第十一章 核酸的生物合成
核酸是贮存和传递遗传信息的生物大分子。生物体的遗传信息是以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂过程中通过DNA的复制把遗传信息由亲代传递给子代，在子代的个体发育过程中遗传信息由DNA传递到RNA，最后翻译成特异的蛋白质，表现出与亲代相似的遗传性状（遗传信息由DNA←→RNA→Pr）。在某些情况下RNA也是重要的遗传物质，如在RNA病毒中RNA具有自我复制的能力，并同时作为mRNA，指导病毒蛋白质的生物合成。在致癌RNA病毒中，RNA还以逆转录的方式将遗传信息传递给DNA分子。上述遗传信息的流向称为中心法则(central dogma)，它是由F．Crick在1958年最早提出的，其后又得到不断的补充和完善。
中心法则可简洁的用图11-1表示：
图11-1 中心法则简图
*P270图中复制就是指以原来分子为模板，合成出相同分子的过程；转录(或逆转录)就是在DNA(或RNA)分子上合成出与其核苷酸顺序相对应的RNA(或DNA)的过程；翻译就是在以rRNA和蛋白质组成的核糖核蛋白体(简称核糖体)上，以mRNA为模板，根据每三个相邻核苷酸决定一种氨基酸的三联体密码规则，由tRNA运送氨基酸，合成出具有特定氨基酸顺序的蛋白质肽链的过程。
第一节 DNA的生物合成一、半保留复制
DNA呈双股螺旋结构，这样的结构对于维持遗传物质的稳定性和复制的准确性都是极为重要的。两条链严格以A—T和G—C碱基配对所形成的氢键联结在一起，这两条链是互补的。在DNA复制时，亲代DNA的双螺旋先行解旋和分开，然后以每条链为模板，按照碱基配对原则，在这两条链上各形成一条互补链。这样，由亲代DNA的分子可以精确地复制出2个子代DNA分子。每个子代DNA分子中有一条链是从亲代DNA来的，另一条则是新形成的，这叫做半保留复制(semiconservative replication) (图11-2)。这个半保留复制首先由Meselson与Stahl (1958)用同位素15N实验证明。将大肠杆菌培养在以15NH4Cl为惟一氮源的培养基中，经多代之后，细胞内所形成的DNA都为15N所标记。收集细胞并抽提出DNA，然后进行氯化铯平衡密度梯度离心。这时DNA形成单一的浮力密度为1.724g／ml的条带，而对照是在普通14N培养基中生长的大肠杆菌，其DNA浮力密度较低，为1.710g／ml。现在将15N氮源培养的大肠杆菌转移到含14N的培养基中生长，每隔一段时间取样测定DNA的浮力密度。经一代之后，DNA只出现一条区带，浮力密度为1.7l7g／ml，位于15N—DNA和14N—DNA之间，这条区带的DNA是由14N／15N—DNA组成的。经二代之后，出现两条区带，其浮力密度分别为1.710g／ml和1.717g／ml，即一条区带为14N／14N—DNA，另一条区带为14N／15N -DNA。再继续培养，14N／14N—DNA分子逐渐增多，而14N／15N—DNA分子所占的比例逐渐减少。这些结果及其解释可用图11-3表示。这个试验结果证明DNA是以半保留方式进行复制的。以后用其他细菌、动物、植物、噬菌体、动物病毒等也证明了DNA的半保留复制。DNA的半保留复制可以使遗传信息的传递保持相对的稳定，这和它的遗传功能是相吻合的，说明半保留复制具有重要的生物学意义。但是这种稳定性是相对的。在一定条件下，DNA会发生损伤，需要修复；在复制和转录中DNA会有损耗，必须进行更新；在发育和分化过程中，DNA特定序列可能修饰、删除、扩增和重排。
二、与DNA复制有关的酶和蛋白质
DNA的合成是以四种三磷酸脱氧核糖核苷为底物（四种NTP）的聚合反应，该过程除了酶的催化之外，还需要以适量的DNA为模板，以RNA(或DNA)为引物和镁离子的参与。
n1dATP
+
n2dGTP DNA聚合酶
+ DNA + (n1+n2+n3+n4)PPi
n3dCTP 模板DNA,Mg2+
+
n4dTTP
原 料 产 物
图11-3 证明DNA半保留复制的Meselsen-Stahl实验图解
实际上，DNA合成的反应是很复杂的，催化这个反应的酶也有多种，除DNA聚合酶外，还有RNA引物合成酶(即引发酶)、DNA连接酶、拓扑异构酶、解螺旋酶及多种蛋白质因子参与。现将与DNA合成有关的几种酶和蛋白质因子扼要介绍如下；
引物合成酶(亦称引发酶，Primase)
此酶以DNA为模板合成一段RNA，这段RNA作为合成DNA的引物(Primer)。催化引物RNA合成的酶对利福平(rifampicin)不敏感，而且在一定程度上可用脱氧核糖核苷酸代替核糖核苷酸作为底物，而与经典的RNA聚合酶不同。大肠杆菌的引物酶为一条单链多肽，分子量为60 000。
DNA聚合酶(DNA polymerase)
目前已知的DNA聚合酶有多种，它们的性状和在DNA合成中的功能均不相同。在大肠杆菌中发现有3种DNA聚合酶，分别称为DNA聚合酶I、Ⅱ、Ⅲ。DNA聚合酶I最初是在1955年由Kornberg在大肠杆菌内发现的。Kornberg将其进行了高度纯化。纯化的酶是一条单链多肽，呈球状，直径约为6.5nm，是DNA直径的3倍左右。相对分子质量为109 000。每个分子含一个锌原子。这个锌原子与酶的催化作用有关。DNA聚合酶I是多功能酶：
（1）、它具有5′ →3′聚合酶功能，形成3′，5′—磷酸二脂键，DNA聚合酶都不能从无到有开始合成DNA链，只能在已有引物的3′端游离—OH上合成延伸DNA，合成延伸方向为5′→3′；
（2）、5′→3′外切酶作用。
A、它的主要功能是对DNA损伤的修复；
B、以及在DNA复制时，填补RNA引物 切除后留下的空隙；
（3）、3′→5′外切酶的活性，在正常聚合条件下此酶活性很低，一旦出现碱基错配，则聚合反应停止，此酶活性增强，它被认为具有校对的功能；
当有底物和模板存在时，DNA聚合酶I可将脱氧核糖核苷酸逐个地加到具有3′—OH末端的多核苷酸(RNA引物或DNA)链上形成3′，5′—磷酸二脂键(图11-4)。至今已发现的DNA聚合酶都不能从无到有开始合成DNA链，只能在已有引物的3′端游离—OH上合成延伸DNA，合成延伸方向为5′→3′。该酶具有3′→5′核酸外切酶的活性，能在3′—OH端将DNA链水解。在正常聚合条件下，3′→5′外切酶活性很低。一旦出现碱基错配，则聚合反应停止，由3′→5′外切酶将错配的核苷酸切除，然后继续进行正常的聚合反应。3′→5′核酸外切酶被认为具有校对的功能。5′→3′核酸外切酶的功能是由5′端水解双链DNA，切下单核苷酸或一段寡核苷酸。它可能起着切除DNA损伤部分或将5′端RNA引物切除的作用。DNA聚合酶I在细胞中担负着多种功能，如双链缺口的填补，单股链的置换合成，具有引物的环形、线形单股链的合成。
图11-4 DNA聚合酶催化的DNA链延伸反应
DNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ与聚合酶I的特性和功能有相同之处，也有区别，如表11-1所示。
DNA聚合酶Ⅱ是由一条相对分子质量为120 000的多肽链组成，它的活力很低，其生理功能尚不清楚。可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起某种作用。
DNA聚合酶Ⅲ极为复杂，目前已知它的全酶含有10种共22个亚基组分和锌原子，其组成是α2ε2θ2τ2γ2δ2δ2′χ2ψ2β4（如表11-2所示）。其中。亚基的分子量为132 000，具有5′→3′DNA聚合酶活性。α、ε和θ三种亚基组成全酶的核心酶(称为pol Щ)。ε亚基具有3′外切酶的校对功能，可以提高DNA复制的保真性。核心酶本身活力较低，只作用于带缺口的双链DNA，加上τ亚基后成为二聚体，称pol Ⅲ′，pol Ⅲ′就可以利用带有引物的长单链DNA。γ和δ亚基则与酶功能的持续性有关，它们与δ′、χ和ψ亚基组装成γ复合体，进一步与核心酶结合，成为pol Ⅲ*，即“天然的”聚合酶Ⅲ，它与β亚基结合就形成全酶。在复制起始中β亚基对引物的识别和结合有关，一旦全酶结合到DNA复制的起始部位，β亚基就被释放出来。现在一般认为，DNA聚合酶Ⅲ是原核生物DNA复制的主要聚合酶。
表11-1 大肠杆菌三种DNA聚合酶的性质比较P273
DNA聚合酶I
DNA聚合酶Ⅱ
DNA聚合酶Ⅲ(复合物)
分子结构
分子量每个细胞所含分子数
5’ →3’聚合作用
3’→5’核酸外切酶
5’→3’核酸外切酶模板和引物完整的双链DNA
具有引物的长单链DNA
具有缺口(<100个核苷酸)的双链DNA
聚合速度(37℃核苷酸／min．分子)
结构基因
单链分子
109 000
400
+
+
+
－
+
+
1 000
po1 A
单链分子
120 000
100
+
+
－
－
－
+
100-300
po1 B
核心酶3个亚基，全酶22个亚基
400 000
10～20
+
+
－
全酶+
核心酶+
15 000以上
pol C，hol E，dna N，dna X,dna
Z，dna Q，ho1 A
表11-2 DNA聚合酶Ⅲ全酶的亚基组成P274
亚基
分子量
亚基数目
其 它 名 称
α
ε
θ
τ
γ
δ
δ′
χ
ψ
β
132 000
27 000
10 000
71 000
52 000
35 000
33 000
15 000
12 000
37 000
2
2
2
2
2
2
2
2
2
4
Pol Ⅲ,核心酶 pol Ⅲ′
(αεθ) (αεθ)2τ2
pol Ⅲ*
γ复合体 全酶
3．真核细胞的DNA聚合酶
在真核细胞内已发现四种DNA聚合酶，分别用α、β、γ和δ表示。这四种聚合酶的特性见表11-3。现在一般认为DNA聚合酶α和δ的作用是复制染色体DNA，主要的根据是它们在细胞内活力水平的变化与DNA复制有明显的平行关系，在分裂细胞的S期达到高峰。聚合酶α催化随后链的合成，而聚合酶δ催化领头链的合成，它还具有3′→5′外切酶的活力。DNA聚合酶β的功能主要是修复作用。DNA聚合酶γ是从线粒体中分离得到的，推测它与线粒体DNA的复制有关。
表11-3 真核生物的DNA聚合酶
DNA聚合酶α
DNA聚合酶β
DNA聚合酶γ
DNA聚合酶δ
分子量亚基数细胞内分布酶活力占总量的百分比核酸外切酶活力
110 000～220 000
4～8个
细胞核
～80％
无
45 000
1个
细胞核
10％～15％
无
60 000
1个
线粒体
2％～15％
无
122 000
1个
细胞核
10％～25％
3′→5′
4,DNA连接酶(DNA ligase)
