第三章 酶生物体内不断进行着各种化学变化。绿色植物和某些细菌能以十分简单的物质(如水、CO2和无机盐)为原料合成各种复杂物质，并把太阳能转化为化学能贮存于有机物质中；而其他生物又能分解这些复杂物质，从中获取能量。例如，动物以植物体中的淀粉等复杂物质为食物，将淀粉降解成单糖，并在细胞内进一步分解为CO2和水，同时释放能量供动物生长、发育、运动等各种生命活动需要。在实验室中，复杂有机物的合成与分解必需在高温、高压、强酸或强碱等剧烈条件下进行，而在生物体内虽然条件十分温和，许多复杂的化学变化却进行得极顺利和迅速，这种使化学反应变得容易和迅速的根本原因就是生物体内普遍存在着生物催化剂——酶。酶与其他催化剂不同，它具有很大的专一性和极高的催化效率，能在机体中十分温和的条件下起高效率的催化作用，这不是无机催化剂所能比拟的。
人们对酶的认识起源于生产实践。我国几千年前就开始制作发酵饮料及食品。夏禹时代，酿酒已经出现，周代已能制作饴糖和酱。春秋战国时期已能用曲治疗消化不良。1833年Payon和Persoz从麦芽提取液中分离得到一种能水解淀粉的物质，称之为淀粉酶。1857 年微生物学家Pasteur等人提出酒精发酵是酵母细胞活动的结果，1878年提出了“酶”这个概，Liebig等人提出发酵现象是由溶解于细胞液中的酶引起的。1913年Michaelis和Menten提出了酶动力学原理——米氏学说，这对酶学反应机理的研究是一个突破。1926年Sumner第一次从刀豆中提取出了脲酶结晶，并第一次证明酶有蛋白质性质。20世纪30年代Northrop又分离出了结晶的胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶，并进行了动力学探讨，确立了酶的蛋白质本质。
现已鉴定出4 000多种酶，其中不少得到结晶，很多种的一级结构或三级结构也已经阐明。随着酶学理论研究的不断深入必将对生命本质的探索作出更大的贡献。
酶的命名与分类一、习惯命名法
1961年以前使用的酶的名称都是习惯沿用的，称为习惯名。习惯命名的原则是：
（1）绝大多数酶依据其底物来命名 如催化水解淀粉的称为淀粉酶，催化水解蛋白质的称为蛋白酶。
（2）某些酶根据所催化的反应性质来命名 如水解酶催化底物分子水解，转氨酶催化一种化合物上的氨基转移至另一化合物上。
（3）有的酶结合上述两个原则来命名 如琥珀酸脱氢酶是催化琥珀酸脱氢反应的酶。
（4）在这些命名的基础上有时还加上酶的来源或酶的其他特点 如胃蛋白酶及胰蛋白酶，碱性磷酸酯酶及酸性磷酸酯酶等。
习惯命名比较简单，应用历史较长，但缺乏系统性，有时出现一酶数名或一名数酶的情况。为了适应酶学的发展，避免命名的重复，国际酶学会议于1961年提出了一个新的系统命名及系统分类的原则，已为国际生化协会所采用。
二、国际系统命名法
按照国际系统命名法，每一种酶有一个系统名称(systematic name)和习惯名称(即推荐名称( recommended name)，后一种名称简单，便于使用，但不严格缺乏系统性。系统名称应当明确表明酶的底物及催化反应的性质。例如，草酸氧化酶(习惯名称)写成系统名称时，应将它的两个底物，即“草酸”及“氧”同时列出，并用“：”将它们隔开，它所催化的反应性质为“氧化”，也需指明，所以它的系统名称为“草酸：氧氧化酶”。若底物之一是水时，可将水略去不写，如乙酰辅酶A水解酶(习惯名)可以写成乙酰辅酶A：水解酶(系统名)，而不必写成乙酰辅酶A：水水解酶。
在国际科学文献中，为严格起见，一般使用酶的系统名称，但是因某些系统名称太长，较复杂为了方便起见，有时仍使用酶的习惯名称。在《酶学手册》(《Enzyme Handbook》，Thome E,Barm编,1969年)或某些专著中列有酶的一览表，表中包括酶的编号、系统名称、习惯名称、反应式、酶的来源、酶的性质等各项内容，必要时可以查阅。
三、国际系统分类法及编号
国际系统法中分类的原则是将所有的酶促反应按反应性质分为六大类，分别用l、2、3、4、5、6的编号来表示。再根据底物中被作用的基团或键的特点将每一大类分为若干个亚类，每个亚类按顺序编成 l、2、3、4……等数字。每一个亚类可再分为若干个亚—亚类，仍用 l、2、3、4……编号。每一个亚—亚类中不同的酶有不同的编号。所以每一个酶的分类编号由四个数字组成，数字间由,.” 隔开；第一个数字指明该酶属于六个大类中的哪一类；第二个数字指出该酶属于哪一个亚类；第三个数字指出该酶属于哪一个亚—亚类；第四个数字则表明该酶在一定的亚—亚类中的排号。编号之前往往冠以EC(如 EC2.6.1.2)，EC为Enzyme Commission(酶学委员会)的缩写。六个大类及其亚类详细介绍如下：
（1）氧化还原酶类 氧化还原酶类(oxido-reductases)催化氧化还原反应。
A2H + B ＝ A + B2H
例如，乳酸：NAD+氧化还原酶(EC1.1.1.27，习惯名为乳酸脱氢酶)及黄嘌呤氧化还原酶(EC1.2.3.2，习惯名为黄嘌呤氧化酶)。
（2）转换酶类 转换酶类(transferases)催化功能基团转移反应。
AB + C ＝ A + BC
例如，丙氨酸：酮戊二酸氨基转换酶(EC2.6.1.2，习惯名为谷丙转氨酶或丙氨酸氨基移换酶)；S-腺苷酰蛋氨酸：尼克酰胺甲基移换酶(EC2.1.1.1，习惯名为尼克酰胺甲基酶)。
（3）水解酶类 水解酶类(hydrolases)催化水解反应。这类酶包括淀粉酶、核酸酶、蛋白酶及脂酶等。
AB + H2O ＝ AOH + BH
例如，亮氨酸氨基肽水解酶(EC3．4．1．1，习惯名为亮氨酸氨肽酶)。
（4）裂合酶类（裂解酶类） 裂合酶类(Iyases)催化从底物上移去一个基团而形成双键的反应或其逆反应。这类酶包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。
例如，柠檬酸裂合酶(EC4.1.3.7，习惯名为柠檬酸合成酶)。
（5）异构酶类 异构酶类(isomerases)催化各种同分异构体的相互转变。
例如，葡萄糖-6-磷酸己酮糖异构酶(EC5.3.1.9，习惯名为6-磷酸葡萄糖异构酶)。
（6）合成酶类 合成酶类(ligases)能催化一切必须与ATP分解反应相偶联，并由两种物质合成一种物质的反应。例如，L-酪氨酸：tRNA连接酶(EC6.1.1.1，习惯名是酪氨酸合成酶)。
第三个数字(表示亚－亚类)，更加精确地表明底物或反应物的性质，如1大类1亚类中的亚-亚类表示受体的类型：
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1．1．1 表示氧化还原酶，作用于 CHOH基团，受体是 NAD+、ADP。
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1．1．2 表示氧化还原酶，作用于 CHOH基团，受体是细胞色素。
／
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1．1．3 表示氧化还原酶，作用于 CHOH基团，受体是分子氧。
／
当酶的编号仅有三个数字时，就已清楚地表明了这个酶的特性：反应性质、底物性质、键的类型。
关于酶编号中第四个数字没有什么特殊规定。例如：
EC 1.1.1.27 为乳酸,NAD+氧化还原酶
EC 1.1.1.37为苹果酸,NAD+氧化还原酶
EC 6.1.1.1 为 L-酪氨酸：tRNA-连接酶(AMP),
EC 6.1.1.2 为 L-色氨酸：tRNA-连接酶(AMP)
前两个都是氧化还原酶，都是作用在－CHOH基团上的第一个亚类，又都是以NAD+为受体的，但第四个数字不同，分别为27、37，说明它们所利用的底物不同，分别为乳酸、苹果酸。它们的习惯名称分别为乳酸脱氢酶及苹果酸脱氢酶。后两种酶都是连接酶，都要求 ATP供给能量，但催化不同的 tRNA与不同的氨基酸之间的连接，所以第四个数字不同。部分亚类分别列于表5-2中。
表5-2 酶的国际分类表(大类及亚类)
(表示分类名称、编号、催化反应的类型)
1.氧化还原酶类 4,裂合酶类
(亚类表示底物中发生氧化的基团的性质) (亚类表示分裂下来的基团与残余分子
间的键的类型)
1.1 作用在 上 4.1 C—C
1.2 作用在 上 4.2 C—O
1.3 作用在 —CH=CH2 上 4.3 C—N
1.4 作用在 上 4.4C—S—S
1.5 作用在 上
1.6 作用在 NADH、NADPH 上
2,移换酶类 5,异构酶类
(亚类表示底物中被转移的性质) (亚类表示异构的键的类型)
2.1 碳基团 5.1 消旋及差向异构酶
2.2 醛或酮基 5.2 顺反异构酶
2.3 酰基
2.4 糖苷基
2.5 除甲基之外的烃基或酰基
2.6 含氮基
2.7 磷酸基
2.8 含硫基
3,水解酶类 6.合成酶类
(亚类表示被水解的类型) (亚类表示新形成的键的类型)
3.1 酯键 6.1 C—N
3.2 糖苷键 6.2 C—S
3.3 醚键 6.3 C—N
3.4 肽键 6.4 C—C
3.5 其他 C—N 键
3.6 酸酐键
第二节 酶的催化性质一、酶是生物催化剂
1．酶和一般催化剂比较
（1）用量少但能大大加快反应速率 酶与一般催化剂一样，虽然细胞中的相对含量很低，却能大大加快反应速度。
（2）不改变反应的平衡点 与一般催化剂一样，酶仅能改变化学反应的速度，并不能改变化学反应的平衡点。酶本身在反应前后也不发生变化。例如，肽键遇水自发水解的反应极为缓慢，没有现实意义，当有酶存在时，这个反应则进行得十分迅速。
（3）可降低反应的活化能 在一个化学反应体系中,反应开始时反应物(S)分子的能量水平很低，为"初态"(initial state)(A)。在反应的任何一瞬间反应物中都有一部分分子具有比初态更高一些的能量，高出的这一部分能量称为活化能(activation energy)，使分子进入“过渡态”(transition state)(即活化态A*)，这时就能形成或打破一些化学键，形成新的物质——产物(P)，即S转变为P。这些具有较高能量处于活化态的分子称为活化分子。反应物中这种活化分子越多,反应速度越快。酶和一般催化剂一样可以降低反应的活化能，增加活化分子数，加快反应速度。酶作为催化剂参加一些反应后，酶分子立即恢复原来的状态，继续参加新的反应。
2．酶作为生物催化剂的特性
（1）催化效率高 以分子比表示,酶催化反应的反应速度比非催化反应高108～1020倍,比其他催化反应高107～1013倍。以转化数(每秒钟每个酶分子能催化多少个μmol的底物发生变化)表示，大部分酶为1 000,最大可达几十万，甚至可达100万以上。
（2）具有高度的专一性 一种酶只能作用于一类或一种特定的物质，这就是酶作用的专一性(specificity)。通常把被酶作用的物质称为底物(substrate)。所以也可以说一种酶只能作用于一种或一类底物。不同的酶有不同的专一性。
（3）易失活 酶是蛋白质,凡是使蛋白质变性的因素(高温、高压、强酸、强碱等)都能使酶的结构破坏，因而失去活性，所以酶的催化作用是在温和的条件(常温、常压和适合的pH值等)下实现的。
（4）酶活力的调节控制 酶活力可以调节控制。它的调控方式很多，包括抑制剂调节、共价修饰调节、反馈调节、酶原激活和激素控制等，详细内容将在后面讨论。这也是化学调控的基础，叶面肥中含有许多离子，有些是光合酶的活化剂。
（5）酶的催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关 有些酶是复合蛋白质,其中的小分子物质(辅酶、辅基及金属离子)与酶的催化活性密切相关。若将它们除去,酶就会失去活性。
酶的高效性、专一性及温和的作用条件在生物体内的新陈代谢中发挥着强有力的作用，酶活力的调控使生命活动中的反应得以有条不紊地进行。
二、酶的化学本质
1．酶的蛋白质本质
蛋白质有多种生物功能，其中具有催化作用的蛋白质称为酶。几乎所有的酶都是蛋白质。酶和其他蛋白质一样都是由氨基酸组成的，具有两性电解质的性质并具有一、二、三、四级结构，也受物理因素(加热、紫外线照射等)及化学因素(酸碱、有机溶剂等)的作用而变性或沉淀，丧失活性。酶的分子量也很大，其水溶液具有亲水胶体的性质，不能通过透析膜。在体外酶被胰蛋白酶水解而失活。
2．酶的核酸性质
多年来人们一直认为酶都是蛋白质，然而，近年来有实验表明：核酸分子也是高活性的酶。最使人震惊的例子是L19RNA，它是原生动物四膜虫 26S rRNA前体经自身拼接所释放出的内含子的缩短的形式（黑板图示）。L19RNA在一定条件下能够以高度专一的形式催化寡聚核糖核苷酸底物的切割与连接。我们称本质为RNA的酶为核糖核酸酶(ribozymes)，有时也称为RNA酶。它们很适于去识别并转化单链核酸，因为它们与所作用的核酸底物享用共同的碱基配对语言。
RNA分子和蛋白质分子一样，可以是非常有效的催化剂，但大多数的RNA的催化效率不及蛋白质。因为RNA不同于蛋白质：首先RNA不能形成大的非极性分子，而且与蛋白质相比它们的极性小得多；第二，核酸只有四种不同的构建单位，而蛋白质有20种氨基酸作为基本的构建单位。
三、酶的底物专一性
酶的两个最显著特性就是它们的高度专一性(specificity)和极高的催化效率。正是由于这些特性使得酶与一般催化剂有明显的区别。酶对它所催化的反应与对底物的选择两方面都是高度专一的。通常酶只能催化一种化学反应或一类相似的化学反应。酶对底物的选择性很严格，有时甚至是绝对的。由于酶具有专一性，所以生物体内的代谢过程才能有一定的方向和顺序。不同的酶具有不同程度的专一性。我们可以将酶的专一性分为三种类型。
1．绝对专一性
有些酶的专一性是绝对的，即除一种底物以外，它对其他任何物质都不起催化作用，这种专一性称为绝对专一性。若底物分子发生细微的改变，便不能作为酶的底物。例如反丁烯二酸酶仅能催化反丁烯二酸形成 L-苹果酸，却不能催化结构极其相似的顺丁烯二酸发生此反应。
2．相对专一性另外一些酶对底物专一性程度要求较低，能够对结构相似的一类化合物起催化作用，这类酶的专一性称为相对专一性。它又可分为基团专一性和键专一性两类。现以水解酶为例说明这两种类型的专一性。设底物 A、B为两个化学基团，两者之间以一定的键连接，当水解酶作用时，反应如下：
A—B + H2O────→ AOH + BH
（1）基团专一性 有些酶除了要求 A和B之间的键合适外，而且对其所作用键两端的基团具有不同的专一性。例如A—B化合物，酶常对其中的一个基团(如A)具有高度的甚至是绝对的专一性，而对另外一个基团(如 B)具有相对的专一性。这种酶的专一性称为基团专一性。例如，α-D-葡萄糖苷酶能水解具有α-l，4-糖苷键的 D-葡萄糖苷，这种酶对α-D-葡萄糖基团和α-糖苷键具有绝对专一性，而底物分子上的R基团则可以是任何糖或非糖基团(如甲基)。所以这种酶既能催化麦芽糖的水解，又能催化蔗糖的水解。
（2）键专一性 有些酶的专一性更低，它只要求底物分子上有适合的化学键就可以起催化作用，而对键两端的A、B基团的结构要求不严，只有相对专一性。例如，酯酶对具有酯键（RCOOR′)的化合物都能进行催化，酯酶除了水解脂肪外，还能水解脂肪酸和醇所合成的酯类。这种专一性称为键专一性。
3．立体专一性一种酶只能对一种立体异构体起催化作用，对其对映体则全无作用，这种专一性称为立体专一性。自然界有许多化合物以立体异构体存在。氨基酸和糖类有D-构型及L-构型的异构体，如D-氨基酸的氧化酶能催化许多D-氨基酸氧化，但对L-氨基酸则完全不起作用，所以D-氨基酸氧化酶与DL-氨基酸作用时，只有一半的底物(D型)被分解，可用此法来分离消旋化合物。
四、酶的组成及分类
1．根据酶的组成将酶分成两类
（1）单酶 因为酶是蛋白质，所以酶和其他蛋白质一样，可以根据其组成成分分为简单蛋白质和结合蛋白质两类。有些酶其活性仅仅决定于蛋白质结构，这类酶属于简单蛋白质，又称单酶，如脲酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及核糖核酸酶等。
（2）全酶 另一类酶其蛋白质与非蛋白组分结合后才表现出酶活性，这类酶属于结合蛋白质，称为全酶，即全酶＝酶蛋白＋辅助因子。
全酶中蛋白质部分称为酶蛋白，非蛋白部分称为辅助因子。在催化反应中酶蛋白与辅因子所起的作用不同，酶的专一性取决于酶蛋白本身，辅助因子一般都在酶促反应中起运输转移电子、原子或某些功能基（如参与氧化还原或运载酰基）的作用。
酶的辅助因子包括金属离子及有机物，绝大多数情况下可以通过透析或其他方法将全酶中的辅助因子除去。例如，酵母提取物有催化葡萄糖发酵的能力，透析除去辅助因子后,酵母就失去了催化能力。这种与酶蛋白松弛结合的辅助因子称为辅酶(cofactor或coenzyme)，但在少数情况下，有一些辅助因子是以共价键和酶蛋白结合在一起的，不易透析除去，这种辅助因子称为辅基(prosthetic group)。辅基与辅酶的区别只在于它们与酶蛋白结合的牢固程度不同，并无严格的界限。一些可作为酶的辅助因子的辅酶和辅基见表5-1。
2．根据酶蛋白的特点将酶分为三类
（1）单体酶 单体酶(monomeric enzyme)只有一条多肽链。属于这一类的酶很少,一般都是催化水解反应的酶，相对分子质量在13 000～35 000之间,如溶菌酶、胰蛋白酶等。
（2）寡聚酶 寡聚酶 (oligomeric enzyme)由几个甚至几十个亚基组成，这些亚基可以是相同的多肽链，也可以是不同的多肽链。亚基之间不是共价结合,彼此很容易分开。寡聚酶的分子量从3.5万到几百万，如磷酸化酶a和3-磷酸甘油脱氢酶等。
（3）多酶体系 多酶体系 (multienzyme system)是由几种酶彼此嵌合形成的复合体。它有利于一系列反应的进行。这类多酶复合体分子量很高，一般都在几百万以上。如脂肪合成酶复合体。
表5-1 一些酶的辅助因子
某些含有或需要金属离子的酶
辅助因子(金属离子)
乙醇脱氢酶(alcohol dehdrogenase)
碳酸酐酶(carbonic anhydrase)
羧肽酶(carboxypeptidase)
碳酸水解酶(phosphohydrolases)
磷酸转移酶(phosphotransferases)
精氨酸酶(arginase)
丙酮酸羧化酶(pyruv tecarboxylase)
细胞色素(cytochromes)
过氧化物酶(peroxidase)
过氧化氢酶(catalase)
琥珀酸脱氢酶(succinic dehydrogenase)
铁氧还蛋白(ferredoxin dehydrogenase)
铁黄素蛋白(Fe-flavoprotein)
酪氨酸酶(tyrosinase)
细胞色素氧化酶(cytochrome oxdase)
漆酶(laccase)
抗坏血酸氧化酶(ascorbic acid oxidase)
丙酮酸磷酸激酶(pyruvate phosphokinase)
细胞膜ATP酶(plasma membranc ATPase)
固氮酶(nitogenase)
Zn2+
Zn2+
Zn2+
Mg2
Mg2+ Mn2+
Mn2+
Zn2+ Mn2+(还需生物素)
Fe2+或Fe3+(铁离子在卟啉环中)
Fe2+或Fe3+(铁离子在卟啉环中)
Fe2+或Fe3+(铁离子在卟啉环中)
Fe2+或Fe3+(还需FAD)
Fe(铁原子在铁硫晶格中，这种蛋白存在于细菌代谢及光合作用中，固氮酶中的这种蛋白质还含有钼原子)
Fe
Cu+或Cu2+
Cu+或Cu2
Cu+或Cu2
Cu+或Cu2
K+(也需要Mg2+)
Na+(也需要K+及Mg2+)
Fe2+，Mo2+
第三节 影响酶促反应速度的因素一、底物浓度对酶促反应速度的影响所有的酶促反应，如果其他条件恒定，则反应速度决定于酶浓度和底物浓度，如果酶浓度保持不变，底物浓度增加，反应速度随之增加，并以双曲线形式达到最大速度。酶促反应速度并不是随着底物浓度的增加而直线增加，而是在高浓度时达到一个极限速度。这时所有的酶分子已被底物所饱和，即酶分子与底物结合的部位已被占据，速度不再增加，如图5-1所示。这个问题我们可以用 Michaelis-Menten 于1913年提出的学说来解释。
Michaelis-Menten 学说的要点是假设有酶—底物中间产物形成，并假设反应中底物转变成产物的速度取决于酶－底物复合物转变成反应产物和酶的速度，其关系如下,
