第二章 蛋白质化学第一节 蛋白质概述一、蛋白质生物功能蛋白质是生物体内最重要的物质之一，英文名称叫做Protein，是“最原初的”、“第一重要的”意思，不论是动物、植物，还是简单的细菌、病毒等都有蛋白质存在。它是细胞原生质的主要成分，与核酸一起共同构成了生命的物质基础。蛋白质的重要性很早就被认识，1838年，当G,J,Mulder提出蛋白质这个名词时，他就明确指出：在植物和动物中存在这样一种物质，毫不怀疑它是生物体中已知的最重要的物质，如果没有它，在我们这个星球上生命则是不可能存在的。恩格斯指出：生命是蛋白质的存在方式。因此，蛋白质有着极其重要的生物学意义。
1．生物催化作用：蛋白质的一个最重要的生物学功能是作为有机体新陈代谢的催化剂——酶。几乎所有的酶都是蛋白质。生物体内的各种化学反应几乎都是在相应的酶参与下进行的。
2．作为结构成分：蛋白质另一个主要的生物学功能是作为有机体的结构成分。在高等动物里，胶原纤维是主要的细胞外结构蛋白，参与结缔组织和骨骼作为身体的支架。细胞里的片层结构，如细胞膜、线粒体、叶绿体和内质网等都是由不溶性蛋白质与脂质组成的。
3．运输的功能：另一类蛋白质具有运输的功能。脊椎动物的血红蛋白和无脊椎动物中的血蓝蛋白，某些色素蛋白如细胞色素c等起传递电子的作用。
4．运动功能：某些蛋白质与生物的运动有关，如肌球蛋白(myosin)和肌动蛋白(actin)是肌肉收缩系统的必要成分。细菌的鞭毛或纤毛蛋白也能产生类似的活动。近年来发现，在非肌肉的运动系统中普遍存在着运动蛋白。
5．储存功能：有些蛋白质具有贮藏氨基酸的功能，作为有机体及其胚胎或幼体生长发育的原料，如蛋类中的卵清蛋白（ovalbumin）、乳类中的酪蛋白（casein)、小麦种子中的麦醇溶蛋白等。
6．免疫防御：生物体防御体系中的抗体（antibody）也是蛋白质。它能识别病毒、细菌以及其他机体的细胞，并与之相结合而排除外来物质对有机体的干扰，起到保护机体的作用。
7．代谢调控：还有一些蛋白质具有激素的功能，对生物体内的新陈代谢起调节作用。如胰岛素参与血糖的调节，能降低血液中葡萄糖的含量。
8．其它作用：近代分子生物学的研究还表明，蛋白质在遗传信息的控制、细胞膜的通透性，以及高等动物的记忆、识别机构等方面都起到重要作用。
二、蛋白质的元素组成蛋白质是含氮的有机化合物，其含氮量占生物组织中一切含氮物质的绝大部分。氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征性元素，根据对大多数蛋白质的氮元素分析，其氮元素的含量都相当接近，一般在15%~17％，平均为16％，即100g蛋白质中含有16g氮。这是凯氏(Kjedahl）定氮法测定蛋白质含量的计算基础。
蛋白质含量＝蛋白氮×6,25
式中：6,25—16％的倒数，每测定１g氮相当于6,25g的蛋白质。
蛋白质除含有氮元素外，含有下述几种主要元素：C：50～55%； Ｈ：6～8％；Ｏ：20～30% ；Ｓ：0~4％。有些蛋白质含有少量的磷，还有些蛋白质含有微量的金属元素，例如铁、铜、锰、锌等。
三、蛋白质的分类
蛋白质可以按不同的方法分类。作为分类的依据主要有：分子的形状或空间构象；分子的溶解性；分子的组成情况；功能。
表3-1 简单蛋白质的分类蛋白质
性 质
清蛋白(albumin)
2.．球蛋白(globulin)
3．谷蛋白(glutelin)
4．醇溶蛋白(prolamine)
5．组蛋白(histone)
6．鱼精蛋白(protamine)
7．硬蛋白（scleroprotein）
溶于水及稀盐、稀酸或稀碱溶液，为饱和硫酸铵所沉淀。广泛存在于生物体内，如血清清蛋白、乳清蛋白等
为半饱和硫酸铵所沉淀，不溶于水而溶于稀盐溶液的称为优球蛋白( euglobulin)；溶于水的称为拟球蛋白(pseudoglobulin)。普遍存在于生物体内，如血清球蛋白、肌球蛋白和植物种子球蛋白等
不溶于水、醇及中性盐溶液，但易溶于稀酸或稀碱，如米谷蛋白(oryzenin)和麦谷蛋白(glutenin)等
不溶于水及无水乙醇，但溶于70%~80%的乙醇中。组成上的特点是脯氨酸和酰胺较多，非极性侧链远较极性侧链多。这类蛋白质主要存在于植物种子中，如玉米醇溶蛋白(zein)、麦醇溶蛋白(gliadin)等溶于水及稀酸，但为稀氨水所沉淀。分子中组氨酸、赖氨酸较多，分子呈碱性，如小牛胸腺组蛋白等
溶于水及稀酸，不溶于氨水。分子中呈碱性的氨基酸特别多，因此呈碱性，如鲑精蛋白(salmin)等
不溶于水、盐、稀酸或稀碱 。这类蛋白是动物体内作为结缔及保护功能的蛋白质,如角蛋白（keratin)、胶原(collagen)、网硬蛋白(reticulin)和弹性蛋白(elastin)等
按照分子的形状或空间构象可将蛋白质分为纤维状蛋白和球状蛋白两大类。纤维状蛋白分子很不对称，形状类似纤维。有的纤维状蛋白能溶于水，如肌肉的结构蛋白和血纤维蛋白原；有的纤维状蛋白不溶于水，如角蛋白、丝心蛋白以及胶原蛋白等。球状蛋白质分子的形状接近球形，空间构象比纤维状蛋白复杂。球状蛋白质的溶解性较好，能结晶，生物体内的蛋白质大多数属于这一类。
根据分子组成情况，可将蛋白质划分为单纯蛋白和结合蛋白两类。单纯蛋白不含有非蛋白质部分。这类蛋白质水解后的最终产物只有氨基酸。单纯蛋白质按其溶解性质的不同可分为白蛋白（或清蛋白）、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、精蛋白、组蛋白以及硬蛋白等（表3-1）。结合蛋白是指由单纯蛋白和非蛋白成分结合而成的蛋白质，包括核蛋白、色蛋白、磷蛋白、糖蛋白等（表3-2）。按照蛋白质的功能，则可划分为酶蛋白、结合蛋白、运输蛋白、受体蛋白、调节蛋白、防御蛋白、贮存蛋白、毒蛋白等（表3-3）。
表3-2 结合蛋白质的分类
蛋白质
性 质
1．核蛋白(nucleoprotein)
2．脂蛋白(lipoprotein)
3．糖蛋白(glycoprotein)和粘蛋白(mucoprotein)
4．磷蛋白(phosphoprotein)
5．血红素蛋白(hemoprotein)
6．黄素蛋白(flavoprotein)
7．金属蛋白(metalloprotein)
辅基是核酸，如脱氧核糖核蛋白、核糖体、烟草花叶病毒等
与脂质结合的蛋白质。脂质成分有磷脂、固醇和中性脂等，如血中的(1-脂蛋白、卵黄球蛋白(lipovitellin)等
辅基成分为半乳糖、甘露糖、己糖胺、己糖醛酸、唾液酸、硫酸或磷酸等，如卵清蛋白、(-球蛋白、血清类粘蛋白(seromucoid)等
磷酸基通过酯键与蛋白质中的丝氨酸或苏氨酸残基侧链相连，如酪蛋白、胃蛋白酶等
辅基为血红素，它是卟啉类化合物，卟啉环中心含有金属，如含铁的血红蛋白、细胞色素c，含镁的叶绿素蛋白，含铜的血蓝蛋白(hemocyanin)等
辅基为黄素腺嘌呤二核苷酸，如琥珀酸脱氢酶、D-氨基酸氧化酶等
与金属直接结合的蛋白，如铁蛋白(ferritin)含铁,乙醇脱氢酶含锌,黄嘌呤氧化酶含钼和铁等
表3-3 蛋白质按生物功能的分类
类型及举例
功能或存在
1.酶(enzymes)
核糖核酸酶(Rnese)
细胞色素C(cytochyome C)
木瓜蛋白酶(papain)
2.储藏蛋白(storage protein)
麦醇溶蛋白(gliadin)
玉米醇溶蛋白(zein)
酪蛋白(casein)
卵清蛋白(ovalbumin)
3.运输蛋白(transport protein)
血红蛋白(hemoglobin)
血蓝蛋白(hemocyanin)
肌红蛋白(myogloin)
血清清蛋白(serum albumin)
β1 -脂蛋白(β1-lipoprotein)
4.收缩蛋白(contractile protein)
肌球蛋白(myosin)
肌动蛋白(actin)
5.保护蛋白(protective protein)
抗体(antibodies)
6.补体(complement)
7.结构蛋白
糖蛋白( glycoprotein )
α-角蛋白(α- keratin )
胶原蛋白( collagen )
水解RNA
转移电子
水解多肽
小麦的种子蛋白
玉米的种子蛋白
牛乳蛋白
鸡蛋清蛋白
在血液中运输O2(脊椎动物)
在血液中运输O2(无脊椎动物)
在肌肉中运输O2
在血液中运输脂肪酸
在血液中运输脂类
肌原纤维的静止纤维
肌原纤维的移动纤维
与异蛋白形成复合体
与抗原抗体系统形成复合体
细胞外壳及壁
皮肤、羽毛、毛发、角
结缔组织
上述蛋白质的分类并不是绝对的，彼此间是有联系的。例如，组蛋白属于单纯蛋白，若它和DNA结合在一起时，则把它们合称为核蛋白，就属于结合蛋白类。
第二节 氨基酸
蛋白质是一类含氮的生物大分子，结构复杂，功能多样。经酸、碱或蛋白酶处理，使蛋白质彻底水解可以得到各种氨基酸。现在已证明氨基酸是蛋白质的基本组成单位，组成蛋白质的氨基酸共有20种。目前从各种生物体中发现的氨基酸已有180多种，除去组成蛋白质的20种氨基酸外，其余氨基酸被称为非蛋白质氨基酸。组成蛋白质的氨基酸称为蛋白质氨基酸。
一、蛋白质氨基酸的一般结构特点及其分类