其作用是催化双链DNA中的切口处的相邻5′—磷酸基与3′—羟基之间形成磷酸酯键。但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来。
大肠杆菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量，产物是AMP和烟酰胺单核苷酸(图11-5)。而在高等生物中，则要求ATP提供能量，产物是AMP和焦磷酸。大肠杆菌的DNA连接酶是分子量为75 000的多肽链。在哺乳动物细胞中发现至少有两种连接酶，分别称为连接酶I和Ⅱ。连接酶I的分子量为200 000，连接酶Ⅱ的为85 000。连接酶I主要在正在繁殖的细胞中起作用。连接酶Ⅱ则在停止分裂的细胞中起作用。DNA连接酶在DNA复制、修复、重组中均起重要作用。
图11-5 DNA连接酶催化反应的机理 P275
5．拓扑异构酶(topoisomerase)
生物体内DNA分子通常处于超螺旋状态，而DNA的许多生物功能需要解开双链才能进行。拓扑异构酶就是催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，它可分为拓扑异构酶I和拓扑异构酶Ⅱ(也称为旋转酶，gyrase)。I型酶可使双链DNA分子中的一条链发生断裂和再连接，反应不需要提供能量，它们主要集中在活性转录区，同转录有关。Ⅱ型酶能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入负超螺旋时需要由ATP提供能量。一个拓扑异构酶Ⅱ的分子1min可引入100个负超螺旋。它们主要分布在染色质骨架蛋白和核基质部位，同复制有关。拓扑异构酶I可减少负超螺旋；拓扑异构酶II可引入负超螺旋，它们协同作用控制着DNA的拓扑结构。拓扑异构酶在重组、修复和DNA的其他转变方面起着重要的作用。
6,解螺旋酶(helicase)
这类酶能通过水解ATP将DNA的两条链打开。ATP水解活力要有单链DNA存在时才表现。大肠杆菌中的rep蛋白(rep基因的产物)就是这样一种酶。由分子量为65 000的一条多肽链组成。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。
7．其他蛋白因子
（1）单链结合蛋白(SSP) 它的功能是稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。
（2）引发前体(preprimosome) 它是由6种蛋白质即dnaB、dnaC、n、n′、n″和i组成。引发前体再与RNA引物合成酶(引发酶)结合，组装成引发体（primosome）。引发体结合到随后链的模板上，具有识别合成起始位点的功能，可以沿模板链5′→3′方向移动，移动到一定位置上即可以引发RNA引物的合成。
三、DNA复制的基本过程
DNA的复制按一定的程序进行，双螺旋的DNA是边解开边合成新链的。A、复制从特定位点开始，B、可以单向或双向进行，但是以双向复制为主。C、由于DNA双链的合成延伸均为5′→3′的方向，因此复制是以半不连续(semidiscontinuous)的方式进行的，即其中一条链相对地连续合成，称之为领头链(1eading strand)，另一条链的合成则是不连续的，称为随后链(1aggingstrand)。在DNA复制叉上进行的复制基本活动包括 a、双链的解开；b、RNA引物的合成；ｃ、DNA链的延长；ｄ、切除RNA引物，填补缺口，e、连接相邻的DNA片段，如图11-6所示。
双链的解开
很多实验都证明了复制是从DNA分子的特定位置开始的，这一位置叫复制原点，常用ori(或o)表示。许多生物的复制原点都是富含A、T的区段。这一区段产生的瞬时单链与单链结合蛋白结合，对复制的起始十分重要。原核生物基因组一般只有一个复制原点。所有DNA的复制原点都处于双螺旋结构内部，就是线状DNA也不是从末端开始复制的。DNA复制速率的调节主要在于起始频率，而DNA延长的速度则大体上是恒定的。在迅速生长的细菌中，当第一次复制起始后，在复制未完成之前，复制原点可以起始第二次复制，这可加快复制的速度。真核细胞可以在DNA链上的多个不同位点同时起始进行复制，所以原核细胞的复制速度尽管比真核细胞快，但由于真核细胞可以在多个位点同时进行，其总速度反而比原核细胞快。
在DNA的复制原点，双股螺旋解开，成单链状态，分别作为模板，各自合成其互补链。在起点处形成一个“眼”状结构。在“眼”的两端，则出现两个叉子状的生长点，称为复制叉(replication fork)。在复制叉上结合着各种各样与复制有关的酶和辅助因子，如DNA解旋酶、引发体和DNA聚合酶，它们在DNA链上构成与核糖体相似大小的复合体称为复制体(replisome)。彼此配合，进行高度精确的复制(图11-6)。
2．RNA引物的合成
在DNA复制的起始处双链解开，领头链先引发开始合成，与其模板形成双链结构，而另一条亲代链则被置换出来。只有在领头链将另一条亲本链的特别序列置换出来，才能产生随后链的前体片段的前引发作用。需要引发酶与引发前体结合形成引发体。引发体在复制叉上移动，识别合成的起始点，引发RNA引物的合成。移动和引发均需要由ATP提供能量。以DNA为模板，按5′→3′的方向，合成一段引物RNA链。引物长度约为几个至10个核苷酸。在引物的5′端含3个磷酸残基，3′端为游离的羟基。
3．DNA链的延长
当RNA引物合成之后，在DNA聚合酶Ⅲ的催化下，以四种脱氧核糖核苷5′-三磷酸为底物，在RNA引物的3′端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出PPi。DNA链的合成是以两条亲代DNA链为模板，按碱基配对原则进行复制的，亲代DNA的双股链呈反向平行，一条链是5′→3′方向，另一条链是3′→5′方向。在一个复制叉内两条链的复制方向不同(图11-7)，所以新合成的二条子链极性也正好相反。由于迄今为止还没有发现一种DNA聚合酶能按3′→5′方向延伸，因此子链中有一条链沿着亲代DNA单链的3′→5′方向(亦即新合成的DNA沿5′→3′方向)不断延长。这条新链称为领头链。而另一条链的合成方向与复制叉的前进方向相反，只能断续地合成5′→3′的多个短片段。1968年冈崎发现了这些片段故又称为冈崎片段(Okazaki fragment)。它们随后连接成大片段，这条新链称为随后链。这种领头链是连续合成的，随后链断续合成的方式称为半不连续复制(semidiscontinuous replication)。原核细胞的冈崎片段长度为1 000～2 000个核苷酸。真核细胞的较短，长度为100～200个核苷酸。
图11-7 DNA的双向复制
尽管领头链的合成总是领先一段，但是从来没有发现领头链跑得太远，而总是与随后链保持相对稳定的一段距离。1988年Kornberg等人从大肠杆菌中分离出800 000的pol Ⅲ*和900 000的pol Ⅲ全酶，其中各个亚基均有两个，并证明是具有双活性部位的非对称结构，这表明同一个pol Ⅲ全酶可能同时负责领头链和随后链的复制。根据实验资料提出如下复制模型(图11-8)，随后链的模板在DNA聚合酶Ⅲ全酶上绕转180o形成一个小环，使冈崎片段的合成方向能够与领头链的合成方向以及复制体的移动方向保持一致。随着冈崎片段的延长，这个大环从DNA聚合酶Ⅲ上释放。在此之前，领头链的合成已将另一部分随后链的模板置换出来，并在适于引发的位点上由引发体合成新的引物，然后再形成一个小环而进行新的冈崎片段的合成。
图11-8 领头链-随后链同时复制模型
4．切除引物，填补缺口，连接修复当新形成的冈崎片段延长至一定长度，其3′—OH端与前面一条老片段的5′端接近时，即发生下列变化：在DNA聚合酶I的作用下，在引物RNA与DNA片段的连接处切断；切去RNA引物后留下的空隙，由DNA聚合酶I催化合成一段DNA填补上；在DNA连接酶的作用下，连接相邻的DNA链；修复掺入DNA链的错配碱基。这样以两条亲代DNA链为模板，各自形成一条新的DNA互补链，结果是形成了两个DNA双股螺旋分子。每个DNA双股螺旋分子中一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，故称为半保留复制。
四、逆向转录（逆转录）
以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA，这与通常转录过程中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反，故称为逆转录(reverse transcription)。在20世纪60年代Temin根据有关的实验结果提出，由RNA肿瘤病毒逆向转录为DNA前病毒，然后由DNA前病毒再转录为RNA肿瘤病毒的设想，但当时未得到重视。直至1970年，Temin和Baltimore各自在鸟类劳氏肉瘤病毒和小鼠白血病病毒等RNA肿瘤病毒中找到了逆转录酶，才证明了存在逆向转录过程。现在人们已发现各种高等真核生物的RNA肿瘤病毒都有逆转录酶。鸟类的劳氏肉瘤病毒的逆转录酶具有三种分子形式，分别为α、αβ和β2，其中αβ是主要形式。α亚基分子量为63 000，β亚基分子量为94 000。α亚基是β亚基的水解产物。只有α亚基具有酶活性。哺乳动物的RNA肿瘤病毒的逆转录酶一般为单亚基结构。如小鼠白血病病毒中的逆转录酶是分子量为70 000的单条多肽链。逆转录酶需要以Ａ、RNA(或DNA)为模板，Ｂ、以四种dNTP为原料，Ｃ、要求短链RNA(或DNA)作为引物，Ｄ、此外还需要适当浓度的二价阳离子Mg2+和Mn2+，沿5′→3′方向合成DNA，形成RNA-DNA杂交分子(或DNA双链分子)。Ｅ、以后，再以RNA-DNA杂交分子中的DNA链为模板，在寄主细胞的DNA聚合酶作用下，可合成另一条DNA互补链，这样便形成了新的双链DNA分子。
逆转录酶是一种多功能酶，它除了具有以RNA为模板的DNA聚合酶和以DNA为模板的DNA聚合酶活性外还兼有RNaseH、DNA内切酶、DNA拓扑异构酶、DNA解链酶和tRNA结合的活性。逆转录酶的发现，表明遗传信息也可以从RNA传递到DNA，从而丰富了分子遗传学中心法则的内容。
几乎所有的真核生物的mRNA分子的3′末端都有一段多聚腺苷酸。当加入寡聚dT作引物时，mRNA就可以成为逆转录酶的模板，在体外合成与其互补的DNA，称为cDNA。这种方法已成为生物技术和分子生物学研究中最常见的方法之一，也使逆转录酶得到广泛的应用。
五、基因突变和DNA的损伤与修复
基因突变