在上式中E表示酶，S表示底物，ES表示酶—底物复合物，P表示产物，K1、K-1和K2为三个假设过程的速度常数。若形成 ES的速度为Vf，则
Vf= K 1([Et]-[ES])[S]
式中Et为酶的总浓度，[Et]-[ES]为未结合的酶的浓度。ES生成的速度Vf与未结合的酶浓度及底物浓度成正比。ES消失的速度Vd为
Vd= K-1[ES]+ K2[ES]
这是由于 ES因生成初反应物(K-1)或生成产物(K2)而消失。
当 ES的生成速度与消失速度相等时，即
Vf=Vd
则 K1([Et]-[ES])[S]＝K-l[ES]+K2 [ES]
将上式移项
K1[Et][S]＝Kl[ES][S]+K2[ES]+K-1[ES]
K1[Et][S]＝(K1[S]+K2+K-1)[ES]
K1[Et][S] [Et][S]
[ES] ＝──────── ＝ ───────
(K1[S]+ K2+ K-1) K2+ K-1
[S]+ ───
K1
设V＝K2[ES]，V为观察所得的初速度，代入上式
K2[Et][S]
V＝ ──────
K 2+ K-1
[S]+ ───
K1
设 K2+ K -1
────＝Km，Vmax＝K2[Et],则
K1
Vmax[S]
V＝─────
[S] + Km
这就是米氏方程(Michaelis-Menten equation),Km称之为米氏常数(Michae1is-constant)。这个方程式表明了当已知Km及Vmax时，酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。
当酶促反应处于V＝1/2 Vmax的特殊情况时，
Vmax Vmax·[S]
── ＝ ──────
Km +[S]
l [S]
＝ ─────
2 Km + [S]
∴Km ＝ [S]
由此可以看出Km 值的物理意义，即Km 值是当酶反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，它的单位是 mol/L，与底物浓度的单位一样。
米氏常数是酶学研究中的一个极重要的数据，关于Km 还可作以下几点分析：
(l) Km 值是酶的特征常数之一，一般只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。不同的酶Km 值不同。
(2)如果一个酶有几种底物，则该酶对每一种底物都有一个特定的Km 值(表5-3)。并且Km值还受 pH值及温度的影响。因此,Km值作为常数只是对一定的底物、一定的 pH值、一定的温度条件而言的。测定酶的Km 值可以作为鉴别酶的一种手段，但是必须在指定的实验条件下进行。
表5-3 一些酶的Km 值
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
酶 底 物 K m(mmol/L)
─────────────────────────────────────────────────
过氧化氢酶(catase) H2O2 25
脲酶(urease) 尿素 25
己糖激酶(hexokinase) 葡萄糖 0.15
果糖 1.5
蔗糖酶(sacchrase) 蔗糖 28
棉子糖 350
胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin) N-苯甲酰酪氨酰胺 2.5
N-甲酰酪氨酰胺 12.0
N-乙酰酪氨酰胺 32.0
甘氨酰酪氨酰胺 122.0
碳酸酐酶(carbinic anhydrase) HCO3- 8.0～9.0
谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase) 谷氨酸 0.12
α-酮戊二酸 2.0
NAD攩+攪 0.025
NADH 0.018
肌酸激酶(creatine kinase) 肌酸 0.6
ADP 19.0
磷酸肌酸 5.0
乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase) 丙酮酸 0.017
丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase) 丙酮酸 1.3
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucosyl-6-phosphate dehydrogenase) 6-磷酸-葡萄糖 0.058
磷酸己糖异构酶(hexose-6-phosphate isomerase) 6-磷酸-葡萄糖 0.7
β-半乳糖苷酶(β-galactosidase) 乳糖 4.0
溶菌酶(lysozyme) 6-N-乙酰-葡萄糖 0.006
丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase) 丙酮酸 0.4
HCO攩-攪 1.0
ATP 0.06
精氨酸-tRNA合成酶(argirine-tRNA-synthetase) 精氨酸 0.003
tRNA 0.0004
ATP 0.3
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
(3)1/Km 近似地表示酶对底物亲和力的大小，l/Km愈大,表明亲和力越大,因为l/Km愈大，Km值就愈小，达到最大反应速度一半所需要的底物浓度就愈小。显然，最适底物与酶的亲和力最大，不需很高的底物浓度就可以很容易地达到Vmax 。
测定Km 值有许多种方法，最常用的是 Lineweaver-Burk的双倒数作图法。求Michaelis-Menten方程的倒数，可得下式：
1 Km 1 1
─ ＝ ── × ── ＋ ──
V Vmax [S] Vmax
此方程相当于一直线的数学表达,y＝ax+b，以1/ V为纵坐标，1/[S]为横坐标，将数据作图，则得一直线,其斜率为Km/ Vmax,将直线延长,在1/[S]及1/ V上的截矩分别为-1/ Km及1/Vmax，这样Km就可以从直线上的截矩计算出来(图5-2)。
图5-2 双倒数作图法，以1/V对1/[S]作图求Km
二,pH值对酶促反应速度的影响大部分酶的活力受其环境 pH值的影响，在一定 pH值下，酶促反应具有最大速度，高于或低于此值，反应速度下降，通常称此pH值为酶促反应的最适pH值 (optimum pH)。
最适pH值有时因底物种类、浓度及缓冲液成分不同而不同，而且常与酶的等电点不一致，因此，酶的最适 pH值并不是一个常数，只是在一定条件下才有意义。几种酶的最适pH值见表5-4。一般在pH值6～8之间,动物酶多在pH值6.5～8.0之间,植物及微生物酶多在 pH值4.5～6.5之间，但也有例外，如胃蛋白酶为1.5。
pH值影响酶活力的原因可能有以下几个方面：
（1）pH值会影响酶蛋白的构象,影响酶分子的稳定性。一般来说，酶在最适pH值时是稳定的,过酸或过碱都能引起蛋白质变性而使酶失去活性。
（2）pH值能影响酶分子的解离状态。因为酶是蛋白质，pH值的变化会影响到蛋白质上的许多极性基团(如氨基、羧基、咪唑基、巯基等)的离子特性。在不同pH值条件下，这些基团解离的状态不同，所带电荷也不同，只有在酶蛋白处于一定解离状态下，才能与底物形成中间物，而且酶的解离状态也影响酶的活性。例如，胃蛋白酶在正离子状态下有活性；胰蛋白酶在负离子状态下有活性；而蔗糖酶在两性离子状态下才具有活性。
表5-4 几种酶的最适pH值
酶 底 物 最 适 pH值
胃蛋白酶(pepsin) 鸡蛋清蛋白 1.5
丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase) 丙酮酸 4.8
脲酶(urease) 脲 6.4～6.9
胰α-淀粉酶(α-amylase) 淀粉 6.7～7.2
麦芽β-淀粉酶(β-amylase) 淀粉 4.5
延胡索酸酶(fumarase) 延胡索酸 6.5
苹果酸 8.0
胰蛋白酶(trypsin) 蛋白质 7.8
精氨酸酶(arginase) 精氨酸 9.5～9.7
（3）pH值影响底物的解离 许多底物或辅酶也具有离子特性(如 ATP、NAD+、CoA等)，pH值的变化也影响它们的解离状态。而酶只与某种解离状态的底物才形成复合物，如在 pH值9.0～10.0时，精氨酸解离成正离子，而精氨酸酶解离成负离子，此时酶的活性最大。
三、温度对酶促反应速度的影响温度对酶促反应速度(用V表示)也有很大影响，如图5-4所示，有一个最适温度(optimum temperature)。最适温度两侧，反应速度都比较低。在达到最适温度之前提高温度，可以提高酶促反应的速度。反应温度提高10℃，其反应速度与原来的反应速度之比称为反应温度系数，用Q10表示。对于许多酶来说，Q10多为 l～2。
也就是说，温度每增高10℃，酶促反应速度为原反应速度的 l～2倍。
温度对酶促反应速度的影响有两方面原因：一是当温度升高时，反应速度加快，这与一般化学反应一样；二是随温度升高而使酶逐步变性，即通过减少有活性的酶而降低酶促反应的速度。酶促反应的最适温度就是这两种过程平衡的结果。在低于最适温度时，以前一种效应为主；在高于最适温度时，则以后一种效应为主，因而酶活性迅速丧失，反应速度很快下降。大部分酶在60℃以上变性，少数酶能耐受较高的温度，如细菌淀粉酶在93℃时活力最高。最适温度不是酶的特征性物理常数，而是上述影响的综合结果，它不是一个固定值，而与酶作用时间的长短有关。酶可以在短时间内耐受较高的温度，只有当酶反应时间在已经规定了的情况下，才有最适温度。
四、酶浓度对酶促反应速度的影响
在一定条件下酶促反应的速度与酶的浓度成正比。因为酶催化反应时，首先要与底物形成一中间产物，即酶-底物复合物。 当底物浓度大大超过酶浓度时，反应达到最大速度。如果此时增加酶的浓度可增加反应速度，酶促反应速度与酶浓度成正比关系。图5-5表示酶反应速度与酶浓度成直线关系。
五、激活剂对酶促反应速度的影响凡是能提高酶活性的物质都称为激活剂(activitor)，其中大部分是离子或简单有机化合物。
激活剂按分子的大小可分为以下三类：
1．无机离子 无机离子可分为三种：
（1）金属离子 金属离子对酶的作用有两种：一是作为酶的辅助因子起作用；二是作为激活剂起作用。作为激活剂起作用的有 K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe2+及 Ca2+等离子。这些金属的原子序数在 11～55之间，其中的 Mg2+是多种激酶及合成酶的激活剂。
（2）阴离子 在一般浓度下,阴离子的激活作用不明显。较突出的是动物唾液中的α-淀粉酶受Cl-激活。Br-也有激活作用，但作用稍弱。
（3）氢离子 氢离子对多种酶有激活作用。
2．中等大小的有机分子 中等大小的有机分子可分为两种：
（1）某些还原剂 半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、氰化物等能激活某些酶，使酶中二硫键还原成巯基(－SH)，从而提高酶活性，木瓜蛋白酶及 D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶也是如此。
（2）EDTA(乙二胺四乙酸)
它是金属螯合剂，能除去酶中的重金属杂质，从而解除重金属离子对酶的抑制作用。
3．具有蛋白质性质的大分子物质
这类激活剂是指可对某些无活性的酶原起作用的物质。
激活作用
无活性的酶原────→有活性的酶六、抑制剂对酶促反应速度的影响
许多化合物能与一定的酶进行可逆或不可逆的结合,而使酶的催化作用受到抑制,这种化合物称为抑制剂(Inhibitor)，如药物、抗生素、毒物、抗代谢物等。酶的抑制作用可以分为两大类，即可逆性抑制(包括竞争性抑制、非竞争性抑制)和不可逆抑制。
1．可逆性抑制
（1）竞争性抑制作用(competitive inhibition) 某些化合物，特别是那些在结构上与天然底物相似的化合物可以与酶的活性中心可逆地结合，因此在反应中抑制剂可与底物竞争同一部位。在酶促反应中酶与底物形成酶－底物复合物ES，抑制剂则与酶结合形成酶—抑制剂复合物：
式中：I——抑制剂；EI——酶-抑制剂复合物；P——产物。
但是酶－抑制剂复合物不能再与底物生成 EIS，但EI的形成是可逆的，并且底物和抑制剂不断竞争酶分子上的活性中心。这种情况称为竞争性抑制作用(competitive inhibition)。竞争性抑制作用可以通过增加底物浓度基本消除。竞争性抑制作用的典型例子为琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase)。当有适当的氢受体(A)时，此酶催化下列反应：
许多结构与琥珀酸结构相似的化合物都能与琥珀酸脱氢酶结合，但不脱氢，这些化合物阻塞了酶的活性中心，因而抑制正常反应的进行。抑制琥珀酸脱氢酶的化合物有乙二酸、丙二酸、戊二酸等，其中抑制作用最强的是丙二酸，当抑制剂和底物的浓度比为1:50时，酶活性被抑制50％。
竞争性抑制作用可以从抑制剂浓度[I]影响V和[S]之间的关系来了解。米氏方程可以写成下式：
Vmax[S]
V＝─────
[S] + Km
可以用和推导米氏方程类似的方法推导出一个有抑制剂浓度[I]和抑制剂-酶复合物解离常数Ki的方程
Vmax [S]
V＝ ─────────
[S] + Km (1+[I]/ Ki)
取上式的倒数并重排，即得
1 Km [I] 1 1
─ ＝ ──(1+ ──)· ── + ──
V Vmax Ki [S] Vmax
以1/ V对1/[S]作图，所得直线即竞争性抑制作用曲线，其在纵坐标上的截矩为1/Vmax，与无抑制剂时的反应相同，即Vmax不变，但直线的斜率变成Km/ Vmax(1+[I]/ Ki)，与无抑制剂时的反应相比变小，即Km值增大。换一句话说，就是当有竞争性抑制剂存在时通过增加底物浓度，可以基本消除竞争性抑制作用，保持最大反应速度不变。因此用作图法可区别无抑制剂、有竞争性抑制剂或有非竞争性抑制剂存在时的反应。
（2）非竞争性抑制作用(noncompetitive inhibition) 有些化合物既能与酶结合，也能与酶－底物复合物结合，称为非竞争性抑制剂，用下列反应表示其过程：
非竞争性抑制与竞争性抑制作用不同之处在于非抑制剂能与ES结合，而S又能与EI结合，都形成 ESI。高浓度的底物不能使这种类型的抑制作用完全逆转，因为底物并不能阻止抑制剂与酶结合。这是由于抑制剂和酶的结合部位与酶的活性部位不同，EI的形成发生在酶分子的不被底物作用的一个部位。此类抑制剂不改变酶的Km值，但Vmax减小。
许多酶能被重金属离子如 Ag+、Hg2+或 Pb2+等抑制，都是非竞争性抑制的例子。例如，脲酶对这些离子极为敏感，微量重金属离子即起抑制作用。
重金属离子与酶的巯基(—SH)形成硫醇盐：
E-SH ＋ Ag+＝E-S-Ag ＋ H+
因为巯基对酶的活性是必需的，故形成硫醇盐后即失去酶的活性。由于硫醇盐的形成具有可逆性，这种抑制作用可以通过加适当的巯基化合物(如半胱氨酸、谷胱甘肽等)的办法去掉重金属而得到解除。通常用碘代乙酰胺检查酶分子的巯基：
各种有机汞化合物(如对氯汞苯甲酸)、各种砷化合物及 N-乙基顺丁烯二酰亚胺也可以和巯基进行反应，抑制酶的作用。
图5-6为竞争性抑制、非竞争性抑制及无抑制酶促反应的比较。这三种类型的区别列于表5-5。
表5-5 各种抑制作用的比较
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抑制 类 型 方 程 式 Vmax Km
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Vmax [S]
无抑制 V＝─────── — —
[S] + Km
Vmax [S]
竞争性抑制 V＝ ────────── 不变 增加
[S] + Km (1+[I]/ Ki)
Vmax [S]
非竞争性抑制 V＝ ────────── 减小 不变
([S]+ Km)(1+[I]/ Ki)
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（3）反竞争性抑制作用(uncompetitive inhibition) 有些抑制剂不能与游离酶在活性中心结合,只能与酶－底物复合物(ES)结合形成ESI，因为底物与酶的结合导致酶构象改变而显现出抑制剂的结合部位，因此抑制剂不与底物分子竞争酶分子的活性中心，但形成的ESI不能转变出产物。反竞争性抑制作用可用下式表示：
这种情况恰恰与竞争性抑制作用相反，故称反竞争性抑制作用。例如氰化物对芳香硫酸脂酶的抑制作用既是此类抑制作用。反竞争性抑制作用在单底物酶反应中比较少见。
2．不可逆的抑制作用(irreversible inhibition)
一些抑制剂与酶的活性中心的功能基团共价结合而抑制酶的活性，这种作用称为不可逆型抑制作用。不能用透析或超滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶的活性。根据不同抑制剂对酶的选择性可将不可逆抑制作用分为两种类型，即专一性的不可逆抑制作用和非专一性的不可逆抑制作用。
（1）专一性的不可逆抑制作用 专一性不可抑制剂仅仅和活性部位的有关的基团反应，有机磷化合物是活性中心上含有丝氨酸残基的酶的专一性不可逆抑制剂。例如，二异丙基氟磷酸(简称DIFP)与酶的丝氨酸残基的反应：
使带有丝氨酸残基的酶由此而丧失活性。
（2）非专一性的不可逆抑制作用 非专一性的不可逆抑制剂则可以和一类或几类基团反应。属于这类抑制剂的有烷化剂、酰化剂等。碘乙酸、2,4-二硝基氟苯(DNFB)等烷化剂可使酶蛋白的氨基、巯基、羧基、硫醚基、咪唑基等烷基化；磺酰氯、酸酐等酰化剂可是酶蛋白的羟基、巯基、氨基、酚基发生酰化反应。例如碘乙酸与3-磷酸甘油醛脱氢酶的巯基共价结合而抑制此酶的活性：
E－SH ＋ ICH2COO- ──→ ES－CH2COO- ＋ HI
专一性的不可逆抑制作用和非专一性的不可逆抑制作用的区别也不是绝对的，有些非专一性抑制剂有时也会转化，产生专一性抑制作用。
第四节 酶的作用机制
一、酶的活性中心
实验证明，酶的催化作用只局限在它的大分子的一定区域。某些酶蛋白分子经水解切去相当一部分肽链后，其残余的部分仍保留一定的活力，似乎除去的那部分肽链是与活力关系不大的次要结构。最初，把酶分子中与底物接触的或非常接近底物的部分称为酶的活性部位,而直接与酶催化有关的部位称为活性中心。这种活性中心的概念不够严格。后来，大量工作，特别是X射线衍射法的发展，再结合化学方法所得到的结果，使人们进一步明确了活性中心(Active site)的概念：对于单酶来说，活性中心就是酶分子在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基上的某些基团，它们在一级结构上可能相距甚远，甚至位于不同的肽链上，通过肽链的盘绕、折叠而在空间构象上相互靠近；对于全酶来说，辅助因子或辅助因子上的某一部分结构往往是活性中心的组成部分。活性中心有两个功能部位：一个是结合部位(binding site),一定的底物通过此部位结合到酶分子上，它决定酶的专一性；另一个是催化部位(catalytic site)，它决定酶的催化能力，底物的键在此处被打断或形成新的键，从而发生一定的化学变化。
酶的活性中心具有一定的三维空间结构，由几个特定的氨基酸残基构成，处于酶分子表面的一个凹穴内，酶的活性中心结构取决于酶蛋白的空间结构，因此，酶分子中的其他部位的作用对于酶的催化作用来说，可能是次要的，但绝不是毫无意义的，它们至少为酶活性中心的形成提供了结构基础。当外界的物理化学因素破坏了酶的结构时，就可能影响酶活性中心的特定结构，因而必然影响酶的活力。
表5-6 一些酶的活性中心的氨基酸残基
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酶 酶分子的氨基酸残基数 活 性 中 心 的 残 基
──────────────────────────────────────────────────
牛胰核糖核酸酶A 124 His129 His119 Lys41
