基因组文库具有代表性的基因文库基因文库 —是来自于某种生物的不同
DNA序列的集合
基因组文库 —用于构建文库的 DNA来源于基因组 DNA
cDNA—用于构建文库的 DNA是 mRNA群体的拷贝（ cDNA），则该文库称之为 cDNA文库具有代表性的基因文库应该在最大限度上覆盖所有的原始序列文库大小以最大可能可获得某一特定序列的基因文库所必须包含的重组体数的计算方式如下
N＝ ln(1-p)/ln(1-f)
P—给定的概率,f—插入片段大小占总基因组大小的比例如果给定概率为 0.99，插入片段为 20kb的情况下，
对人类基因组（ 3Χ109bp）来说，所需重组体的数目为 6.9 Χ 105； 而对于大肠杆菌而言，仅需要
1100个重组体因此，插入大小仅有 5－ 10kp的质粒就可以很好地构建原核生物的基因组文库，
因为只需要几千个重组体就够了而对于较大的基因组，较大的插入片段可以使所需的重组体数量减少，这也正是开发黏粒以及 YAC载体的原因基因组 DNA
为了构建具有代表性的基因文库，必须将纯化后的基因组 DNA进行随机切割，产生适合克隆进所有载体的大小合适的片段真核生物基因组 DNA的提取
提取细胞核 —为了防止器官（叶绿体、线粒体）
DNA的污染
蛋白酶降解及分相抽提 —去除蛋白质、脂类以及其他的大分子杂质原核细胞基因组 DNA的提取
直接抽提 DNA
经提取的基因组 DNA是由染色体断裂而成的数百 kp大小的长片段构成长片段的进一步切割
物理剪切 —利用振荡、超声等物理方法剪切可以非常随机地进一步将长片段切割成小片段，片段末端通常都是平末端
限制性酶解 —位点非随机分布基因组 DNA片段的限制性内切酶酶解使用限制性内切酶酶解基因组 DNA可产生非随机片段，为了获得 15－ 25kb的或更大的基因组 DNA片段（适用于 λ 噬菌体或黏粒载体的片段 ），需要进行 部分酶解,即通过合理使用限制性内切酶
（种类和用量），调节酶切片段的大小合适的酶切片段可由琼脂糖凝胶电泳或蔗糖梯度纯化回收载体质粒载体 —用于基因组较小的生物，如大肠杆菌，用质粒载体来构建基因组文库，只需 5000个克隆就可以达到高于 99
％的覆盖率构建较大的基因组文库
*λ 噬菌体 — 最大可插入片段,23kb
黏粒 — 45kb
细菌人工染色体（ BAC） — 350kb
酵母人工染色体 (YAC)— 1000kb
基因组 DNA文库的构建流程提取切割整合转化质粒载体蓝白筛选噬菌体及黏粒载体
YAC载体
How m any clo ne s for one hu m an
geno m e?
V e c t or A vg,I ns e r t S i z e # of Cl one s
p l a s m i d 1,000 bp 3,000,0 00
pha g e 15,00 0 bp 200,0 00
co s m i d 50,00 0 bp 60,00 0
YA C 200,0 00 bp 15,00 0
cDNA文库
mRNA分离、纯化与分离
cDNA的合成
cDNA末端的处理与载体的连接
mRNA分离、纯化与分离通常用于构建 cDNA的是真核细胞的 mRNA
由于 cDNA从 mRNA合成而来，代表了基因组的可转录部分，不含内含子序列，因此可被用于在大肠杆菌中表达编码蛋白由于每类细胞和组织只表达一套特定的基因，因此从特定组织中制备的 mRNA通常会富集某些特异序列。所以起始材料的选择十分重要
mRNA的提取全长 mRNA具有一个 polyA的 3’末端，可以被用于
mRNA的分离；
可以用寡聚纤维素柱，选择性地吸附 mRNA
纯化
P urify poly(A ) RNA
Onl y m RN A h a s po l y (A) t a il,Pu ri f y m RN A b y
h y b r idisa ti o n t o oi g o ( d T) b e a d s.