是指DNA的碱基顺序发生突然而永久性地变化，从而影响DNA的复制，并使DNA的转录和翻译也跟着改变，因而表现出异常的遗传特征。DNA的突变可以有几种形式：(1)一个或几个碱基对被置换(replacement)；(2)插入(insertion)一个或几个碱基对；(3)一个或多个碱基对缺失(deletion)。置换和插入的变化是可逆的，缺失则是不可逆的。最常见的突变形式是碱基对的置换。嘌呤碱之间或嘧啶碱之间的置换称为转换(transition)，嘌呤和嘧啶之间的置换称为颠换(transversion)。突变有自发突变和诱发突变。自发突变的机率很低。据估计在DNA的合成中，大约每109个碱基对发生一次突变。然而，逆转录酶合成的DNA保真度差，错配碱基的出现率要比真核生物或大肠杆菌的高1～3个数量级，所以各种RNA肿瘤病毒具有很高的自发突变频率。诱发突变可以由物理因素或化学因素引起，物理因素如电离辐射和紫外光等均可以诱发突变。在农业技术上常利用辐射诱变进行育种。化学因素如脱氨剂和烷化试剂也均可诱发突变。亚硝酸为强脱氨剂，可使腺嘌吟转变为次黄嘌呤，鸟嘌呤转变为黄嘌呤，胞嘧啶转变为尿嘧啶，而导致碱基配对错误。烷化剂如硫酸二甲酯(DMS)可使鸟嘌呤的N7位氮原子甲基化，使之成为带一个正电荷的季铵基团，减弱N9位上的N-糖苷键，致使脱氧核糖苷键不稳定，发生水解而丢失嘌呤碱，以后可被其他碱基取代或引起DNA链断裂。
DNA的损伤修复
某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都能引起生物突变和致死。因为它们均能作用于DNA，造成其结构和功能的破坏。例如X射线可以在DNA链上形成缺口(nick)；高剂量的紫外辐射则使DNA链上嘧啶碱基，特别是胸腺嘧啶的环已烯键活化，使同股相邻或不同股的胸腺嘧啶环已烯键之间形成新的共价键，连结成一个环丁烷，产生二聚体，在双螺旋区产生变形。构象的改变必将阻碍DNA的复制和转录，引起错股合成，最终细胞死亡。
目前已知有四种修复途径：光复活、切除修复、复组修复和诱导修复。
(1)光复活 这是一种高度专一的修复形式，其机制是：利用光能(最有效波长为400nm左右)激活光复活酶(高等哺乳动物缺乏该系统)，切除嘧啶二聚体之间的C－C键，而恢复原来的状态。光修复机制只作用于紫外线照射所形成的产物。
(2)切除修复 如果DNA损伤较为严重，则必须进行切除修复，即在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除掉，并以完整的一股链为模板，合成出切去的部分，使DNA恢复正常。这是一种较普遍的修复机制(图11-9)。参与的酶主要有对DNA损伤专一的DNA内切酶、DNA聚合酶I(或DNA聚合酶Ⅱ)和DNA连接酶。此外还可以由糖苷化酶切除受损伤的碱基造成无碱基的AP位点(apurinic或apyrimidinic)，此位点可被AP核酸内切酶识别，将损伤的DNA链切开。
(3)重组修复 重组修复的关键酶是重组修复酶，如大肠杆菌中的ReeA蛋白。含有损伤的DNA仍可进行复制，但在子代DNA链与损伤链相对应部位出现缺口。通过分子间重组，从完整的亲代或子代链上将相应的碱基顺序片段移至缺口处，然后用再合成的多核苷酸链补上提供缺口片断所造成的空缺(图11-10)。
图11-9 DNA损伤的切除修复过程 图11-10 DNA损伤的重组修复过程
(4)诱导修复 许多能造成DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应(SOS反应)。它包括DNA修复和导致变异两个方面。应急反应能Ａ、诱导切除修复和重组修复中某些关键酶和蛋白质的产生，加强修复能力。Ｂ、此外应急反应还能诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，它能在DNA损伤部位进行复制而避免了死亡，却带来了高的变异率。
以上几种修复系统只有光复活是利用光能，其余均利用ATP水解所释放的能量。光复活、切除修复和糖苷化酶修复都是修复模板链，重组修复是形成一条新的正常模板链，而SOS修复是唯一导致突变的修复。
第二节 在DNA指导下RNA的合成在DNA指导下的RNA合成称为转录。在转录过程中，以DNA的一条链为模板，按照碱基配对原则，合成一条与DNA链的一定区段互补的RNA链。细胞的各类RNA（包括mRNA、rRNA和tRNA）都是通过转录合成的，最初转录的RNA产物通常需要经过一系列断裂、拼接、修饰等加工过程才能成为成熟的RNA分子。
一、RNA的合成反应
在DNA指导下RNA的合成反应可用下式表示：
n1ATP
＋
n2GTP
＋ DNA指导的RNA聚合酶 RNA＋（n1＋n2＋n3＋n4）PPi
n3CTP DNA、Mg2+或Mn2+
＋
n4UTP
上式表明，DNA指导下的RNA合成反应是一酶促反应，以四种核糖核苷三磷酸（ATP、GTP、CTP、UTP）作为底物，需要适当的DNA为模板，不需要引物，在DNA指导的RNA聚合酶的催化下进行。反应产物RNA的组成决定于加入的作为模板的DNA的性质。例如，曾用各种不同碱基组的DNA作为模板，其所产生的RNA的碱基比例与加入的DNA之碱基比例基本上相一致，只是以尿嘧啶代替了DNA中的胸腺嘧啶（表l1-4）。
表11-4 不同DNA模板对产物RNA组成的影响
DNA来源
DNA模板
RNA产物
腺嘌呤
胸腺嘧啶
鸟嘌呤
胞嘧啶
腺嘌呤
尿嘧啶
鸟嘌呤
胞嘧啶
多聚dT
0
1
0
0
0.98
0.02
0
0
多聚（dA-T）
0.5
0.48
0.01
0.01
0.52
0.48
0
0
大肠杆菌
0.25
0.24
0.25
0.26
0.23
0.26
0.21
0.27
小牛胸腺
0.29
0.26
0.23
0.21
0.28
0.26
0.24
0.22
噬菌体T2
0.33
0.33
0.17
0.18
0.33
0.30
0.18
0.18
噬菌体φ×174（单链）
0.25
0.33
0.23
0.19
0.32
0.25
0.20
0.23
噬菌体φ×174（双链）
0.29
0.29
0.21
0.21
0.29
0.28
0.22
0.22
在体外，RNA聚合酶能使DNA的两条链同时进行转录，而在体内DNA的两条链中仅有一条链可用于转录，或者某些区域以这条链转录，另一些区域以另一条链转录，对应的链只能进行复制，而无转录功能，这称为不对称转录。用作模板的链称为反义链（antisense strand），另一条链称为有义链（sense strand）。DNA在体外转录时失去链的选择作用，而使两条链同样进行转录，这种不正常情况可能是由于RNA聚合酶在分离时丢失亚基引起的。在RNA聚合酶反应中，天然的（双链）DNA作为模板比变性的（单链）DNA更为有效。这表明RNA聚合酶的作用方式与DNA聚合酶有某些不同。DNA在复制时，首先需要将两条链解开，通过半保留的方式形成两个子代DNA分子；而RNA聚合酶以完整双链DNA为模板，DNA碱基顺序的转录是通过全保留的方式（conservative mode），转录后DNA仍然保持双链的结构。当然，这并不排除在转录时DNA的双链结构部分地被解开。事实上，有许多实验说明，DNA进行转录的部分结构是不稳定的，很可能发生局部的解开。两条链中的一条可作为有效的模板，在其上合成出互补的RNA链。当被解开的两条DNA链重新形成双螺旋结构时，已合成的RNA链即离开DNA链（图11-11）。
二、RNA聚合酶已从大肠杆菌和其他细菌中高度提纯了DNA指导的RNA聚合酶。大肠杆菌的RNA聚合酶全酶（holoenzyme）相对分子质量约50万，由五个亚基（α2ββ′σ）组成。没有σ亚基的酶（α2ββ′）叫核心酶（core enzyme）。核心酶只能使已开始合成的RNA链延长，但不具有起始合成RNA的能力，必须加入σ亚基才表现出全部聚合酶的活性。这就是说，在开始合成RNA链时必须有σ亚基参与作用，因此σ亚基为起始因子。各亚基的大小和功能列于表11-5。
表11-5 大肠杆菌RNA聚合酶各亚基的大小和功能亚 基
分 子 量
比 例
功 能
β′
165 000
1
和模板DNA结合
β
155 000
1
起始和催化作用
σ
95 000
1
起始作用
α
39 000
2
未知
在不同的细菌中，α、β和β′亚基的大小比较恒定，σ亚基有较大变动，其相对分子质量44 000～92 000。σ亚基的功能在于使RNA聚合酶稳定地结合到DNA的启动子上。单独的核心酶也能与DNA结合，这主要是由碱性蛋白质与酸性核酸之间的静电引力造成的，因此与其特殊序列无关，DNA仍然保持双螺旋形式。σ亚基能够改变RNA聚合酶与DNA之间的亲和力，它极大减少了酶与DNA一般序列的结合常数和停留时间，同时又大大增加了酶与DNA启动子的结合常数和停留时间。这样就使得全酶能迅速找到启动子并与之结合。
表11-6 真核细胞RNA聚合酶的种类和性质酶 的 种 类
不 同 名 称
分 布
合成的RNA类型
A
（对α-鹅膏蕈碱不敏感）
AⅠ（a+b）、Ⅰ、ⅠA、RC-Ⅱ
AⅡ、Ⅰ、ⅠB
核仁
rRNA
B
（对低浓度α-鹅膏蕈碱敏感）
BⅠ、Ⅱ、ⅡA、RC-Ⅰ、
BⅡ、Ⅱ、ⅡB
核质
核内不均一的RNA
（mRNA的前体）
C
（对高浓度α-鹅膏蕈碱敏感）
AⅢ、Ⅲ、RC-Ⅲ
核质
rRNA和5SRNA
真核细胞的RNA聚合酶有许多种，相对分子质量都在50万左右，通常由4～6种亚基组成。利用α-鹅膏蕈碱的抑制作用可将它们分为三类：RNA聚合酶A（或Ｉ）,RNA聚合酶B（或II）和RNA聚合酶C（或III）。它们可以分别对不同种类的RNA进行转录（表11-6）。
三、RNA的转录过程由RNA聚合酶催化的转录过程可分为三个反应步骤：①转录的起始；②链的延长；③链的终止。
（１）转录的起始 RNA聚合酶与DNA双链的特定部位相结合，并局部解开双螺旋，以使模板链可与核糖核苷酸进行碱基配对。解链仅发生在与RNA聚合酶结合的部位。起始阶段通常包括对双链DNA特定部位的识别、局部解开双链和在最初两个核苷酸之间形成磷酸二酯键。在此过程中所要求的全部DNA序列称为启动子。启动子部位必定具有某种特殊结构。这种特殊结构可能表现为DNA片段的特定核苷酸排列顺序，也可能表现为DNA片段局部的特异高级结构。一般地说，启动子部位常是AT含量高的区域，因为该区域的熔点（Tm）较低，双链容易打开。第一个核苷酸掺入的位置称为转录起点，在新合成的RNA链的5′末端通常为带有三个磷酸基团的鸟苷或腺苷（pppG或pppA）。这就是说，合成的第一个底物通常是GTP或ATP。
图11-12 在大肠杆菌中由RNA聚合酶合成RNA的过程