氨基酸是含有氨基及羧基的有机化合物。从蛋白质水解产物中分离出来的常见的20种氨基酸除脯氨酸外，其余19种氨基酸在结构上的共同特点是与羧基相邻的(-碳原子上都有一个氨基，因而称为(-氨基酸。结构通式如下,
从结构上看，除甘氨酸外，所有(-氨基酸的(-碳原子都是不对称碳原子（asymmetric carbon）或称手性中心，因此都具有旋光性，都能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋通常用（－）表示，右旋通常用（＋）表示。其次每种氨基酸都有D-和L-型两种立体异构体，这是与甘油醛相比较确定的。书写时将羧基写在(-碳原子的上端，则氨基在左边的为L-型，氨基在右边的为D-型（如图3-1）。
必须指出，构型与旋光方向二者之间没有直接对应关系。各种L-型氨基酸中有的为左旋有的为右旋，即便同一种L-型氨基酸，在不同溶剂中测定时，其比旋光值和旋光方向也会不同。从蛋白质水解得到的 (- 氨基酸都属于L-型的，所以习惯上书写氨基酸都不标明构型和旋光方向。
从(-氨基酸的结构通式可以知道，各种(-氨基酸的区别就在于侧链R基团的不同，即是说，不同的氨基酸有不同的R基团。这样，组成蛋白质的20种常见氨基酸可以按照R基的化学结构或极性大小进行分类。在这里，我们将按照各种氨基酸侧链R基团的极性差别进行分类。这对于认识蛋白质的性质、结构与功能更为有利。按照这种分类方法可将氨基酸分为四大类：即非极性或疏水性的侧链R基氨基酸；极性但不带电荷的R基氨基酸；带正电荷的R基氨基酸；带负电荷的R基氨基酸表（表3-4~表3-7）。注意，这些氨基酸的解离条件是指在细胞生理pH值范围内。
图3- 1 丙氨酸的一对对映体与L -和D -甘油醛的绝对构型的立体关系表3-4 具有非极性或疏水的R基团的氨基酸氨基酸名称
R集团
三字母符号
单字母符号
丙 氨 酸
（alanune）
缬 氨 酸
（valine）
亮 氨 酸
（leucine）
异 亮 氨 酸
（isoleucine）
Ala
Val
Leu
Ile
A
V
L
I
氨基酸名称
R集团
三字母符号
单字母符号
脯 氨 酸
（proline）
苯 丙 氨 酸
（phenylalanine）
色 氨 酸
（tryptophan）
甲 硫 氨 酸
（methionine）
Pro
Phe
Trp
Met
P
F
W
M
表3-4这一组中共有8种氨基酸（丙、缬、亮、异、脯、笨、色、硫）。4种带有脂肪烃侧链的氨基酸，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2种含芳香环氨基酸：苯丙氨酸和色氨酸；1种含硫氨基酸即甲硫氨酸；1种亚氨基酸：脯氨酸。这组氨基酸在水中的溶解度比极性R基氨基酸小。其中以丙氨酸的R基疏水性最小。
表3-5这一组中有7种氨基酸。这组氨基酸比非极性R基氨基酸易溶于水。它们的侧链中含有不解离的极性基，能与水形成氢键。丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸中侧链的极性是由于它们的羟基造成的；天冬酰胺和谷氨酰胺R基极性是它们的酰胺基引起的；半胱氨酸则是由于含有巯基的缘故。甘氨酸的侧链介于极性与非极性之间，有时也把它归入非极性类，但是它的R基只不过是一个氢原子，对极性强的(-氨基和(-羧基影响极小。这一组氨基酸中半胱氨酸和酪氨酸的R基极性最强。半胱氨酸中的巯基和酪氨酸中的酚羟基，虽然在pH=7时电离很弱，但与这组氨基酸中的其他氨基酸侧链相比失去质子的倾向大得多。
表3-6属于这一类的是两种酸性氨基酸，它们都含有两个羧基，并且第二个羧基在pH值6~7范围内也完全解离，因此分子带负电荷。
表3-7这一类氨基酸在pH=7时携带净正电荷，又叫碱性氨基酸。赖氨酸除(-氨基外，在脂肪链的( 位置上还有一个氨基；精氨酸含有一个带正电荷的胍基；组氨酸有一个咪唑基。在pH=6.0时，组氨酸分子50％以上质子化，但在pH=7.0时，质子化的分子不到10％。组氨酸是R基的pK值在7附近的唯一种氨基酸。
表3-5 具有极性不带电荷的R基团的氨基酸氨基酸名称
R 基 团
三字母符号
单字母符
甘 氨 酸
（glycine）
Gly
G
丝 氨 酸
（serine)
Ser
S
苏 氨 酸
（threonine)
Thr
T
半 胱 氨 酸
(cysteine)
Cys
C
酪 氨 酸
（tyrosine）
Tyr
Y
天 冬 酰 胺
(asparagine)
Asn
N
谷 氨 酰 胺
（glutamine）
Gln
Q
表3-6 R基团带负电荷的氨基酸氨基酸名称
R 基 团
三字母符号
单字母符号
天 冬 氨 酸
（aspartic acid）
Asp
D
谷 氨 酸
（glutamic acid）
Glu
E
表3-7 R基团带正电荷的氨基酸
氨基酸名称
R 基 团
三字母符号
单字母符号
赖 氨 酸
（lysine）
Lys
K
精 氨 酸
(argnine)
Arg
R
组 氨 酸
（histidine）
His
H
总之，氨基酸的结构特点是：
１、α-氨基酸：参与组成蛋白质的20种氨基酸,除脯氨酸是一种α-亚氨基酸外,其余的都是α-氨基酸
２、式中Ｒ表示侧链，２0种蛋白质氨基酸在结构上的差别仅在于侧链基团R的不同。
３、除没有手性碳原子的甘氨酸外,其它蛋白质氨基酸均为L-型氨基酸。
二、稀有的蛋白质氨基酸蛋白质组成中，除了20种常见氨基酸（基本氨基酸）外，从少数蛋白质中还分离出一些稀有氨基酸，它们都是相应常见氨基酸的衍生物。如4-羟脯氨酸（4-hydroxyproline），存在于动物的纤维蛋白、胶原蛋白及某些植物蛋白（如烟草细胞壁的糖蛋白）；又如胶原蛋白中的5-羟赖氨酸（5-hydroxylysine）和肌球蛋白中的6-N-甲基赖氨酸（6-N-methyllysine）都是赖氨酸的衍生物。
三、非蛋白质氨基酸
有些氨基酸以游离或结合态存在于各种细胞或组织中，但不存在于蛋白质中。生物体内已发现数百种非蛋白质氨基酸。大部分是常见氨基酸的衍生物，但也有D-型和一些β、γ或δ-氨基酸。如参与细菌细胞壁组成的肽聚糖中存在有D-谷氨酸和D-丙氨酸，短菌杆肽S（gramicidin）中的D-苯丙氨酸等。
这些非蛋白质氨基酸中，有些是重要的代谢物前体或中间产物。如β-丙氨酸是维生素B3（泛酸）的前体；瓜氨酸（citrulline）和鸟氨酸（ornithine）是合成精氨酸的前体。γ-氨基丁酸是一种神精递质。
四、氨基酸的理化性质
1．两性解离与等电点依照Bronsted - Lowry的酸碱质子理论，酸是质子(H＋)供体（donor），碱是质子的受体（acceptor）。酸碱的相互关系如下：
HA＝A－＋H＋
酸 碱 质子这里原始的酸（HA）和生成的碱（A-）被称为共轭酸-碱对。
根据这一理论，氨基酸在水中的偶极离子既起酸（质子供体）的作用：
也起碱（质子受体）的作用。
同一个氨基酸分子上带有能释放出质子的-NH3＋正离子和能接受质子的-COO－负离子，是两性离子。氨基酸具有两性解离的特点，因此是两性电解质。
完全质子化的氨基酸可以看成是多元酸，侧链不能解离的中性氨基酸可看作是二元酸，酸性氨基酸和碱性氨基酸可视为三元酸。现以甘氨酸为例说明氨基酸的解离情况。 它分步解离如下：
(3.1)
(3.2)
在上列公式中，K′1和K′2分别代表α-碳原子上的-COO－和-N＋H3 的表观解离常数。如果侧链 R基上有可解离的基团，其表观解离常数用K′R表示。
物质的表观解离常数可以用测定滴定曲线的实验方法求得。当lmol甘氨酸溶于水时，溶液的pH值约等于6，如果用标准NaOH进行滴定，以加入的NaOH的摩尔数对pH值作图，则得滴定曲线B(图3-2)在 pH值9.6处有一拐点。从甘氨酸的解离公式(3.2)可知，当滴定至H3＋N—CH2—COO－有一半变成H2N—CH2—COO－，即[ R０]＝[ R－]时,则K′2＝[H＋],两边各取负对数得pK′2=pH，这就是曲线B拐点处的pH值(9.6)。如果用标准盐酸滴定，以加入的盐酸摩尔数对pH值作图，则得滴定曲线A，在pH值2.34处有一拐点。同样，从解离公式(3.1)可知,pK′1＝2.34，这里 H3＋N—CH2—COO—和H3＋N—CH2—COOH的摩尔浓度相等，即[R＋]＝[R０]。如果利用PH=p K′+lg[质子受体]/[质子供体]以及所给的pK′1值和pK′2值等数据，即可计算出任一pH值条件下一种氨基酸的各种离子的比例。
图3-2 甘氨酸的解离曲线（方框内表示在解离曲线拐点处的pH值时所具有的离子形式）
为了判断滴定曲线上的两个拐点——pH值2.34和9.60究竟代表甘氨酸中哪个基团的解离，可以把它们与脂肪酸和脂肪胺的pK′值进行对比。脂肪酸中的—COOH基 pK′值一般在4～5，脂肪胺中的—N＋H3的pK′值一般在9～10。所以最可能的是pK1′＝2.34代表甘氨酸中—COOH基的解离，pK2′＝9.60代表甘氨酸中—N＋H3基的解离。甘氨酸中的—COOH基的酸性要比醋酸(pK′＝4.76)强100多倍，这是因为邻近的—N＋H3基的正电荷对—COOH的质子(H＋)产生静电排斥因而增强了—COOH基释放质子的趋势，用下式表示：
