核糖体上释放出来,折叠成它成熟的构象,释放 DanK是在 DnaJ和 GrpE帮助下完成的 。 DnaJ和 GrpE
可以激活 Hsp70的 ATP酶活性 。
Hsp70的真核变种以同样的方式发生作用 。 它们可能要在 Hsp40的帮助下进行 (相当于 DnaJ)。 不同的 Hsp70作用在相应的靶蛋白上 。 胞液蛋白作用于从核糖体新生的蛋白 。 在内质网变种,线粒体或是染色质中对蛋白质产生更简单的作用,就像它们穿过膜而到达器官内部一样 。
Chaperonin system
Chaperonin system Hsp60一族组成一个大的包含两个亚基的容器。 Hsp60(大肠杆菌中的 GroEL)形成的结构包含 14个亚基，这些亚基以两个分别由７个亚基组成的环内翻，在各自的顶端连接。这意味着这双环的顶部和底部的表面相同，
而它们中心的是直连通的，这整个结构就像一中空的圆柱。 Hsp60/GroEL在指导折叠中起了必不可少的作用，有时也被叫作伴侣分子，而 Hsp10/GroES又是
Hsp60/ GroEL发挥作用所必需的，因此被叫做辅伴侣分子
Hsp60/GroEL
forms an oligomeric
ring structure
蛋白质分子包藏于柱状结构中，在被控制的环境下进行折叠或降解
Hsp60/GroEL
forms an oligomeric
ring structure
Hsp60/GroEL的两个环背靠背连接，形成中空的柱状结构。
Hsp10/GroES七聚体形成一个圆顶结构，覆盖在中心空上。
蛋白质分子结合于远端环的孔中
Hsp60/GroEL forms an
oligomeric ring structure
Hsp60/GroEL作用有 两种模型。一种推测是它提供了一个让蛋白质在其中进行自我装配的保护性环境。另一种模型认为它发挥类似 Hsp70的引导作用。现在发现的证据支持后一种模型，即直接影响折叠。
ATP水解在 GroeEL/ES的行为中发挥着重要作用。和 GroES相结合的 GroEL环上的每一个亚基都有一个 ATP分子,GroES的结合伴随着 7分子 ATP的水解。这种
GroEL/ES复合物在 ADP-bound形式下是稳定的。 GroEL远侧环上的亚基也结合有
ATP。这些 ATP分子的水解是和邻近环上
ADP的取代相结合的。这种交换释放
GroES
Misfolding of proteins can be caused by
What can go wrong?
Mutation in the DNA so that the amino acid sequence
differs from normal
Lack of an enzyme or chaperone needed to fold a protein
Correctly folded protein becoming misfolded by
accumulated damage due to oxidation or other chemical
reaction
Interaction with other misfolded protein
Misfolding can cause disease in several
ways
A protein is non-functional
A protein is in short supply
A protein is unable to get to the right place,due to inability
to fold correctly
The presence of protein aggregates,that have a damaging
effect on the cell
One important factor to keep in mind:
Defective and misfolded proteins are normally rapidly
degraded by proteolysis,It may therefore not always be
obvious that a protein is misfolding,it may look as if it
is absent,
Inherited Diseases
Usually a total absence of a protein will be lethal,so large deletions in the DNA will
usually alter the protein so drastically that the embryo does not survive,In general a
small change,such as the mutation of one amino acid or a small deletion will not
inactivate a protein unless it is in the active site of an enzyme,a ligand binding site or
in an essential structural position (such as a sharp turn where only certain
conformations can occur,or in amino acids involved in salt bridges in the interior of
the molecule),Many single amino acid mutations have little affect on the folding,but
in a number of cases it has been shown that a mutation produces a defect in folding,
that results in a less efficient,or unstable protein,In some others the effect is to cause
an abnormal interaction,so that a new type of structure is formed.
Inherited diseases have examples of all four types of consequences of misfolded protein,
Emphysema肺气肿 is due to a lack of?-anti-proteinase,
Osteogenesis imperfecta 不完全成骨 is due to an unstable fold,
Cystic fibrosis 囊性纤维 and familial hypercholesteremia 高胆固醇血症
may be due to a misfolded protein that cannot take up its proper position,
Familial amyloidosis淀粉样变性病 and Alzheimer's disease involve
aggregation of misfolded proteins.