H y b r idise El u te
cDNA的合成第一链合成时，反转录酶需要一个引物以延伸合成 mRNA
模板的拷贝，通常用的引物是寡聚 dT
第二链合成
cDNA末端的处理
由于大片段的平末端连接效率非常低，因此为了避免用平末端与载体连接，对双链 cDNA
的末端进行加工是十分必要的
方法：添加特异性核酸接头以形成适合于克隆的黏性末端
末端转移酶 —可以向 cDNA末端加上与克隆载体末端互补的尾部与载体的连接筛选从基因文库的大量克隆中鉴定出某个含有目的基因的特定克隆的过程，称为 筛选筛选过程通常需要一个核酸探针进行杂交，该探针可以与其互补序列结合从而检测出含目的基因的克隆通常构建核酸探针，要求了解其基因序列或表达产物（蛋白质）的信息探针的制作方法聚合酶链式反应（ PCR）
从目的基因的表达产物（蛋白质）的序列信息，可以派生出其可能的 DNA序列混合物，
根据该序列信息，可以采用 PCR技术构建核酸探针
PCR探针
寡聚核苷酸探针平板杂交筛选克隆 DNA转移到尼龙膜上；膜上的 DNA在碱性条件下变性，解聚形成单链；再通过烤膜或紫外线照射，单链将与膜紧密结合；再将膜置于含有放射性标记的核酸探针的溶液中保温，使探针与其互补序列进行杂交；
杂交后充分洗去未杂交的探针，然后可由放射性自显影鉴定寡聚核苷酸探针抗体探针克隆的鉴定克隆的鉴定是指重组 DNA分子的各种特性，如大小、限制性图谱、基因的方向以及核苷酸序列等，具体步骤包括：
已经克隆化的 DNA样品的纯化
制作限制性图谱
DNA与 RNA杂交限制性图谱片段大小
对于质粒或噬菌体克隆中插入的基因组 DNA
片段或 cDNA片段的大小，可以用将插入片段与载体 DNA分开的限制性内切酶来酶解，如用 ECOR1位点构建的 cDNA克隆，最好还用
ECOR1来酶解，可以回收插入片段和载体，再通过琼脂糖电泳就可以知道插入片段以及载体分子的大小了插入片段的方向以及多插入片段时的排列顺序
采用多种限制性酶来单切或组合切割
可以得到不同的特异性酶解片段
再分别进行组合（拼接）
得到插入序列的信息
DNA与 RNA的杂交检测能与特定探针杂交的 DNA（ southern）
或 RNA（ northern）
DNA Hybridization (Southern)
B
A
C
D
E
The mixture of double-stranded DNA
fragments generated by restriction
nuclease treatment of DNA is separated
according to length by electrophoresis,
A sheet of either nitrocellulose paper or nylon
paper is laid over the gel,and the separated
DNA fragments are transferred to the sheet
by blotting,The gel is supported on a layer of
sponge in a bath of alkali solution,and the
buffer is sucked through the gel and the
nitrocellulose paper by paper towels stacked
on top of the nitrocellulose,As the buffer is
sucked through,it denatures the DNA and
transfers the single-stranded fragments from
the gel to the surface of the nitrocellulose
sheet,where they adhere firmly,This transfer
is necessary to keep the DNA firmly in place
while the hybridization procedure (D) is
carrried out,
The nitrocellulose sheet is carefully
peeled off the gel.