（２）链的延长 σ亚基仅与转录的起始有关，一旦RNA开始合成，它就被释放而离开核心酶。σ亚基的存在与否对核心酶的亚基构象有较大影响。当σ亚基存在时，核心酶的β′亚基和其他亚基表现为有利于专一结合在DNA特定序列上的构象；而σ亚基释放后，核心酶失去识别和专一结合在特定序列上的能力，因而可在模板上移动并按模板序列选择核糖核苷酸。在模板链上合成的RNA链可暂时形成RNA－DNA杂交双链。在延长阶段，随着RNA聚合酶向前移动，DNA解链区也随之推进，RNA链得以不断延长。但随后DNA的互补链即取代RNA－DNA杂交双链中的RNA链，从而恢复原来的DNA双螺旋结构。RNA聚合酶沿着模板链3′→5′方向移动，RNA链的合成方向是5′→3′。当以大肠杆菌RNA聚合酶合成RNA时，合成速度为每秒钟40～100个核苷酸。
（３）链的终止 DNA分子具有终止转录的核苷酸序列信号。在这些信号中，有些能被RNA聚合酶本身所识别，转录进行到该处即告终止，RNA链和RNA聚合酶便会从DNA模板上脱离下来。另一些信号则被ρ因子所识别。ρ因子是一种参与转录终止过程的蛋白质因子，它能辨别DNA上特殊的终止位点（ρ位点），使RNA链从DNA上脱离，停止转录。
在大肠杆菌中，由RNA聚合酶催化合成RNA的整个过程如图11-12所示。
四、转录后加工
在细胞内，由RNA聚合酶合成的原初转录物往往需要经过一系列的变化，包括键的裂解、5′端与3′端的切除和特殊结构的形成、碱基的修饰和糖苷键的改变以及拼接等过程，才能转变为成熟的RNA分子。此过程总称为RNA的成熟或转录后加工。
原核生物的mRNA一经转录通常立即进行翻译，除少数外，一般不进行转录后加工。但稳定的RNA（tRNA、rRNA）都要经过一系列加工才能成为有活性的分子。真核生物由于存在细胞核结构，转录和翻译在时间上和空间上都被分隔开来，其mRNA前体的加工极后需通过拼接使编码区成为连续序列。在真核生物中，还能通过不同的加工方式，表达出不同的信息。因此，对于真核生物来讲，RNA的加工尤为重要。
1．mRNA前体的加工
mRNA的原初转录物是相对分子质量极大的前体，即核内含不均一RNA（缩写为hnRNA）。hnRNA的碱基组成与总的DNA组成类似，因此又称为类似DNA的RNA（D-RNA）。它们在核内迅速合成和降解，半寿期很短，只有几分钟，比细胞质mRNA更不稳定。hnRNA分子中含有大量的插入部分即内含子，将在转录后的加工过程中被降解掉。据估算，hnRNA分子中大约只有25％的部分经加工转变成mRNA。当然，插入部分绝不会是无意义的，推测它们可能与转录和转录后代谢的调控作用有关。由hnRNA转变成mRNA的加工过程如下：①5′端形成特殊的帽子结构（m7GpppmNp）；②在链的3′端切断并加上多聚腺苷酸（PolyA）尾巴；③通过拼接除去由内含子转录来的序列；④链内部核苷被甲基化。
2．rRNA前体的加工
在原核细胞内含有三种rRNA，即5S、16S、23SrRNA。在各类细菌细胞中，编码核糖体RNA的基因排列在一起，它们包含有16S、23S、5SrRNA以及一个或几个tRNA基因，成为一个转录单位，其沉降系数为30S。在核糖核酸酶III和核糖核酸酶E的作用下，形成这三种成熟rRNA的前体，分别以P16S、P23S和P5S表示，它们经断裂和甲基化后即转变为成熟的rRNA（图11-13）。
真核生物细胞的核仁是rRNA合成、加工和装配成核糖体的场所。哺乳类动物细胞的核糖体含有四种不同的RNA，即28S、18S、5.8S和5SrRNA（它们的相对分子质量分别为l.7×106，0.65×106，5×104和4×104）。28S、18S和5.8SrRNA在转录过程中先形成共同的45S大分子前体（相对分子质最为4×106），然后再断裂成相应的rRNA，它们的关系如下,
28 S
(1.7×106)
32 S
(2.1×106) 5.8 S
45 S 41S (5×104)
(4.1×106) (3.1×106) 20 S
(0.9×105) 18 S
(0.65×106)
在真核生物中,5SrRNA基因也是成簇排列的，中间隔以不被转录的区域。它由RNA聚合酶III转录，经过适当加工即与28SrRNA和5.8SrRNA以及有关蛋白质一起组成核糖体的大亚基。18SrRNA与有关蛋白质则组成小亚基。
3．tRNA前体的加工
大肠杆菌染色体基因组共有tRNA基因约60个。tRNA基因大多成簇存在，或与tRNA基因或与编码蛋白质的基因组成混合转录单位。tRNA前体的加工包括：①由核酸内切酶在tRNA两端切断；②由核酸外切酶从3′端逐个切去附加的顺序，进行修剪；③在tRNA的3′端加上胞苷酸—胞苷酸—腺苷酸（—CCAOH）；④核苷的修饰。
真核生物tRNA基因的数目比原核生物tRNA基因的数目要大得多，啤酒酵母有250个tRNA基因，而人体细胞则有1300个。真核生物tRNA基因也成簇排列，并且被间隔区所分开。tRNA基因由RNA聚合酶III转录，转录产物为稍大的tRNA前体。在tRNA前体分子的5′端和3′端都有附加的序列，需由核酸内切酶和外切酶加以切除。真核生物tRNA前体的3′端不含CCA序列，成熟tRNA3′端的CCA是后加上去的，tRNA的修饰成分由特异的修饰酶催化。真核生物的tRNA除含有修饰碱基外，还有2′-O-甲基核糖，具有居间序列的tRNA前体还需将这部分序列切掉。
第三节 RNA的复制
核糖核酸（RNA）在传递DNA的遗传信息和控制蛋白质生物合成中的重要作用已如上述。在有些生物中，核糖核酸还可以是遗传信息的基本携带者，并能通过复制而合成出与其自身相同的分子。例如，某些RNA病毒，当它侵入寄主细胞后即可借助于复制酶（replicase）（RNA指导的RNA聚合酶）而进行病毒RNA的复制。
从感染RNA病毒的细胞中可以分离RNA复制酶，这种酶以病毒RNA作模板，在有四种核苷三磷酸和镁离子存在时合成出与模板性质相同的RNA。用复制产物去感染细胞，能产生正常的RNA病毒。可见，病毒的全部遗传信息包括合成病毒外壳蛋白质（coat protein）和各种有关酶的信息均贮存在被复制的RNA之中。
一、噬菌体QβRNA的复制复制酶的模板特异性很高，它只识别病毒自身的RNA，而对宿主细胞和其他与病毒无关的RNA均无反应。例如，噬菌体Qβ的复制酶只能以噬菌体QβRNA作模板，而不能以与其相类似的噬菌体MS2、R17和f2RNA或其他RNA作模扳。
大量关于RNA复制机理的研究工作是以感染各种RNA噬菌体（如噬菌体Qβ）的大肠杆菌为材料进行的。噬菌体Qβ是一种直径为20nm的正二十面体小噬菌体，含30％的RNA，其余为蛋白质。RNA是相对分子质量1.5×106左右的单链分子，约由4 500个核苷酸组成，含有编码3～4个蛋白质分子的基因。其有关蛋白质称之为A1，它是完整病毒的次要组分。氨基酸顺序分析表明，A1蛋白N端氨基酸顺序与外壳蛋白一致。推测编码A1蛋白的RNA顺序具有两个终止位点，在第一个位点终止时仅产生外壳蛋白，但如通读过去直到第二个终止位点，就可以产生A1蛋白。Qβ的基因顺序是：
5′末端——成熟蛋白——外壳蛋白（或A1蛋白）——复制酶β亚基——3′末端
Qβ复制酶有4个亚基，噬菌体RNA只编码其中的β亚基，另外三个亚基（α、γ和δ）则来自宿主细胞。现已证明，α是核糖体的蛋白质S1,γ和δ是宿主细胞蛋白质合成系统中的肽链延长因子EF-Tu和EF-Ts 。它们的性质和功能见表11-7。
表11-7 Qβ复制酶亚基的性质和功能亚 基 名 称
相对分子质量
来 源
功 能
Ⅰ（α）
Ⅱ（β）
Ⅲ（γ）
Ⅳ（δ）
65 000
65 000
45 000
35000
宿主细胞核糖体的蛋白质S1
噬菌体感染后合成宿主细胞的EF-Tu因子宿主细胞的EF-Ts因子
与噬菌体QβRNA结合聚合反应中磷酸二酯键形成的活性中心与底物结合，识别模板并选择底物稳定α、γ亚基结构
当噬菌体Qβ的RNA侵入大肠杆菌细胞后，其RNA本身即为mRNA，可以直接进行与病毒繁殖有关的蛋白质的合成。通常将具有mRNA功能的链称为正链，而它的互补链为负链，故噬菌体QβRNA为正链。在噬菌体特异的复制酶装配好后不久，酶就吸附到正链RNA的3′末端，以它为模板合成出负链RNA。合成进程结束，负链从模板上释放,同样的酶又吸附到负链RNA的3′末端，并以负链为模板合成正链（图11-14），所以两条链都是由5′→3′方向延长。在最适宜的条件下，正链和负链的合成速度均为每秒35个核苷酸。
当以正链为模板合成负链时，除需要复制酶外，还需要两个来自宿主细胞的蛋白质因子，称为HFⅠ和HFⅡ。但是以负链为模板合成正链时并不需要这两个因子。在感染后期，噬菌体RNA大量合成，这时正链RNA合成远超过负链RNA的合成，其原因就是宿主的蛋白质因子起了调节作用。进化的压力使病毒具有极高的复制效率、精确的识别和控制机理，并且尽量依赖寄主的条件。病毒的一个显著特点是，它的各组成成分常具有多种复杂的功能。例如，Qβ复制酶不仅能将噬菌体正链和负链RNA与大量存在于宿主细胞的所有RNA区别开来，特异地催化噬菌体RNA的复制，而且还能强力地抑制核糖体结合到QβRNA上，起蛋白质合成阻遏物的作用，这在病毒复制的早期起重要作用。再如，外壳蛋白是病毒颗粒结构的组分，同时又是复制酶合成的调节蛋白，因此感染后期当外壳蛋白的需要量达到高潮时，复制酶的合成便大大降低。
二、病毒RNA复制的主要方式
RNA病毒的种类很多，其复制方式也是多种多样的，归纳起来可以分成以下几类：
（１）病毒含有正链RNA 进入宿主细胞后首先合成复制酶（以及有关蛋白质），然后在复制酶作用下进行病毒RNA的复制，最后由病毒RNA和蛋白质装配成病毒颗粒。噬菌体Qβ和灰质炎病毒（poliovirus）即是这种类型的代表。灰质炎病毒是一种小RNA病毒（picornavirus）。它感染细胞后，病毒RNA即与宿主核糖体结合，产生一条长的多肽链，在宿主蛋白酶的作用下水解成6个蛋白质，其中包括1个复制酶、4个外壳蛋白和1个功能还不清楚的蛋白质。在形成复制酶后病毒RNA才开始复制。
（２）病毒含有负链RNA和复制酶 如狂犬病病毒（rabies virus）和马水疱性口炎病毒（vesicular-stomatitis virus）。这类病毒侵入细胞后，借助于病毒带进去的复制酶合成出正链RNA，再以正链RNA为模板，合成病毒蛋白和复制病毒RNA。
（３）病毒含有双链的RNA和复制酶 如呼肠孤病毒（reovirus）。这类病毒以双链RNA为模板，在病毒复制酶的作用下通过不对称的转录，合成出正链RNA，并以正链RNA为模板翻译成病毒蛋白质，然后再合成病毒负链RNA，形成双链RNA分子。
（４）致癌RNA病毒 主要包括白血病病毒（leukemia virus）和肉瘤病毒（sarcoma virus）。它们的复制需经过DNA前病毒阶段，由逆转录酶所催化。这类病毒的复制过程前面已有详细介绍。