Chaperonin
(分子伴侣 )
Protein Folding
1,Deacylation,acylation of N-terminus
2,Proteolysis
3,Methylation
4,Phosphorylation
5,Sidechain modification for cross-linking
6,Conversion of sidechains to prosthetic groups
7,Attachment of prosthetic groups
8,Attachment of lipids
9,glycosylation
74
Postranslational Modifications
Protein modification
微小的取代：氨基酸侧链的改变，共价修饰。
除了 Ala,Gly,Ile,Leu,Met and Val六种氨基酸外，其它氨基酸都可以被修饰。修饰的方式包括磷酸化 Phosphorylaton，乙酰化 acetylation，
甲基化 methylation，羟基化 hydroxylation，糖基化 glycosylation
增大：特定氨基酸残基上添加体积较大的基团或主链修饰
剪切从新生肽链上除去残基
修饰可能是永久的，也可以是可逆的氨基酸侧链的较小的取代
永久性并与蛋白质功能相关，如在胶原蛋白中
Pro的羟基化稳定了三股螺旋组成的三级结构；
甲状腺球蛋白的碘化；凝血酶原谷胺酰胺残基的
г-羧化。
分子内或分子间键的形成：很多细胞外蛋白中二硫键的形成，如胰岛素；免疫球蛋白
可逆性与活性修饰相关：如 TyrSerThr的羟基磷酸化调节酶的活性，酪氨酸激酶和细胞周期蛋白激酶；组蛋白赖氨酸残基的乙酰化可调节他们形成高级染色质结构的活性，并在染色质结构域的建立中起重要作用
75
76
O-linkage to GalNAc
N-linkage to GlcNAc
Posttranslation Modifications 1
Vitamin K-Dependent Modifications
Vitamin K is a cofactor in the
carboxylation of glutamine residues,
The result of this type of reaction is a g-
carboxyglutamate (called a gla residue),
The formation of gla residues within
several proteins of the blood clotting
cascade is critical for their normal
function,The presence of gla residues
allows the protein to chelate calcium
ions and thereby render an altered
conformation and biological activity to
the protein.
Sulfation
Sulfate modification of proteins
occurs at tyrosine residues such as in fibrinogen
and in some secreted proteins (eg gastrin),The
universal sulfate donor is 3'-phosphoadenosyl-5'-
phosphosulphate (PAPS),
Since sulfate is added permanently it
is necessary for the biological activity and not
used as a regulatory modification like that of
tyrosine phosphorylation.
Posttranslation Modifications 2
Selenium is a trace element and is found as a
component of several prokaryotic and
eukaryotic enzymes that are involved in redox
reactions,The selenium in these selenoproteins
is incorporated as a unique amino acid,
selenocysteine,during translation,A particularly
important eukaryotic selenoenzyme is glutathione
peroxidase,This enzyme is required
during the oxidation of glutathione by hydrogen
peroxide (H2O2) and organic hydroperoxides.
Phosphorylation
Post-translational phosphorylation is one of the most
common protein modifications that occurs in animal