溶菌酶 129 Asp52 Glu35
木瓜蛋白酶 212 Cys25 His150
枯草杆菌蛋白酶 275 His64 Ser221
碳酸酐酶 258 His95—Zn95—His129
↓
His117
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二、酶与底物分子的结 合
酶的活性中心具有一定的大小和一定的几何形状，这样便于与底物的结合，那么酶与底物究竞如何与底物结合呢？ 这与酶的专一性直接相关。关于这个问题有两个假说:
（1）锁与钥匙学说 E．
Fischer在1890年提出，底物分子或底物分子的一部分像钥匙那样，专一地楔入到酶的活性中心部位，也就是说底物分子进行化学反应的部位与酶分子上有催化效能的必需基团间具有紧密互补的关系(如图5-7所示)。
这个学说强调指出只有固定的底物才能楔入与它互补的酶表面，用这个学说可以较好地解释酶的立体异构专一性。
有一些问题用锁与钥匙学说不能解释：如果酶的活性中心是锁和钥匙学说中的锁，那么，那种结构不可能既适合于可逆反应的底物，又适合于可逆反应的产物，而且也不能解释酶的专一性中的所有现象。这样后人便提出了诱导楔合假说。
（2）诱导楔合假说
由Koshland于1964年提出：当酶与底物分子接近时，酶蛋白受底物分子的诱导，其构象发生有利于底物结构的变化，
酶与底物在此基础上互补楔合，进行反应。近年来 X射线衍射分析的实验结果支持这一假说，证明了酶与底物结合时，确有显著的构象变化。因此人们认为这一假说比较满意地说明了酶的专一性。图5-8则表示酶构象在专一性底物及非专一性底物存在时的变化。
图中黑线条表示带有催化基团A、B及结合基团C的肽段，它与带斜线的“酶”共同组成酶分子，a表示底物与酶分子活性中心的原有构象，b表示专一性底物引入后，酶蛋白构象改变，诱导楔合使催化基团 A、B并列成有利于结合底物的状态，并形成酶－底物复合物。但是，如果引入了不正常的、非专一性的底物，情况就不同了，c表示在底物上加入了一个庞大的基团，妨碍了酶的A、B基团并列，因此不利于酶与底物的结合，如加入某些竞争性抑制剂等。d则表示在正常底物上切除某些基团后，酶蛋白的带 B基的肽链顶住了A基的肽链，也阻止了 A、B基的并列，因此也不利于酶与底物结合，这样的酶也就不能起催化作用了。
三、与酶的高效性有关的因素
酶催化反应机理的研究是当代生物化学的重要课题，其重要内容之一就是探索酶作用高效性的原因。据现在所知与酶高效性有关的主要因素有以下几个方面：
1．酶降低反应的活化能
设有一化学反应如下：
A—B ──→ A…B ──→ A＋B
在反应系统中包含一部分高能态的活化的A-B分子，称为过渡态(A…B)。当发生反应时，连接A和B的键会变得很弱而断裂以导致产物A和B的形成。反应速度与其过渡态成正比，而过渡态的浓度取决于生成过渡态的反应分子所需要的临界热动能。酶促反应的一个重要特点是降低反应的活化能，使之较易达到过渡态，结果使更多的分子参加反应，加快反应速度。
一个反应的速度常数可用阿累尼乌斯(Arrhenius)方程表示：
Ea
lnk ＝ lnA － ──
RT
式中k为速度常数，A为指前因子，它是与温度、浓度均无关的常数，Ea为活化能，R为气体常数，T为绝对温度。一般的化学反应在37℃时其Ea 值为62.7～82.6 kJ/mol，而许多酶促反应的Ea值为8.36～33.4 kJ/mol，由此可见酶促反应的活化能比一般反应的活化能低的多。
2．底物与酶的“靠近”及“定向”
由于化学反应速度与反应物浓度成正比，若在反应系统的某一局部区域底物浓度增加，则反应速度也随之加快。提高反应速度的最主要方法是使底物分子进入活性中心区域，亦即大大提高活性区域的底物浓度。曾测到过某底物在溶液中的浓度为0.001mol/L，而在酶活性中心的浓度竞达100mol/L，比溶液中的浓度高10万倍！因此可以想象，在酶的活性中心区域反应速度必定是极高的。
当底物未与酶结合时，活性中心的催化基团还未能与底物十分靠近，但由于酶活性中心的结构有一种可适应性，即当专一性底物与活性中心结合时，酶蛋白发生一定的构象变化，使反应所需要的酶中的催化基团与结合基团正确地排列并定位，以便能与底物楔合，使底物分子可以“靠近”及“定向”于酶，这也就是前面提到的诱导楔合。这样活性中心局部的底物浓度才能大大提高。酶构象发生的这种改变是反应速度增加的一种很重要的原因。反应后，释放出产物，酶的构象再逆转，回到它的初始状态。对溶菌酶和羧肽酶的X衍射分析的实验结果证实了以上的看法。Jenck等人指出“靠近”及“定向”可能使反应速度增长108倍，这与许多酶的催化效率的计算是很相近的。
3．使底物分子中的敏感键发生“变形”
酶使底物分子中的敏感键发生“变形”，从而促使底物中的敏感键更易于破裂。前面曾经提到，当酶遇到它的专一性底物时，发生构象变化以利于催化。事实上，不仅酶构象受底物作用而变化，底物分子也常常受酶作用而变化。酶中的某些基团或离子可以使底物分子内敏感键中的某些基团的电子云密度增高或降低，产生“电子张力”，使敏感键的一端更加敏感，更易于发生反应。有时甚至使底物分子发生形变，这样就使酶—底物复合物易于形成。而且往往是酶构象发生变化的同时，底物分子也发生形变，从而形成一个互相楔合的酶—底物复合物。羧肽酶A的X衍射分析结果就为这种“电子张力”理论提供了证据。
4．共价催化
还有一些酶以另一种方式来提高催化反应的速度，即共价催化。这种方式是底物与酶形成一个反应活性很高的共价中间物，这个中间物易变成过渡状态，因此反应的活化能大大降低，底物可以越过较低的“能阈”而形成产物。例如，丝氨酸类酶与酰基形成酰基酶；半胱氨酸类酶活性中心的半胱氨酸巯基与底物酰基形成含共价硫酯键的中间物。
5．酸碱催化
有两种酸碱催化剂，一是狭义的酸碱催化剂，即H+与OH-。由于酶反应的最适pH值一般接近于中性，因此H+与OH-的催化在酶反应中的重要性是比较有限的。另一种是广义的酸碱催化剂，指的是质子供体及质子受体的催化，它们在酶反应中十分重要，发生在细胞内的许多种类型的有机反应都是受广义的酸碱催化的，例如将水加到羰基上、羧酸酯及磷酸酯的水解、各种分子重排以及许多取代反应等。
酶蛋白中含有几种可以起广义酸碱催化作用的功能基，如氨基、羧基、巯基、酚羟基及咪唑基等。其中组氨酸的咪唑基值得特别注意，因为它既是一个很强的亲核基团，又是一个有效的广义酸碱功能基。（在同一个活性中心，既可进行酸催化又可以进行碱催化）
影响酸碱催化反应速度的因素有两个：
（1）酸碱的强度 在以上功能基中，组氨酸的咪唑基的解离数为6.0，这意味着由咪唑基上解离下来的质子的浓度与水中的[H+]相近，因此它在接近于生物体液pH值的条件下(即在中性条件下)，有一半以酸的形式存在，另一半以碱的形式存在。也就是说咪唑基既可以作为质子供体，又可作为质子的受体在酶促反应中发挥催化作用。因此，咪唑基是酶催化作用中最有效最活泼的一个催化功能基。
（2）功能基供出质子或接受质子的速度在这方面咪唑基又是特别突出，它供出或接受质子的速度十分迅速，其半寿期小于10-10s，而且供出或接受质子的速度几乎相等。
由于咪唑基有如此的优点，所以虽然组氨酸在大多数蛋白质中含量很少，却很重要。推测在生物进化过程中，它很可能不是作为一般的结构蛋白成分，而是被选择作为酶分子中的催化结构而存在下来的。
广义的酸碱催化与共价催化可使酶促反应速度大大提高，但是比起前面第二和第三种方式来，它们使酶促反应速度增长较小。尽管如此，还必须看到它们在提高酶促反应速度中起的重要作用，尤其是广义酸碱催化还有独到之处：它为在近于中性的 pH值下进行催化创造了有利条件。因为在这种接近中性 pH值的条件下，H+与OH-的浓度太低，不足以起到催化剂的作用。
6．酶活性中心的疏水性
某些酶的活性中心穴内相对地说是非极性的，因此酶的催化基团被低价电环境所包围，在某些情况下，还可能排除高极性的水分子。这样，底物分子的敏感键和酶的催化基团之间就会有很大的反应力，这有助于加速酶反应的速度。酶的活性中心的这种性泴质是使某些酶催化总速度加快的一个原因。
四、酶原(zymogen)及其激活有的酶其肽链在生物合成之后，即可自发地折叠成一定的三维结构，一旦形成了一定的构象，酶就立即表现出全部酶活性，如溶菌酶。然而有些酶在生物体内首先合成出来的只是它的无活性的前体，称为酶原。这些酶原必须在一定的条件下去掉一个或几个特殊的肽键，从而使酶的构象发生一定的变化，才有活性，这一过程称为酶原激活。无活性状态转变成有活性状态的过程是不可逆的。属于这种类型的有消化系统的酶(如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶等)以及血液凝固过程的级联作用中的一系列酶。消化酶及凝血酶被不可逆地转变成活性状态,在不可逆地结合着专一性抑制性蛋白分子时，酶会失去活性，同时酶分子本身也发生变化。酶原通过酶促激活作用,由无活性的前体转变成有活性的酶，这是共价调节的一种特殊形式——共价键断裂，造成不可逆的酶活性变化,即由无活性酶原转变为有活性的酶。
五、酶的作用机理
下面以胰凝乳蛋白酶为例说明酶的作用机理。
1．胰凝乳蛋白酶原的激活
胰凝乳蛋白酶是胰脏中合成的一种蛋白水解酶。在胰脏中它以酶原的形式合成，储存在胰脏的脂类-蛋白质膜上。当需要消化时，它们即分泌到十二指肠的管中，在那里被活化为蛋白酶。
图5-9 胰凝乳蛋白酶原的活化过程
胰凝乳蛋白酶由一条多肽链组成，含有245个氨基酸残基及5个二硫键。酶原活化成胰凝乳蛋白酶，首先是由胰蛋白酶在连接Arg15及Ile16的肽键进行选择性的裂解，产生π-胰凝乳蛋白酶,肽键的这个水解即将无活性的酶转变成有活性的π-胰凝乳蛋白酶,然后这个胰凝乳蛋白酶催化从π-胰凝乳蛋白酶上去掉两个二肽(残基14和15、147和148)，产生α-胰凝乳蛋白酶，即有活性酶的稳定形式。最后形成的α-胰凝乳蛋白酶由三条肽链组成(分别称A、B和C)，相对分子质量为25 000，这些肽链靠二硫键(共价键)结合在一起。图5-9为胰凝乳蛋白酶的活化过程。
2．胰凝乳蛋白酶的三维结构
Blow利用X光结晶学研究已经以0.2nm的分辨率得到胰凝乳蛋白酶的三维结构，它是一个紧密的椭圆球，大小为5.1nm×4.0nm×4.0nm，在其二结构中有很复杂的折叠，但与肌红蛋白及血红蛋白不同，在这个结构中很少α-螺旋。在其二级结构中为反平行的折叠片，这是由于组成胰凝乳蛋白酶的三条肽链彼此以反平行方向排列，邻近的肽链以氢键维系在一起。
3．胰凝乳蛋白酶的底物专一性
胰凝乳蛋白酶在动物小肠中催化蛋白质的水解，它裂解羧基端具有芳香基团的氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸的色氨酸)的肽键。用酶与竞争性抑制剂的复合物进行X光结晶学研究的结果显示，底物结合部位为一非极性的袋子，所以，底物专一性是由底物的非极性R
基团与这个部位之间的疏水的相互作用决定的。
4．胰凝乳蛋白酶的催化机理
（1）电荷转接系统(charge relay metwork) 关于胰凝乳蛋白酶的氨基酸顺序、三维结构知识、化学和动力学研究结果已使生物化学家能够提出一个酶催化机理的化学解释。胰凝乳蛋白酶是一个丝氨酸蛋白酶，在其活性部位上有一个异乎寻常的亲核丝氨酰氧原子，这个氧原子是酶的催化活性所必需的。有许多酶需要反应性的丝氨酸残基进行催化，如乙酰胆碱酯酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及弹性蛋白酶,它们很容易用二异丙基氟磷酸(DIFP)
使之失活而鉴定出来。在α-胰凝乳蛋白酶的27个丝氨酸残基中只有一个是强亲核的，这个问题从其中三个残基(Asp102、His57及Ser195)之间的特异的空间关系根据氢键产生一个电荷转接系统可以得到解释。在催化部位埋藏的Asp102与His57之间及His57及Ser195之间存在的氢键建立起一个平衡，这个平衡使得在催化部位的Ser195的羟基的质子被有效地撤走，结果使该残基上的氧原子成为强烈亲核的，His的咪唑环(共轭碱形式)氢键的共振是这个系统的有效性的关键。
图5-11 胰凝乳蛋白酶中的电荷转接系统
（2）水解肽键所需的置换反应机理 胰凝乳蛋白酶水解肽键是经过两步置换反应进行的，第一步产生一个胺,继之产生一个酸。水解的过程包含着酶的酰化作用并放出一个胺，随后酶发生脱酰作用产生一个酸。当Ser195的氧原子处于强烈的亲核状态时开始进行催化作用,氧原子对底物上的羰基碳进行亲核攻击,结果形成一个不稳定的四联体的过渡态。酶－底物的过渡状态很快分解，C—N共价键断裂，产生一酰基—酶中间产物(酯化的Ser195)及第一个产物，一种胺。这样，酰基中间产物的形成为亲核置换的结果，即羰基碳的亲核取代基(—NH—R2)被另一(—O—CH2—Ser195)所取代。为了产生第二产物(酸)，靠H2O分子上的氧对酰基-酶中间产物的酰基进行亲核攻击而发生酶的脱酰作用。Ser195的C—O键裂解产生一个酸及复原的酶，围绕Asp102的疏水环境有利于电荷转接系统上这个残基及基团的质子化，然后电荷转接系统又帮助Ser195活化。这样氢键(电荷转接系统)及Lewis酸碱催化作用(水解)给胰凝乳蛋白酶的双置换催化机理提供了可信的化学基础。
第五节 别构酶、同工酶、诱导酶、抗体酶
一、别构酶
1．别构酶的性质、结构、别构效应与效应物
别构酶(allosteric enzyme)是代谢过程中的关键酶(又称变构酶)，是寡聚酶，由多个亚基组成，具有四级结构，除了有可以和底物结合的酶的活性中心(active site)以外，还有可以结合调节物的别构中心(allosteric site 有时也称调节中心)，这两个中心位于酶蛋白的不同部位，或在不同的亚基上，或在同一亚基的不同部位上。
调节物(或效应物)与酶分子的别构中心结合后，诱导或稳定住酶分子的某种构象，使酶活性中心对底物的结合与催化作用受到影响，从而调节酶的反应速度及代谢过程，此效应称为酶的别构效应。不同调节酶的调节物分子不同，有的别构酶具有同促效应(homotropic effect)，或称同种协同效应，它的调节物分子就是底物分子，这种酶分子上有两个以上的底物结合中心，其调节作用取决于酶是有多少个底物结合中心被占据。有的别构酶具有异促效应(heterotropic effect)。这种别构酶除了与底物分子作用外，还可与其他的调节物分子结合，它的调节物分子不是底物分子。苏氨酸脱水酶属于后一类别构酶。
2．别构酶的动力学特点和活性调节机理
（1）别构酶的动力学特点 别构酶催化反应的反应速度对底物浓度的曲线不是米氏方程所规定的双曲线，而是S形曲线。这种S形曲线表明,酶结合1分子底物 (或效应物)后,酶的构象发生了变化，这种新的构象有益于后续分子与酶的结合，大大地促进酶对后续的底物分子(或效应物)的亲合性。这是正协同性(又称协同结合或正协同效应) 的一个例子。这种别构酶称为正协同效应的别构酶(图5-12)。
从图5-12可以看出，在米氏类型酶的曲线(图5-12中A)中当[S]＝0.11时，V＝10％ Vmax，当[S]＝9时，V＝90％Vmax，达到这两种速度的底物浓度之比为81；而在S型曲线(图5-12中B)中达到同样两种速度的浓度比为3。这表明当底物浓度略微变化时，如上升到3倍，别构酶的酶反应速度可以从10％Vmax增加到90％Vmax，而在典型的米氏类型的酶中，速度若发生这么大的变化，则必然要求底物浓度有大得多的改变上升到81倍才行。这就说明对于别构酶来说，底物浓度变化引起酶促反应速度迅速变化，而米氏类型酶的酶促反应速度是随底物浓度的变化而慢慢变化的。因此在中等速度或较低的底物浓度下，这种底物浓度在完整细胞中一般是存在的，这种S形的反应体现为当底物浓度发生较小变化时，别构酶可以极大程度地控制着反应速度，这也是别构酶调节酶反应速度的原因所在。由于以上这种正协同效应，使底物浓度对酶反应速度的影响极大。换言之，就是由于正协同效应，使得酶的反应速度对底物浓度的变化极为敏感。
另一类酶具有负协同效应。这类酶的动力学曲线在表观上与双曲线有些类似，在底物浓度较低的范围内酶活力上升很快，但继续下去，底物浓度虽有较大的提高，但反应速度升高却较小。也就是说负协同效应可以使酶的反应速度对外界环境中底物浓度的变化不敏感。
（2）别构酶的活性调节机理 别构酶是由多亚基组成的，且活性中心和别构中心是分开的，那么别构中心上的调节物是怎样调节别构酶的催化活性的？可以用下列两种模式解释此问题。
①协同模式(Concerted or Symmetry model，又称MWC模型)
别构酶的协同模式或对称模式是 Monod，Wyman及Changeux于1965年提出的，我们将此模式应用于一个由两个相同亚基组成的别构酶，每个亚基有一个活性部位。假设亚基可能以两种构象存在，称为R及T(如图5-13)，R形(松弛状态)对底物的亲和力大，而T形(紧张状态)对底物的亲和力小，R形与 T形可以互变，这个模式的重要假设是两个亚基必须处于相同的构象状态，因此二聚体保持着对称。分子的构象可以是 RR或TT，而不是RT。
图5-13 别构酶的T形及R形示意图别构酶与底物的结合过程是底物不存在时，所有酶分子均为T形，加底物后构象的平衡式即向R形方向转移，因为底物只与 R形结合，当底物与一个活性部位结合时，同一酶分子的另一部位也必须处于 R形，这是协同模式所假设的，换言之，从T到R或从R到T的转变是协同的。因此，当底物加入时，R形酶分子的比例逐步增加，故底物的结合是有协同作用的，当活性部位全部饱和时，所有酶分子均为 R形(如图5-14)。
别构酶有激活剂(正调节物)和抑制剂(负调节物) 别构激活剂和抑制剂的效应用协同模式可以很容易得到解释。别构抑制剂优先与 T形结合，而别构激活剂优先与 R形结合，因此，别构抑制剂使 R T构象平衡式向 T移动，而别构激活剂使之向 R式移动(如图5-15)。
②顺序模式(Sequential or progressive interaction model，也称KNF模型) 别构酶的相互作用也可以用Koshland提出的顺序模式解释。这个模式有下列三点假设：
a,．任何亚基都只有两种构象状态，即R和T。
b．底物的结合，使其与之结合亚基的形状发生变化，不过酶分子的另一亚基的构象则不变。
c．一亚基中底物结合引起的构象变化可以增加或减少同一酶分子中另一亚基的底物亲合力。
以上两种模式有几点不同：第一，在顺序模式中，在底物不存在时，并未假设T与R间存在平衡，而从T向R的构象转变是由底物诱导的；第二，在酶分子的不同亚基中从T向R构象转变不是协同的而是顺序的，因此，在顺序模式中杂交种RT占优势而在协同模式中被排除，协同模式假设即使亚基处于不同的构象状态它们也能相互作用。 究竟哪个模式正确呢？每一种模式都只适合于某些变构酶，而对某些变构酶来说没有一种模式是满意的，对这些蛋白质来说只假设有两种构象似乎太局限了，需要更复杂的模式才能解释这些蛋白质的变构性质。
图5-14 别构酶的协同模式,第一个底 图5-15 在协同模式中变构抑制剂
物分子结合后，亲合力低的 使 T态稳定,而变构激活
TT转变成亲合力高的RR 剂使R态稳定
二、同工酶同工酶的概念
与代谢调节关系密切的酶除了调节酶 (regulatory enzymes，主要是指别构酶和共价调节酶)外，还有一类称为同工酶(isoenzyme)，它对细胞的发育及代谢的调节都很重要。同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。近年来，由于蛋白质分离技术的发展，特别是凝胶电泳的应用，使同工酶可以从细胞提取物中分离出来。这类酶存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织中，甚至同一组织的同一细胞中。这类酶由两个或两个以上的亚基聚合而成，它们催化同一个反应，但是它们的生理性质、理化性质及反应机理却是不相同的。
举例(乳酸脱氢酶同工酶)
目前已发现的同工酶有几百种，研究得较多的是乳酸脱氢酶(LDH)。存在于哺乳动物中的有5种，它们都催化同样的反应：
但它们对底物的Km值却有显著的区别。它们的相对分子质量都相近,大约是130 000～
150 000，都含有4个亚基，每个亚基即每条肽链的相对分子质量都是35 000左右。现在已经知道这些亚基分为两类：一类为骨骼肌型的，以M表示；另一类为心肌型的，以 H表示。5种同工酶的亚基组成分别为 HHHH(这一种在心肌中占优势)，HHHM、HHMM、HMMM及MMMM(这一种在骨路肌中占优势)。M亚基及 H亚基可以分开，但无活性。它们的氨基酸组成及顺序不同，电泳行为亦不同。