核酸是贮存和传递遗传信息的生物大分子。生物体的遗传信息是以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂过程中通过DNA的复制把遗传信息由亲代传递给子代，在子代的个体发育过程中遗传信息由DNA传递到RNA，最后翻译成特异的蛋白质，表现出与亲代相似的遗传性状（遗传信息由DNA←→RNA→Pr）。在某些情况下RNA也是重要的遗传物质，如在RNA病毒中RNA具有自我复制的能力，并同时作为mRNA，指导病毒蛋白质的生物合成。在致癌RNA病毒中，RNA还以逆转录的方式将遗传信息传递给DNA分子。上述遗传信息的流向称为中心法则(central dogma)，它是由F．Crick在1958年最早提出的，其后又得到不断的补充和完善。
中心法则可简洁的用图11-1表示：
图11-1 中心法则简图
*P270图中复制就是指以原来分子为模板，合成出相同分子的过程；转录(或逆转录)就是在DNA(或RNA)分子上合成出与其核苷酸顺序相对应的RNA(或DNA)的过程；翻译就是在以rRNA和蛋白质组成的核糖核蛋白体(简称核糖体)上，以mRNA为模板，根据每三个相邻核苷酸决定一种氨基酸的三联体密码规则，由tRNA运送氨基酸，合成出具有特定氨基酸顺序的蛋白质肽链的过程。
第一节 DNA的生物合成一、半保留复制
DNA呈双股螺旋结构，这样的结构对于维持遗传物质的稳定性和复制的准确性都是极为重要的。两条链严格以A—T和G—C碱基配对所形成的氢键联结在一起，这两条链是互补的。在DNA复制时，亲代DNA的双螺旋先行解旋和分开，然后以每条链为模板，按照碱基配对原则，在这两条链上各形成一条互补链。这样，由亲代DNA的分子可以精确地复制出2个子代DNA分子。每个子代DNA分子中有一条链是从亲代DNA来的，另一条则是新形成的，这叫做半保留复制(semiconservative replication) (图11-2)。这个半保留复制首先由Meselson与Stahl (1958)用同位素15N实验证明。将大肠杆菌培养在以15NH4Cl为惟一氮源的培养基中，经多代之后，细胞内所形成的DNA都为15N所标记。收集细胞并抽提出DNA，然后进行氯化铯平衡密度梯度离心。这时DNA形成单一的浮力密度为1.724g／ml的条带，而对照是在普通14N培养基中生长的大肠杆菌，其DNA浮力密度较低，为1.710g／ml。现在将15N氮源培养的大肠杆菌转移到含14N的培养基中生长，每隔一段时间取样测定DNA的浮力密度。经一代之后，DNA只出现一条区带，浮力密度为1.7l7g／ml，位于15N—DNA和14N—DNA之间，这条区带的DNA是由14N／15N—DNA组成的。经二代之后，出现两条区带，其浮力密度分别为1.710g／ml和1.717g／ml，即一条区带为14N／14N—DNA，另一条区带为14N／15N -DNA。再继续培养，14N／14N—DNA分子逐渐增多，而14N／15N—DNA分子所占的比例逐渐减少。这些结果及其解释可用图11-3表示。这个试验结果证明DNA是以半保留方式进行复制的。以后用其他细菌、动物、植物、噬菌体、动物病毒等也证明了DNA的半保留复制。DNA的半保留复制可以使遗传信息的传递保持相对的稳定，这和它的遗传功能是相吻合的，说明半保留复制具有重要的生物学意义。但是这种稳定性是相对的。在一定条件下，DNA会发生损伤，需要修复；在复制和转录中DNA会有损耗，必须进行更新；在发育和分化过程中，DNA特定序列可能修饰、删除、扩增和重排。
二、与DNA复制有关的酶和蛋白质
DNA的合成是以四种三磷酸脱氧核糖核苷为底物（四种NTP）的聚合反应，该过程除了酶的催化之外，还需要以适量的DNA为模板，以RNA(或DNA)为引物和镁离子的参与。
n1dATP
+
n2dGTP DNA聚合酶
+ DNA + (n1+n2+n3+n4)PPi
n3dCTP 模板DNA,Mg2+
+
n4dTTP
原 料 产 物
图11-3 证明DNA半保留复制的Meselsen-Stahl实验图解
实际上，DNA合成的反应是很复杂的，催化这个反应的酶也有多种，除DNA聚合酶外，还有RNA引物合成酶(即引发酶)、DNA连接酶、拓扑异构酶、解螺旋酶及多种蛋白质因子参与。现将与DNA合成有关的几种酶和蛋白质因子扼要介绍如下；
引物合成酶(亦称引发酶，Primase)
此酶以DNA为模板合成一段RNA，这段RNA作为合成DNA的引物(Primer)。催化引物RNA合成的酶对利福平(rifampicin)不敏感，而且在一定程度上可用脱氧核糖核苷酸代替核糖核苷酸作为底物，而与经典的RNA聚合酶不同。大肠杆菌的引物酶为一条单链多肽，分子量为60 000。
DNA聚合酶(DNA polymerase)
目前已知的DNA聚合酶有多种，它们的性状和在DNA合成中的功能均不相同。在大肠杆菌中发现有3种DNA聚合酶，分别称为DNA聚合酶I、Ⅱ、Ⅲ。DNA聚合酶I最初是在1955年由Kornberg在大肠杆菌内发现的。Kornberg将其进行了高度纯化。纯化的酶是一条单链多肽，呈球状，直径约为6.5nm，是DNA直径的3倍左右。相对分子质量为109 000。每个分子含一个锌原子。这个锌原子与酶的催化作用有关。DNA聚合酶I是多功能酶：
（1）、它具有5′ →3′聚合酶功能，形成3′，5′—磷酸二脂键，DNA聚合酶都不能从无到有开始合成DNA链，只能在已有引物的3′端游离—OH上合成延伸DNA，合成延伸方向为5′→3′；
（2）、5′→3′外切酶作用。
A、它的主要功能是对DNA损伤的修复；
B、以及在DNA复制时，填补RNA引物 切除后留下的空隙；
（3）、3′→5′外切酶的活性，在正常聚合条件下此酶活性很低，一旦出现碱基错配，则聚合反应停止，此酶活性增强，它被认为具有校对的功能；
当有底物和模板存在时，DNA聚合酶I可将脱氧核糖核苷酸逐个地加到具有3′—OH末端的多核苷酸(RNA引物或DNA)链上形成3′，5′—磷酸二脂键(图11-4)。至今已发现的DNA聚合酶都不能从无到有开始合成DNA链，只能在已有引物的3′端游离—OH上合成延伸DNA，合成延伸方向为5′→3′。该酶具有3′→5′核酸外切酶的活性，能在3′—OH端将DNA链水解。在正常聚合条件下，3′→5′外切酶活性很低。一旦出现碱基错配，则聚合反应停止，由3′→5′外切酶将错配的核苷酸切除，然后继续进行正常的聚合反应。3′→5′核酸外切酶被认为具有校对的功能。5′→3′核酸外切酶的功能是由5′端水解双链DNA，切下单核苷酸或一段寡核苷酸。它可能起着切除DNA损伤部分或将5′端RNA引物切除的作用。DNA聚合酶I在细胞中担负着多种功能，如双链缺口的填补，单股链的置换合成，具有引物的环形、线形单股链的合成。
图11-4 DNA聚合酶催化的DNA链延伸反应
DNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ与聚合酶I的特性和功能有相同之处，也有区别，如表11-1所示。
DNA聚合酶Ⅱ是由一条相对分子质量为120 000的多肽链组成，它的活力很低，其生理功能尚不清楚。可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起某种作用。
DNA聚合酶Ⅲ极为复杂，目前已知它的全酶含有10种共22个亚基组分和锌原子，其组成是α2ε2θ2τ2γ2δ2δ2′χ2ψ2β4（如表11-2所示）。其中。亚基的分子量为132 000，具有5′→3′DNA聚合酶活性。α、ε和θ三种亚基组成全酶的核心酶(称为pol Щ)。ε亚基具有3′外切酶的校对功能，可以提高DNA复制的保真性。核心酶本身活力较低，只作用于带缺口的双链DNA，加上τ亚基后成为二聚体，称pol Ⅲ′，pol Ⅲ′就可以利用带有引物的长单链DNA。γ和δ亚基则与酶功能的持续性有关，它们与δ′、χ和ψ亚基组装成γ复合体，进一步与核心酶结合，成为pol Ⅲ*，即“天然的”聚合酶Ⅲ，它与β亚基结合就形成全酶。在复制起始中β亚基对引物的识别和结合有关，一旦全酶结合到DNA复制的起始部位，β亚基就被释放出来。现在一般认为，DNA聚合酶Ⅲ是原核生物DNA复制的主要聚合酶。
表11-1 大肠杆菌三种DNA聚合酶的性质比较P273
DNA聚合酶I
DNA聚合酶Ⅱ
DNA聚合酶Ⅲ(复合物)
分子结构
分子量每个细胞所含分子数
5’ →3’聚合作用
3’→5’核酸外切酶
5’→3’核酸外切酶模板和引物完整的双链DNA
具有引物的长单链DNA
具有缺口(<100个核苷酸)的双链DNA
聚合速度(37℃核苷酸／min．分子)
结构基因
单链分子
109 000
400
+
+
+
－
+
+
1 000
po1 A
单链分子
120 000
100
+
+
－
－
－
+
100-300
po1 B
核心酶3个亚基，全酶22个亚基
400 000
10～20
+
+
－
全酶+
核心酶+
15 000以上
pol C，hol E，dna N，dna X,dna
Z，dna Q，ho1 A
表11-2 DNA聚合酶Ⅲ全酶的亚基组成P274
亚基
分子量
亚基数目
其 它 名 称
α
ε
θ
τ
γ
δ
δ′
χ
ψ
β
132 000
27 000
10 000
71 000
52 000
35 000
33 000
15 000
12 000
37 000
2
2
2
2
2
2
2
2
2
4
Pol Ⅲ,核心酶 pol Ⅲ′
(αεθ) (αεθ)2τ2
pol Ⅲ*
γ复合体 全酶
3．真核细胞的DNA聚合酶
在真核细胞内已发现四种DNA聚合酶，分别用α、β、γ和δ表示。这四种聚合酶的特性见表11-3。现在一般认为DNA聚合酶α和δ的作用是复制染色体DNA，主要的根据是它们在细胞内活力水平的变化与DNA复制有明显的平行关系，在分裂细胞的S期达到高峰。聚合酶α催化随后链的合成，而聚合酶δ催化领头链的合成，它还具有3′→5′外切酶的活力。DNA聚合酶β的功能主要是修复作用。DNA聚合酶γ是从线粒体中分离得到的，推测它与线粒体DNA的复制有关。
表11-3 真核生物的DNA聚合酶
DNA聚合酶α
DNA聚合酶β
DNA聚合酶γ
DNA聚合酶δ
分子量亚基数细胞内分布酶活力占总量的百分比核酸外切酶活力
110 000～220 000
4～8个
细胞核
～80％
无
45 000
1个
细胞核
10％～15％
无
60 000
1个
线粒体
2％～15％
无
122 000
1个
细胞核
10％～25％
3′→5′
4,DNA连接酶(DNA ligase)