The sheet containing the bound single-
stranded DNA fragments is placed in a
sealed plastic bag together with buffer
containing a radioactively labeled DNA
probe specific for the required DNA
sequence,The sheet is exposed for a
prolonged period to the probe under
conditions favoring hybridization,
The sheet is removed from the bag and
washed thoroughly,so that only probe
molecules that have hybridized to the DNA on
the paper remain attached,After
autoradiography,the DNA that has hybridized
to the labeled probe will show up as bands on
the autoradiograph,An adaptation of this
technique to detect specific sequences in RNA
is called Northern blotting,In this case mRNA
molecules are electrophoresed through the
gel and the probe is usually a single-stranded
DNA molecule,
DNA测序化学法 (Maxam,Gilbert)
酶法（ Sanger）
加法系统
碱法系统聚合酶链式反应（ PCR）
聚合酶链式反应
通过合理的引物设计，与目标 DNA分子互补，
能被 DNA聚合酶延伸，被引物结合的模板区就可以通过变性、引物退火和聚合的循环来大量扩增，该过程就是聚合酶链式反应
Polymerase Chain Reaction (PCR)
变性 退火 聚合
DNA序列的集合
基因组文库 —用于构建文库的 DNA来源于基因组 DNA
cDNA—用于构建文库的 DNA是 mRNA群体的拷贝（ cDNA），则该文库称之为 cDNA文库具有代表性的基因文库应该在最大限度上覆盖所有的原始序列文库大小以最大可能可获得某一特定序列的基因文库所必须包含的重组体数的计算方式如下
N＝ ln(1-p)/ln(1-f)
P—给定的概率,f—插入片段大小占总基因组大小的比例如果给定概率为 0.99，插入片段为 20kb的情况下，
对人类基因组（ 3Χ109bp）来说，所需重组体的数目为 6.9 Χ 105； 而对于大肠杆菌而言，仅需要
1100个重组体因此，插入大小仅有 5－ 10kp的质粒就可以很好地构建原核生物的基因组文库，
因为只需要几千个重组体就够了而对于较大的基因组，较大的插入片段可以使所需的重组体数量减少，这也正是开发黏粒以及 YAC载体的原因基因组 DNA
为了构建具有代表性的基因文库，必须将纯化后的基因组 DNA进行随机切割，产生适合克隆进所有载体的大小合适的片段真核生物基因组 DNA的提取
提取细胞核 —为了防止器官（叶绿体、线粒体）
DNA的污染
蛋白酶降解及分相抽提 —去除蛋白质、脂类以及其他的大分子杂质原核细胞基因组 DNA的提取
直接抽提 DNA
经提取的基因组 DNA是由染色体断裂而成的数百 kp大小的长片段构成长片段的进一步切割
物理剪切 —利用振荡、超声等物理方法剪切可以非常随机地进一步将长片段切割成小片段，片段末端通常都是平末端
限制性酶解 —位点非随机分布基因组 DNA片段的限制性内切酶酶解使用限制性内切酶酶解基因组 DNA可产生非随机片段，为了获得 15－ 25kb的或更大的基因组 DNA片段（适用于 λ 噬菌体或黏粒载体的片段 ），需要进行 部分酶解,即通过合理使用限制性内切酶
（种类和用量），调节酶切片段的大小合适的酶切片段可由琼脂糖凝胶电泳或蔗糖梯度纯化回收载体质粒载体 —用于基因组较小的生物，如大肠杆菌，用质粒载体来构建基因组文库，只需 5000个克隆就可以达到高于 99
％的覆盖率构建较大的基因组文库
*λ 噬菌体 — 最大可插入片段,23kb
黏粒 — 45kb
细菌人工染色体（ BAC） — 350kb
酵母人工染色体 (YAC)— 1000kb
基因组 DNA文库的构建流程提取切割整合转化质粒载体蓝白筛选噬菌体及黏粒载体
YAC载体
How m any clo ne s for one hu m an
geno m e?
V e c t or A vg,I ns e r t S i z e # of Cl one s
p l a s m i d 1,000 bp 3,000,0 00
pha g e 15,00 0 bp 200,0 00
co s m i d 50,00 0 bp 60,00 0
YA C 200,0 00 bp 15,00 0
cDNA文库
mRNA分离、纯化与分离
cDNA的合成
cDNA末端的处理与载体的连接
mRNA分离、纯化与分离通常用于构建 cDNA的是真核细胞的 mRNA
由于 cDNA从 mRNA合成而来，代表了基因组的可转录部分，不含内含子序列，因此可被用于在大肠杆菌中表达编码蛋白由于每类细胞和组织只表达一套特定的基因，因此从特定组织中制备的 mRNA通常会富集某些特异序列。所以起始材料的选择十分重要
mRNA的提取全长 mRNA具有一个 polyA的 3’末端，可以被用于
mRNA的分离；
可以用寡聚纤维素柱，选择性地吸附 mRNA
纯化
P urify poly(A ) RNA
Onl y m RN A h a s po l y (A) t a il,Pu ri f y m RN A b y
h y b r idisa ti o n t o oi g o ( d T) b e a d s.