3．研究同工酶的理论意义及实践意义
同工酶不仅存在于动物中，还存在于植物及微生物中。例如，苹果酸脱氢酶就存在于猪心、牛心、豌豆及大肠杆菌中。
最近的研究表明,LDH同工酶中的两种不同的肽链是受不同的基因控制而产生的。电泳图谱可以表示出LDH同工酶在不同组织中的不同比例。在动物的胚胎发育及细胞分化过程中,LDH同工酶的相对比例是会改变的。现在同工酶的研究已经成为细胞分化及形态遗传的分子学基础中的重要内容。
同工酶分析法在农业上已开始用于优势杂交组合的预测。例如，番茄优势杂交组合种子与弱势杂交组合的种子中的脂酶同工酶是有差异的，从这种差异中可以看出杂种优势。在临床上也已应用同工酶作诊断指标。例如，冠心病及冠状动脉血栓引起的心肌受损患者血清中 LDH(H4)及 LDH2(MH3)含量增高，而肝细胞受损患者血清中LDH5(M4)增高。当某种组织发生病变时，就有某种特殊的同工酶释放出来。对病人及正常人同工酶电泳图谱进行比较，有助于上述疾病的诊断。
三、诱导酶
根据酶的合成与代谢物的关系，人们把酶相对地区分为结构酶(structural enzyme)和诱导酶(induced enzyme)。细胞内结构酶是指细胞中天然存在的酶，它的含量较为稳定，受外界的影响小。诱导酶是指当细胞中加入特定诱导物后诱导产生的酶，它的含量在诱导物存在下显著提高，这种诱导物往往是该酶底物的类似物或底物本身。诱导酶在微生物中较多见，如大肠杆菌一般只利用葡萄糖，当培养基不含葡萄糖而只含乳糖时，开始时代谢强度大大低于培养基含有葡萄糖的情况，继续培养一段时间后，代谢强度慢慢提高，最后达到与含葡萄糖时一样，因为这时大肠杆菌中已产生了属于诱导酶的半乳糖苷酶。
四、抗体酶(abzyme)
抗体是专一于抗原分子的、有催化活性的一类具有特殊生物学功能的蛋白质。它由抗原分子促进而大量产生，并与抗原分子之间有结合专一性。酶与其底物之间的结合也有专一性，因而人们设想是否可以在抗原分子作用下产生大量的、新颖的酶。
近十年来，人们模拟酶与底物的过渡态结构合成一些类似物——半抗原。用人工合成的半抗原对动物进行免疫，再检查动物中是否能产生一些具有催化活性的抗体，研究工作正沿着这个方向进行，已经制备出了具有酯酶活性的抗体。
抗体酶具有较高的的催化活性，但小于那些动力学上十分完善的酶。抗体酶能催化某些天然酶所不能催化的反应，为开拓有重要意义的新酶源作出重要贡献。
第六节 酶的分离提纯与活力测定一、酶分离提纯的一般原则对酶进行分离提纯有两方面的目的：一是为了研究酶的理化特性(包括结构与功能、生物学作用等)。对酶进行鉴定，必须用纯酶。 二是作为生化试剂及用作药物的酶，常常也要求有较高的纯度。
根据酶在体内的作用部位，可以将酶分为胞外酶及胞内酶两大类。胞外酶易于分离，如收集动物胰液即可分离出其中的各种蛋白酶及酯酶等。胞内酶存在于细胞内，必须破碎细胞才能进行分离，分离步骤简述如下：
（1）选材 应选择酶含量高、易于分离的动、植物组织或微生物材料作原料。
（2）破碎细胞 动物细胞较易破碎,通过一般的研磨器、匀浆器、捣碎机等就可达到目的；细菌细胞具有较厚的细胞壁，较难破碎，需要用超声波、细菌磨、溶菌酶、某些化学试剂(如甲苯、去氧胆酸钠)或冻融等处理加以破碎。植物细胞也有较厚的细胞壁，其破碎方法因组织不同或类似于动物细胞或类似于细菌细胞。
（3）抽提 在低温下，用水或低盐缓冲液，从已破碎的细胞中将酶溶出。 这样所得的粗提液中往往含有很多杂蛋白及核酸、多糖等成分。
（4）分离提纯 根据酶是蛋白质这一特性，用一系列提纯蛋白质的方法，如盐析(硫酸铵或氯化钠)、调节pH值、等电点沉淀、有机溶剂(乙醇、丙酮、异丙醇等)分级分离等经典方法提纯。
酶是生物活性物质，在提纯时必须考虑尽量减少酶活力的损失，因此全部操作需在低温下进行。一般在0～5℃间进行，用有机溶剂分级分离时必须在-20～-15℃下进行。为防止重金属使酶失活，有时需加入少量的 EDTA螯合剂；为防止酶蛋白—SH 被氧化失活，需要在抽提溶剂中加入少量巯基乙醇。在整个分离提纯过程中不能过度搅拌，以免产生大量泡沫，使酶变性。
在分离提纯过程中，必须经常测定酶的比活力，以指导提纯工作正确进行。若要得到纯度更高的制品，还需进一步提纯，常用的方法有磷酸钙凝胶吸附、离子交换纤维素(如DEAE-纤维素，CM-纤维素)分离、葡聚糖凝胶层析、离子交换－葡聚糖凝胶层析、凝胶电泳分离及亲和层析分离等。
（5）保存 最后需将酶制品浓缩、结晶，以便保存。酶制品一般都应在-20℃以下低温保存。
酶很易失活，绝不能高温烘干，可用的方法是：①保存浓缩的酶液：用硫酸铵沉淀或硫酸铵反透析法使酶浓缩，使用前再透析除去硫酸铵。②冰冻干燥：对于已除去盐分的酶液可以先在低温下结冻，再减压使水分升华，制成酶的干粉，保存于冰箱中。③浓缩液加入等体积甘油后，可于-20℃下长期保存。
二、酶活力测定与酶活力单位
酶活力(enzyme activity)也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。检查酶的含量及存在，不能直接用重量或体积来表示，常用它催化某一特定反应的能力来表示，即用酶的活力来表示。酶活力的高低是研究酶的特性、生产及应用酶制剂的一项不可缺少的指标。
（1）酶活力与酶反应速度 酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的反应速度来表示，即酶催化的反应速度愈快，酶的活力就愈高；速度愈慢，酶活力就愈低。所以测定酶活力(实质上就是测定酶的量)就是测定酶促反应的速度(用V表示)。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示，所以反应速度的单位是：底物浓度／单位时间。将产物浓度对反应时间作图，反应速度即图5-16中曲线的斜率。从图中可知，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶反应速度下降。引起下降的原因很多，如底物浓度的降低，酶在一定的pH值及温度下部分失活；产物对酶的抑制、产物浓度增加而加速了逆反应的进行等。因此，研究酶反应速度应以酶促反应的初速度为准，这时上述各种干扰因素尚未起作用，速度基本保持恒定不变。
测定产物增加量或底物减少量的方法很多。常用的方法有化学滴定、比色、比旋光度、气体测压、测定紫外吸收、电化学法、荧光测定以及同位素技术等。选择哪一种方法，要根据底物或产物的物理化学性质而定。在简单的酶反应中，底物的减少与产物增加的速度是相等的，但一般以测定产物为好，因为实验设计规定的底物浓度往往是过量的，反应时底物减少的量只占总量的一个极小部分，所以不易准确；而产物则从无到有，只要方法足够灵敏，就可以准确测定。
（2）酶活力单位(U,active unit) 酶的活力大小也就是酶量的大小，用酶的活力单位来度量。1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件下 l min内能转化lμmol底物的酶量，或是转化底物中 lμmol的有关基团的酶量。特定条件是指：温度选定为25℃，其他条件(如pH值及底物浓度)均采用最适条件。这是一个统一的标准，但使用起来不如习惯方法方便。
被人们普遍采纳的习惯用法较方便，如α-淀粉酶，可用每小时催化1g可溶性淀粉液化所需要的酶量来表示，也可以用每小时催化1ml 2％可溶性淀粉液化所需要的酶量作为1个酶单位。不过这些表示法都不够严格，同一种酶有好几种不同的单位，也不便于对酶活力进行比较。
（3）酶的比活力(specific activity) 比活力的大小，也就是酶含量的大小，即每毫克酶蛋白所具有的酶活力，一般用单位／毫克蛋白质(U／mg蛋白质)来表示。有时也用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少个活力单位来表示(U／g或U／ml)。它是酶学研究及生产中经常使用的数据，可以用来比较每单位重量酶蛋白的催化能力。对同一种酶来说，比活力愈高，酶愈纯。
（4）酶的转换数(Kcat) 转换数为每秒钟每个酶分子转换底物的微摩尔数(μmol)。它相当于产物－酶中间产物(ES)形成后，酶将底物转换为产物的速度。在数值上，Kcat＝K3，此处的K3即米氏方程导出的K3，是由ES形成产物的速度常数。
第七节 维生素与辅酶维生素及辅酶的研究是20世纪前半期生物化学最显著的成就，特别是阐明了B族维生素在酶反应中担负辅酶的作用。在此时期从分子水平探讨人体的营养需要所取得的划时代的进展，对人类的健康做出了重大贡献。
维生素包括两大类：水溶性维生素脂溶性维生素。在水溶性维生素中除维生素C外，B族维生素都作为辅酶的成分在酶反应中担负催化作用。各种维生素见表5-8。
表5-8 维生素及辅酶类型
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类 型 辅 酶 或 其 他 功 能 生 化 作 用
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硫胺素(B1) 焦磷酸硫胺素(TPP) α-酮酸氧化脱羧等
核黄素(B2) 黄素单核苷酸(FMN) 氢原子(电子)转移
黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD) 氢原子(电子)转移
泛 酸(B3 ) 辅 酶 A 酰基基团的转移
尼克酸(B5或PP) 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) 氢原子(电子)转移
(烟酸) 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP) 氢原子(电子)转移
吡哆醛(B6) 磷酸吡哆醛 氨基基团的转移
生物素(B7) 胞生物素 羟基的转移
叶 酸 (B11) 四氢叶酸 一碳基团的转移
维生素 (B12) B12 氢原子的1,2移位
硫辛酸 硫辛酰赖氨酸 氢原子和酰基基团的转移
维生素 C 羟化作用的辅助因素
维生素 A 11-视黄醛 视觉循环
维生素 D 钙和磷酸的代谢
维生素 E 抗氧化剂
维生素 K 凝血酶原的生物合成
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一、水溶性维生素
1．硫胺素
硫胺素(thiamine)或称为维生素Bl，存在于许多植物种子中，尤其是在谷物种子的外皮中，因而在未经研磨的大米和全麦粒制作的食物中此种维生素的含量较丰富。在动植物组织和酵母中它主要以辅酶即焦磷酸硫胺素(TPP)的形式存在。
人类若缺乏维生素B1则产生脚气病，脚气病在世界上以稻米为主要食物的地区比较普遍。
焦磷酸硫胺素在α-酮酸脱羧酶、丙酮酸脱羧酶、转酮酶和磷酸酮糖酶中起着辅酶的作用。磷酸酮糖酶是某些细菌中的与戊糖代谢有关的酶，反应如下：
在这些反应中，硫胺素分子中的噻唑环上的C2 位置上的氢原子容易解离出一质子以形成一个负碳离子。此负碳离子与带正碳离子的丙酮酸加成，此加成物以后经电子重排发生脱羧基反应，而后乙醛解离再生成负碳离子，这个过程如图5-18。
2．核黄素核黄素(riboflavin)又称为维生素B2，自然界中存在的维生素B2大多数为黄素单核甘酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核甘酸(FAD)。FMN和FAD在酶的活性中心中起着辅基的作用。它们的结构如下图。
核黄素可以在绿色植物、细菌和真菌中合成，但不能在动物中合成。在动物中它以黄素辅酶的形式存在。
核黄素缺乏症在人类中很难观察到，核黄素缺乏会患癞皮病。
核黄素辅酶的功能是起氧化还原作用。还原型的核黄素是无色的，当暴露在空气中时就会氧化变为黄色的氧化型核黄素。还原反应是在一个“l,4加成反应”中加上两个氢原子(两个电子和两个质子)而生成还原或消色的核黄素。此维生素的结构式及氧化还原反应如下：
3．泛酸泛酸(pantothenic acid)又称为维生素B3，其结构式如下：
它是β-丙氨酸与α,γ-二羟-β，β-二甲基丁酸结合而成的化合物。
动物和微生物都需要泛酸，但是最初发现它是因为它具有促进酶酵母生长的能力。在自然界这种维生素是作为辅酶A和酰基载体蛋白的组成成分存在的，它是乙酰化作用的辅酶，辅酶A的结构式如下：
由辅酶A和羧酸形成的硫酯具有特殊功能，使它在生化反应中起着一定的作用。
泛酸也是一种被称为酰基载体蛋白(ACP)的成分，这是一种只含几个氨基酸残基的热稳定的小分子蛋白质。ACP在脂肪酸的合成中起重要作用，在ACP中，4-磷酸泛巯基酰乙胺与蛋白质中的一个丝氨酸残基中的羟基呈共价连接。此分子内由于有泛酰巯基乙胺存在，因而能以一种类似于辅酶A的方式与其巯基形成硫酯而起着酰基载体的作用。ACP的蛋白质部分与4-磷酸泛酰巯基乙胺连接如下：
4．烟酸胺、烟酸烟酸又称为维生素B5或维生素PP，它包括烟酸和烟酰胺两种化合物。
烟酸和烟酰胺的分布很广，动植物组织中都有。缺乏这种维生素会使人患癞皮病。
烟酰胺核苷酸是一些催化氧化还原反应的脱氢酶的辅酶。
酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+) 和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）的结构式如下。
含NAD+ 和NADP+ 的脱氢酶不仅对其底物是专一的，而且对其辅酶也是专一的。例如，在磷酸戊糖途径中，催化6-磷酸葡萄糖氧化的6-磷酸葡萄糖脱氢酶要求NADP+ 作为辅酶，当6—磷酸葡萄糖氧化时，NADP+ 立即被还原。同样，乙醇脱氢酶催化乙醇氧化的同时，将NAD+ 还原，其反应如下：
CH3CH2OH + NAD+ CH3CHO + NADH + H+
根据烟酰胺核苷酸脱氢酶催化反应的研究证明：反应时从底物脱去 2mol氢原子(两个电子及两个质子)。氧化型及还原型的 NAD（NADP）的结构简式及氧化还原反应见下式：
其中的R表示辅酶分子的其他部分。当1分子氧化型烟酰胺分子接受1个质子和两个电子就转变为1分子还原型烟酰胺分子。
5．维生素B6
属于维生素B6的化合物有3种，即吡哆醛、吡哆胺和吡哆醇。
这三种维生素B6在动植物材料中广泛存在，谷粒中尤为丰富。自然界中存在的吡哆醛和吡哆胺以其磷酸衍生物状态存在以作为辅酶。
磷酸吡哆醛在氨基酸的转氨、脱羧和外消旋等重要反应中起着催比作用，其中每个反应都是由不同的专一性酶分子催化，但各反应中都以磷酸吡哆醛作为辅酶。
6．生物素生物素(biotin)又称为维生素B7或维生素H，它是一种含硫的化合物，由脲与硫戊环结合而成，并且有一个C5酸支链。
生物素在自然界广泛存在，肝和酵母中含量较丰富。这种维生素主要是通过ε- N-赖氨酸残基而与蛋白质结合的。生物胞素即ε-N-生物素酰-L-赖氨酸，是从含生物素的蛋白质中分离出来的一种水解产物。
在大肠杆菌中乙酰辅酶A（乙酰CoA）转化成丙二酰CoA的反应有三种蛋白质参加反应：①生物素羧化酶；②生物素羧基载体蛋白(BCCP)；③乙酰CoA：丙二酰CoA转羧基酶。
BCCP在这些步骤中起着关键性的作用。
7．叶酸叶酸(folic acid)又称为维生素B11是由蝶啶、对氨基苯甲酸和L-谷氨酸连接而成，其结构如下：
叶酸在自然界中广泛存在，它能治疗动物营养障碍性贫血病。
叶酸以其还原性产物起辅酶的作用。叶酸先经L-叶酸还原酶还原成二氢叶酸(DHF)，再被二氢叶酸还原酶还原成四氢(THF)，这两个反应中的还原剂都是NADPH。
8．维生素B12
维生素B 12是一种氰钴胺素(Cyanocobalamin)，其结构式如下。
辅酶B12
分离出的维生素B12除含CN－外，也可以含羟基、亚硝基、氯离子、硫酸根离子及其他阴离子,而且还有其他维生素B12 的类似物存在，如在细菌中，其5，6-二甲基苯骈咪唑残基可被其他的含氮碱基所取代。 在假维生素B12中，其含氮碱基为腺嘌呤，有时碱基可以是5-羟基苯骈咪唑。维生素B12 只在动物及微生物中发现，而不存在于植物中，它以辅酶B12状态存在。在此辅酶中，维生素B12分子中的CN－ 被5′-脱氧腺苷取代，与腺苷中的核糖的5′-碳原子连结，所以是5′-脱氧腺苷钴胺素。 此有机金属中的亚甲基基团是此辅酶中的一个活性中心。此辅酶相当不稳定，当遇光或氰化物时便裂解成相应的羟基钴胺素或氰钴胺素。因而，自然界存在的维生素B12很可能是以辅酶B12的形式存在。
9．硫辛酸硫辛酸(lipoic acid)为一种含硫的脂肪酸，呈氧化型和还原型存在，结构式如下：
硫辛酸是丙酮酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶多酶复合物中的一种辅助因素。在此复合物中，硫辛酸起着转酰基作用，同时在这个反应中硫辛酸被还原以后又重新被氧化。
10．抗坏血酸
抗坏血酸(ascorbic acid)又称为维生素C 。它是一种己糖内酯，有L及D型两种异构体，只有L型有生理作用。维生素C与辅酶的关系至今尚未被弄清。
在动植物中，除去豚鼠和灵长类动物(包括人类)外，都能以D-葡萄糖合成抗坏血酸。人类膳食中缺乏抗坏血酸时，便会得坏血病，这是一种引致水肿、皮下出血、贫血、牙齿和牙龈发生病理变化的疾病。早在古代人们就已知道这种病，当水手长期航海而少食和缺食新鲜蔬菜、水果时即会得此病。
抗坏血酸是一种很好的还原剂，其氧化形式为脱氢抗坏血酸，可被多种还原剂 [如谷胱甘肽（GSH）]所还原。所以两种类型的抗坏血酸可组成一个可逆的氧化还原系统。在胶原形成时，抗坏血酸起着外源还原剂的作用，使脯氨酸转化成羟脯氨酸。因此，抗坏血酸的生化作用与细胞的羟基化作用有关。
二、脂溶性维生素
1．维生素A
维生素A又称为视黄醇(retinol)。视黄醇及其醛衍生物―视黄醛(retinal)的结构如下, 这些化合物是由其母体物质β-胡萝卜素形成的，所以β-胡萝卜素又称为维生素A原。肠液中含有一种加氧酶，能将1分子β-胡萝卜素裂解产生2分子维生素A1醛，它又可被醇脱氢酶还原成视黄醇。
在胡萝卜素中所有的双键均为反式构型，这在生成的视黄醇和视黄醛中仍保持不变。
α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和γ-胡萝卜素及玉米黄素都是由植物合成的，动物不能合成，因而维生素A的最好来源是绿色蔬菜。由于胡萝卜素具有疏水性质，它也存在于牛奶和动物脂肪中，动物肝脏中储藏较多。淡水鱼的鱼肝油中有3-脱氢视黄醇（维生素A2）。缺乏视黄醇的典型症状是上皮细胞中发生角化作用(keratinization)，在眼睛中则会引起干眼病。人类和实验动物缺乏视黄醇的早期症状为夜盲症。维生素A过多时也会引起损害,在极端的情况下还可发现维生素A的毒害作用。
2．维生素D
维生素D是固醇类物质，其结构如右：
已知许多化合物对防止佝偻病有效，它们都是由不同类型的维生素D原经紫外线辐射而衍生的。植物不含维生素D，但植物的固醇、麦角醇经紫外线照射可以得到维生素D2(钙化醇)。 动物组织中的T-脱氢胆固醇，存在于皮肤表层中，可由于紫外线辐射而转化成维生素D3 。后者鱼肝油中也存在。
3．维生素E
维生素E是一种生育酚类化合物。生育酚有许多种，其中分布广泛、生物活性最强的是α-生育酚，即5,7,8-三甲基母育酚，结构式如下。
维生素E在自然界中分布甚广，在麦胚油、玉米油、花生油中大量存在，也存在于动物的脂肪中。
生育酚在体外最重要的效应即它是一种强抗氧化剂。有人认为生育酚的生物化学作用是能保护敏感的线粒体系统免受脂质过氧化物的不可逆抑制作用的影响。所以用缺乏生育酚的动物制备的线粒体的活性大大衰退，这是由羟高铁血红素催化的高度不饱和脂肪酸的氧化作用所引起的。
4．维生素K
维生素K是L-甲基萘醌的衍生物，最初的维生素K1是从苜蓿中分离出来的，有一个由4个类异戊二烯单位组成的叶绿基的侧链，其3个类异戊二烯被氧化。在维生素K2系统中侧链上有6～9个类异戊二烯单位。维生素K1及维生素K2的结构式如图所示。