其作用是催化双链DNA中的切口处的相邻5′—磷酸基与3′—羟基之间形成磷酸酯键。但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来。
大肠杆菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量，产物是AMP和烟酰胺单核苷酸(图11-5)。而在高等生物中，则要求ATP提供能量，产物是AMP和焦磷酸。大肠杆菌的DNA连接酶是分子量为75 000的多肽链。在哺乳动物细胞中发现至少有两种连接酶，分别称为连接酶I和Ⅱ。连接酶I的分子量为200 000，连接酶Ⅱ的为85 000。连接酶I主要在正在繁殖的细胞中起作用。连接酶Ⅱ则在停止分裂的细胞中起作用。DNA连接酶在DNA复制、修复、重组中均起重要作用。
图11-5 DNA连接酶催化反应的机理 P275
5．拓扑异构酶(topoisomerase)
生物体内DNA分子通常处于超螺旋状态，而DNA的许多生物功能需要解开双链才能进行。拓扑异构酶就是催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，它可分为拓扑异构酶I和拓扑异构酶Ⅱ(也称为旋转酶，gyrase)。I型酶可使双链DNA分子中的一条链发生断裂和再连接，反应不需要提供能量，它们主要集中在活性转录区，同转录有关。Ⅱ型酶能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入负超螺旋时需要由ATP提供能量。一个拓扑异构酶Ⅱ的分子1min可引入100个负超螺旋。它们主要分布在染色质骨架蛋白和核基质部位，同复制有关。拓扑异构酶I可减少负超螺旋；拓扑异构酶II可引入负超螺旋，它们协同作用控制着DNA的拓扑结构。拓扑异构酶在重组、修复和DNA的其他转变方面起着重要的作用。
6,解螺旋酶(helicase)
这类酶能通过水解ATP将DNA的两条链打开。ATP水解活力要有单链DNA存在时才表现。大肠杆菌中的rep蛋白(rep基因的产物)就是这样一种酶。由分子量为65 000的一条多肽链组成。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。
7．其他蛋白因子
（1）单链结合蛋白(SSP) 它的功能是稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。
（2）引发前体(preprimosome) 它是由6种蛋白质即dnaB、dnaC、n、n′、n″和i组成。引发前体再与RNA引物合成酶(引发酶)结合，组装成引发体（primosome）。引发体结合到随后链的模板上，具有识别合成起始位点的功能，可以沿模板链5′→3′方向移动，移动到一定位置上即可以引发RNA引物的合成。
三、DNA复制的基本过程
DNA的复制按一定的程序进行，双螺旋的DNA是边解开边合成新链的。A、复制从特定位点开始，B、可以单向或双向进行，但是以双向复制为主。C、由于DNA双链的合成延伸均为5′→3′的方向，因此复制是以半不连续(semidiscontinuous)的方式进行的，即其中一条链相对地连续合成，称之为领头链(1eading strand)，另一条链的合成则是不连续的，称为随后链(1aggingstrand)。在DNA复制叉上进行的复制基本活动包括 a、双链的解开；b、RNA引物的合成；ｃ、DNA链的延长；ｄ、切除RNA引物，填补缺口，e、连接相邻的DNA片段，如图11-6所示。
双链的解开
很多实验都证明了复制是从DNA分子的特定位置开始的，这一位置叫复制原点，常用ori(或o)表示。许多生物的复制原点都是富含A、T的区段。这一区段产生的瞬时单链与单链结合蛋白结合，对复制的起始十分重要。原核生物基因组一般只有一个复制原点。所有DNA的复制原点都处于双螺旋结构内部，就是线状DNA也不是从末端开始复制的。DNA复制速率的调节主要在于起始频率，而DNA延长的速度则大体上是恒定的。在迅速生长的细菌中，当第一次复制起始后，在复制未完成之前，复制原点可以起始第二次复制，这可加快复制的速度。真核细胞可以在DNA链上的多个不同位点同时起始进行复制，所以原核细胞的复制速度尽管比真核细胞快，但由于真核细胞可以在多个位点同时进行，其总速度反而比原核细胞快。
在DNA的复制原点，双股螺旋解开，成单链状态，分别作为模板，各自合成其互补链。在起点处形成一个“眼”状结构。在“眼”的两端，则出现两个叉子状的生长点，称为复制叉(replication fork)。在复制叉上结合着各种各样与复制有关的酶和辅助因子，如DNA解旋酶、引发体和DNA聚合酶，它们在DNA链上构成与核糖体相似大小的复合体称为复制体(replisome)。彼此配合，进行高度精确的复制(图11-6)。
2．RNA引物的合成
在DNA复制的起始处双链解开，领头链先引发开始合成，与其模板形成双链结构，而另一条亲代链则被置换出来。只有在领头链将另一条亲本链的特别序列置换出来，才能产生随后链的前体片段的前引发作用。需要引发酶与引发前体结合形成引发体。引发体在复制叉上移动，识别合成的起始点，引发RNA引物的合成。移动和引发均需要由ATP提供能量。以DNA为模板，按5′→3′的方向，合成一段引物RNA链。引物长度约为几个至10个核苷酸。在引物的5′端含3个磷酸残基，3′端为游离的羟基。
3．DNA链的延长
当RNA引物合成之后，在DNA聚合酶Ⅲ的催化下，以四种脱氧核糖核苷5′-三磷酸为底物，在RNA引物的3′端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出PPi。DNA链的合成是以两条亲代DNA链为模板，按碱基配对原则进行复制的，亲代DNA的双股链呈反向平行，一条链是5′→3′方向，另一条链是3′→5′方向。在一个复制叉内两条链的复制方向不同(图11-7)，所以新合成的二条子链极性也正好相反。由于迄今为止还没有发现一种DNA聚合酶能按3′→5′方向延伸，因此子链中有一条链沿着亲代DNA单链的3′→5′方向(亦即新合成的DNA沿5′→3′方向)不断延长。这条新链称为领头链。而另一条链的合成方向与复制叉的前进方向相反，只能断续地合成5′→3′的多个短片段。1968年冈崎发现了这些片段故又称为冈崎片段(Okazaki fragment)。它们随后连接成大片段，这条新链称为随后链。这种领头链是连续合成的，随后链断续合成的方式称为半不连续复制(semidiscontinuous replication)。原核细胞的冈崎片段长度为1 000～2 000个核苷酸。真核细胞的较短，长度为100～200个核苷酸。
图11-7 DNA的双向复制
尽管领头链的合成总是领先一段，但是从来没有发现领头链跑得太远，而总是与随后链保持相对稳定的一段距离。1988年Kornberg等人从大肠杆菌中分离出800 000的pol Ⅲ*和900 000的pol Ⅲ全酶，其中各个亚基均有两个，并证明是具有双活性部位的非对称结构，这表明同一个pol Ⅲ全酶可能同时负责领头链和随后链的复制。根据实验资料提出如下复制模型(图11-8)，随后链的模板在DNA聚合酶Ⅲ全酶上绕转180o形成一个小环，使冈崎片段的合成方向能够与领头链的合成方向以及复制体的移动方向保持一致。随着冈崎片段的延长，这个大环从DNA聚合酶Ⅲ上释放。在此之前，领头链的合成已将另一部分随后链的模板置换出来，并在适于引发的位点上由引发体合成新的引物，然后再形成一个小环而进行新的冈崎片段的合成。
图11-8 领头链-随后链同时复制模型
4．切除引物，填补缺口，连接修复当新形成的冈崎片段延长至一定长度，其3′—OH端与前面一条老片段的5′端接近时，即发生下列变化：在DNA聚合酶I的作用下，在引物RNA与DNA片段的连接处切断；切去RNA引物后留下的空隙，由DNA聚合酶I催化合成一段DNA填补上；在DNA连接酶的作用下，连接相邻的DNA链；修复掺入DNA链的错配碱基。这样以两条亲代DNA链为模板，各自形成一条新的DNA互补链，结果是形成了两个DNA双股螺旋分子。每个DNA双股螺旋分子中一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，故称为半保留复制。
四、逆向转录（逆转录）
以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA，这与通常转录过程中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反，故称为逆转录(reverse transcription)。在20世纪60年代Temin根据有关的实验结果提出，由RNA肿瘤病毒逆向转录为DNA前病毒，然后由DNA前病毒再转录为RNA肿瘤病毒的设想，但当时未得到重视。直至1970年，Temin和Baltimore各自在鸟类劳氏肉瘤病毒和小鼠白血病病毒等RNA肿瘤病毒中找到了逆转录酶，才证明了存在逆向转录过程。现在人们已发现各种高等真核生物的RNA肿瘤病毒都有逆转录酶。鸟类的劳氏肉瘤病毒的逆转录酶具有三种分子形式，分别为α、αβ和β2，其中αβ是主要形式。α亚基分子量为63 000，β亚基分子量为94 000。α亚基是β亚基的水解产物。只有α亚基具有酶活性。哺乳动物的RNA肿瘤病毒的逆转录酶一般为单亚基结构。如小鼠白血病病毒中的逆转录酶是分子量为70 000的单条多肽链。逆转录酶需要以Ａ、RNA(或DNA)为模板，Ｂ、以四种dNTP为原料，Ｃ、要求短链RNA(或DNA)作为引物，Ｄ、此外还需要适当浓度的二价阳离子Mg2+和Mn2+，沿5′→3′方向合成DNA，形成RNA-DNA杂交分子(或DNA双链分子)。Ｅ、以后，再以RNA-DNA杂交分子中的DNA链为模板，在寄主细胞的DNA聚合酶作用下，可合成另一条DNA互补链，这样便形成了新的双链DNA分子。
逆转录酶是一种多功能酶，它除了具有以RNA为模板的DNA聚合酶和以DNA为模板的DNA聚合酶活性外还兼有RNaseH、DNA内切酶、DNA拓扑异构酶、DNA解链酶和tRNA结合的活性。逆转录酶的发现，表明遗传信息也可以从RNA传递到DNA，从而丰富了分子遗传学中心法则的内容。
几乎所有的真核生物的mRNA分子的3′末端都有一段多聚腺苷酸。当加入寡聚dT作引物时，mRNA就可以成为逆转录酶的模板，在体外合成与其互补的DNA，称为cDNA。这种方法已成为生物技术和分子生物学研究中最常见的方法之一，也使逆转录酶得到广泛的应用。
五、基因突变和DNA的损伤与修复
基因突变