H y b r idise El u te
cDNA的合成第一链合成时，反转录酶需要一个引物以延伸合成 mRNA
模板的拷贝，通常用的引物是寡聚 dT
第二链合成
cDNA末端的处理
由于大片段的平末端连接效率非常低，因此为了避免用平末端与载体连接，对双链 cDNA
的末端进行加工是十分必要的
方法：添加特异性核酸接头以形成适合于克隆的黏性末端
末端转移酶 —可以向 cDNA末端加上与克隆载体末端互补的尾部与载体的连接筛选从基因文库的大量克隆中鉴定出某个含有目的基因的特定克隆的过程，称为 筛选筛选过程通常需要一个核酸探针进行杂交，该探针可以与其互补序列结合从而检测出含目的基因的克隆通常构建核酸探针，要求了解其基因序列或表达产物（蛋白质）的信息探针的制作方法聚合酶链式反应（ PCR）
从目的基因的表达产物（蛋白质）的序列信息，可以派生出其可能的 DNA序列混合物，
根据该序列信息，可以采用 PCR技术构建核酸探针
PCR探针
寡聚核苷酸探针平板杂交筛选克隆 DNA转移到尼龙膜上；膜上的 DNA在碱性条件下变性，解聚形成单链；再通过烤膜或紫外线照射，单链将与膜紧密结合；再将膜置于含有放射性标记的核酸探针的溶液中保温，使探针与其互补序列进行杂交；
杂交后充分洗去未杂交的探针，然后可由放射性自显影鉴定寡聚核苷酸探针抗体探针克隆的鉴定克隆的鉴定是指重组 DNA分子的各种特性，如大小、限制性图谱、基因的方向以及核苷酸序列等，具体步骤包括：
已经克隆化的 DNA样品的纯化
制作限制性图谱
DNA与 RNA杂交限制性图谱片段大小
对于质粒或噬菌体克隆中插入的基因组 DNA
片段或 cDNA片段的大小，可以用将插入片段与载体 DNA分开的限制性内切酶来酶解，如用 ECOR1位点构建的 cDNA克隆，最好还用
ECOR1来酶解，可以回收插入片段和载体，再通过琼脂糖电泳就可以知道插入片段以及载体分子的大小了插入片段的方向以及多插入片段时的排列顺序
采用多种限制性酶来单切或组合切割
可以得到不同的特异性酶解片段
再分别进行组合（拼接）
得到插入序列的信息
DNA与 RNA的杂交检测能与特定探针杂交的 DNA（ southern）
或 RNA（ northern）
DNA Hybridization (Southern)
B
A
C
D
E
The mixture of double-stranded DNA
fragments generated by restriction
nuclease treatment of DNA is separated
according to length by electrophoresis,
A sheet of either nitrocellulose paper or nylon
paper is laid over the gel,and the separated
DNA fragments are transferred to the sheet
by blotting,The gel is supported on a layer of
sponge in a bath of alkali solution,and the
buffer is sucked through the gel and the
nitrocellulose paper by paper towels stacked
on top of the nitrocellulose,As the buffer is
sucked through,it denatures the DNA and
transfers the single-stranded fragments from
the gel to the surface of the nitrocellulose
sheet,where they adhere firmly,This transfer
is necessary to keep the DNA firmly in place
while the hybridization procedure (D) is
carrried out,
The nitrocellulose sheet is carefully
peeled off the gel.
The sheet containing the bound single-
stranded DNA fragments is placed in a
sealed plastic bag together with buffer
containing a radioactively labeled DNA
probe specific for the required DNA
sequence,The sheet is exposed for a
prolonged period to the probe under
conditions favoring hybridization,
The sheet is removed from the bag and
washed thoroughly,so that only probe
molecules that have hybridized to the DNA on
the paper remain attached,After
autoradiography,the DNA that has hybridized
to the labeled probe will show up as bands on
the autoradiograph,An adaptation of this
technique to detect specific sequences in RNA
is called Northern blotting,In this case mRNA
molecules are electrophoresed through the
gel and the probe is usually a single-stranded
DNA molecule,
DNA测序化学法 (Maxam,Gilbert)
酶法（ Sanger）
加法系统
碱法系统聚合酶链式反应（ PCR）
聚合酶链式反应
通过合理的引物设计，与目标 DNA分子互补，
能被 DNA聚合酶延伸，被引物结合的模板区就可以通过变性、引物退火和聚合的循环来大量扩增，该过程就是聚合酶链式反应
Polymerase Chain Reaction (PCR)
变性 退火 聚合