最初维生素K1是从植物中分离出来的，所以植物性食物是维生素K1的丰富来源。K2系列的维生素可由细菌，尤其是肠内的细菌形成。因此健康动物不容易缺乏维生素K 。人类在某种情况下，即上述细菌被破坏或其生长受到抑制时可能会发生维生素K缺乏。所以服用抗菌素，尤其是长时间服用，维生素K会降低到一定水平，致使血液凝集的时间延长而发生危险。胆汁闭塞或使脂类在肠内的吸收降低时会发生维生素K缺乏症。
至今还没有发现维生素K在任何酶系统中有明显的作用。已知维生素K的主要作用是促进血液凝固，因为维生素K促进肝脏合成凝血酶原。缺乏维生素K会引起血液中凝血酶原水平降低。此外，在一些细菌中维生素K也起着电子传递的作用，其作用和动物体内的泛醌相似。
人们对酶的认识起源于生产实践。我国几千年前就开始制作发酵饮料及食品。夏禹时代，酿酒已经出现，周代已能制作饴糖和酱。春秋战国时期已能用曲治疗消化不良。1833年Payon和Persoz从麦芽提取液中分离得到一种能水解淀粉的物质，称之为淀粉酶。1857 年微生物学家Pasteur等人提出酒精发酵是酵母细胞活动的结果，1878年提出了“酶”这个概，Liebig等人提出发酵现象是由溶解于细胞液中的酶引起的。1913年Michaelis和Menten提出了酶动力学原理——米氏学说，这对酶学反应机理的研究是一个突破。1926年Sumner第一次从刀豆中提取出了脲酶结晶，并第一次证明酶有蛋白质性质。20世纪30年代Northrop又分离出了结晶的胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶，并进行了动力学探讨，确立了酶的蛋白质本质。
现已鉴定出4 000多种酶，其中不少得到结晶，很多种的一级结构或三级结构也已经阐明。随着酶学理论研究的不断深入必将对生命本质的探索作出更大的贡献。
酶的命名与分类一、习惯命名法
1961年以前使用的酶的名称都是习惯沿用的，称为习惯名。习惯命名的原则是：
（1）绝大多数酶依据其底物来命名 如催化水解淀粉的称为淀粉酶，催化水解蛋白质的称为蛋白酶。
（2）某些酶根据所催化的反应性质来命名 如水解酶催化底物分子水解，转氨酶催化一种化合物上的氨基转移至另一化合物上。
（3）有的酶结合上述两个原则来命名 如琥珀酸脱氢酶是催化琥珀酸脱氢反应的酶。
（4）在这些命名的基础上有时还加上酶的来源或酶的其他特点 如胃蛋白酶及胰蛋白酶，碱性磷酸酯酶及酸性磷酸酯酶等。
习惯命名比较简单，应用历史较长，但缺乏系统性，有时出现一酶数名或一名数酶的情况。为了适应酶学的发展，避免命名的重复，国际酶学会议于1961年提出了一个新的系统命名及系统分类的原则，已为国际生化协会所采用。
二、国际系统命名法
按照国际系统命名法，每一种酶有一个系统名称(systematic name)和习惯名称(即推荐名称( recommended name)，后一种名称简单，便于使用，但不严格缺乏系统性。系统名称应当明确表明酶的底物及催化反应的性质。例如，草酸氧化酶(习惯名称)写成系统名称时，应将它的两个底物，即“草酸”及“氧”同时列出，并用“：”将它们隔开，它所催化的反应性质为“氧化”，也需指明，所以它的系统名称为“草酸：氧氧化酶”。若底物之一是水时，可将水略去不写，如乙酰辅酶A水解酶(习惯名)可以写成乙酰辅酶A：水解酶(系统名)，而不必写成乙酰辅酶A：水水解酶。
在国际科学文献中，为严格起见，一般使用酶的系统名称，但是因某些系统名称太长，较复杂为了方便起见，有时仍使用酶的习惯名称。在《酶学手册》(《Enzyme Handbook》，Thome E,Barm编,1969年)或某些专著中列有酶的一览表，表中包括酶的编号、系统名称、习惯名称、反应式、酶的来源、酶的性质等各项内容，必要时可以查阅。
三、国际系统分类法及编号
国际系统法中分类的原则是将所有的酶促反应按反应性质分为六大类，分别用l、2、3、4、5、6的编号来表示。再根据底物中被作用的基团或键的特点将每一大类分为若干个亚类，每个亚类按顺序编成 l、2、3、4……等数字。每一个亚类可再分为若干个亚—亚类，仍用 l、2、3、4……编号。每一个亚—亚类中不同的酶有不同的编号。所以每一个酶的分类编号由四个数字组成，数字间由,.” 隔开；第一个数字指明该酶属于六个大类中的哪一类；第二个数字指出该酶属于哪一个亚类；第三个数字指出该酶属于哪一个亚—亚类；第四个数字则表明该酶在一定的亚—亚类中的排号。编号之前往往冠以EC(如 EC2.6.1.2)，EC为Enzyme Commission(酶学委员会)的缩写。六个大类及其亚类详细介绍如下：
（1）氧化还原酶类 氧化还原酶类(oxido-reductases)催化氧化还原反应。
A2H + B ＝ A + B2H
例如，乳酸：NAD+氧化还原酶(EC1.1.1.27，习惯名为乳酸脱氢酶)及黄嘌呤氧化还原酶(EC1.2.3.2，习惯名为黄嘌呤氧化酶)。
（2）转换酶类 转换酶类(transferases)催化功能基团转移反应。
AB + C ＝ A + BC
例如，丙氨酸：酮戊二酸氨基转换酶(EC2.6.1.2，习惯名为谷丙转氨酶或丙氨酸氨基移换酶)；S-腺苷酰蛋氨酸：尼克酰胺甲基移换酶(EC2.1.1.1，习惯名为尼克酰胺甲基酶)。
（3）水解酶类 水解酶类(hydrolases)催化水解反应。这类酶包括淀粉酶、核酸酶、蛋白酶及脂酶等。
AB + H2O ＝ AOH + BH
例如，亮氨酸氨基肽水解酶(EC3．4．1．1，习惯名为亮氨酸氨肽酶)。
（4）裂合酶类（裂解酶类） 裂合酶类(Iyases)催化从底物上移去一个基团而形成双键的反应或其逆反应。这类酶包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。
例如，柠檬酸裂合酶(EC4.1.3.7，习惯名为柠檬酸合成酶)。
（5）异构酶类 异构酶类(isomerases)催化各种同分异构体的相互转变。
例如，葡萄糖-6-磷酸己酮糖异构酶(EC5.3.1.9，习惯名为6-磷酸葡萄糖异构酶)。
（6）合成酶类 合成酶类(ligases)能催化一切必须与ATP分解反应相偶联，并由两种物质合成一种物质的反应。例如，L-酪氨酸：tRNA连接酶(EC6.1.1.1，习惯名是酪氨酸合成酶)。
第三个数字(表示亚－亚类)，更加精确地表明底物或反应物的性质，如1大类1亚类中的亚-亚类表示受体的类型：
＼
1．1．1 表示氧化还原酶，作用于 CHOH基团，受体是 NAD+、ADP。
／
＼
1．1．2 表示氧化还原酶，作用于 CHOH基团，受体是细胞色素。
／
＼
1．1．3 表示氧化还原酶，作用于 CHOH基团，受体是分子氧。
／
当酶的编号仅有三个数字时，就已清楚地表明了这个酶的特性：反应性质、底物性质、键的类型。
关于酶编号中第四个数字没有什么特殊规定。例如：
EC 1.1.1.27 为乳酸,NAD+氧化还原酶
EC 1.1.1.37为苹果酸,NAD+氧化还原酶
EC 6.1.1.1 为 L-酪氨酸：tRNA-连接酶(AMP),
EC 6.1.1.2 为 L-色氨酸：tRNA-连接酶(AMP)
前两个都是氧化还原酶，都是作用在－CHOH基团上的第一个亚类，又都是以NAD+为受体的，但第四个数字不同，分别为27、37，说明它们所利用的底物不同，分别为乳酸、苹果酸。它们的习惯名称分别为乳酸脱氢酶及苹果酸脱氢酶。后两种酶都是连接酶，都要求 ATP供给能量，但催化不同的 tRNA与不同的氨基酸之间的连接，所以第四个数字不同。部分亚类分别列于表5-2中。
表5-2 酶的国际分类表(大类及亚类)
(表示分类名称、编号、催化反应的类型)
1.氧化还原酶类 4,裂合酶类
(亚类表示底物中发生氧化的基团的性质) (亚类表示分裂下来的基团与残余分子
间的键的类型)
1.1 作用在 上 4.1 C—C
1.2 作用在 上 4.2 C—O
1.3 作用在 —CH=CH2 上 4.3 C—N
1.4 作用在 上 4.4C—S—S
1.5 作用在 上
1.6 作用在 NADH、NADPH 上
2,移换酶类 5,异构酶类
(亚类表示底物中被转移的性质) (亚类表示异构的键的类型)
2.1 碳基团 5.1 消旋及差向异构酶
2.2 醛或酮基 5.2 顺反异构酶
2.3 酰基
2.4 糖苷基
2.5 除甲基之外的烃基或酰基
2.6 含氮基
2.7 磷酸基
2.8 含硫基
3,水解酶类 6.合成酶类
(亚类表示被水解的类型) (亚类表示新形成的键的类型)
3.1 酯键 6.1 C—N
3.2 糖苷键 6.2 C—S
3.3 醚键 6.3 C—N
3.4 肽键 6.4 C—C
3.5 其他 C—N 键
3.6 酸酐键
第二节 酶的催化性质一、酶是生物催化剂
1．酶和一般催化剂比较
（1）用量少但能大大加快反应速率 酶与一般催化剂一样，虽然细胞中的相对含量很低，却能大大加快反应速度。
（2）不改变反应的平衡点 与一般催化剂一样，酶仅能改变化学反应的速度，并不能改变化学反应的平衡点。酶本身在反应前后也不发生变化。例如，肽键遇水自发水解的反应极为缓慢，没有现实意义，当有酶存在时，这个反应则进行得十分迅速。
（3）可降低反应的活化能 在一个化学反应体系中,反应开始时反应物(S)分子的能量水平很低，为"初态"(initial state)(A)。在反应的任何一瞬间反应物中都有一部分分子具有比初态更高一些的能量，高出的这一部分能量称为活化能(activation energy)，使分子进入“过渡态”(transition state)(即活化态A*)，这时就能形成或打破一些化学键，形成新的物质——产物(P)，即S转变为P。这些具有较高能量处于活化态的分子称为活化分子。反应物中这种活化分子越多,反应速度越快。酶和一般催化剂一样可以降低反应的活化能，增加活化分子数，加快反应速度。酶作为催化剂参加一些反应后，酶分子立即恢复原来的状态，继续参加新的反应。
2．酶作为生物催化剂的特性
（1）催化效率高 以分子比表示,酶催化反应的反应速度比非催化反应高108～1020倍,比其他催化反应高107～1013倍。以转化数(每秒钟每个酶分子能催化多少个μmol的底物发生变化)表示，大部分酶为1 000,最大可达几十万，甚至可达100万以上。
（2）具有高度的专一性 一种酶只能作用于一类或一种特定的物质，这就是酶作用的专一性(specificity)。通常把被酶作用的物质称为底物(substrate)。所以也可以说一种酶只能作用于一种或一类底物。不同的酶有不同的专一性。
（3）易失活 酶是蛋白质,凡是使蛋白质变性的因素(高温、高压、强酸、强碱等)都能使酶的结构破坏，因而失去活性，所以酶的催化作用是在温和的条件(常温、常压和适合的pH值等)下实现的。
（4）酶活力的调节控制 酶活力可以调节控制。它的调控方式很多，包括抑制剂调节、共价修饰调节、反馈调节、酶原激活和激素控制等，详细内容将在后面讨论。这也是化学调控的基础，叶面肥中含有许多离子，有些是光合酶的活化剂。
（5）酶的催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关 有些酶是复合蛋白质,其中的小分子物质(辅酶、辅基及金属离子)与酶的催化活性密切相关。若将它们除去,酶就会失去活性。
酶的高效性、专一性及温和的作用条件在生物体内的新陈代谢中发挥着强有力的作用，酶活力的调控使生命活动中的反应得以有条不紊地进行。
二、酶的化学本质
1．酶的蛋白质本质
蛋白质有多种生物功能，其中具有催化作用的蛋白质称为酶。几乎所有的酶都是蛋白质。酶和其他蛋白质一样都是由氨基酸组成的，具有两性电解质的性质并具有一、二、三、四级结构，也受物理因素(加热、紫外线照射等)及化学因素(酸碱、有机溶剂等)的作用而变性或沉淀，丧失活性。酶的分子量也很大，其水溶液具有亲水胶体的性质，不能通过透析膜。在体外酶被胰蛋白酶水解而失活。
2．酶的核酸性质
多年来人们一直认为酶都是蛋白质，然而，近年来有实验表明：核酸分子也是高活性的酶。最使人震惊的例子是L19RNA，它是原生动物四膜虫 26S rRNA前体经自身拼接所释放出的内含子的缩短的形式（黑板图示）。L19RNA在一定条件下能够以高度专一的形式催化寡聚核糖核苷酸底物的切割与连接。我们称本质为RNA的酶为核糖核酸酶(ribozymes)，有时也称为RNA酶。它们很适于去识别并转化单链核酸，因为它们与所作用的核酸底物享用共同的碱基配对语言。
RNA分子和蛋白质分子一样，可以是非常有效的催化剂，但大多数的RNA的催化效率不及蛋白质。因为RNA不同于蛋白质：首先RNA不能形成大的非极性分子，而且与蛋白质相比它们的极性小得多；第二，核酸只有四种不同的构建单位，而蛋白质有20种氨基酸作为基本的构建单位。
三、酶的底物专一性
酶的两个最显著特性就是它们的高度专一性(specificity)和极高的催化效率。正是由于这些特性使得酶与一般催化剂有明显的区别。酶对它所催化的反应与对底物的选择两方面都是高度专一的。通常酶只能催化一种化学反应或一类相似的化学反应。酶对底物的选择性很严格，有时甚至是绝对的。由于酶具有专一性，所以生物体内的代谢过程才能有一定的方向和顺序。不同的酶具有不同程度的专一性。我们可以将酶的专一性分为三种类型。
1．绝对专一性
有些酶的专一性是绝对的，即除一种底物以外，它对其他任何物质都不起催化作用，这种专一性称为绝对专一性。若底物分子发生细微的改变，便不能作为酶的底物。例如反丁烯二酸酶仅能催化反丁烯二酸形成 L-苹果酸，却不能催化结构极其相似的顺丁烯二酸发生此反应。
2．相对专一性另外一些酶对底物专一性程度要求较低，能够对结构相似的一类化合物起催化作用，这类酶的专一性称为相对专一性。它又可分为基团专一性和键专一性两类。现以水解酶为例说明这两种类型的专一性。设底物 A、B为两个化学基团，两者之间以一定的键连接，当水解酶作用时，反应如下：
A—B + H2O────→ AOH + BH
（1）基团专一性 有些酶除了要求 A和B之间的键合适外，而且对其所作用键两端的基团具有不同的专一性。例如A—B化合物，酶常对其中的一个基团(如A)具有高度的甚至是绝对的专一性，而对另外一个基团(如 B)具有相对的专一性。这种酶的专一性称为基团专一性。例如，α-D-葡萄糖苷酶能水解具有α-l，4-糖苷键的 D-葡萄糖苷，这种酶对α-D-葡萄糖基团和α-糖苷键具有绝对专一性，而底物分子上的R基团则可以是任何糖或非糖基团(如甲基)。所以这种酶既能催化麦芽糖的水解，又能催化蔗糖的水解。
（2）键专一性 有些酶的专一性更低，它只要求底物分子上有适合的化学键就可以起催化作用，而对键两端的A、B基团的结构要求不严，只有相对专一性。例如，酯酶对具有酯键（RCOOR′)的化合物都能进行催化，酯酶除了水解脂肪外，还能水解脂肪酸和醇所合成的酯类。这种专一性称为键专一性。
3．立体专一性一种酶只能对一种立体异构体起催化作用，对其对映体则全无作用，这种专一性称为立体专一性。自然界有许多化合物以立体异构体存在。氨基酸和糖类有D-构型及L-构型的异构体，如D-氨基酸的氧化酶能催化许多D-氨基酸氧化，但对L-氨基酸则完全不起作用，所以D-氨基酸氧化酶与DL-氨基酸作用时，只有一半的底物(D型)被分解，可用此法来分离消旋化合物。
四、酶的组成及分类
1．根据酶的组成将酶分成两类
（1）单酶 因为酶是蛋白质，所以酶和其他蛋白质一样，可以根据其组成成分分为简单蛋白质和结合蛋白质两类。有些酶其活性仅仅决定于蛋白质结构，这类酶属于简单蛋白质，又称单酶，如脲酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及核糖核酸酶等。
（2）全酶 另一类酶其蛋白质与非蛋白组分结合后才表现出酶活性，这类酶属于结合蛋白质，称为全酶，即全酶＝酶蛋白＋辅助因子。
全酶中蛋白质部分称为酶蛋白，非蛋白部分称为辅助因子。在催化反应中酶蛋白与辅因子所起的作用不同，酶的专一性取决于酶蛋白本身，辅助因子一般都在酶促反应中起运输转移电子、原子或某些功能基（如参与氧化还原或运载酰基）的作用。
酶的辅助因子包括金属离子及有机物，绝大多数情况下可以通过透析或其他方法将全酶中的辅助因子除去。例如，酵母提取物有催化葡萄糖发酵的能力，透析除去辅助因子后,酵母就失去了催化能力。这种与酶蛋白松弛结合的辅助因子称为辅酶(cofactor或coenzyme)，但在少数情况下，有一些辅助因子是以共价键和酶蛋白结合在一起的，不易透析除去，这种辅助因子称为辅基(prosthetic group)。辅基与辅酶的区别只在于它们与酶蛋白结合的牢固程度不同，并无严格的界限。一些可作为酶的辅助因子的辅酶和辅基见表5-1。
2．根据酶蛋白的特点将酶分为三类
（1）单体酶 单体酶(monomeric enzyme)只有一条多肽链。属于这一类的酶很少,一般都是催化水解反应的酶，相对分子质量在13 000～35 000之间,如溶菌酶、胰蛋白酶等。
（2）寡聚酶 寡聚酶 (oligomeric enzyme)由几个甚至几十个亚基组成，这些亚基可以是相同的多肽链，也可以是不同的多肽链。亚基之间不是共价结合,彼此很容易分开。寡聚酶的分子量从3.5万到几百万，如磷酸化酶a和3-磷酸甘油脱氢酶等。
（3）多酶体系 多酶体系 (multienzyme system)是由几种酶彼此嵌合形成的复合体。它有利于一系列反应的进行。这类多酶复合体分子量很高，一般都在几百万以上。如脂肪合成酶复合体。
表5-1 一些酶的辅助因子
某些含有或需要金属离子的酶
辅助因子(金属离子)
乙醇脱氢酶(alcohol dehdrogenase)
碳酸酐酶(carbonic anhydrase)
羧肽酶(carboxypeptidase)
碳酸水解酶(phosphohydrolases)
磷酸转移酶(phosphotransferases)
精氨酸酶(arginase)
丙酮酸羧化酶(pyruv tecarboxylase)
细胞色素(cytochromes)
过氧化物酶(peroxidase)
过氧化氢酶(catalase)
琥珀酸脱氢酶(succinic dehydrogenase)
铁氧还蛋白(ferredoxin dehydrogenase)
铁黄素蛋白(Fe-flavoprotein)
酪氨酸酶(tyrosinase)
细胞色素氧化酶(cytochrome oxdase)
漆酶(laccase)
抗坏血酸氧化酶(ascorbic acid oxidase)
丙酮酸磷酸激酶(pyruvate phosphokinase)
细胞膜ATP酶(plasma membranc ATPase)
固氮酶(nitogenase)
Zn2+
Zn2+
Zn2+
Mg2
Mg2+ Mn2+
Mn2+
Zn2+ Mn2+(还需生物素)
Fe2+或Fe3+(铁离子在卟啉环中)
Fe2+或Fe3+(铁离子在卟啉环中)
Fe2+或Fe3+(铁离子在卟啉环中)
Fe2+或Fe3+(还需FAD)
Fe(铁原子在铁硫晶格中，这种蛋白存在于细菌代谢及光合作用中，固氮酶中的这种蛋白质还含有钼原子)
Fe
Cu+或Cu2+
Cu+或Cu2
Cu+或Cu2
Cu+或Cu2
K+(也需要Mg2+)
Na+(也需要K+及Mg2+)
Fe2+，Mo2+
第三节 影响酶促反应速度的因素一、底物浓度对酶促反应速度的影响所有的酶促反应，如果其他条件恒定，则反应速度决定于酶浓度和底物浓度，如果酶浓度保持不变，底物浓度增加，反应速度随之增加，并以双曲线形式达到最大速度。酶促反应速度并不是随着底物浓度的增加而直线增加，而是在高浓度时达到一个极限速度。这时所有的酶分子已被底物所饱和，即酶分子与底物结合的部位已被占据，速度不再增加，如图5-1所示。这个问题我们可以用 Michaelis-Menten 于1913年提出的学说来解释。
Michaelis-Menten 学说的要点是假设有酶—底物中间产物形成，并假设反应中底物转变成产物的速度取决于酶－底物复合物转变成反应产物和酶的速度，其关系如下,
在上式中E表示酶，S表示底物，ES表示酶—底物复合物，P表示产物，K1、K-1和K2为三个假设过程的速度常数。若形成 ES的速度为Vf，则
Vf= K 1([Et]-[ES])[S]
式中Et为酶的总浓度，[Et]-[ES]为未结合的酶的浓度。ES生成的速度Vf与未结合的酶浓度及底物浓度成正比。ES消失的速度Vd为
Vd= K-1[ES]+ K2[ES]
这是由于 ES因生成初反应物(K-1)或生成产物(K2)而消失。
当 ES的生成速度与消失速度相等时，即
Vf=Vd