含一氨基一羧基和不解离R基的氨基酸都具有类似甘氨酸的滴定曲线。这类氨基酸的pK′值相当于pK1′的范围为2.0～3.0，pK2′为9.0～10.0 （见表3-8）。带有可解离R基的氨基酸，相当于三元酸，有三个pK′值，因此滴定曲线比较复杂。
从甘氨酸的解离公式或解离曲线可以看到，氨基酸的带电状况与溶液的pH值有关，改变pH值可以使氨基酸带上正电荷或负电荷，也可以使它处于正负电荷数相等即净电荷为零的兼性离子状态。图3-2中曲线A和B之间的拐点(pI=5.97)就是甘氨酸处于净电荷为零时的pH值，称为等电点(isoelectric point，缩写为pI)或等电pH值(pHI)。在等电pH值时，氨基酸在电场中既不向正极也不向负极移动，即处于兼性离子(极少数为中性分子)状态，少数离子成阳离子和阴离子，但解离成阳离子和阴离子的数目相等。
对侧链R基不解离的中性氨基酸来说，其等电点是它的pKl′和pK2′的算术平均值。
在等电点以上的任何pH值，氨基酸带净负电荷，并因此在电场中向正极移动。在低于等电点的任一 pH值，氨基酸带有净正电荷，在电场中向负极移动。在一定pH值范围内，氨基酸溶液的pH值离等电点越远，氨基酸所携带的净电荷越大。
20种基本氨基酸，除组氨酸外，在生理pH值(pH值为7左右)下都没有明显的缓冲容量。因为这些氨基酸的pK′值都不在pH值7附近(表3-8)，而缓冲容量只在接近pK′值时才显现出来。从表3-8和图3-2可见，组氨酸咪唑基的pK′R值为6.0，在pH值为7附近有明显的缓冲作用。
表3-8 氨基酸的表观解离常数和等电点氨基酸
pK1′（-COOH）
pK2′（-NH3）
pKR′(R—基团)
pI
甘氨酸
2.34
9.60
5.97
丙氨酸
2.34
9.69
6.02
缬氨酸
2.32
9.62
5.97
亮氨酸
2.36
9.60
5.98
异亮氨酸
2.36
9.68
6.02
丝氨酸
2.21
9.15
5.68
苏氨酸
2.63
10.43
6.53
天冬氨酸
2.09
9.82
3.86(β-COOH)
2.97
天冬酰胺
2.02
8.8
5.41
谷氨酸
2.19
9.67
4.25(γ-COOH)
3.22
谷氨酰胺
2.17
9.13
5.65
精氨酸
2.17
9.04
12,48（胍基）
10.76
赖氨酸
2.18
8.95
10,53（ε-NH2）
9.74
组氨酸
1.82
9.17
6,00( 咪唑基)
7.59
半胱氨酸
1.71
8.33
10,78( —SH)
5.02
甲硫氨酸
2.28
9.21
5.75
苯丙氨酸
1.83
9.13
5.48
酪氨酸
2.20
9.11
10,07(—OH)
5.66
色氨酸
2.38
9.39
5.89
脯氨酸
1.99
10.60
6.30
注：除半胱氨酸是30℃时的测定值外，其他氨基酸都是25℃时的测定值。
2．吸收光谱参与蛋白质组成的20种氨基酸，在可见光区域都没有光吸收，但在远紫外区域(＜220 nm均有光吸收。在近紫外区域(220～300 nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。因为它们的R 基含有苯环共轭双键系统。酪氨酸的最大光吸收波长在275 nm，苯丙氨酸的在257 nm，色氨酸的在280 nm。
蛋白质由于含有这些氨基酸，因此也有紫外吸收能力。一般最大光吸收在波长280 nm处，因此利用分光光度法能很方便地测定蛋白质的含量。但是在不同的蛋白质中这些氨基酸的含量不同，所以它们的消光系数（或称吸收系数）是不完全一样的。
3．除甘氨酸外都具有旋光性
4．重要化学反应
氨基酸的化学反应主要是指它的(-氨基和α-羧基以及侧链上的功能团所参与的那些反应。
（1）与亚硝酸反应 在室温下亚硝酸能与含游离α-氨基的氨基酸起反应，定量地放出氮气，氨基酸被氧化成羟酸(含亚氨基的脯氨酸则不能与亚硝酸反应)。其反应式如下：
在标准条件下测定生成的氮气体积，即可计算出氨基酸的量，用此方法反应很快，也较为准确，是定量测定氨基酸的方法之一（此反应是Vanslyke氨基氮测定法的基础）。此法还可用于蛋白质水解程度的测定。
这里值得注意的是生成的氮气(N2)只有一半来自氨基酸。此外应该指出，除α-NH2外，赖氨酸的ε-NH2也能与亚硝酸反应，但速度较慢。而α-NH2作用3～4min即完成反应。
（2）与2，4-二硝基氟苯的反应 在弱碱性溶液中，氨基酸的α- 氨基很容易与2，4-二硝基氟苯（DNFB）作用，生成稳定的黄色2，4-二硝基苯基氨基酸（简写为DNP-氨基酸）。
这个反应首先被英国的Sanger用来鉴定多肽或蛋白质的N末端氨基酸。
（3）与异硫氰酸苯酯反应 在弱碱性条件下，氨基酸中的α-氨基还可以与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，产生相应的苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸）。在无水酸中，PTC-氨基酸即环化为苯硫乙内酰脲（PTH），后者在酸中极稳定。
这些衍生物是无色的，可用层析法加以分离鉴定。这个反应首先被Edman用于鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸。它在多肽和蛋白质的氨基酸顺序分析方面占有重要地位。
（4）与茚三酮反应 在氨基酸的分析化学中，具有特殊意义的是氨基酸与茚三酮的反应。茚三酮在弱酸性溶液中与α-氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氨、脱羧反应，最后茚三酮与反应物──氨和还原茚三酮发生作用，生成蓝紫色物质。其反应如下,
用纸层析或柱层析把各种氨基酸分开后，利用茚三酮显色可以定性或定量测定各种氨基酸。定量释放的CO2用测压法测量，从而计算出参加反应的氨基酸量。
两个亚氨基酸──脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应形成黄色化合物。
第三节 肽
一、肽键、肽链、肽单位、氨基酸残基和肽的命名一个氨基酸的α-羧基和另一个氨基酸的α-氨基脱水缩合而成的化合物叫肽。氨基酸之间脱水后形成的键叫肽键(peptide bond)，又称为酰胺键，写作—CO—NH—（反式立体结构）。最简单的肽由两个氨基酸组成，称为二肽(dipeptide)，其中包含一个肽键。含有三个、四个氨基酸的肽分别称为三肽、四肽。10个以上氨基酸所生成的肽称为多肽，多肽为链状结构，所以多肽也叫多肽链。肽链中氨基酸由于参加肽键的形成已经不是原来完整的分子，因此称为氨基酸残基（amino acid residue）。多肽链中每一氨基酸单位在形成肽键时都丢失1分子水。严格地说每形成一个肽键丢失1分子水，因此丢失的水分子数比氨基酸残基数少1个。一条多肽链通常在一端含有一个游离的末端氨基，在另一端含有一个游离的末端羧基。这两个游离的末端基团有时连接而成环状肽(cyclic peptide)。肽的命名是根据参与其组成的氨基酸残基来确定的。规定从肽链的NH2末端氨基酸残基开始，称为某氨基酰某氨基酰……某氨基酸。例如，具有下列化学结构的五肽命名为丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸，简写为 Ser—Gly－Tyr—Ala—Leu。
肽链也像氨基酸一样具有极性，通常总是把NH2末端氨基酸残基放在左边,COOH末端氨基酸残基放在右边。除特别指明者外，上面举例的五肽丝氨酸残基一侧为NH2末端，亮氨酸残基一侧为 COOH末端。注意，反过来书写的 Leu—Ala—Tyr—Gly—Ser是与前者不同的另一种五肽。从上面五肽的化学结构可以看出，肽链中的骨干是由右示单位规则地重复排列而成的，称之为共价主链(main backbond)。各种肽链的主链结构都是一样的，但侧链R基的顺序即氨基酸残基顺序不同。肽链主链上的重复结构称为肽单位( peptideunit )或肽基(peptide group)。肽键的实际结构是一个共振杂化体（resonance hybrid）。由于氮电子离域形成了包括肽键的羰基氧、羰基碳和酰胺氮在内的O—C—N(系统，因此主链肽键C—N具有双键性质而不能自由旋转，据测定C—N单键的键长是0.148nm；C＝N双键的键长是0.127nm；据预测肽键（共振杂化体）中的C…N的键长应介于两者之间。X-射线衍射分析证实，肽键中C…N的键长为0.132nm，结果肽键的所有4个原子和与之相连的两个α-碳原子（习惯上称为Cα）都处于一个平面内，此刚性结构的平面称为肽平面（peptide plane）或酰胺平面（图3-3），每一个肽单位实际上就是一个肽平面。肽平面内的C＝O与N—H呈反式排列，各原子间的键长和键角都是固定的。
二、重要的寡肽及其应用
在生物体内,氨基酸通过肽键连接,除了合成蛋白质多肽链外,还能合成一些具有调节功能的小分子肽,称为生物活性肽。肽广泛存在于动植物组织中，有一些在生物体内具有特殊功能。据近年来对活性肽的研究，生物的生长发育、细胞分化、大脑活动、肿瘤病变、免疫防御、生殖控制、抗衰老、生物钟规律及分子进化等均涉及到活性肽。