cells,The vast majority of phosphorylations occur as a
mechanism to regulate
the biological activity of a protein and as such are
transient,In other words a phosphate (or more than one
in many cases) is added and later removed,
The enzymes that phosphorylate proteins are termed
kinases and those that remove phosphates are termed
phosphatases,
ATP + protein <----> phosphoprotein + ADP
较大的侧链或主链修饰
侧链上添加与蛋白质功能有关的化学基团
– 酶活力所必需的核苷酸的增加，如大肠杆菌中谷胺酰胺合成酶中腺苷酸基团的添加； Hedgehog信号蛋白质上胆固醇的添加控制其扩散；细胞色素 C与珠蛋白上血红素辅基的添加
与蛋白质导向与加工有关的
– 半胱氨酸的酰化使蛋白质导向细胞膜
– 在 Asn-X-Ser/Thr序列中天冬氨酸残基的 N-糖基化使蛋白质进入分泌途径
– 蛋白质的泛肽化使蛋白质定向降解
末端残基修饰
– 许多胞浆蛋白 N端残基的酰化常常和蛋白质的转运有关，如 Ras的豆蔻酰化使其定向到细胞膜肽链的剪切
很多蛋白质起始的 Met通过共翻译或后翻译切除
分泌型蛋白质在穿越内质网膜的转运过程中信号肽被切除
非成熟蛋白质 -蛋白原 (proprotein,蛋白前体 )通过剪切成熟：如酶原 zymogens蛋白通过水解后活化 ;胰岛素原内部 C肽的去除
遗传信息的加工：脊髓灰质炎病毒基因组和哺乳类速激肽基因合成的多蛋白的剪切；内蛋白子
inteins的剪切
多蛋白：噬菌体、病毒的转录物以及许多真核生物编码激素的 mRNA翻译后先成为一条多肽链，
随后被特定的蛋白酶切割，结果可产生多种成熟的蛋白质分子。
Protein degradation
蛋白质的稳定性相差很大,半衰期从几分钟 (如很多调节蛋白 )到几个星期或更长 (如很多结构和储存蛋白：胶原蛋白,血红蛋白等 )
在细胞中存在着几种不同的降解途径,其活性根据营养状态和涉及蛋白质的修饰的其它细胞信号的不同
– 很多具有不稳定特征的蛋白质都含有 PEST位点 (PEST site),即富含 pro,glu,ser,thr的序列 。
– 另一些蛋白质可能通过翻译后修饰被定位到降解途径
– 也有的通过凡特定残基的化学修饰与小的蛋白 泛素 结合
N端法则 (N-end rule)：蛋白质的 N端残基及其修饰状态可能通过作为泛素形成潜在的靶位点,在蛋白质代谢的调节中起重要作用
– 稳定性高 Ala,Cys,Gly,Met,Pro,Ser,Thr,Val (t1/2>20h)
– 稳定性低 Arg,His,Ile,Leu,Lys,Phe,Trp,Tyr (t1/2~2-30min)
Proteases in Cell
一个细胞包含许多蛋白酶,有多种特性 。 可将其分为三类：
一些蛋白酶参与特殊的加工过程以产生成熟的蛋白,包括从分泌蛋白切信号序列,切胞液酶使成熟 。 caspase蛋白酶参与了细胞凋亡的过程
溶酶体 Lysosome是膜包围的细胞器,降解进入细胞的蛋白 。
蛋白酶体 proteasome是一个大的复合体,能够降解进入细胞液的蛋白,它作用于已与泛素肽链连接的底物蛋白和已形成多泛素链的蛋白,既参与普遍的降解 （ 将一个蛋白完全变成小片断 ）,也参与一些特殊加工事件 。
Proteasome蛋白酶体
Proteasome蛋白酶体有两种形式。一是 20S复合体 700KD，有蛋白酶活性。辅助蛋白可将复
20S转为 26S (2000Kd)的形式，它们的调节亚基有与泛素结合的特性。
20S向 26S的转换，肽链断裂，释放产物等过程都需要 ATP释放。
20S复合体是中空的圆柱状，由 7种不同?和?
亚基组成 的反向环结合而成，一个 19S的 cap结合于 20S复合体的一端或两端，形成 26S复合体。
泛素的定向作用
蛋白酶体降解蛋白分为两步：首先将蛋白定向,然后酶解 。 定向是由 泛素循环
ubiquitin cycle来完成的
泛素 ubiquitin一小段多肽,与将降解的底物蛋白共价连接 。 泛素化系统有三个组分 。
泛素活化酶 E1,利用水解 ATP,通过高能的硫酯键,连接半胱氨酸残基与泛素
C-末端的甘氨酸残基 。 然后泛素移向泛素结合酶 E2,由 E2将其与底物蛋白的赖氨酸的?氨基通过异肽键连接 。 蛋白连接酶 E3负责识别底物蛋白 。 泛素通过异肽酶从降解的底物上释放 。
Feature of hydrolytic mechanism of the
proteasome
Proteasome水解蛋白质的机制不同于其它蛋白酶，其催化中心是位于 N端的 Thr残基，由 Thr的羟基攻击底物蛋白质的肽键
Proteasome 有数种蛋白酶的活性，各有其特异性，可以分别攻击酸性、碱性和中性氨基酸，具有广泛性。
不同的水解酶活性和底物特性是由不同亚基提供的，
有时一种特异的酶活性由两种以上的亚基协同完成。
底物的降解是在中央小室内完成的，没有中间产物，
直到将底物蛋白分解到一定的大小以下，才将产物排出。
通常产物为 8-9个残基的小肽。