则 K1([Et]-[ES])[S]＝K-l[ES]+K2 [ES]
将上式移项
K1[Et][S]＝Kl[ES][S]+K2[ES]+K-1[ES]
K1[Et][S]＝(K1[S]+K2+K-1)[ES]
K1[Et][S] [Et][S]
[ES] ＝──────── ＝ ───────
(K1[S]+ K2+ K-1) K2+ K-1
[S]+ ───
K1
设V＝K2[ES]，V为观察所得的初速度，代入上式
K2[Et][S]
V＝ ──────
K 2+ K-1
[S]+ ───
K1
设 K2+ K -1
────＝Km，Vmax＝K2[Et],则
K1
Vmax[S]
V＝─────
[S] + Km
这就是米氏方程(Michaelis-Menten equation),Km称之为米氏常数(Michae1is-constant)。这个方程式表明了当已知Km及Vmax时，酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。
当酶促反应处于V＝1/2 Vmax的特殊情况时，
Vmax Vmax·[S]
── ＝ ──────
Km +[S]
l [S]
＝ ─────
2 Km + [S]
∴Km ＝ [S]
由此可以看出Km 值的物理意义，即Km 值是当酶反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，它的单位是 mol/L，与底物浓度的单位一样。
米氏常数是酶学研究中的一个极重要的数据，关于Km 还可作以下几点分析：
(l) Km 值是酶的特征常数之一，一般只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。不同的酶Km 值不同。
(2)如果一个酶有几种底物，则该酶对每一种底物都有一个特定的Km 值(表5-3)。并且Km值还受 pH值及温度的影响。因此,Km值作为常数只是对一定的底物、一定的 pH值、一定的温度条件而言的。测定酶的Km 值可以作为鉴别酶的一种手段，但是必须在指定的实验条件下进行。
表5-3 一些酶的Km 值
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
酶 底 物 K m(mmol/L)
─────────────────────────────────────────────────
过氧化氢酶(catase) H2O2 25
脲酶(urease) 尿素 25
己糖激酶(hexokinase) 葡萄糖 0.15
果糖 1.5
蔗糖酶(sacchrase) 蔗糖 28
棉子糖 350
胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin) N-苯甲酰酪氨酰胺 2.5
N-甲酰酪氨酰胺 12.0
N-乙酰酪氨酰胺 32.0
甘氨酰酪氨酰胺 122.0
碳酸酐酶(carbinic anhydrase) HCO3- 8.0～9.0
谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase) 谷氨酸 0.12
α-酮戊二酸 2.0
NAD攩+攪 0.025
NADH 0.018
肌酸激酶(creatine kinase) 肌酸 0.6
ADP 19.0
磷酸肌酸 5.0
乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase) 丙酮酸 0.017
丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase) 丙酮酸 1.3
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucosyl-6-phosphate dehydrogenase) 6-磷酸-葡萄糖 0.058
磷酸己糖异构酶(hexose-6-phosphate isomerase) 6-磷酸-葡萄糖 0.7
β-半乳糖苷酶(β-galactosidase) 乳糖 4.0
溶菌酶(lysozyme) 6-N-乙酰-葡萄糖 0.006
丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase) 丙酮酸 0.4
HCO攩-攪 1.0
ATP 0.06
精氨酸-tRNA合成酶(argirine-tRNA-synthetase) 精氨酸 0.003
tRNA 0.0004
ATP 0.3
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
(3)1/Km 近似地表示酶对底物亲和力的大小，l/Km愈大,表明亲和力越大,因为l/Km愈大，Km值就愈小，达到最大反应速度一半所需要的底物浓度就愈小。显然，最适底物与酶的亲和力最大，不需很高的底物浓度就可以很容易地达到Vmax 。
测定Km 值有许多种方法，最常用的是 Lineweaver-Burk的双倒数作图法。求Michaelis-Menten方程的倒数，可得下式：
1 Km 1 1
─ ＝ ── × ── ＋ ──
V Vmax [S] Vmax
此方程相当于一直线的数学表达,y＝ax+b，以1/ V为纵坐标，1/[S]为横坐标，将数据作图，则得一直线,其斜率为Km/ Vmax,将直线延长,在1/[S]及1/ V上的截矩分别为-1/ Km及1/Vmax，这样Km就可以从直线上的截矩计算出来(图5-2)。
图5-2 双倒数作图法，以1/V对1/[S]作图求Km
二,pH值对酶促反应速度的影响大部分酶的活力受其环境 pH值的影响，在一定 pH值下，酶促反应具有最大速度，高于或低于此值，反应速度下降，通常称此pH值为酶促反应的最适pH值 (optimum pH)。
最适pH值有时因底物种类、浓度及缓冲液成分不同而不同，而且常与酶的等电点不一致，因此，酶的最适 pH值并不是一个常数，只是在一定条件下才有意义。几种酶的最适pH值见表5-4。一般在pH值6～8之间,动物酶多在pH值6.5～8.0之间,植物及微生物酶多在 pH值4.5～6.5之间，但也有例外，如胃蛋白酶为1.5。
pH值影响酶活力的原因可能有以下几个方面：
（1）pH值会影响酶蛋白的构象,影响酶分子的稳定性。一般来说，酶在最适pH值时是稳定的,过酸或过碱都能引起蛋白质变性而使酶失去活性。
（2）pH值能影响酶分子的解离状态。因为酶是蛋白质，pH值的变化会影响到蛋白质上的许多极性基团(如氨基、羧基、咪唑基、巯基等)的离子特性。在不同pH值条件下，这些基团解离的状态不同，所带电荷也不同，只有在酶蛋白处于一定解离状态下，才能与底物形成中间物，而且酶的解离状态也影响酶的活性。例如，胃蛋白酶在正离子状态下有活性；胰蛋白酶在负离子状态下有活性；而蔗糖酶在两性离子状态下才具有活性。
表5-4 几种酶的最适pH值
酶 底 物 最 适 pH值
胃蛋白酶(pepsin) 鸡蛋清蛋白 1.5
丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase) 丙酮酸 4.8
脲酶(urease) 脲 6.4～6.9
胰α-淀粉酶(α-amylase) 淀粉 6.7～7.2
麦芽β-淀粉酶(β-amylase) 淀粉 4.5
延胡索酸酶(fumarase) 延胡索酸 6.5
苹果酸 8.0
胰蛋白酶(trypsin) 蛋白质 7.8
精氨酸酶(arginase) 精氨酸 9.5～9.7
（3）pH值影响底物的解离 许多底物或辅酶也具有离子特性(如 ATP、NAD+、CoA等)，pH值的变化也影响它们的解离状态。而酶只与某种解离状态的底物才形成复合物，如在 pH值9.0～10.0时，精氨酸解离成正离子，而精氨酸酶解离成负离子，此时酶的活性最大。
三、温度对酶促反应速度的影响温度对酶促反应速度(用V表示)也有很大影响，如图5-4所示，有一个最适温度(optimum temperature)。最适温度两侧，反应速度都比较低。在达到最适温度之前提高温度，可以提高酶促反应的速度。反应温度提高10℃，其反应速度与原来的反应速度之比称为反应温度系数，用Q10表示。对于许多酶来说，Q10多为 l～2。
也就是说，温度每增高10℃，酶促反应速度为原反应速度的 l～2倍。
温度对酶促反应速度的影响有两方面原因：一是当温度升高时，反应速度加快，这与一般化学反应一样；二是随温度升高而使酶逐步变性，即通过减少有活性的酶而降低酶促反应的速度。酶促反应的最适温度就是这两种过程平衡的结果。在低于最适温度时，以前一种效应为主；在高于最适温度时，则以后一种效应为主，因而酶活性迅速丧失，反应速度很快下降。大部分酶在60℃以上变性，少数酶能耐受较高的温度，如细菌淀粉酶在93℃时活力最高。最适温度不是酶的特征性物理常数，而是上述影响的综合结果，它不是一个固定值，而与酶作用时间的长短有关。酶可以在短时间内耐受较高的温度，只有当酶反应时间在已经规定了的情况下，才有最适温度。
四、酶浓度对酶促反应速度的影响
在一定条件下酶促反应的速度与酶的浓度成正比。因为酶催化反应时，首先要与底物形成一中间产物，即酶-底物复合物。 当底物浓度大大超过酶浓度时，反应达到最大速度。如果此时增加酶的浓度可增加反应速度，酶促反应速度与酶浓度成正比关系。图5-5表示酶反应速度与酶浓度成直线关系。
五、激活剂对酶促反应速度的影响凡是能提高酶活性的物质都称为激活剂(activitor)，其中大部分是离子或简单有机化合物。
激活剂按分子的大小可分为以下三类：
1．无机离子 无机离子可分为三种：
（1）金属离子 金属离子对酶的作用有两种：一是作为酶的辅助因子起作用；二是作为激活剂起作用。作为激活剂起作用的有 K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe2+及 Ca2+等离子。这些金属的原子序数在 11～55之间，其中的 Mg2+是多种激酶及合成酶的激活剂。
（2）阴离子 在一般浓度下,阴离子的激活作用不明显。较突出的是动物唾液中的α-淀粉酶受Cl-激活。Br-也有激活作用，但作用稍弱。
（3）氢离子 氢离子对多种酶有激活作用。
2．中等大小的有机分子 中等大小的有机分子可分为两种：
（1）某些还原剂 半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、氰化物等能激活某些酶，使酶中二硫键还原成巯基(－SH)，从而提高酶活性，木瓜蛋白酶及 D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶也是如此。
（2）EDTA(乙二胺四乙酸)
它是金属螯合剂，能除去酶中的重金属杂质，从而解除重金属离子对酶的抑制作用。
3．具有蛋白质性质的大分子物质
这类激活剂是指可对某些无活性的酶原起作用的物质。
激活作用
无活性的酶原────→有活性的酶六、抑制剂对酶促反应速度的影响
许多化合物能与一定的酶进行可逆或不可逆的结合,而使酶的催化作用受到抑制,这种化合物称为抑制剂(Inhibitor)，如药物、抗生素、毒物、抗代谢物等。酶的抑制作用可以分为两大类，即可逆性抑制(包括竞争性抑制、非竞争性抑制)和不可逆抑制。
1．可逆性抑制
（1）竞争性抑制作用(competitive inhibition) 某些化合物，特别是那些在结构上与天然底物相似的化合物可以与酶的活性中心可逆地结合，因此在反应中抑制剂可与底物竞争同一部位。在酶促反应中酶与底物形成酶－底物复合物ES，抑制剂则与酶结合形成酶—抑制剂复合物：
式中：I——抑制剂；EI——酶-抑制剂复合物；P——产物。
但是酶－抑制剂复合物不能再与底物生成 EIS，但EI的形成是可逆的，并且底物和抑制剂不断竞争酶分子上的活性中心。这种情况称为竞争性抑制作用(competitive inhibition)。竞争性抑制作用可以通过增加底物浓度基本消除。竞争性抑制作用的典型例子为琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase)。当有适当的氢受体(A)时，此酶催化下列反应：
许多结构与琥珀酸结构相似的化合物都能与琥珀酸脱氢酶结合，但不脱氢，这些化合物阻塞了酶的活性中心，因而抑制正常反应的进行。抑制琥珀酸脱氢酶的化合物有乙二酸、丙二酸、戊二酸等，其中抑制作用最强的是丙二酸，当抑制剂和底物的浓度比为1:50时，酶活性被抑制50％。
竞争性抑制作用可以从抑制剂浓度[I]影响V和[S]之间的关系来了解。米氏方程可以写成下式：
Vmax[S]
V＝─────
[S] + Km
可以用和推导米氏方程类似的方法推导出一个有抑制剂浓度[I]和抑制剂-酶复合物解离常数Ki的方程
Vmax [S]
V＝ ─────────
[S] + Km (1+[I]/ Ki)
取上式的倒数并重排，即得
1 Km [I] 1 1
─ ＝ ──(1+ ──)· ── + ──
V Vmax Ki [S] Vmax
以1/ V对1/[S]作图，所得直线即竞争性抑制作用曲线，其在纵坐标上的截矩为1/Vmax，与无抑制剂时的反应相同，即Vmax不变，但直线的斜率变成Km/ Vmax(1+[I]/ Ki)，与无抑制剂时的反应相比变小，即Km值增大。换一句话说，就是当有竞争性抑制剂存在时通过增加底物浓度，可以基本消除竞争性抑制作用，保持最大反应速度不变。因此用作图法可区别无抑制剂、有竞争性抑制剂或有非竞争性抑制剂存在时的反应。
（2）非竞争性抑制作用(noncompetitive inhibition) 有些化合物既能与酶结合，也能与酶－底物复合物结合，称为非竞争性抑制剂，用下列反应表示其过程：
非竞争性抑制与竞争性抑制作用不同之处在于非抑制剂能与ES结合，而S又能与EI结合，都形成 ESI。高浓度的底物不能使这种类型的抑制作用完全逆转，因为底物并不能阻止抑制剂与酶结合。这是由于抑制剂和酶的结合部位与酶的活性部位不同，EI的形成发生在酶分子的不被底物作用的一个部位。此类抑制剂不改变酶的Km值，但Vmax减小。
许多酶能被重金属离子如 Ag+、Hg2+或 Pb2+等抑制，都是非竞争性抑制的例子。例如，脲酶对这些离子极为敏感，微量重金属离子即起抑制作用。
重金属离子与酶的巯基(—SH)形成硫醇盐：
E-SH ＋ Ag+＝E-S-Ag ＋ H+
因为巯基对酶的活性是必需的，故形成硫醇盐后即失去酶的活性。由于硫醇盐的形成具有可逆性，这种抑制作用可以通过加适当的巯基化合物(如半胱氨酸、谷胱甘肽等)的办法去掉重金属而得到解除。通常用碘代乙酰胺检查酶分子的巯基：
各种有机汞化合物(如对氯汞苯甲酸)、各种砷化合物及 N-乙基顺丁烯二酰亚胺也可以和巯基进行反应，抑制酶的作用。
图5-6为竞争性抑制、非竞争性抑制及无抑制酶促反应的比较。这三种类型的区别列于表5-5。
表5-5 各种抑制作用的比较
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抑制 类 型 方 程 式 Vmax Km
─────────────────────────────────────────────────
Vmax [S]
无抑制 V＝─────── — —
[S] + Km
Vmax [S]
竞争性抑制 V＝ ────────── 不变 增加
[S] + Km (1+[I]/ Ki)
Vmax [S]
非竞争性抑制 V＝ ────────── 减小 不变
([S]+ Km)(1+[I]/ Ki)
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（3）反竞争性抑制作用(uncompetitive inhibition) 有些抑制剂不能与游离酶在活性中心结合,只能与酶－底物复合物(ES)结合形成ESI，因为底物与酶的结合导致酶构象改变而显现出抑制剂的结合部位，因此抑制剂不与底物分子竞争酶分子的活性中心，但形成的ESI不能转变出产物。反竞争性抑制作用可用下式表示：
这种情况恰恰与竞争性抑制作用相反，故称反竞争性抑制作用。例如氰化物对芳香硫酸脂酶的抑制作用既是此类抑制作用。反竞争性抑制作用在单底物酶反应中比较少见。
2．不可逆的抑制作用(irreversible inhibition)
一些抑制剂与酶的活性中心的功能基团共价结合而抑制酶的活性，这种作用称为不可逆型抑制作用。不能用透析或超滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶的活性。根据不同抑制剂对酶的选择性可将不可逆抑制作用分为两种类型，即专一性的不可逆抑制作用和非专一性的不可逆抑制作用。
（1）专一性的不可逆抑制作用 专一性不可抑制剂仅仅和活性部位的有关的基团反应，有机磷化合物是活性中心上含有丝氨酸残基的酶的专一性不可逆抑制剂。例如，二异丙基氟磷酸(简称DIFP)与酶的丝氨酸残基的反应：
使带有丝氨酸残基的酶由此而丧失活性。
（2）非专一性的不可逆抑制作用 非专一性的不可逆抑制剂则可以和一类或几类基团反应。属于这类抑制剂的有烷化剂、酰化剂等。碘乙酸、2,4-二硝基氟苯(DNFB)等烷化剂可使酶蛋白的氨基、巯基、羧基、硫醚基、咪唑基等烷基化；磺酰氯、酸酐等酰化剂可是酶蛋白的羟基、巯基、氨基、酚基发生酰化反应。例如碘乙酸与3-磷酸甘油醛脱氢酶的巯基共价结合而抑制此酶的活性：
E－SH ＋ ICH2COO- ──→ ES－CH2COO- ＋ HI
专一性的不可逆抑制作用和非专一性的不可逆抑制作用的区别也不是绝对的，有些非专一性抑制剂有时也会转化，产生专一性抑制作用。
第四节 酶的作用机制
一、酶的活性中心
实验证明，酶的催化作用只局限在它的大分子的一定区域。某些酶蛋白分子经水解切去相当一部分肽链后，其残余的部分仍保留一定的活力，似乎除去的那部分肽链是与活力关系不大的次要结构。最初，把酶分子中与底物接触的或非常接近底物的部分称为酶的活性部位,而直接与酶催化有关的部位称为活性中心。这种活性中心的概念不够严格。后来，大量工作，特别是X射线衍射法的发展，再结合化学方法所得到的结果，使人们进一步明确了活性中心(Active site)的概念：对于单酶来说，活性中心就是酶分子在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基上的某些基团，它们在一级结构上可能相距甚远，甚至位于不同的肽链上，通过肽链的盘绕、折叠而在空间构象上相互靠近；对于全酶来说，辅助因子或辅助因子上的某一部分结构往往是活性中心的组成部分。活性中心有两个功能部位：一个是结合部位(binding site),一定的底物通过此部位结合到酶分子上，它决定酶的专一性；另一个是催化部位(catalytic site)，它决定酶的催化能力，底物的键在此处被打断或形成新的键，从而发生一定的化学变化。
酶的活性中心具有一定的三维空间结构，由几个特定的氨基酸残基构成，处于酶分子表面的一个凹穴内，酶的活性中心结构取决于酶蛋白的空间结构，因此，酶分子中的其他部位的作用对于酶的催化作用来说，可能是次要的，但绝不是毫无意义的，它们至少为酶活性中心的形成提供了结构基础。当外界的物理化学因素破坏了酶的结构时，就可能影响酶活性中心的特定结构，因而必然影响酶的活力。
表5-6 一些酶的活性中心的氨基酸残基
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酶 酶分子的氨基酸残基数 活 性 中 心 的 残 基
──────────────────────────────────────────────────
牛胰核糖核酸酶A 124 His129 His119 Lys41
溶菌酶 129 Asp52 Glu35
木瓜蛋白酶 212 Cys25 His150
枯草杆菌蛋白酶 275 His64 Ser221
碳酸酐酶 258 His95—Zn95—His129
↓
His117
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二、酶与底物分子的结 合
酶的活性中心具有一定的大小和一定的几何形状，这样便于与底物的结合，那么酶与底物究竞如何与底物结合呢？ 这与酶的专一性直接相关。关于这个问题有两个假说:
（1）锁与钥匙学说 E．