（1）谷胱甘肽 动植物细胞中都含有一种三肽，称为还原型谷胱甘肽(reduced glutathion) 即(-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，因为它含有游离的－SH，所以常用GSH来表示。它的分子中有一特殊的(-肽键，是谷氨酸的(-羧基与半胱氨酸的α-氨基缩合而成，显然这与蛋白质分子中的肽键不同。结构式如下,
还原型谷肽甘肽(GSH) 氧化型谷胱甘肽(GSSG)
由于GSH中含有一个活泼的巯基，很容易氧化，两分子GSH脱氢以二硫键相连就成为氧化型谷胱甘肽(GSSG)。谷胱甘肽作为清除剂与有害的氧化剂作用可以保护含巯基的蛋白质，还是某些酶的辅酶，在体内氧化还原过程中起重要作用。
（2）脑啡肽 在小的活性肽中一类称为脑啡肽(enkephalins)的物质近年来很引人注意。它是一类比吗啡更有镇痛作用的五肽物质。1975年底将其结构搞清，并从猪脑中分离出两种类型的脑啡肽。其结构如下：
甲硫氨酸型脑啡肽(Met-脑啡肽)
H· Tyr· Gly· Gly· Phe·Met·OH
亮氨酸型脑啡肽(Leu-脑啡肽)
H· Tyr· Gly· Gly· phe· Leu·OH
由于脑啡肽类物质是高等动物脑组织中原来就有的，因此对它们进行深入研究不仅有可能人工合成出一类既有镇痛作用而又不会像吗啡那佯使病人上瘾的药物来，更重要的是为分子神经生物学的研究开阔了思路，从而可以在分子基础上阐明大脑的活动。
（3）加压素 加压素是脑下垂体后叶所分泌的多肽激素，由九个肽组成，呈环状结构，其简式如下：
加压素的功能是促进血管平滑肌收缩和抗利尿作用，因此临床上用于治疗尿崩症和肺咯血。
第四节 蛋白质的分子结构
蛋白质是生物体中功能最多样化的生物大分子。它们在功能上的多样化决定于构象上的多样化。蛋白质的基本结构是由氨基酸残基构成的多肽链，再由一条或一条以上的多肽链按一定的方式组合成具有特定结构的生物活性分子。随着肽链数目、氨基酸的组成及其排列顺序不同就形成了不同的蛋白质。
根据对不同种类、不同形状、不同功能的蛋白质三维结构的研究，已确认蛋白质的结构有不同的层次，人们为了认识的方便通常将其分为一级结构、二级结构、超二级结构、结构域、三级结构及四级结构。
一、蛋白质的一级结构
1．一级结构的含义及重要性
1969年，国际纯化学和应用化学协会经过讨论，规定一级结构只指肽链中的氨基酸的排列顺序，其他内容属于一般的化学结构。这种规定对于讨论“一级结构决定高级结构”这一命题是有意义的。
1953年，Sanger等人经过将近10年的努力，首次完成了牛胰岛素的氨基酸顺序的测定，目前一级结构已经测定的蛋白质数量日益增多，主要的有胰岛素、细胞色素c、血红蛋白、肌红蛋白、烟草花叶病毒蛋白、牛胰核糖核酸酶及溶菌酶等。
胰岛素是一级结构首先被揭示的蛋白质，是动物胰岛细胞分泌的一种激素蛋白。胰岛素分子由51个氨基酸残基组成，相对分子质量为5734，它由两条肽链组成，一条称为A链，是21肽；另一条称为B链，是30肽。A链和B链由两对二硫键连接起来。在A链内还有一个由二硫键形成的链内小环(图3-4)。
图3-4 牛胰岛素的化学结构
Pr一级结构研究的内容：多肽链的数目、排列顺序、链内或链间二硫键的形成。
测定一级结构的意 义在于：（1） 不仅使人工合成有生物活性的蛋白质和多肽成为可能，而且对于揭示一级结构与生物功能间的关系也有着特别重要的意义。我国生化工作者根据胰岛素的氨基酸顺序于1965年用人工方法合成了具有生物活性的牛胰岛素，第一次成功地完成了蛋白质的全合成，为生物化学的发展作出了重大贡献。此外，（2） 人们可以从比较生物化学（Comparative biochemistry）的角度分析比较功能相同、而种属来源不同的蛋白质的一级结构差异，为生物进化提供生物化学依据；（3）也可以分析比较同种蛋白质的个体差异，为遗传疾病的诊治提供可靠依据。镰刀形红细胞分贫血病在非洲人中比较常见患者的红细胞合成了一种不正常的血红蛋白（HbS），正常人的血红蛋白（HbA），研究发现差别在于AA顺序上，即HbA：β-链N-端第6位AA为Glu；
HbS：β-链N-端第6位AA为Val；
因为Glu在生理PH下为带负电荷的极性R基团AA，Val在生理PH下为非极性R基团AA，就使得分子表面的减少，影响分子的正常聚集，致使体积下降，溶解度降低，血球随之收缩为镰刀形，以致输氧能力下降，细胞变得脆弱发生溶血。
2,测定一级结构的基本原理和方法
人们已知的数百种多肽和蛋白质顺序的测定，大都是采用F,Sanger实验室所确立的方法。基本上包括从多肽链的某一自由末端起依次将氨基酸残基切下并逐个进行鉴定。但是，在特定的分解反应中，要使所需产物的产率达到100％实际上是很困难的。这样就会给长肽链顺序的测定带来一些问题。因为当末端残基逐步分解时，每切下一个残基都会产生相应短的肽链产物，而每一步产物的量在反应体系内所占的比例将依次减小；相反，从最短肽链上切下的氨基酸与前几步尚未反应的较长肽链上所切下的氨基酸相混的机会不断增多。这是一个根本性的化学限制因素。正是这个因素决定了氨基酸顺序测定的战略，也就是说，应该先把多肽链降解成足够短的顺序以便使化学反应能够产生可靠的结果，然后再把这些结果组合成整条多肽链的顺序。在蛋白质顺序测定中实际所采用的步骤是：
（1）将待测蛋白质进行纯化
（2）拆开所有二硫键 若多肽链之间或多肽链内部存在二硫键，在测定肽链的氨基酸顺序之前必须把二硫键拆开，以获得伸展的肽链，这样才能进行氨基酸顺序的测定。最常用的方法是还原法和氧化法。还原法是用过量的巯基乙醇(mercaptoethanol) 或二硫苏糖醇（dithiothr eitol,简称DTT）等巯基化合物使二硫键拆开被还原为半胱氨酸残基的巯基（——SH）。为防止巯基被氧化需要对巯基加以保护，常用的保护剂是碘乙酸。氧化法常用过甲酸（CHOOOH）作为氧化剂使二硫键氧化成半胱氨磺酸。
S S
A链
S S
胰岛素
S S
B链
β-巯基乙醇
SH SH
A链
SH SH
SH SH
B链
碘乙酸
SCH2COOH SCH2COOH
A链
SCH2COOH SCH2COOH
SCH2COOH SCH2COOH
B链
（3）测定氨基末端和羧基末端的氨基酸 要识别氨基末端的氨基酸可以通过二硝基氟苯(DNFB)与之反应，然后经过酸水解,FDNB标记的氨基末端氨基酸即被释放出来，它具有较深的颜色，可根据它在薄层层析或纸电泳中的迁移特性进行鉴定。
羧基末端氨基酸的化学测定法至今还不能令人满意。该法是将肽链用无水肼在100℃条件下进行处理，由于其他所有的氨基酸残基都变成相应的氨基肼化合物，只有羧基末端氨基酸仍以游离氨基酸形式存在，因此可用层析法分离鉴定，或者可以将肽链用羧肽酶进行限制性酶解。由于反应产物中的游离氨基酸主要是羧基末端氨基酸，因而可用层析法鉴定其类型。
（4）至少要用两种不同的方法将多肽链专一性地裂解成小肽段 要完成这一步骤可用肽链内切酶，它能催化多肽链在特定的位点上发生分解。图3-5所列举的四种专一性的酶通常用于这一步骤。与溴化氢进行反应是一种特有的化学方法，它能使多肽链在甲硫氨酸残基处专一性地发生裂解，并且同时将羧基末端的甲硫氨酸转变成高丝氨酸内酯。尽管由甲硫氨酸转变而来的这一反应产物与20种天然氨基酸有所不同，但是通过它进一步转变成高丝氨酸还是容易鉴定的。
胰蛋白酶 R1＝Lys或 Arg侧链(专一要求，水解速度快)；
R2＝Pro(抑制水解)
糜蛋白酶 R1＝Phe、Trp或 Tyr(水解速度快)； Leu,Met或 His (水解速度次之)
R2＝Pro(抑制水解)
嗜热菌蛋白酶 R1＝Leu,Ile,Phe,Trp,Val,Tyr或 Met(疏水性强的残基，水解速度快)
R2＝Gly或 Pro(不水解)
R1或 R3＝Pro(抑制水解)
胃蛋白酶 R 1和 R2＝Phe,Leu,Trp,Tyr以及其他疏水性残基(水解速度快)
R1＝Pro(不水解)
图3-5 几种蛋白水解酶(内肽酶)的专一性
（5）小肽段的分离及氨基酸顺序测定 由完整的蛋白质多肽链裂解而成的肽段的分离通常采用离子交换层析法。肽段经过分离以后可用不同的方法进行分析，既可以测定它们的氨基酸组成，也可以测定它们的氨基酸顺序。用前面介绍的苯异硫氰酸法可以测定分离后的肽段的氨基酸顺序，这种方法又叫Edman降解法，它是将多肽链上的氨基酸从氨基末端逐个切下，以乙内酰苯硫脲的衍生物形式释放出来，而这些衍生物可以根据它们的薄层层析性质进行测定。
测定肽段的氨基酸顺序还可以使用顺序分析仪，它是将Edman降解法自动化。测定速度有很大提高，也比人工测定精确。
（6）用片段重叠法确定整个肽链的氨基酸顺序 在各个肽段的顺序确定下来以后，接着就要弄清这些肽段在完整的蛋白质中是怎样衔接的。在这一步中，必须对用两种不同的专一性分解方法得来的肽段进行顺序分析。只有这样，才足以确定蛋白质的完整顺序。因为两套顺序中含有交叠顺序，就是说，在用第一种专一性分解方法所产生的肽段中，那些具有游离氨基或游离羧基的残基原先在完整的蛋白质肽链内是连接着的，这些残基在用第二种专一性分解方法所产生的肽段中将重新出现在顺序的内部。