是指DNA的碱基顺序发生突然而永久性地变化，从而影响DNA的复制，并使DNA的转录和翻译也跟着改变，因而表现出异常的遗传特征。DNA的突变可以有几种形式：(1)一个或几个碱基对被置换(replacement)；(2)插入(insertion)一个或几个碱基对；(3)一个或多个碱基对缺失(deletion)。置换和插入的变化是可逆的，缺失则是不可逆的。最常见的突变形式是碱基对的置换。嘌呤碱之间或嘧啶碱之间的置换称为转换(transition)，嘌呤和嘧啶之间的置换称为颠换(transversion)。突变有自发突变和诱发突变。自发突变的机率很低。据估计在DNA的合成中，大约每109个碱基对发生一次突变。然而，逆转录酶合成的DNA保真度差，错配碱基的出现率要比真核生物或大肠杆菌的高1～3个数量级，所以各种RNA肿瘤病毒具有很高的自发突变频率。诱发突变可以由物理因素或化学因素引起，物理因素如电离辐射和紫外光等均可以诱发突变。在农业技术上常利用辐射诱变进行育种。化学因素如脱氨剂和烷化试剂也均可诱发突变。亚硝酸为强脱氨剂，可使腺嘌吟转变为次黄嘌呤，鸟嘌呤转变为黄嘌呤，胞嘧啶转变为尿嘧啶，而导致碱基配对错误。烷化剂如硫酸二甲酯(DMS)可使鸟嘌呤的N7位氮原子甲基化，使之成为带一个正电荷的季铵基团，减弱N9位上的N-糖苷键，致使脱氧核糖苷键不稳定，发生水解而丢失嘌呤碱，以后可被其他碱基取代或引起DNA链断裂。
DNA的损伤修复
某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都能引起生物突变和致死。因为它们均能作用于DNA，造成其结构和功能的破坏。例如X射线可以在DNA链上形成缺口(nick)；高剂量的紫外辐射则使DNA链上嘧啶碱基，特别是胸腺嘧啶的环已烯键活化，使同股相邻或不同股的胸腺嘧啶环已烯键之间形成新的共价键，连结成一个环丁烷，产生二聚体，在双螺旋区产生变形。构象的改变必将阻碍DNA的复制和转录，引起错股合成，最终细胞死亡。
目前已知有四种修复途径：光复活、切除修复、复组修复和诱导修复。
(1)光复活 这是一种高度专一的修复形式，其机制是：利用光能(最有效波长为400nm左右)激活光复活酶(高等哺乳动物缺乏该系统)，切除嘧啶二聚体之间的C－C键，而恢复原来的状态。光修复机制只作用于紫外线照射所形成的产物。
(2)切除修复 如果DNA损伤较为严重，则必须进行切除修复，即在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除掉，并以完整的一股链为模板，合成出切去的部分，使DNA恢复正常。这是一种较普遍的修复机制(图11-9)。参与的酶主要有对DNA损伤专一的DNA内切酶、DNA聚合酶I(或DNA聚合酶Ⅱ)和DNA连接酶。此外还可以由糖苷化酶切除受损伤的碱基造成无碱基的AP位点(apurinic或apyrimidinic)，此位点可被AP核酸内切酶识别，将损伤的DNA链切开。
(3)重组修复 重组修复的关键酶是重组修复酶，如大肠杆菌中的ReeA蛋白。含有损伤的DNA仍可进行复制，但在子代DNA链与损伤链相对应部位出现缺口。通过分子间重组，从完整的亲代或子代链上将相应的碱基顺序片段移至缺口处，然后用再合成的多核苷酸链补上提供缺口片断所造成的空缺(图11-10)。
图11-9 DNA损伤的切除修复过程 图11-10 DNA损伤的重组修复过程
(4)诱导修复 许多能造成DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应(SOS反应)。它包括DNA修复和导致变异两个方面。应急反应能Ａ、诱导切除修复和重组修复中某些关键酶和蛋白质的产生，加强修复能力。Ｂ、此外应急反应还能诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，它能在DNA损伤部位进行复制而避免了死亡，却带来了高的变异率。
以上几种修复系统只有光复活是利用光能，其余均利用ATP水解所释放的能量。光复活、切除修复和糖苷化酶修复都是修复模板链，重组修复是形成一条新的正常模板链，而SOS修复是唯一导致突变的修复。
第二节 在DNA指导下RNA的合成在DNA指导下的RNA合成称为转录。在转录过程中，以DNA的一条链为模板，按照碱基配对原则，合成一条与DNA链的一定区段互补的RNA链。细胞的各类RNA（包括mRNA、rRNA和tRNA）都是通过转录合成的，最初转录的RNA产物通常需要经过一系列断裂、拼接、修饰等加工过程才能成为成熟的RNA分子。
一、RNA的合成反应
在DNA指导下RNA的合成反应可用下式表示：
n1ATP
＋
n2GTP
＋ DNA指导的RNA聚合酶 RNA＋（n1＋n2＋n3＋n4）PPi
n3CTP DNA、Mg2+或Mn2+
＋
n4UTP
上式表明，DNA指导下的RNA合成反应是一酶促反应，以四种核糖核苷三磷酸（ATP、GTP、CTP、UTP）作为底物，需要适当的DNA为模板，不需要引物，在DNA指导的RNA聚合酶的催化下进行。反应产物RNA的组成决定于加入的作为模板的DNA的性质。例如，曾用各种不同碱基组的DNA作为模板，其所产生的RNA的碱基比例与加入的DNA之碱基比例基本上相一致，只是以尿嘧啶代替了DNA中的胸腺嘧啶（表l1-4）。
表11-4 不同DNA模板对产物RNA组成的影响
DNA来源
DNA模板
RNA产物
腺嘌呤
胸腺嘧啶
鸟嘌呤
胞嘧啶
腺嘌呤
尿嘧啶
鸟嘌呤
胞嘧啶
多聚dT
0
1
0
0
0.98
0.02
0
0
多聚（dA-T）
0.5
0.48
0.01
0.01
0.52
0.48
0
0
大肠杆菌
0.25
0.24
0.25
0.26
0.23
0.26
0.21
0.27
小牛胸腺
0.29
0.26
0.23
0.21
0.28
0.26
0.24
0.22
噬菌体T2
0.33
0.33
0.17
0.18
0.33
0.30
0.18
0.18
噬菌体φ×174（单链）
0.25
0.33
0.23
0.19
0.32
0.25
0.20
0.23
噬菌体φ×174（双链）
0.29
0.29
0.21
0.21
0.29
0.28
0.22
0.22
在体外，RNA聚合酶能使DNA的两条链同时进行转录，而在体内DNA的两条链中仅有一条链可用于转录，或者某些区域以这条链转录，另一些区域以另一条链转录，对应的链只能进行复制，而无转录功能，这称为不对称转录。用作模板的链称为反义链（antisense strand），另一条链称为有义链（sense strand）。DNA在体外转录时失去链的选择作用，而使两条链同样进行转录，这种不正常情况可能是由于RNA聚合酶在分离时丢失亚基引起的。在RNA聚合酶反应中，天然的（双链）DNA作为模板比变性的（单链）DNA更为有效。这表明RNA聚合酶的作用方式与DNA聚合酶有某些不同。DNA在复制时，首先需要将两条链解开，通过半保留的方式形成两个子代DNA分子；而RNA聚合酶以完整双链DNA为模板，DNA碱基顺序的转录是通过全保留的方式（conservative mode），转录后DNA仍然保持双链的结构。当然，这并不排除在转录时DNA的双链结构部分地被解开。事实上，有许多实验说明，DNA进行转录的部分结构是不稳定的，很可能发生局部的解开。两条链中的一条可作为有效的模板，在其上合成出互补的RNA链。当被解开的两条DNA链重新形成双螺旋结构时，已合成的RNA链即离开DNA链（图11-11）。
二、RNA聚合酶已从大肠杆菌和其他细菌中高度提纯了DNA指导的RNA聚合酶。大肠杆菌的RNA聚合酶全酶（holoenzyme）相对分子质量约50万，由五个亚基（α2ββ′σ）组成。没有σ亚基的酶（α2ββ′）叫核心酶（core enzyme）。核心酶只能使已开始合成的RNA链延长，但不具有起始合成RNA的能力，必须加入σ亚基才表现出全部聚合酶的活性。这就是说，在开始合成RNA链时必须有σ亚基参与作用，因此σ亚基为起始因子。各亚基的大小和功能列于表11-5。
表11-5 大肠杆菌RNA聚合酶各亚基的大小和功能亚 基
分 子 量
比 例
功 能
β′
165 000
1
和模板DNA结合
β
155 000
1
起始和催化作用
σ
95 000
1
起始作用
α
39 000
2
未知
在不同的细菌中，α、β和β′亚基的大小比较恒定，σ亚基有较大变动，其相对分子质量44 000～92 000。σ亚基的功能在于使RNA聚合酶稳定地结合到DNA的启动子上。单独的核心酶也能与DNA结合，这主要是由碱性蛋白质与酸性核酸之间的静电引力造成的，因此与其特殊序列无关，DNA仍然保持双螺旋形式。σ亚基能够改变RNA聚合酶与DNA之间的亲和力，它极大减少了酶与DNA一般序列的结合常数和停留时间，同时又大大增加了酶与DNA启动子的结合常数和停留时间。这样就使得全酶能迅速找到启动子并与之结合。
表11-6 真核细胞RNA聚合酶的种类和性质酶 的 种 类
不 同 名 称
分 布
合成的RNA类型
A
（对α-鹅膏蕈碱不敏感）
AⅠ（a+b）、Ⅰ、ⅠA、RC-Ⅱ
AⅡ、Ⅰ、ⅠB
核仁
rRNA
B
（对低浓度α-鹅膏蕈碱敏感）
BⅠ、Ⅱ、ⅡA、RC-Ⅰ、
BⅡ、Ⅱ、ⅡB
核质
核内不均一的RNA
（mRNA的前体）
C
（对高浓度α-鹅膏蕈碱敏感）
AⅢ、Ⅲ、RC-Ⅲ
核质
rRNA和5SRNA
真核细胞的RNA聚合酶有许多种，相对分子质量都在50万左右，通常由4～6种亚基组成。利用α-鹅膏蕈碱的抑制作用可将它们分为三类：RNA聚合酶A（或Ｉ）,RNA聚合酶B（或II）和RNA聚合酶C（或III）。它们可以分别对不同种类的RNA进行转录（表11-6）。
三、RNA的转录过程由RNA聚合酶催化的转录过程可分为三个反应步骤：①转录的起始；②链的延长；③链的终止。
（１）转录的起始 RNA聚合酶与DNA双链的特定部位相结合，并局部解开双螺旋，以使模板链可与核糖核苷酸进行碱基配对。解链仅发生在与RNA聚合酶结合的部位。起始阶段通常包括对双链DNA特定部位的识别、局部解开双链和在最初两个核苷酸之间形成磷酸二酯键。在此过程中所要求的全部DNA序列称为启动子。启动子部位必定具有某种特殊结构。这种特殊结构可能表现为DNA片段的特定核苷酸排列顺序，也可能表现为DNA片段局部的特异高级结构。一般地说，启动子部位常是AT含量高的区域，因为该区域的熔点（Tm）较低，双链容易打开。第一个核苷酸掺入的位置称为转录起点，在新合成的RNA链的5′末端通常为带有三个磷酸基团的鸟苷或腺苷（pppG或pppA）。这就是说，合成的第一个底物通常是GTP或ATP。
图11-12 在大肠杆菌中由RNA聚合酶合成RNA的过程