Fischer在1890年提出，底物分子或底物分子的一部分像钥匙那样，专一地楔入到酶的活性中心部位，也就是说底物分子进行化学反应的部位与酶分子上有催化效能的必需基团间具有紧密互补的关系(如图5-7所示)。
这个学说强调指出只有固定的底物才能楔入与它互补的酶表面，用这个学说可以较好地解释酶的立体异构专一性。
有一些问题用锁与钥匙学说不能解释：如果酶的活性中心是锁和钥匙学说中的锁，那么，那种结构不可能既适合于可逆反应的底物，又适合于可逆反应的产物，而且也不能解释酶的专一性中的所有现象。这样后人便提出了诱导楔合假说。
（2）诱导楔合假说
由Koshland于1964年提出：当酶与底物分子接近时，酶蛋白受底物分子的诱导，其构象发生有利于底物结构的变化，
酶与底物在此基础上互补楔合，进行反应。近年来 X射线衍射分析的实验结果支持这一假说，证明了酶与底物结合时，确有显著的构象变化。因此人们认为这一假说比较满意地说明了酶的专一性。图5-8则表示酶构象在专一性底物及非专一性底物存在时的变化。
图中黑线条表示带有催化基团A、B及结合基团C的肽段，它与带斜线的“酶”共同组成酶分子，a表示底物与酶分子活性中心的原有构象，b表示专一性底物引入后，酶蛋白构象改变，诱导楔合使催化基团 A、B并列成有利于结合底物的状态，并形成酶－底物复合物。但是，如果引入了不正常的、非专一性的底物，情况就不同了，c表示在底物上加入了一个庞大的基团，妨碍了酶的A、B基团并列，因此不利于酶与底物的结合，如加入某些竞争性抑制剂等。d则表示在正常底物上切除某些基团后，酶蛋白的带 B基的肽链顶住了A基的肽链，也阻止了 A、B基的并列，因此也不利于酶与底物结合，这样的酶也就不能起催化作用了。
三、与酶的高效性有关的因素
酶催化反应机理的研究是当代生物化学的重要课题，其重要内容之一就是探索酶作用高效性的原因。据现在所知与酶高效性有关的主要因素有以下几个方面：
1．酶降低反应的活化能
设有一化学反应如下：
A—B ──→ A…B ──→ A＋B
在反应系统中包含一部分高能态的活化的A-B分子，称为过渡态(A…B)。当发生反应时，连接A和B的键会变得很弱而断裂以导致产物A和B的形成。反应速度与其过渡态成正比，而过渡态的浓度取决于生成过渡态的反应分子所需要的临界热动能。酶促反应的一个重要特点是降低反应的活化能，使之较易达到过渡态，结果使更多的分子参加反应，加快反应速度。
一个反应的速度常数可用阿累尼乌斯(Arrhenius)方程表示：
Ea
lnk ＝ lnA － ──
RT
式中k为速度常数，A为指前因子，它是与温度、浓度均无关的常数，Ea为活化能，R为气体常数，T为绝对温度。一般的化学反应在37℃时其Ea 值为62.7～82.6 kJ/mol，而许多酶促反应的Ea值为8.36～33.4 kJ/mol，由此可见酶促反应的活化能比一般反应的活化能低的多。
2．底物与酶的“靠近”及“定向”
由于化学反应速度与反应物浓度成正比，若在反应系统的某一局部区域底物浓度增加，则反应速度也随之加快。提高反应速度的最主要方法是使底物分子进入活性中心区域，亦即大大提高活性区域的底物浓度。曾测到过某底物在溶液中的浓度为0.001mol/L，而在酶活性中心的浓度竞达100mol/L，比溶液中的浓度高10万倍！因此可以想象，在酶的活性中心区域反应速度必定是极高的。
当底物未与酶结合时，活性中心的催化基团还未能与底物十分靠近，但由于酶活性中心的结构有一种可适应性，即当专一性底物与活性中心结合时，酶蛋白发生一定的构象变化，使反应所需要的酶中的催化基团与结合基团正确地排列并定位，以便能与底物楔合，使底物分子可以“靠近”及“定向”于酶，这也就是前面提到的诱导楔合。这样活性中心局部的底物浓度才能大大提高。酶构象发生的这种改变是反应速度增加的一种很重要的原因。反应后，释放出产物，酶的构象再逆转，回到它的初始状态。对溶菌酶和羧肽酶的X衍射分析的实验结果证实了以上的看法。Jenck等人指出“靠近”及“定向”可能使反应速度增长108倍，这与许多酶的催化效率的计算是很相近的。
3．使底物分子中的敏感键发生“变形”
酶使底物分子中的敏感键发生“变形”，从而促使底物中的敏感键更易于破裂。前面曾经提到，当酶遇到它的专一性底物时，发生构象变化以利于催化。事实上，不仅酶构象受底物作用而变化，底物分子也常常受酶作用而变化。酶中的某些基团或离子可以使底物分子内敏感键中的某些基团的电子云密度增高或降低，产生“电子张力”，使敏感键的一端更加敏感，更易于发生反应。有时甚至使底物分子发生形变，这样就使酶—底物复合物易于形成。而且往往是酶构象发生变化的同时，底物分子也发生形变，从而形成一个互相楔合的酶—底物复合物。羧肽酶A的X衍射分析结果就为这种“电子张力”理论提供了证据。
4．共价催化
还有一些酶以另一种方式来提高催化反应的速度，即共价催化。这种方式是底物与酶形成一个反应活性很高的共价中间物，这个中间物易变成过渡状态，因此反应的活化能大大降低，底物可以越过较低的“能阈”而形成产物。例如，丝氨酸类酶与酰基形成酰基酶；半胱氨酸类酶活性中心的半胱氨酸巯基与底物酰基形成含共价硫酯键的中间物。
5．酸碱催化
有两种酸碱催化剂，一是狭义的酸碱催化剂，即H+与OH-。由于酶反应的最适pH值一般接近于中性，因此H+与OH-的催化在酶反应中的重要性是比较有限的。另一种是广义的酸碱催化剂，指的是质子供体及质子受体的催化，它们在酶反应中十分重要，发生在细胞内的许多种类型的有机反应都是受广义的酸碱催化的，例如将水加到羰基上、羧酸酯及磷酸酯的水解、各种分子重排以及许多取代反应等。
酶蛋白中含有几种可以起广义酸碱催化作用的功能基，如氨基、羧基、巯基、酚羟基及咪唑基等。其中组氨酸的咪唑基值得特别注意，因为它既是一个很强的亲核基团，又是一个有效的广义酸碱功能基。（在同一个活性中心，既可进行酸催化又可以进行碱催化）
影响酸碱催化反应速度的因素有两个：
（1）酸碱的强度 在以上功能基中，组氨酸的咪唑基的解离数为6.0，这意味着由咪唑基上解离下来的质子的浓度与水中的[H+]相近，因此它在接近于生物体液pH值的条件下(即在中性条件下)，有一半以酸的形式存在，另一半以碱的形式存在。也就是说咪唑基既可以作为质子供体，又可作为质子的受体在酶促反应中发挥催化作用。因此，咪唑基是酶催化作用中最有效最活泼的一个催化功能基。
（2）功能基供出质子或接受质子的速度在这方面咪唑基又是特别突出，它供出或接受质子的速度十分迅速，其半寿期小于10-10s，而且供出或接受质子的速度几乎相等。
由于咪唑基有如此的优点，所以虽然组氨酸在大多数蛋白质中含量很少，却很重要。推测在生物进化过程中，它很可能不是作为一般的结构蛋白成分，而是被选择作为酶分子中的催化结构而存在下来的。
广义的酸碱催化与共价催化可使酶促反应速度大大提高，但是比起前面第二和第三种方式来，它们使酶促反应速度增长较小。尽管如此，还必须看到它们在提高酶促反应速度中起的重要作用，尤其是广义酸碱催化还有独到之处：它为在近于中性的 pH值下进行催化创造了有利条件。因为在这种接近中性 pH值的条件下，H+与OH-的浓度太低，不足以起到催化剂的作用。
6．酶活性中心的疏水性
某些酶的活性中心穴内相对地说是非极性的，因此酶的催化基团被低价电环境所包围，在某些情况下，还可能排除高极性的水分子。这样，底物分子的敏感键和酶的催化基团之间就会有很大的反应力，这有助于加速酶反应的速度。酶的活性中心的这种性泴质是使某些酶催化总速度加快的一个原因。
四、酶原(zymogen)及其激活有的酶其肽链在生物合成之后，即可自发地折叠成一定的三维结构，一旦形成了一定的构象，酶就立即表现出全部酶活性，如溶菌酶。然而有些酶在生物体内首先合成出来的只是它的无活性的前体，称为酶原。这些酶原必须在一定的条件下去掉一个或几个特殊的肽键，从而使酶的构象发生一定的变化，才有活性，这一过程称为酶原激活。无活性状态转变成有活性状态的过程是不可逆的。属于这种类型的有消化系统的酶(如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶等)以及血液凝固过程的级联作用中的一系列酶。消化酶及凝血酶被不可逆地转变成活性状态,在不可逆地结合着专一性抑制性蛋白分子时，酶会失去活性，同时酶分子本身也发生变化。酶原通过酶促激活作用,由无活性的前体转变成有活性的酶，这是共价调节的一种特殊形式——共价键断裂，造成不可逆的酶活性变化,即由无活性酶原转变为有活性的酶。
五、酶的作用机理
下面以胰凝乳蛋白酶为例说明酶的作用机理。
1．胰凝乳蛋白酶原的激活
胰凝乳蛋白酶是胰脏中合成的一种蛋白水解酶。在胰脏中它以酶原的形式合成，储存在胰脏的脂类-蛋白质膜上。当需要消化时，它们即分泌到十二指肠的管中，在那里被活化为蛋白酶。
图5-9 胰凝乳蛋白酶原的活化过程
胰凝乳蛋白酶由一条多肽链组成，含有245个氨基酸残基及5个二硫键。酶原活化成胰凝乳蛋白酶，首先是由胰蛋白酶在连接Arg15及Ile16的肽键进行选择性的裂解，产生π-胰凝乳蛋白酶,肽键的这个水解即将无活性的酶转变成有活性的π-胰凝乳蛋白酶,然后这个胰凝乳蛋白酶催化从π-胰凝乳蛋白酶上去掉两个二肽(残基14和15、147和148)，产生α-胰凝乳蛋白酶，即有活性酶的稳定形式。最后形成的α-胰凝乳蛋白酶由三条肽链组成(分别称A、B和C)，相对分子质量为25 000，这些肽链靠二硫键(共价键)结合在一起。图5-9为胰凝乳蛋白酶的活化过程。
2．胰凝乳蛋白酶的三维结构
Blow利用X光结晶学研究已经以0.2nm的分辨率得到胰凝乳蛋白酶的三维结构，它是一个紧密的椭圆球，大小为5.1nm×4.0nm×4.0nm，在其二结构中有很复杂的折叠，但与肌红蛋白及血红蛋白不同，在这个结构中很少α-螺旋。在其二级结构中为反平行的折叠片，这是由于组成胰凝乳蛋白酶的三条肽链彼此以反平行方向排列，邻近的肽链以氢键维系在一起。
3．胰凝乳蛋白酶的底物专一性
胰凝乳蛋白酶在动物小肠中催化蛋白质的水解，它裂解羧基端具有芳香基团的氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸的色氨酸)的肽键。用酶与竞争性抑制剂的复合物进行X光结晶学研究的结果显示，底物结合部位为一非极性的袋子，所以，底物专一性是由底物的非极性R
基团与这个部位之间的疏水的相互作用决定的。
4．胰凝乳蛋白酶的催化机理
（1）电荷转接系统(charge relay metwork) 关于胰凝乳蛋白酶的氨基酸顺序、三维结构知识、化学和动力学研究结果已使生物化学家能够提出一个酶催化机理的化学解释。胰凝乳蛋白酶是一个丝氨酸蛋白酶，在其活性部位上有一个异乎寻常的亲核丝氨酰氧原子，这个氧原子是酶的催化活性所必需的。有许多酶需要反应性的丝氨酸残基进行催化，如乙酰胆碱酯酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及弹性蛋白酶,它们很容易用二异丙基氟磷酸(DIFP)
使之失活而鉴定出来。在α-胰凝乳蛋白酶的27个丝氨酸残基中只有一个是强亲核的，这个问题从其中三个残基(Asp102、His57及Ser195)之间的特异的空间关系根据氢键产生一个电荷转接系统可以得到解释。在催化部位埋藏的Asp102与His57之间及His57及Ser195之间存在的氢键建立起一个平衡，这个平衡使得在催化部位的Ser195的羟基的质子被有效地撤走，结果使该残基上的氧原子成为强烈亲核的，His的咪唑环(共轭碱形式)氢键的共振是这个系统的有效性的关键。
图5-11 胰凝乳蛋白酶中的电荷转接系统
（2）水解肽键所需的置换反应机理 胰凝乳蛋白酶水解肽键是经过两步置换反应进行的，第一步产生一个胺,继之产生一个酸。水解的过程包含着酶的酰化作用并放出一个胺，随后酶发生脱酰作用产生一个酸。当Ser195的氧原子处于强烈的亲核状态时开始进行催化作用,氧原子对底物上的羰基碳进行亲核攻击,结果形成一个不稳定的四联体的过渡态。酶－底物的过渡状态很快分解，C—N共价键断裂，产生一酰基—酶中间产物(酯化的Ser195)及第一个产物，一种胺。这样，酰基中间产物的形成为亲核置换的结果，即羰基碳的亲核取代基(—NH—R2)被另一(—O—CH2—Ser195)所取代。为了产生第二产物(酸)，靠H2O分子上的氧对酰基-酶中间产物的酰基进行亲核攻击而发生酶的脱酰作用。Ser195的C—O键裂解产生一个酸及复原的酶，围绕Asp102的疏水环境有利于电荷转接系统上这个残基及基团的质子化，然后电荷转接系统又帮助Ser195活化。这样氢键(电荷转接系统)及Lewis酸碱催化作用(水解)给胰凝乳蛋白酶的双置换催化机理提供了可信的化学基础。
第五节 别构酶、同工酶、诱导酶、抗体酶
一、别构酶
1．别构酶的性质、结构、别构效应与效应物
别构酶(allosteric enzyme)是代谢过程中的关键酶(又称变构酶)，是寡聚酶，由多个亚基组成，具有四级结构，除了有可以和底物结合的酶的活性中心(active site)以外，还有可以结合调节物的别构中心(allosteric site 有时也称调节中心)，这两个中心位于酶蛋白的不同部位，或在不同的亚基上，或在同一亚基的不同部位上。
调节物(或效应物)与酶分子的别构中心结合后，诱导或稳定住酶分子的某种构象，使酶活性中心对底物的结合与催化作用受到影响，从而调节酶的反应速度及代谢过程，此效应称为酶的别构效应。不同调节酶的调节物分子不同，有的别构酶具有同促效应(homotropic effect)，或称同种协同效应，它的调节物分子就是底物分子，这种酶分子上有两个以上的底物结合中心，其调节作用取决于酶是有多少个底物结合中心被占据。有的别构酶具有异促效应(heterotropic effect)。这种别构酶除了与底物分子作用外，还可与其他的调节物分子结合，它的调节物分子不是底物分子。苏氨酸脱水酶属于后一类别构酶。
2．别构酶的动力学特点和活性调节机理
（1）别构酶的动力学特点 别构酶催化反应的反应速度对底物浓度的曲线不是米氏方程所规定的双曲线，而是S形曲线。这种S形曲线表明,酶结合1分子底物 (或效应物)后,酶的构象发生了变化，这种新的构象有益于后续分子与酶的结合，大大地促进酶对后续的底物分子(或效应物)的亲合性。这是正协同性(又称协同结合或正协同效应) 的一个例子。这种别构酶称为正协同效应的别构酶(图5-12)。
从图5-12可以看出，在米氏类型酶的曲线(图5-12中A)中当[S]＝0.11时，V＝10％ Vmax，当[S]＝9时，V＝90％Vmax，达到这两种速度的底物浓度之比为81；而在S型曲线(图5-12中B)中达到同样两种速度的浓度比为3。这表明当底物浓度略微变化时，如上升到3倍，别构酶的酶反应速度可以从10％Vmax增加到90％Vmax，而在典型的米氏类型的酶中，速度若发生这么大的变化，则必然要求底物浓度有大得多的改变上升到81倍才行。这就说明对于别构酶来说，底物浓度变化引起酶促反应速度迅速变化，而米氏类型酶的酶促反应速度是随底物浓度的变化而慢慢变化的。因此在中等速度或较低的底物浓度下，这种底物浓度在完整细胞中一般是存在的，这种S形的反应体现为当底物浓度发生较小变化时，别构酶可以极大程度地控制着反应速度，这也是别构酶调节酶反应速度的原因所在。由于以上这种正协同效应，使底物浓度对酶反应速度的影响极大。换言之，就是由于正协同效应，使得酶的反应速度对底物浓度的变化极为敏感。
另一类酶具有负协同效应。这类酶的动力学曲线在表观上与双曲线有些类似，在底物浓度较低的范围内酶活力上升很快，但继续下去，底物浓度虽有较大的提高，但反应速度升高却较小。也就是说负协同效应可以使酶的反应速度对外界环境中底物浓度的变化不敏感。
（2）别构酶的活性调节机理 别构酶是由多亚基组成的，且活性中心和别构中心是分开的，那么别构中心上的调节物是怎样调节别构酶的催化活性的？可以用下列两种模式解释此问题。
①协同模式(Concerted or Symmetry model，又称MWC模型)
别构酶的协同模式或对称模式是 Monod，Wyman及Changeux于1965年提出的，我们将此模式应用于一个由两个相同亚基组成的别构酶，每个亚基有一个活性部位。假设亚基可能以两种构象存在，称为R及T(如图5-13)，R形(松弛状态)对底物的亲和力大，而T形(紧张状态)对底物的亲和力小，R形与 T形可以互变，这个模式的重要假设是两个亚基必须处于相同的构象状态，因此二聚体保持着对称。分子的构象可以是 RR或TT，而不是RT。
图5-13 别构酶的T形及R形示意图别构酶与底物的结合过程是底物不存在时，所有酶分子均为T形，加底物后构象的平衡式即向R形方向转移，因为底物只与 R形结合，当底物与一个活性部位结合时，同一酶分子的另一部位也必须处于 R形，这是协同模式所假设的，换言之，从T到R或从R到T的转变是协同的。因此，当底物加入时，R形酶分子的比例逐步增加，故底物的结合是有协同作用的，当活性部位全部饱和时，所有酶分子均为 R形(如图5-14)。
别构酶有激活剂(正调节物)和抑制剂(负调节物) 别构激活剂和抑制剂的效应用协同模式可以很容易得到解释。别构抑制剂优先与 T形结合，而别构激活剂优先与 R形结合，因此，别构抑制剂使 R T构象平衡式向 T移动，而别构激活剂使之向 R式移动(如图5-15)。
②顺序模式(Sequential or progressive interaction model，也称KNF模型) 别构酶的相互作用也可以用Koshland提出的顺序模式解释。这个模式有下列三点假设：
a,．任何亚基都只有两种构象状态，即R和T。
b．底物的结合，使其与之结合亚基的形状发生变化，不过酶分子的另一亚基的构象则不变。
c．一亚基中底物结合引起的构象变化可以增加或减少同一酶分子中另一亚基的底物亲合力。
以上两种模式有几点不同：第一，在顺序模式中，在底物不存在时，并未假设T与R间存在平衡，而从T向R的构象转变是由底物诱导的；第二，在酶分子的不同亚基中从T向R构象转变不是协同的而是顺序的，因此，在顺序模式中杂交种RT占优势而在协同模式中被排除，协同模式假设即使亚基处于不同的构象状态它们也能相互作用。 究竟哪个模式正确呢？每一种模式都只适合于某些变构酶，而对某些变构酶来说没有一种模式是满意的，对这些蛋白质来说只假设有两种构象似乎太局限了，需要更复杂的模式才能解释这些蛋白质的变构性质。
图5-14 别构酶的协同模式,第一个底 图5-15 在协同模式中变构抑制剂
物分子结合后，亲合力低的 使 T态稳定,而变构激活
TT转变成亲合力高的RR 剂使R态稳定
二、同工酶同工酶的概念
与代谢调节关系密切的酶除了调节酶 (regulatory enzymes，主要是指别构酶和共价调节酶)外，还有一类称为同工酶(isoenzyme)，它对细胞的发育及代谢的调节都很重要。同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。近年来，由于蛋白质分离技术的发展，特别是凝胶电泳的应用，使同工酶可以从细胞提取物中分离出来。这类酶存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织中，甚至同一组织的同一细胞中。这类酶由两个或两个以上的亚基聚合而成，它们催化同一个反应，但是它们的生理性质、理化性质及反应机理却是不相同的。
举例(乳酸脱氢酶同工酶)
目前已发现的同工酶有几百种，研究得较多的是乳酸脱氢酶(LDH)。存在于哺乳动物中的有5种，它们都催化同样的反应：
但它们对底物的Km值却有显著的区别。它们的相对分子质量都相近,大约是130 000～
150 000，都含有4个亚基，每个亚基即每条肽链的相对分子质量都是35 000左右。现在已经知道这些亚基分为两类：一类为骨骼肌型的，以M表示；另一类为心肌型的，以 H表示。5种同工酶的亚基组成分别为 HHHH(这一种在心肌中占优势)，HHHM、HHMM、HMMM及MMMM(这一种在骨路肌中占优势)。M亚基及 H亚基可以分开，但无活性。它们的氨基酸组成及顺序不同，电泳行为亦不同。
3．研究同工酶的理论意义及实践意义
同工酶不仅存在于动物中，还存在于植物及微生物中。例如，苹果酸脱氢酶就存在于猪心、牛心、豌豆及大肠杆菌中。
最近的研究表明,LDH同工酶中的两种不同的肽链是受不同的基因控制而产生的。电泳图谱可以表示出LDH同工酶在不同组织中的不同比例。在动物的胚胎发育及细胞分化过程中,LDH同工酶的相对比例是会改变的。现在同工酶的研究已经成为细胞分化及形态遗传的分子学基础中的重要内容。