蛋白质一级结构的顺序测定完成后，将未拆开二硫键的同一种蛋白质再一次进行专一性的酶解，由此就可以确定完整的蛋白质中二硫键的位置。
二、蛋白质的空间构象和维持构象的作用力
我们已经认识到不同的蛋白质有不同的氨基酸组成和不同的氨基酸排列顺序。但是，这不是蛋白质之间区别的全部。事实上，通过对蛋白质结构的研究，发现每种蛋白质都能在它特定的一级结构基础上选择它特定的空间构象去完成它特定的生物功能。为了运送氧，血红蛋白的肽链必须按照它所选择的方式折叠；核糖核酸酶必须达到它一定的构象才能同核糖核酸结合并降解它。蛋白质的空间构象就是指蛋白质分子中的原子或基团在三维空间的排列、分布及肽链的走向。
1．构型与构象的概念构象和构型是两个容易混淆的概念。 一个分子内的原子间的关系在化学家的手中表达成平面式，例如某种氨基酸，我们通常写成平面结构式,
但这仅仅是为了表达和交流的方便。分子内原子间的关系是立体的。构象和构型就是从不同的角度来表述这种立体的关系。构型(configuration)是指不对称碳原子所连接的四个不同的原子或基团在空间中的两种不同的排列（图3-6）。而构象( conformation)是指一个由几个碳原子组成的分子，因一些单键的旋转而形成的不同碳原子上各取代基团或原子的空间排列。构型的改变必然会引起共价键的破坏，并形成一些新键（如氨基酸由D型变成L型）。构象的改变并不需要共价键的断裂，只需要单键的旋转就可以产生新的构象。
多肽链的共价主链形式上都是单键。因此，可以设想一个多肽主链将可能有无限多种构象，并且由于热运动，任何一种特定的多肽构象还将发生不断变化。然而目前已知一个蛋白质的多肽链在维持生物体正常运转的温度和pH值条件下，只有一种或很少几种构象。这种天然构象保证了它的生物活性，并且相当稳定，甚至蛋白质被分离出来以后，仍然保持着天然状态。这一事实说明了天然蛋白质主链上的单链并不能自由旋转。
图3-6 立体异构体的构型
（这种异构体没有共价键的破裂不能互变）
2．蛋白质构象的作用力现已知道，维持和稳定蛋白质分子构象的作用力有氢键、疏水作用力、范德华力、离子键和二硫键(图3-7)。
图3-7 维持蛋白质三级结构的各种作用力
① 离子键；② 氢键； ③ 疏水作用； ④ 范德华力； ⑤ 二硫键
(1) 氢键 由电负性较强的原子与氢形成的基团如N－H和O－H具有很大偶极距，成键电子云分布偏向电负性大的原子核，因此氢原子核周围的电子分布就少，正电荷的氢核（质子）就在外侧裸露。这一正电荷氢核遇到另一个电负性强的原子时，就产生静电吸引，即所谓的氢键（hydrogen bond）。
x — H … y
这里x、y是电负性强的原子（N、O、S等），x—H是共价键。H…y是氢键 。x是氢（质子）的供体，y是氢（质子）的受体。氢键具有两个重要特征，一个是方向性，相互吸引的方向沿氢受体y的孤电子对轨道轴，受体y与供体x之间的角度接近180o；另一个是饱和性，表现在一般情况下x—H只能和一个y原子相结合。饱和性是由于H原子较小，而供体和受体的原子都相当大，这样它们将排斥另一个受体原子再与氢结合。
氢键在维持蛋白质的结构中起着极其重要的作用。多肽链主链上的羰基氧和酰胺氢之间形成的氢键是维持蛋白质二级结构的主要作用力。除此之外，氢键还可以在侧链与侧链、侧链与介质水、主链肽基与侧链或主链肽基与水之间形成。大多数蛋白质所采取的折叠策略是使主链肽基之间形成最大数目的分子内氢键（如α-螺旋，β-折叠），与此同时保持大部分能成氢键的侧链处于蛋白质分子的表面而与水相互作用。
(2) 疏水作用力 疏水作用力(hydrophobic iteraction)是指非极性基团即疏水基团为了避开水相而群集在一起的集合力。水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子内部，这种现象就是疏水作用或疏水效应。也曾称为疏水键。它在维持蛋白质的三级结构方面占有突出的地位。疏水作用其实并不是疏水基团之间有什么吸引力的缘故，而是疏水基团或疏水侧链出自避开水的需要而被迫接近。当然，当疏水基团接近到等于范德华间距时，相互间将有弱的范德华引力。
疏水作用在室温范围内随温度的升高而增加。超过最高温度(40～60℃，因侧链不同而异)后复又减弱。
(3) 范德华力 在物质的聚集状态中，分子与分子之间存在着一种较弱的作用力。早在1873年范德华就已注意到这种力的存在，并考虑这种力的影响和分子本身占有体积的事实，提出了著名的范德华状态方程。以后，人们把中性分子或中性原子之间的作用力称为范德华力。
范德华力包括两种类型的相互作用：一种是吸引作用；另一种是排斥作用。前者称为范德华引力；后者称为范德华斥力。一般认为，范德华引力有三种表现形式：① 极性基团之间偶极与偶极的相互吸引(取向力)；② 极性基团的偶极与非极性基团的诱导偶极之间的相互吸引(诱导力)；③ 非极性基团瞬时偶极之间的相互吸引(色散力)。其共同的特点是：引力随作用基团之间距离的增大而迅速减小，但两个作用基团只相互吸引，并不相碰。因为当它们靠得很近时，电子云之间会发生排斥，从而产生范德华斥力。因此上述两个基团之间的作用距离是由范德华引力和范德华斥力的平衡来决定的。这种距离称为范德华间距。两个共价键键合的原子之间的范德华间距等于它们各自的范德华半径之和。
迄今所测得的蛋白质构象都显示出蛋白质分子内的基团是紧密堆积的。这表明，在蛋白质分子内无疑存在着范德华力，它对维持和稳定蛋白质的三、四级结构具有一定贡献。
(4) 离子键 离子键又称盐键、盐桥或静电作用力。它是由带相反电荷的两个基团间的静电吸引所形成的。
在蛋白质分子中，通常有带正电荷的基团和带负电荷的基团。其中，带正电荷的基团有：N—末端的α-NH3＋，肽链中赖氨酸残基的ε-NH3＋等；带负电荷的基团有：C—末端的α-COO-，肽链中天门冬氨酸残基的β-COO-，谷氨酸残基的γ-COO-。在蛋白质空间结构与环境都适宜的情况下，正负电荷基团中有一部分是相互接近而形成离子键的。
高浓度的盐、过高或过低的 pH值可以破坏蛋白质构象中的离子键。如果溶液中的pH值比羧基的 pK值低 l~2个 pH单位，或者比氨基的pK值高l~2个 pH值单位，由于上述基团的解离状态或带电状态发生改变，因而它们之间就不能形成离子键。这也是强酸强碱之所以能使蛋白质变性的主要原因。
（5）二硫键 二硫键(disulfide bond)又称为二硫桥或硫硫桥，是两个硫原子之间所形成的共价键。它可以把不同的肽链或同一条肽链的不同部分连接起来，对维持和稳定蛋白质的构象具有重要作用。
二硫键并不指令多肽链的折叠，假如蛋白质中所有二硫键相继被还原，将引起蛋白质的天然构象改变和生物活性丧失。在许多情况下，二硫键可以选择性地被还原，这些实验证明，某些二硫键是生物活性所必需的，另一些二硫键则不是生物活性所必需的，但与维持蛋白质的稳定有关。在绝大多数情况下，二硫键是在多肽链的β-转角附近形成的。
3．立体化学原理
在本章第三节中介绍过，肽平面是一个刚性平面，肽平面内的C＝O与N—Ｈ键呈反式排列，各原子间的键长和键角都是固定的。肽链主链上只有α- 碳原子连接的两个键，如Cα—N1键和Cα—C2键是单键，能自由旋转。绕Cα—N 1键旋转的角度称为Φ角，绕Cα—C 2键旋转的角度称为Ψ角（如图3-3）。原则上Φ和Ψ可以取－180o和+180o之间的任一值，这样多肽链的所有可能构象都能用Φ和Ψ这两个构象角称（为二面角）来描述。当Φ的旋转键N1—Cα两侧的N1—C1和Cα—C2呈顺式时，规定Φ＝0o；同样，Ψ的旋转键Cα—C2两侧的Cα— N1和C 2—N2呈顺式时，规定Ψ＝Oo(图3-8)。从Cα向N1看(见图3-3)，沿顺时针方向旋转 Cα—N1键所形成的Φ角规定为正值，逆时针旋转为负值；从Cα向C2看，沿顺时针旋转Cα—C2键所形成的Ψ角规定为正值，逆时针旋转为负值。
图3-8 相当于Φ＝0o，Ψ＝0o时的构象
由于相邻平面的H原子和O原子之间的空间重叠，
此构象实际上不允许存在。Φ和Ψ同时旋转180o，
则转变为完全伸展的肽链构象（见图3-3）
若把肽链上的原子看作具有特定范德华半径的坚硬球体并制成模型进行模拟试验，人们很快会发现Φ与Ψ角的许多组合不可能存在，因为主链上的原子之间或主链上的原子与
侧链R基团之间会发生空间相撞。例如，图3-9所示的Φ＝0°，Ψ＝0°的构象显然是不可能存在的，若对Φ、Ψ角的所有可能的组合进行观察，则会发现，由于各种各样不利的空间效应，真正能够存在的构象为数有限。在Ramachandran图（简称拉氏图或拉氏构象图），即图3-9上已经表示出构象所允许的Φ、Ψ区域，其中实线封闭的区域是一般允许区，这个区域内的任何二面角所规定的肽链构象都是立体化学所允许的；而虚线封闭的区域是最大允许区(临界限制区)，这个区域内的任何二面角所规定的肽链构象虽是立体化学可以允许的，但不够稳定。该图清楚地表明了允许区域是怎样受到多肽主链和侧链基团的空间效应的限制。不过这里所假设的原子基团是具有特定范德华半径的刚性球体。事实上，分子中的原子并不是刚性球体，所以蛋白质中真正的两面角的大小范围比图中所定的还要大一些。