（２）链的延长 σ亚基仅与转录的起始有关，一旦RNA开始合成，它就被释放而离开核心酶。σ亚基的存在与否对核心酶的亚基构象有较大影响。当σ亚基存在时，核心酶的β′亚基和其他亚基表现为有利于专一结合在DNA特定序列上的构象；而σ亚基释放后，核心酶失去识别和专一结合在特定序列上的能力，因而可在模板上移动并按模板序列选择核糖核苷酸。在模板链上合成的RNA链可暂时形成RNA－DNA杂交双链。在延长阶段，随着RNA聚合酶向前移动，DNA解链区也随之推进，RNA链得以不断延长。但随后DNA的互补链即取代RNA－DNA杂交双链中的RNA链，从而恢复原来的DNA双螺旋结构。RNA聚合酶沿着模板链3′→5′方向移动，RNA链的合成方向是5′→3′。当以大肠杆菌RNA聚合酶合成RNA时，合成速度为每秒钟40～100个核苷酸。
（３）链的终止 DNA分子具有终止转录的核苷酸序列信号。在这些信号中，有些能被RNA聚合酶本身所识别，转录进行到该处即告终止，RNA链和RNA聚合酶便会从DNA模板上脱离下来。另一些信号则被ρ因子所识别。ρ因子是一种参与转录终止过程的蛋白质因子，它能辨别DNA上特殊的终止位点（ρ位点），使RNA链从DNA上脱离，停止转录。
在大肠杆菌中，由RNA聚合酶催化合成RNA的整个过程如图11-12所示。
四、转录后加工
在细胞内，由RNA聚合酶合成的原初转录物往往需要经过一系列的变化，包括键的裂解、5′端与3′端的切除和特殊结构的形成、碱基的修饰和糖苷键的改变以及拼接等过程，才能转变为成熟的RNA分子。此过程总称为RNA的成熟或转录后加工。
原核生物的mRNA一经转录通常立即进行翻译，除少数外，一般不进行转录后加工。但稳定的RNA（tRNA、rRNA）都要经过一系列加工才能成为有活性的分子。真核生物由于存在细胞核结构，转录和翻译在时间上和空间上都被分隔开来，其mRNA前体的加工极后需通过拼接使编码区成为连续序列。在真核生物中，还能通过不同的加工方式，表达出不同的信息。因此，对于真核生物来讲，RNA的加工尤为重要。
1．mRNA前体的加工
mRNA的原初转录物是相对分子质量极大的前体，即核内含不均一RNA（缩写为hnRNA）。hnRNA的碱基组成与总的DNA组成类似，因此又称为类似DNA的RNA（D-RNA）。它们在核内迅速合成和降解，半寿期很短，只有几分钟，比细胞质mRNA更不稳定。hnRNA分子中含有大量的插入部分即内含子，将在转录后的加工过程中被降解掉。据估算，hnRNA分子中大约只有25％的部分经加工转变成mRNA。当然，插入部分绝不会是无意义的，推测它们可能与转录和转录后代谢的调控作用有关。由hnRNA转变成mRNA的加工过程如下：①5′端形成特殊的帽子结构（m7GpppmNp）；②在链的3′端切断并加上多聚腺苷酸（PolyA）尾巴；③通过拼接除去由内含子转录来的序列；④链内部核苷被甲基化。
2．rRNA前体的加工
在原核细胞内含有三种rRNA，即5S、16S、23SrRNA。在各类细菌细胞中，编码核糖体RNA的基因排列在一起，它们包含有16S、23S、5SrRNA以及一个或几个tRNA基因，成为一个转录单位，其沉降系数为30S。在核糖核酸酶III和核糖核酸酶E的作用下，形成这三种成熟rRNA的前体，分别以P16S、P23S和P5S表示，它们经断裂和甲基化后即转变为成熟的rRNA（图11-13）。
真核生物细胞的核仁是rRNA合成、加工和装配成核糖体的场所。哺乳类动物细胞的核糖体含有四种不同的RNA，即28S、18S、5.8S和5SrRNA（它们的相对分子质量分别为l.7×106，0.65×106，5×104和4×104）。28S、18S和5.8SrRNA在转录过程中先形成共同的45S大分子前体（相对分子质最为4×106），然后再断裂成相应的rRNA，它们的关系如下,
28 S
(1.7×106)
32 S
(2.1×106) 5.8 S
45 S 41S (5×104)
(4.1×106) (3.1×106) 20 S
(0.9×105) 18 S
(0.65×106)
在真核生物中,5SrRNA基因也是成簇排列的，中间隔以不被转录的区域。它由RNA聚合酶III转录，经过适当加工即与28SrRNA和5.8SrRNA以及有关蛋白质一起组成核糖体的大亚基。18SrRNA与有关蛋白质则组成小亚基。
3．tRNA前体的加工
大肠杆菌染色体基因组共有tRNA基因约60个。tRNA基因大多成簇存在，或与tRNA基因或与编码蛋白质的基因组成混合转录单位。tRNA前体的加工包括：①由核酸内切酶在tRNA两端切断；②由核酸外切酶从3′端逐个切去附加的顺序，进行修剪；③在tRNA的3′端加上胞苷酸—胞苷酸—腺苷酸（—CCAOH）；④核苷的修饰。
真核生物tRNA基因的数目比原核生物tRNA基因的数目要大得多，啤酒酵母有250个tRNA基因，而人体细胞则有1300个。真核生物tRNA基因也成簇排列，并且被间隔区所分开。tRNA基因由RNA聚合酶III转录，转录产物为稍大的tRNA前体。在tRNA前体分子的5′端和3′端都有附加的序列，需由核酸内切酶和外切酶加以切除。真核生物tRNA前体的3′端不含CCA序列，成熟tRNA3′端的CCA是后加上去的，tRNA的修饰成分由特异的修饰酶催化。真核生物的tRNA除含有修饰碱基外，还有2′-O-甲基核糖，具有居间序列的tRNA前体还需将这部分序列切掉。
第三节 RNA的复制
核糖核酸（RNA）在传递DNA的遗传信息和控制蛋白质生物合成中的重要作用已如上述。在有些生物中，核糖核酸还可以是遗传信息的基本携带者，并能通过复制而合成出与其自身相同的分子。例如，某些RNA病毒，当它侵入寄主细胞后即可借助于复制酶（replicase）（RNA指导的RNA聚合酶）而进行病毒RNA的复制。
从感染RNA病毒的细胞中可以分离RNA复制酶，这种酶以病毒RNA作模板，在有四种核苷三磷酸和镁离子存在时合成出与模板性质相同的RNA。用复制产物去感染细胞，能产生正常的RNA病毒。可见，病毒的全部遗传信息包括合成病毒外壳蛋白质（coat protein）和各种有关酶的信息均贮存在被复制的RNA之中。
一、噬菌体QβRNA的复制复制酶的模板特异性很高，它只识别病毒自身的RNA，而对宿主细胞和其他与病毒无关的RNA均无反应。例如，噬菌体Qβ的复制酶只能以噬菌体QβRNA作模板，而不能以与其相类似的噬菌体MS2、R17和f2RNA或其他RNA作模扳。
大量关于RNA复制机理的研究工作是以感染各种RNA噬菌体（如噬菌体Qβ）的大肠杆菌为材料进行的。噬菌体Qβ是一种直径为20nm的正二十面体小噬菌体，含30％的RNA，其余为蛋白质。RNA是相对分子质量1.5×106左右的单链分子，约由4 500个核苷酸组成，含有编码3～4个蛋白质分子的基因。其有关蛋白质称之为A1，它是完整病毒的次要组分。氨基酸顺序分析表明，A1蛋白N端氨基酸顺序与外壳蛋白一致。推测编码A1蛋白的RNA顺序具有两个终止位点，在第一个位点终止时仅产生外壳蛋白，但如通读过去直到第二个终止位点，就可以产生A1蛋白。Qβ的基因顺序是：
5′末端——成熟蛋白——外壳蛋白（或A1蛋白）——复制酶β亚基——3′末端
Qβ复制酶有4个亚基，噬菌体RNA只编码其中的β亚基，另外三个亚基（α、γ和δ）则来自宿主细胞。现已证明，α是核糖体的蛋白质S1,γ和δ是宿主细胞蛋白质合成系统中的肽链延长因子EF-Tu和EF-Ts 。它们的性质和功能见表11-7。
表11-7 Qβ复制酶亚基的性质和功能亚 基 名 称
相对分子质量
来 源
功 能
Ⅰ（α）
Ⅱ（β）
Ⅲ（γ）
Ⅳ（δ）
65 000
65 000
45 000
35000
宿主细胞核糖体的蛋白质S1
噬菌体感染后合成宿主细胞的EF-Tu因子宿主细胞的EF-Ts因子
与噬菌体QβRNA结合聚合反应中磷酸二酯键形成的活性中心与底物结合，识别模板并选择底物稳定α、γ亚基结构
当噬菌体Qβ的RNA侵入大肠杆菌细胞后，其RNA本身即为mRNA，可以直接进行与病毒繁殖有关的蛋白质的合成。通常将具有mRNA功能的链称为正链，而它的互补链为负链，故噬菌体QβRNA为正链。在噬菌体特异的复制酶装配好后不久，酶就吸附到正链RNA的3′末端，以它为模板合成出负链RNA。合成进程结束，负链从模板上释放,同样的酶又吸附到负链RNA的3′末端，并以负链为模板合成正链（图11-14），所以两条链都是由5′→3′方向延长。在最适宜的条件下，正链和负链的合成速度均为每秒35个核苷酸。
当以正链为模板合成负链时，除需要复制酶外，还需要两个来自宿主细胞的蛋白质因子，称为HFⅠ和HFⅡ。但是以负链为模板合成正链时并不需要这两个因子。在感染后期，噬菌体RNA大量合成，这时正链RNA合成远超过负链RNA的合成，其原因就是宿主的蛋白质因子起了调节作用。进化的压力使病毒具有极高的复制效率、精确的识别和控制机理，并且尽量依赖寄主的条件。病毒的一个显著特点是，它的各组成成分常具有多种复杂的功能。例如，Qβ复制酶不仅能将噬菌体正链和负链RNA与大量存在于宿主细胞的所有RNA区别开来，特异地催化噬菌体RNA的复制，而且还能强力地抑制核糖体结合到QβRNA上，起蛋白质合成阻遏物的作用，这在病毒复制的早期起重要作用。再如，外壳蛋白是病毒颗粒结构的组分，同时又是复制酶合成的调节蛋白，因此感染后期当外壳蛋白的需要量达到高潮时，复制酶的合成便大大降低。
二、病毒RNA复制的主要方式
RNA病毒的种类很多，其复制方式也是多种多样的，归纳起来可以分成以下几类：
（１）病毒含有正链RNA 进入宿主细胞后首先合成复制酶（以及有关蛋白质），然后在复制酶作用下进行病毒RNA的复制，最后由病毒RNA和蛋白质装配成病毒颗粒。噬菌体Qβ和灰质炎病毒（poliovirus）即是这种类型的代表。灰质炎病毒是一种小RNA病毒（picornavirus）。它感染细胞后，病毒RNA即与宿主核糖体结合，产生一条长的多肽链，在宿主蛋白酶的作用下水解成6个蛋白质，其中包括1个复制酶、4个外壳蛋白和1个功能还不清楚的蛋白质。在形成复制酶后病毒RNA才开始复制。
（２）病毒含有负链RNA和复制酶 如狂犬病病毒（rabies virus）和马水疱性口炎病毒（vesicular-stomatitis virus）。这类病毒侵入细胞后，借助于病毒带进去的复制酶合成出正链RNA，再以正链RNA为模板，合成病毒蛋白和复制病毒RNA。
（３）病毒含有双链的RNA和复制酶 如呼肠孤病毒（reovirus）。这类病毒以双链RNA为模板，在病毒复制酶的作用下通过不对称的转录，合成出正链RNA，并以正链RNA为模板翻译成病毒蛋白质，然后再合成病毒负链RNA，形成双链RNA分子。
（４）致癌RNA病毒 主要包括白血病病毒（leukemia virus）和肉瘤病毒（sarcoma virus）。它们的复制需经过DNA前病毒阶段，由逆转录酶所催化。这类病毒的复制过程前面已有详细介绍。