同工酶分析法在农业上已开始用于优势杂交组合的预测。例如，番茄优势杂交组合种子与弱势杂交组合的种子中的脂酶同工酶是有差异的，从这种差异中可以看出杂种优势。在临床上也已应用同工酶作诊断指标。例如，冠心病及冠状动脉血栓引起的心肌受损患者血清中 LDH(H4)及 LDH2(MH3)含量增高，而肝细胞受损患者血清中LDH5(M4)增高。当某种组织发生病变时，就有某种特殊的同工酶释放出来。对病人及正常人同工酶电泳图谱进行比较，有助于上述疾病的诊断。
三、诱导酶
根据酶的合成与代谢物的关系，人们把酶相对地区分为结构酶(structural enzyme)和诱导酶(induced enzyme)。细胞内结构酶是指细胞中天然存在的酶，它的含量较为稳定，受外界的影响小。诱导酶是指当细胞中加入特定诱导物后诱导产生的酶，它的含量在诱导物存在下显著提高，这种诱导物往往是该酶底物的类似物或底物本身。诱导酶在微生物中较多见，如大肠杆菌一般只利用葡萄糖，当培养基不含葡萄糖而只含乳糖时，开始时代谢强度大大低于培养基含有葡萄糖的情况，继续培养一段时间后，代谢强度慢慢提高，最后达到与含葡萄糖时一样，因为这时大肠杆菌中已产生了属于诱导酶的半乳糖苷酶。
四、抗体酶(abzyme)
抗体是专一于抗原分子的、有催化活性的一类具有特殊生物学功能的蛋白质。它由抗原分子促进而大量产生，并与抗原分子之间有结合专一性。酶与其底物之间的结合也有专一性，因而人们设想是否可以在抗原分子作用下产生大量的、新颖的酶。
近十年来，人们模拟酶与底物的过渡态结构合成一些类似物——半抗原。用人工合成的半抗原对动物进行免疫，再检查动物中是否能产生一些具有催化活性的抗体，研究工作正沿着这个方向进行，已经制备出了具有酯酶活性的抗体。
抗体酶具有较高的的催化活性，但小于那些动力学上十分完善的酶。抗体酶能催化某些天然酶所不能催化的反应，为开拓有重要意义的新酶源作出重要贡献。
第六节 酶的分离提纯与活力测定一、酶分离提纯的一般原则对酶进行分离提纯有两方面的目的：一是为了研究酶的理化特性(包括结构与功能、生物学作用等)。对酶进行鉴定，必须用纯酶。 二是作为生化试剂及用作药物的酶，常常也要求有较高的纯度。
根据酶在体内的作用部位，可以将酶分为胞外酶及胞内酶两大类。胞外酶易于分离，如收集动物胰液即可分离出其中的各种蛋白酶及酯酶等。胞内酶存在于细胞内，必须破碎细胞才能进行分离，分离步骤简述如下：
（1）选材 应选择酶含量高、易于分离的动、植物组织或微生物材料作原料。
（2）破碎细胞 动物细胞较易破碎,通过一般的研磨器、匀浆器、捣碎机等就可达到目的；细菌细胞具有较厚的细胞壁，较难破碎，需要用超声波、细菌磨、溶菌酶、某些化学试剂(如甲苯、去氧胆酸钠)或冻融等处理加以破碎。植物细胞也有较厚的细胞壁，其破碎方法因组织不同或类似于动物细胞或类似于细菌细胞。
（3）抽提 在低温下，用水或低盐缓冲液，从已破碎的细胞中将酶溶出。 这样所得的粗提液中往往含有很多杂蛋白及核酸、多糖等成分。
（4）分离提纯 根据酶是蛋白质这一特性，用一系列提纯蛋白质的方法，如盐析(硫酸铵或氯化钠)、调节pH值、等电点沉淀、有机溶剂(乙醇、丙酮、异丙醇等)分级分离等经典方法提纯。
酶是生物活性物质，在提纯时必须考虑尽量减少酶活力的损失，因此全部操作需在低温下进行。一般在0～5℃间进行，用有机溶剂分级分离时必须在-20～-15℃下进行。为防止重金属使酶失活，有时需加入少量的 EDTA螯合剂；为防止酶蛋白—SH 被氧化失活，需要在抽提溶剂中加入少量巯基乙醇。在整个分离提纯过程中不能过度搅拌，以免产生大量泡沫，使酶变性。
在分离提纯过程中，必须经常测定酶的比活力，以指导提纯工作正确进行。若要得到纯度更高的制品，还需进一步提纯，常用的方法有磷酸钙凝胶吸附、离子交换纤维素(如DEAE-纤维素，CM-纤维素)分离、葡聚糖凝胶层析、离子交换－葡聚糖凝胶层析、凝胶电泳分离及亲和层析分离等。
（5）保存 最后需将酶制品浓缩、结晶，以便保存。酶制品一般都应在-20℃以下低温保存。
酶很易失活，绝不能高温烘干，可用的方法是：①保存浓缩的酶液：用硫酸铵沉淀或硫酸铵反透析法使酶浓缩，使用前再透析除去硫酸铵。②冰冻干燥：对于已除去盐分的酶液可以先在低温下结冻，再减压使水分升华，制成酶的干粉，保存于冰箱中。③浓缩液加入等体积甘油后，可于-20℃下长期保存。
二、酶活力测定与酶活力单位
酶活力(enzyme activity)也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。检查酶的含量及存在，不能直接用重量或体积来表示，常用它催化某一特定反应的能力来表示，即用酶的活力来表示。酶活力的高低是研究酶的特性、生产及应用酶制剂的一项不可缺少的指标。
（1）酶活力与酶反应速度 酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的反应速度来表示，即酶催化的反应速度愈快，酶的活力就愈高；速度愈慢，酶活力就愈低。所以测定酶活力(实质上就是测定酶的量)就是测定酶促反应的速度(用V表示)。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示，所以反应速度的单位是：底物浓度／单位时间。将产物浓度对反应时间作图，反应速度即图5-16中曲线的斜率。从图中可知，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶反应速度下降。引起下降的原因很多，如底物浓度的降低，酶在一定的pH值及温度下部分失活；产物对酶的抑制、产物浓度增加而加速了逆反应的进行等。因此，研究酶反应速度应以酶促反应的初速度为准，这时上述各种干扰因素尚未起作用，速度基本保持恒定不变。
测定产物增加量或底物减少量的方法很多。常用的方法有化学滴定、比色、比旋光度、气体测压、测定紫外吸收、电化学法、荧光测定以及同位素技术等。选择哪一种方法，要根据底物或产物的物理化学性质而定。在简单的酶反应中，底物的减少与产物增加的速度是相等的，但一般以测定产物为好，因为实验设计规定的底物浓度往往是过量的，反应时底物减少的量只占总量的一个极小部分，所以不易准确；而产物则从无到有，只要方法足够灵敏，就可以准确测定。
（2）酶活力单位(U,active unit) 酶的活力大小也就是酶量的大小，用酶的活力单位来度量。1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件下 l min内能转化lμmol底物的酶量，或是转化底物中 lμmol的有关基团的酶量。特定条件是指：温度选定为25℃，其他条件(如pH值及底物浓度)均采用最适条件。这是一个统一的标准，但使用起来不如习惯方法方便。
被人们普遍采纳的习惯用法较方便，如α-淀粉酶，可用每小时催化1g可溶性淀粉液化所需要的酶量来表示，也可以用每小时催化1ml 2％可溶性淀粉液化所需要的酶量作为1个酶单位。不过这些表示法都不够严格，同一种酶有好几种不同的单位，也不便于对酶活力进行比较。
（3）酶的比活力(specific activity) 比活力的大小，也就是酶含量的大小，即每毫克酶蛋白所具有的酶活力，一般用单位／毫克蛋白质(U／mg蛋白质)来表示。有时也用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少个活力单位来表示(U／g或U／ml)。它是酶学研究及生产中经常使用的数据，可以用来比较每单位重量酶蛋白的催化能力。对同一种酶来说，比活力愈高，酶愈纯。
（4）酶的转换数(Kcat) 转换数为每秒钟每个酶分子转换底物的微摩尔数(μmol)。它相当于产物－酶中间产物(ES)形成后，酶将底物转换为产物的速度。在数值上，Kcat＝K3，此处的K3即米氏方程导出的K3，是由ES形成产物的速度常数。
第七节 维生素与辅酶维生素及辅酶的研究是20世纪前半期生物化学最显著的成就，特别是阐明了B族维生素在酶反应中担负辅酶的作用。在此时期从分子水平探讨人体的营养需要所取得的划时代的进展，对人类的健康做出了重大贡献。
维生素包括两大类：水溶性维生素脂溶性维生素。在水溶性维生素中除维生素C外，B族维生素都作为辅酶的成分在酶反应中担负催化作用。各种维生素见表5-8。
表5-8 维生素及辅酶类型
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类 型 辅 酶 或 其 他 功 能 生 化 作 用
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硫胺素(B1) 焦磷酸硫胺素(TPP) α-酮酸氧化脱羧等
核黄素(B2) 黄素单核苷酸(FMN) 氢原子(电子)转移
黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD) 氢原子(电子)转移
泛 酸(B3 ) 辅 酶 A 酰基基团的转移
尼克酸(B5或PP) 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) 氢原子(电子)转移
(烟酸) 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP) 氢原子(电子)转移
吡哆醛(B6) 磷酸吡哆醛 氨基基团的转移
生物素(B7) 胞生物素 羟基的转移
叶 酸 (B11) 四氢叶酸 一碳基团的转移
维生素 (B12) B12 氢原子的1,2移位
硫辛酸 硫辛酰赖氨酸 氢原子和酰基基团的转移
维生素 C 羟化作用的辅助因素
维生素 A 11-视黄醛 视觉循环
维生素 D 钙和磷酸的代谢
维生素 E 抗氧化剂
维生素 K 凝血酶原的生物合成
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一、水溶性维生素
1．硫胺素
硫胺素(thiamine)或称为维生素Bl，存在于许多植物种子中，尤其是在谷物种子的外皮中，因而在未经研磨的大米和全麦粒制作的食物中此种维生素的含量较丰富。在动植物组织和酵母中它主要以辅酶即焦磷酸硫胺素(TPP)的形式存在。
人类若缺乏维生素B1则产生脚气病，脚气病在世界上以稻米为主要食物的地区比较普遍。
焦磷酸硫胺素在α-酮酸脱羧酶、丙酮酸脱羧酶、转酮酶和磷酸酮糖酶中起着辅酶的作用。磷酸酮糖酶是某些细菌中的与戊糖代谢有关的酶，反应如下：
在这些反应中，硫胺素分子中的噻唑环上的C2 位置上的氢原子容易解离出一质子以形成一个负碳离子。此负碳离子与带正碳离子的丙酮酸加成，此加成物以后经电子重排发生脱羧基反应，而后乙醛解离再生成负碳离子，这个过程如图5-18。
2．核黄素核黄素(riboflavin)又称为维生素B2，自然界中存在的维生素B2大多数为黄素单核甘酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核甘酸(FAD)。FMN和FAD在酶的活性中心中起着辅基的作用。它们的结构如下图。
核黄素可以在绿色植物、细菌和真菌中合成，但不能在动物中合成。在动物中它以黄素辅酶的形式存在。
核黄素缺乏症在人类中很难观察到，核黄素缺乏会患癞皮病。
核黄素辅酶的功能是起氧化还原作用。还原型的核黄素是无色的，当暴露在空气中时就会氧化变为黄色的氧化型核黄素。还原反应是在一个“l,4加成反应”中加上两个氢原子(两个电子和两个质子)而生成还原或消色的核黄素。此维生素的结构式及氧化还原反应如下：
3．泛酸泛酸(pantothenic acid)又称为维生素B3，其结构式如下：
它是β-丙氨酸与α,γ-二羟-β，β-二甲基丁酸结合而成的化合物。
动物和微生物都需要泛酸，但是最初发现它是因为它具有促进酶酵母生长的能力。在自然界这种维生素是作为辅酶A和酰基载体蛋白的组成成分存在的，它是乙酰化作用的辅酶，辅酶A的结构式如下：
由辅酶A和羧酸形成的硫酯具有特殊功能，使它在生化反应中起着一定的作用。
泛酸也是一种被称为酰基载体蛋白(ACP)的成分，这是一种只含几个氨基酸残基的热稳定的小分子蛋白质。ACP在脂肪酸的合成中起重要作用，在ACP中，4-磷酸泛巯基酰乙胺与蛋白质中的一个丝氨酸残基中的羟基呈共价连接。此分子内由于有泛酰巯基乙胺存在，因而能以一种类似于辅酶A的方式与其巯基形成硫酯而起着酰基载体的作用。ACP的蛋白质部分与4-磷酸泛酰巯基乙胺连接如下：
4．烟酸胺、烟酸烟酸又称为维生素B5或维生素PP，它包括烟酸和烟酰胺两种化合物。
烟酸和烟酰胺的分布很广，动植物组织中都有。缺乏这种维生素会使人患癞皮病。
烟酰胺核苷酸是一些催化氧化还原反应的脱氢酶的辅酶。
酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+) 和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）的结构式如下。
含NAD+ 和NADP+ 的脱氢酶不仅对其底物是专一的，而且对其辅酶也是专一的。例如，在磷酸戊糖途径中，催化6-磷酸葡萄糖氧化的6-磷酸葡萄糖脱氢酶要求NADP+ 作为辅酶，当6—磷酸葡萄糖氧化时，NADP+ 立即被还原。同样，乙醇脱氢酶催化乙醇氧化的同时，将NAD+ 还原，其反应如下：
CH3CH2OH + NAD+ CH3CHO + NADH + H+
根据烟酰胺核苷酸脱氢酶催化反应的研究证明：反应时从底物脱去 2mol氢原子(两个电子及两个质子)。氧化型及还原型的 NAD（NADP）的结构简式及氧化还原反应见下式：
其中的R表示辅酶分子的其他部分。当1分子氧化型烟酰胺分子接受1个质子和两个电子就转变为1分子还原型烟酰胺分子。
5．维生素B6
属于维生素B6的化合物有3种，即吡哆醛、吡哆胺和吡哆醇。
这三种维生素B6在动植物材料中广泛存在，谷粒中尤为丰富。自然界中存在的吡哆醛和吡哆胺以其磷酸衍生物状态存在以作为辅酶。
磷酸吡哆醛在氨基酸的转氨、脱羧和外消旋等重要反应中起着催比作用，其中每个反应都是由不同的专一性酶分子催化，但各反应中都以磷酸吡哆醛作为辅酶。
6．生物素生物素(biotin)又称为维生素B7或维生素H，它是一种含硫的化合物，由脲与硫戊环结合而成，并且有一个C5酸支链。
生物素在自然界广泛存在，肝和酵母中含量较丰富。这种维生素主要是通过ε- N-赖氨酸残基而与蛋白质结合的。生物胞素即ε-N-生物素酰-L-赖氨酸，是从含生物素的蛋白质中分离出来的一种水解产物。
在大肠杆菌中乙酰辅酶A（乙酰CoA）转化成丙二酰CoA的反应有三种蛋白质参加反应：①生物素羧化酶；②生物素羧基载体蛋白(BCCP)；③乙酰CoA：丙二酰CoA转羧基酶。
BCCP在这些步骤中起着关键性的作用。
7．叶酸叶酸(folic acid)又称为维生素B11是由蝶啶、对氨基苯甲酸和L-谷氨酸连接而成，其结构如下：
叶酸在自然界中广泛存在，它能治疗动物营养障碍性贫血病。
叶酸以其还原性产物起辅酶的作用。叶酸先经L-叶酸还原酶还原成二氢叶酸(DHF)，再被二氢叶酸还原酶还原成四氢(THF)，这两个反应中的还原剂都是NADPH。
8．维生素B12
维生素B 12是一种氰钴胺素(Cyanocobalamin)，其结构式如下。
辅酶B12
分离出的维生素B12除含CN－外，也可以含羟基、亚硝基、氯离子、硫酸根离子及其他阴离子,而且还有其他维生素B12 的类似物存在，如在细菌中，其5，6-二甲基苯骈咪唑残基可被其他的含氮碱基所取代。 在假维生素B12中，其含氮碱基为腺嘌呤，有时碱基可以是5-羟基苯骈咪唑。维生素B12 只在动物及微生物中发现，而不存在于植物中，它以辅酶B12状态存在。在此辅酶中，维生素B12分子中的CN－ 被5′-脱氧腺苷取代，与腺苷中的核糖的5′-碳原子连结，所以是5′-脱氧腺苷钴胺素。 此有机金属中的亚甲基基团是此辅酶中的一个活性中心。此辅酶相当不稳定，当遇光或氰化物时便裂解成相应的羟基钴胺素或氰钴胺素。因而，自然界存在的维生素B12很可能是以辅酶B12的形式存在。
9．硫辛酸硫辛酸(lipoic acid)为一种含硫的脂肪酸，呈氧化型和还原型存在，结构式如下：
硫辛酸是丙酮酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶多酶复合物中的一种辅助因素。在此复合物中，硫辛酸起着转酰基作用，同时在这个反应中硫辛酸被还原以后又重新被氧化。
10．抗坏血酸
抗坏血酸(ascorbic acid)又称为维生素C 。它是一种己糖内酯，有L及D型两种异构体，只有L型有生理作用。维生素C与辅酶的关系至今尚未被弄清。
在动植物中，除去豚鼠和灵长类动物(包括人类)外，都能以D-葡萄糖合成抗坏血酸。人类膳食中缺乏抗坏血酸时，便会得坏血病，这是一种引致水肿、皮下出血、贫血、牙齿和牙龈发生病理变化的疾病。早在古代人们就已知道这种病，当水手长期航海而少食和缺食新鲜蔬菜、水果时即会得此病。
抗坏血酸是一种很好的还原剂，其氧化形式为脱氢抗坏血酸，可被多种还原剂 [如谷胱甘肽（GSH）]所还原。所以两种类型的抗坏血酸可组成一个可逆的氧化还原系统。在胶原形成时，抗坏血酸起着外源还原剂的作用，使脯氨酸转化成羟脯氨酸。因此，抗坏血酸的生化作用与细胞的羟基化作用有关。
二、脂溶性维生素
1．维生素A
维生素A又称为视黄醇(retinol)。视黄醇及其醛衍生物―视黄醛(retinal)的结构如下, 这些化合物是由其母体物质β-胡萝卜素形成的，所以β-胡萝卜素又称为维生素A原。肠液中含有一种加氧酶，能将1分子β-胡萝卜素裂解产生2分子维生素A1醛，它又可被醇脱氢酶还原成视黄醇。
在胡萝卜素中所有的双键均为反式构型，这在生成的视黄醇和视黄醛中仍保持不变。
α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和γ-胡萝卜素及玉米黄素都是由植物合成的，动物不能合成，因而维生素A的最好来源是绿色蔬菜。由于胡萝卜素具有疏水性质，它也存在于牛奶和动物脂肪中，动物肝脏中储藏较多。淡水鱼的鱼肝油中有3-脱氢视黄醇（维生素A2）。缺乏视黄醇的典型症状是上皮细胞中发生角化作用(keratinization)，在眼睛中则会引起干眼病。人类和实验动物缺乏视黄醇的早期症状为夜盲症。维生素A过多时也会引起损害,在极端的情况下还可发现维生素A的毒害作用。
2．维生素D
维生素D是固醇类物质，其结构如右：
已知许多化合物对防止佝偻病有效，它们都是由不同类型的维生素D原经紫外线辐射而衍生的。植物不含维生素D，但植物的固醇、麦角醇经紫外线照射可以得到维生素D2(钙化醇)。 动物组织中的T-脱氢胆固醇，存在于皮肤表层中，可由于紫外线辐射而转化成维生素D3 。后者鱼肝油中也存在。
3．维生素E
维生素E是一种生育酚类化合物。生育酚有许多种，其中分布广泛、生物活性最强的是α-生育酚，即5,7,8-三甲基母育酚，结构式如下。
维生素E在自然界中分布甚广，在麦胚油、玉米油、花生油中大量存在，也存在于动物的脂肪中。
生育酚在体外最重要的效应即它是一种强抗氧化剂。有人认为生育酚的生物化学作用是能保护敏感的线粒体系统免受脂质过氧化物的不可逆抑制作用的影响。所以用缺乏生育酚的动物制备的线粒体的活性大大衰退，这是由羟高铁血红素催化的高度不饱和脂肪酸的氧化作用所引起的。
4．维生素K
维生素K是L-甲基萘醌的衍生物，最初的维生素K1是从苜蓿中分离出来的，有一个由4个类异戊二烯单位组成的叶绿基的侧链，其3个类异戊二烯被氧化。在维生素K2系统中侧链上有6～9个类异戊二烯单位。维生素K1及维生素K2的结构式如图所示。
最初维生素K1是从植物中分离出来的，所以植物性食物是维生素K1的丰富来源。K2系列的维生素可由细菌，尤其是肠内的细菌形成。因此健康动物不容易缺乏维生素K 。人类在某种情况下，即上述细菌被破坏或其生长受到抑制时可能会发生维生素K缺乏。所以服用抗菌素，尤其是长时间服用，维生素K会降低到一定水平，致使血液凝集的时间延长而发生危险。胆汁闭塞或使脂类在肠内的吸收降低时会发生维生素K缺乏症。
至今还没有发现维生素K在任何酶系统中有明显的作用。已知维生素K的主要作用是促进血液凝固，因为维生素K促进肝脏合成凝血酶原。缺乏维生素K会引起血液中凝血酶原水平降低。此外，在一些细菌中维生素K也起着电子传递的作用，其作用和动物体内的泛醌相似。