图3-9 Ramachandran构象图
C＝胶原螺旋；β＝反平行式β－折叠；βP＝平行式β－折叠；
αR和αL ＝右手和左手α－螺旋； 310＝310－螺旋；π＝4．4 16－螺旋。
拉氏图表示的是某些蛋白质Φ，Ψ构象测定值的分布情况。这些蛋白质的三维结构是根据结晶学得知的，它们中的大多数处在空间效应允许的范围内。甘氨酸残基通常例外，其他氨基酸因空间阻碍而不能呈现的构象对甘氨酸来说都是可以的。因为甘氨酸中的R基团是氢原子，与其他氨基酸中同Cα相连的CH2 或CH3基团比较起来小得多。这就消除了主链上的原子与 R基团之间的许多空间效应。当R基团不是氢原子时，氨基酸的构象有可能会受到限制。
总之，我们可以理解，立体化学所允许的构象被限制的如此严格，原因就在于肽链的基本几何特征使肽链上各种原子基团之间产生了不同的空间效应。
三、蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构主要是指蛋白质多肽链中有规则重复的构象。二级结构的基本类型有α-螺旋,β-折叠、β-转角和无规卷曲。它们广泛存在于天然蛋白质内。但各种类型的二级结构并不是均匀地分布在蛋白质中。某些蛋白质，如血红蛋白和肌红蛋白含有大量的α-螺旋，而另一些蛋白质如铁氧还蛋白（ferrredoxin）则不含任何的(-螺旋。不同蛋白质中β-折叠的含量和β-转角的数目也有很大的变化。
1．α-螺旋
α-螺旋(α-he1ix)是蛋白质中最常见、含量最丰富的二级结构。（1） α-螺旋中每个残基(Cα)成对二面角Φ和Ψ各自取同一数值，Φ＝－57o，Ψ＝－48o 即形成具有周期性规则的构象。（2） 多肽链主链环绕中心轴螺旋式的上升，每隔3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈，沿螺旋轴方向上升0.54nm，每个残基绕轴旋转100 o，沿轴上升0.15nm(图3-10)。（3）α-螺旋中氨基酸残基的侧链（R）伸向外侧。（4） 相邻的螺圈之间形成链内氢键，氢键的取向几乎与中心轴平行 。氢键是由肽键上的 N—H中的氢和它后面(N端)第四个残基上的中的氧之间形成的,
n=3
N端 C端这里,n＝3表示氢键封闭的环共包含13个原子(3×3+4)。常用3.613螺旋(n＝3)代表α-螺旋，其中3.6指每圈螺旋含3.6个残基，3.6的右下角的13表示氢键封闭的环内含13个原子。
蛋白质中α-螺旋有左手螺旋和右手螺旋两种，（5）迄今研究过的所有天然蛋白质的α-螺旋绝大多数都是右手螺旋，原因是右手螺旋比左手螺旋稳定。左手α-螺旋虽然很稀少，但也会偶然出现。例如，在嗜热菌蛋白酶中就有很短一段左手α-螺旋，由Asp—Asn—Gly—Gly(226～229)组成。蛋白质多肽链能否形成α-螺旋结构以及形成的螺旋体是否稳定决定于它们的氨基酸组成和排列顺序，如多肽链中有脯氨酸时，α-螺旋就被中断，并产生一个“结节”。这是因为脯氨酸的α-亚氨基上的氢原子参与肽键的形成后，再没有多余的氢原子形成氢键，所以多肽链顺序上有脯氨酸残基时，肽链就拐弯。不再形成α-螺旋。
2．β-折叠(β-pleated sheet )
蛋白质中另一类常见的二级结构是β-折叠(图3-11)。两条或多条几乎完全伸展的肽链并排在一起便形成β-折叠，这时相邻肽链主链上的－NH和C=O之间形成有规则的氢键。
反平行式β-折叠 平行式β-折叠图3-11 β-折叠的平行式和反平行式
由于主链上各个肽单位所包含的NH基和羰基处于反式位置，所以只要把其余的肽键加到折叠片上就能使β-折叠延伸为多股结构。β-折叠可以有两种不同的排列方式。一种是平行式（parallel），肽链的排列方向（N→C）是一顺的，即所有肽链的N末端都在同一方向；另一种反平行式（antiparallel），肽链的极性一顺一倒，N末端间隔同向，如图3-12所示，无论是平行β-折叠还是反平行β-折叠，构成这两种折叠的肽链的构象特点是R基团在折叠片两侧的指向正反交错，而且肽平面基本上都在某一片层的平面上，以保证肽链与肽链之间形成较强的氢键。反平行式β-折叠在纤维轴上的重复周期为0.7nm，而平行式β-折叠是0.65nm，因此平行式的折叠程度略大于反平行式的。
图3-12 β-折叠构象（反平行式）
β-折叠的特点：
(1)是一种肽链相当伸展的结构,肽链中的肽键平面之间折叠成锯齿状
(2) 相邻肽键之间形成氢键维持其稳定性
(3) 两条或多条几乎完全伸展的肽链并排在一起，肽链的走向有正、反两种
(4) R侧链交替分布在片层两侧
3．β-转角
β-转角（β-turn）也称为回折（reverse turn ）、β-弯曲（β-bend ）或发夹结构（hairpin structure ），肽链主链出现1800的回折，这种回折称为β-转角。它是球状蛋白质中发现的又一种二级结构。它有三种类型，每种类型都有4个氨基酸残基（图3-13）。在所有这三种类型的β-转角中，弯曲处的第一个残基的C＝O和第四个残基的NH之间形成一个4→1氢键，产生一种不很稳定的环形结构。类型Ⅰ和类型Ⅱ的关系在于中心肽单位旋转了180o。类型Ⅱ中C３几乎无例外地是甘氨酸残基，否则由于空间位阻，不能形成氢键。类型Ⅲ是在第一个和第三个残基之间形成的一小段3１０-螺旋。类型Ⅰ和类型Ⅲ几乎没有区别，因为它们的C１α的构象是相同的，并且C２α 的构象也相差很小。目前发现的β-转角多数都处在球状蛋白质分子表面，在这里改变多肽链的方向阻力
图3-13 β-转角的三种类型比较小。经考查，β-转角在球状蛋白质中含量是十分丰富的，约占全部残基的1/4。β-转角的构象是由第二残基（C２α）和第三残基（C３α）的二面角（Φ２，Ψ２ ； Φ３,Ψ３）所规定的。类型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的特征二面角见表3-9。
表3-9 类型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的特征二面角类 型
Φ２
Ψ２
Φ３
Ψ３
I
－60°
－30°
－90°
0°
II
－60°
＋120°
＋80°
0°
III
－60°
－30°
－60°
－30°
4．无规则卷曲(nonregular coil)
多肽链主链骨架上的若干肽段在空间的排布有些是有规则的，如能形成α-螺旋、β-折叠、β-转角的构象，而有些却没有规则。这些肽段在空间的不规则排布称为无规则卷曲。无规则卷曲，有人又称之为无规则构象、无规线团、自由折叠或回转。在一般球蛋白分子中，往往含有大量的无规则卷曲，它使蛋白质肽链从整体上形成球状构象。
综上所述，我们可以看出，蛋白质的二级结构通常是指蛋白质多肽链主链在空间中的走向，一般形成有规律的构象，并以氢键来维持主链构象的稳定。这级水平的构象不涉及氨基酸残基的侧链基团在空间的排列。
四、超二级结构和结构域
随着对蛋白质空间结构研究的深入，在二级结构和三级结构之间还可以进一步细分为超二级结构和结构域。
超二级结构（super-secondary structure）
在蛋白质中，特别是球蛋白中，蛋白质不只是有二级结构，经常可以看到由若干相邻的二级结构单元(即α-螺旋、β-折叠片和β-转角等)组合在一起，彼此相互作用，形成有规则、在空间上能辨认的二级结构组合体，充当三级结构的构件称为超二级结构。
已知的超二级结构有三种基本组合形式，即α- 螺旋的组合(αα)，β-折叠组合(βββ)，α-螺旋和β-折叠的组合(βαβ)。
（1）αα 结构 这是一种由两股或三股右手α- 螺旋彼此缠绕而成的左手超螺旋(superhelix)(图3-14a)，重复距离约为14nm。由于超卷曲，螺旋的主链的Φ和Ψ角与正常的α-螺旋略有偏差，每圈螺旋为3.5个残基，而不是通常的3.6个残基。沿轴的重复距离由0.54nm缩短到0.51nm。螺旋之间可能作用的侧链是非极性侧链，它向着超螺旋内部，躲开与水接触；其他的是极性侧链，处于蛋白质分子的表面，与水接触。单个的α-螺旋每隔7个残基重复一次。疏水侧链处于螺旋一侧，位于重复单位的第三到第四个残基。螺旋链之间非极性侧链互相装配紧密，超螺旋的稳定性主要是非极性侧链间的范德华力相互作用的结果。
(2) βαβ结构 最简单的βαβ组合是由二段平行式的β-链和一段连接链组成的，此超二级结构称为βXβ单位(图3-14b)。连接链或是α-螺旋或是无规则卷曲，它大体上反平行于β-链。最常见的βαβ组合是由三段平行式的β-链和二段α-螺旋链构成(图3-14c)，此超二级结构称为Rossmann-折叠（Rossmann-fold ）。几乎在所有的实例（已知有一个例外）中连接链都是以右手交叉连接方式处于β-折叠片的一侧。这是一种拓扑现象，它是由于β-链倾向于右手扭转（twisting）而产生的。
(3) βββ结构 β-曲折是另一种常见的超二级结构，由在一级结构上连续、在β-折叠中相邻的三条反平行式β-链通过紧凑的β-转角连接而成(图3-14d)。
回形拓扑结构（“Greek Key”topology）也是反平行式β-折叠片中常出现的一种超二级结构(图3-14e)。这种结构直接用希腊陶瓷花瓶上的一种常见的图案命名，称为拓扑结构。这种拓扑结构有两种可能的回旋方向，但实际上只存在其中的一种。这种选择的基础尚未确定。
2．结构域结构域(structural domain)或称为辖区，是多肽链在超二级结构的基础上组装而成的。多肽链首先是在某些区域相邻的氨基酸残基形成有规则的二级结构，然后主要又是相邻的二级结构片段集装在一起形成超二级结构。超二级结构以特定的组合方式连接，在一个较大的蛋白质分子中形成两个或多个在空间上可以明显区分的折叠实体，这种实体称为结构域。最常见的结构域含100～200个氨基酸残基，少至40个左右，多至400个以上。结构域是蛋白质三级结构的组件单位，多肽链的折叠最后一步是结构域的缔合。对于那些较小的蛋白质分子或亚基来说，结构域和三级结构往往是一个意思，也就是说这些蛋白质是单结构域的。
从结构形成的角度看，一条长的多肽链先分别折叠成几个相对独立的区域再缔合成三级结构（图3-15），要比整条多肽链直接折叠成三级结构更为合理。从功能角度看，很多多结构域酶的活性中心都位于结构域之间，通过结构域容易构造具有特定三维排布的活性中心。由于结构域之间常常只有一段肽链相连，形成所谓“铰链区”(hinge negion)，使结构域容易发生相对运动，但这种柔性的铰链不可能在亚基之间存在，因为它们之间没有共价键连接，如作较大的运动，亚基将完全分开。结构域之间的这种柔性(fiexibility )将有利于活性中心结合底物和施加应力，有利于别构中心结合调节物和发生别构效应。
图3-15 卵溶菌酶（egg lysozyme）的三级结构结构域是多肽链在超二级结构的基础上组装而成的，组装的基本方式有限。多肽链的手性对蛋白质结构的组织产生很大影响。精细构象能的计算表明，最稳定的β-链构象具有轻度右手扭转倾向。β-链的这种右手扭转倾向实际上给所有已知的蛋白质带来两个不同但又有联系的结构效果。这些效果对蛋白质结构的组织十分重要，因为扭转的β-链常是构成蛋白质结构的骨架。一个效果反应在球状蛋白质中平行β-折叠片的β-链间的交叉连接都是右手的，这一点曾在超二级结构βαβ组合中看到 ；另一个效果反映在对球状蛋白质中平行β-折叠片的几何形状的影响。球状蛋白质中大的平行β-折叠片是由多个βαβ超二级结构组装而成的，组装后β-折叠片的形状取决于相邻β-链间氢键的排列式样。有的形成β-圆桶（β-barrel）或称圆柱（cylinder），如丙糖磷酸异构酶(triose phosphate isomerase )和丙酮酸激酶结构域I（Pyruvafie Kinase domain I ）的结构所示（图3-16a），它们的中心部分是平行的β-链组成的内桶，周围由α-螺旋组成外桶，内外桶紧挨在一起，中心空间只能容纳折叠片的疏水侧链。有的形成马鞍形（saddle shape ），如乳酸脱氢酶结构域I（lactatedehydrogenase doamin I ）黄素氧还蛋白（flavodoxin）的结构（如图3-16b）。这里马鞍形平行β-折叠片的两侧各有一层α- 螺旋和环（loop ）。
球状蛋白质中一个稳定的α-螺旋组装方式是4-α-螺旋索（4-α-helicalbandle） 。在此排布四个约等长的α-螺旋依次与其最近邻的螺旋相连，螺旋索的横截面大体呈方形，如蚯蚓血红蛋白(hemerythrin)的结构(如图3-17)。上面介绍了结构域的一些组织式样。有时，一种蛋白质中的结构域彼此十分不同，如木瓜蛋白酶(papain)中的两个结构域。但在有些蛋白质中结构域彼此极其相似，如硫氰酸酶(rhodanase)。两个相似的结构域经常是二重对称
磷酸丙糖异构酶（侧面） 磷酸丙糖异构酶（顶面） 丙酮酸激酶结构域1
a
乳酸脱氢酶结构域1（侧面） 乳酸脱氢酶结构域1（顶面） 磷酸甘油酸激酶结构域2
b
轴的关系。一个亚基中两个结构域之间的紧密程度不一，有的两个结构域各自独立成球状实体，中间仅由一段柔性的肽链连接；有的相互间接触面宽而紧密，整个亚基的外表是一个平整的球面。此外还有一些中间类型也是常见的，如磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase)的整个亚基伸长，结构域之间有一裂沟。
五、蛋白质的三级结构
1．蛋白质三级结构的概念及特点蛋白质分子的三级结构是指一条多肽链在二级结构(包括超二级结构和结构域)的基础上进一步盘曲或折叠，形成包括主、侧链在内的专一性空间排布。对于单链蛋白质，三级结构就是分子本身的特征性主体结构；对于多链蛋白质，三级结构则是各组成链(亚基)的主链和侧链的空间排布。生物体重要的生命活动都与蛋白质的三级结构直接相关并且对三级结构有严格要求。 所以三级结构是蛋白质构象中一个至关重要的等级式层次，从整体观念看，它实际包含着除亚基缔合以外的蛋白质分子结构的全部内容。据不完全统计，到目前为止已经确定的蛋白质结构大约有200种，从中看到可供选择的空间排布是多种多样的，因为蛋白质每一个不同的顺序总是与一种独特的三级结构相关联的。然而，经仔细比较发现许多蛋白质的三级结构具有某些相似之处，其基本特征是,
（1）在蛋白质分子中，一条多肽链往往是通过一部分α- 螺旋、一部分β-折叠、一部分β-转角和一部分无规则卷曲形成紧密的球状构象。
在两条链之间或一条肽链的不同肽段之间，有时存在着平行β-折叠或反平行β-折叠。β-折叠的含量因蛋白质的不同而异。
在180°的肽链转折处往往有α-转角。
在螺旋与螺旋之间、β-折叠与β-折叠之间或者螺旋与β-折叠之间往往是无规则卷曲。
（2）在蛋白质分子中，大多数非极性侧链总是埋在分子的内部形成疏水核；而大多数极性侧链总是暴露在分子的表面，形成亲水区。极性基团的种类、数目与排布决定了蛋白质的功能。
有不少较大的蛋白质分子含有几个区域即结构域，它们都是紧密的球状构象。结构域的划分往往是与功能相联系的。
（3）在蛋白质分子的表面，往往有一个内陷的空穴（裂隙、凹槽、袋）。此空穴往往是疏水区，能够容纳一个或两个小分子配体或大分子配体的一部分。对酶分子的活性来说，此空穴正好容纳一个或两个小分子底物，或大分子底物的一部分，此即酶分子的活性部位。对肌红蛋白、血红蛋白、细胞色素c来说，此空穴正好容纳一个血红素分子。
（4）主要靠疏水键、氢键、盐键等维持其稳定性。
2．肌红蛋白的三级结构与功能
肌红蛋白(myoglobin)是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质。在潜水哺乳类如鲸、海豹和海豚的肌肉中肌红蛋白含量特别丰富，以致使它们的肌肉呈棕色。由于肌红蛋白储氧使这些动物能长时间潜在水下。 肌红蛋白在功能和结构上和血红蛋白极为相近。它由一条多肽链构成，有153个氨基酸残基及一个血红素（heme）辅基，相对分子质量为17 800。1963年Kendrew及其同事由鲸肌红蛋白的 X射线衍射图案测定了它的空间结构(图3-18)。肌红蛋白整个分子是按照复杂而不对称的方式盘绕成一个圆中空的结构。肌红蛋白的特点是整个分子中肽链有77％呈α-螺旋体构象。有8段长度为7～24个氨基酸残基的α-螺旋体。在拐角处，α-螺旋体受到破坏，在这些拐角都有一段l～8个氨基酸残基的松散肽链，在 C—末端也有一段5个氨基酸残基的松散肽链。肌红蛋白中四个脯氨酸残基各自处在一个拐弯处，一些难成α-螺旋体的氨基酸，如异亮氨酸、丝氨酸等，也在此处出现。肌红蛋白整个分子显得十分致密结实，分子内部只有一个适于包含4个水分子的空间。具有极性基团侧链的氨基酸残基几乎全部分布在分子的表面，这些氨基酸残基侧链上的极性基团正可以与水分子结合，而使肌红蛋白成为可溶性，而非极性的残基则被埋在分子内部，不与水接触。血红素辅基垂直地伸出分子表面，并通过组氨酸残基与肌红蛋白分子内部相连。在吡咯中央的Fe原子的配体中，四个是平面卟啉分子的N，组氨酸残基的咪唑基是它的第五个配位体，第六个配体处于“开放”状态，用作O２结合部位。
图3-18 抹香鲸肌红蛋白的三级结构
(根据0.2nm分辨率的资料分析所得的结构)
六、蛋白质的四级结构
1．有关四级结构的一些概念许多生物活性蛋白质是由两条或多条肽链构成，肽链与肽链之间并不是通过共价键相连，而是由非共价键缔合在一起。每条多肽链都有自已的一级、二级和三级结构。在这种蛋白质中，每条肽链就被称为亚基或亚单位（subunit）。亚基一般只是一条多肽链，但有的亚基由二条或多条多肽链组成，这些多肽链相互间以二硫键相连。蛋白质分子的亚基数目一般为偶数，其中含2个或4个亚基的蛋白质占多数，奇数亚基构成的蛋白质就目前所知，只不过10多种。由二个亚基组成的称为二（聚）体蛋白质，由四个亚基组成的称为四（聚）体蛋白质，由二个或多个亚基组成的蛋白质统称寡聚蛋白质或多体蛋白质（multimericprotein ）。所谓蛋白质的四级结构就是指各个亚基在寡聚蛋白质的天然构象中的几何位置和它们之间的相互关系。在四级结构中，亚基可以是相同的或不同的，由相同亚基构成的四级结构叫均一四级结构，由不同亚基构成的四级结构叫非均一四级结构。无四级结构的蛋白质称为单体蛋白质。单独的一个亚基无生物活性，只有当各亚基有机结合在一起，才能发挥正常的生物活性在生物分子缔合的研究中，亚基、原体（profomer)的概念尚无严格定义，它们都是一词多义，有时它们等同，有时它们各异。一般认为，具有四级结构的蛋白质中每个球状蛋白质称为亚基。亚基在蛋白质分子中的空间排布问题是四级结构研究的重要内容，根据X射线结构分析和电子显微镜的观察，多数寡聚蛋白质分子亚基的排列是对称的，对称性是四级结构蛋白质分子最重要的性质之一。对称的寡蛋白质分子是由二个或多个不对称的等同结构成分组成的。这种等同结构成分被称为原体，原体一般就是亚基，但是原体可以是二个或多个亚基的聚集体。例如，血红蛋白分子是由二个原体组成的对称二体，其中每个原体是由α- 亚基（一条α珠蛋白链）和β-亚基（一条β珠蛋白链〕所构成的聚集体（αβ）。这里把原体看作单体，所以称血红蛋白为二体。如果以亚基为单体，血红蛋白则为四体。
2．血红蛋白的结构血红蛋白是一种寡聚蛋白质，由四个亚基组成。根据X射线晶体结构分析揭示，血红蛋白分子接近于一个球体，直径5.5nm，相对分子质量为65 000 。它由两条α-链和两条β-链组成，是一个含有两种不同亚基的四聚体。每一个亚基含有一个血红素辅基。α-链由141个氨基酸组成，β-链由146个氨基酸组成，各自都有一定的排列次序。α-链和β- 链的一级结构差别较大，但它们的三级结构大致相同，并和肌红蛋白极相似，如β-链的主链经几次弯曲和转动也是形成8个肽段的α-螺旋体，在N—端和C—端以及各个α-螺旋肽段之间都有长短不一的非螺旋松散链。β-链自身转折后，疏水侧链在分子内部，极性基团暴露在分子表面。血红蛋白分子中四条链（α、α、β、β）各自折叠卷曲形成三级结构，再通过分子表面的一些次级键(主要是离子键和氢键)的结合而联系在一起，互相凹凸镶嵌排列，形成一个四聚体的功能单位（图3-19）。
图3-19 脱氧血红蛋白β-亚基的三级结构，α-亚基和肌红蛋白的三级结构与此极其相似第五节 蛋白质结构与功能的关系蛋白质的结构与功能之间具有高度的统一性，蛋白质分子具有的多种多样的生物功能是以其化学组成和极其复杂的结构为基础的。这不仅在于其一定的化学结构，而且还在于一定的空间构象。研究蛋白质的结构与生物功能的关系正成为当前分子生物学的一个重要方面。
一、蛋白质的一级结构与生物功能的关系
1．同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化
同源蛋白质（homologous protein）是指在不同的有机体中实现同一功能的蛋白质。例如细胞色素c（cytochrome c）广泛存在于需氧生物细胞的线粒体中，在生物氧化过程中起传递电子的作用。不同种属来源的同源蛋白质一般具有相同长度或接近相同长度的多肽链。同源蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨基酸对所有的种属来说都是相同的，因此称为不变残基（invariant residue）。但是其他位置的氨基酸因种属不同有相当大的变化，因此称为可变残基（variable residue）。同源蛋白质的氨基酸顺序中这样的相似性被称为顺序同源（sequence homology）现象。
顺序同源的生物学意义从细胞色素c分子上看得最清楚。细胞色素c是一种传递电子的载体，分子中含有血红素，相对分子质量为12 400，由64个氨基酸残基组成。血红素Fe上的两个配位键与His及Met络合。细胞色素c是一种古老的蛋白质，从低等生物到高等生物，包括人类在内都有细胞色素c。现在已经对将近100个生物种属(包括动物、植物、真菌、细菌等)的细胞色素c的一级结构进行了测定和比较，发现亲缘关系越近，其结构越相似。例如，人和黑猩猩、猴、狗、金枪鱼、飞蛾、酵母的细胞色素c比较，则可变的氨基酸残基数目依次为0、1、10、21、31和44。细胞色素c的氨基酸顺序分析资料已被用来核对各个物种之间的分类学关系，以及绘制进化树（evolutionary tree），即系统发生树（图3-20）。根据进化树不仅可以研究从单细胞有机体到多细胞有机体的生物进化过程，而且可以粗略估计现存的各类种属生物的分歧时间（表3-10）。
表3-10 各种有机体的细胞色素c中氨基酸顺序的差异及分歧时间比较项
氨基酸顺序中差异的数目
分歧时间
/百万年
比较项
氨基酸顺序中差异的数目
分歧时间
/百万年
人—猴
1
50~60
哺乳类—鸡
10~15
280
人—马
12
70~75
哺乳类－鲔
17~21
400
人—狗
10
70~75
脊椎动物－酵母
43~48
1 100
猪—牛—羊
0
马—牛
3
60~65
虽然各种生物在亲缘关系上差别很大，但与功能密切相关部分的氨基酸顺序都有共同处，在25种生物来源的细胞色素c中，发现只有35个氨基酸残基完全不变。这35个氨基酸残基中除11个残基(第70到80个残基)是在一起形成一个肽段外，其它的不变残基则分散在肽链的一定位置上(图3-21)。细胞色素c实现它的功能只需要肽链中的一定位置上的一部分氨基酸顺序，如第十四和第十七位置上的半胱氨酸残基可能保证了与辅基血红素连接的必要位置。第70到80位置上的不变肽段可能是细胞色素c与酶相结合的部分。这样部分顺序稳定的肽链可能在形成构象时已能实现它的生物功能。
2．一级结构的变异与分子病
蛋白质分子化学结构中的细微差异，在某些情况下可能引起生物功能的显著变化，甚至使有机体出现病态现象，突出的例子如镰刀型贫血病(sickle-cell anemia)。该病在非洲人中比较常见，其显著的特点是有相当一部分红血球的形状是镰刀状或新月状。这是由于病人的血红蛋白分子（用HbS表示）与正常人的血红蛋白分子（HbA）相比，在574个氨基酸中只有两个氨基酸的差异引起的，正常人HbA的β-链N－端第6位氨基酸为谷氨酸,而病人HbS的β-链N－端第6位氨基酸为缬氨酸。
β-链N－端氨基酸排列顺序,
HbA,H2N—Val—His—Leu—Thr—Pro—Glu—Glu—Lys…………COO－
HbS,H2N—Va1—His—Leu—Thr—Pro—Va1—Glu—Lys…………COO－
由于这二个氨基酸性质上的差别（谷氨酸在生理pH值下为带负电荷R基氨基酸，而缬氨酸却是一种非极性R基氨基酸〕，就使得HbS分子表面的负电荷数减少，影响分子的正常聚集，致使体积下降，溶解度降低，血球随之收缩成镰刀形，以致输氧功能下降，细胞变得脆弱发生溶血。血红蛋白是由两条α-链和两条β-链共574个氨基酸构成的蛋白质，仅仅只有两条β-链的两个氨基酸残基发生改变，竟导致功能上如此重大的变化，足见结构与功能关系的高度统一。
血红蛋白一级结构的改变是由于编码它的基因发生了点突变。这种因基因突变产生异常蛋白从而导致的先天性疾病叫做分子病或遗传病。血红蛋白一级结构发生改变而导致的分子病的例子很多，镰刀形红细胞贫血病只是其中的一种。了解到分子病发生的原因后，可以设计出一些新药给予治疗。例如，异氰酸盐（H—N＝C＝O），可以与HbS的N—端缬氨酸残基上的游离氨基结合，使其氨甲酰化，可以恢复其分子表面的电荷数，从而改善病情。
二、三级结构与功能的关系
蛋白质特定的生理功能是由它特定的空间构象决定的。蛋白质空间构象被破坏时，它失去了执行生理功能的能力：酶不再具有催化作用，蛋白激素不再起调节代谢的作用，膜蛋白不再作为通透的载体。改变蛋白质周围的环境，就有可能破坏蛋白质天然的三级结构，使之丧失功能，形成部分松散或称为变性的蛋白质。
20世纪60年代初,F,While和 C,B,Anfinsen所做的一系列经典的实验就已经证明情况确实如此。他们选择牛胰核糖核酸酶（RNase)为研究对象，以它的变性和复性加以说明。核糖核酸酶是一个含4个二硫键和124个氨基酸残基的酶，当天然的核糖核酸酶在8mol(L尿素存在下用巯基乙醇处理后，则分子内四个二硫键破裂，整个肽链松散成无规线团，同时酶活性也完全丧失。但当用透析方法将尿素和巯基乙醇除去后，核糖核酸酶活性又可逐渐恢复，最后达到原来活性的95％～100％，并且复原后的产物的物理化学性质与天然的核糖核酸酶完全一样。值得注意的是，在复原过程中，肽链上的8个巯基借空气中的氧重新氧化成四个二硫键时，它们的配对完全与天然分子中的相同，准确无误。可见蛋白质的三级结构与它的功能之间的统一。
第六节 蛋白质的重要性质由于蛋白质是由氨基酸组成的，因此它具有某些与氨基酸有关的性质。但它与氨基酸有着质的区别，表现出单个氨基酸所没有的性质。认识和理解蛋白质的性质，对于蛋白质的分离、纯化工作以及研究蛋白质的结构与功能等都是极为重要的。
一、蛋白质的两性解离及电泳蛋白质分子由氨基酸组成，而氨基酸是两性电解质，虽然蛋白质多肽链中的氨基酸的α-氨基和α- 羧基都已结合成肽键，但是N—末端和C—末端仍具有游离的α-氨基和α-羧基。组成蛋白质的许多氨基酸具有可解离的侧链基团，如ε-氨基、β- 羧基、γ-羧基、咪唑基、胍基、酚基、巯基等，这些侧链基团在一定的pH值条件下可以释放或接受H+,它们构成了蛋白质两性解离的基础。基于上述两方面的原因，我们说蛋白质是两性电解质。在一定的pH值条件下能解离为带电基团，从而使蛋白质带电。当溶液在某一特定 pH值的条件下使蛋白质所带正电荷与负电荷恰好相等，即总净电荷为零时，在电场中，蛋白质分子既不向阳极移动，也不向阴极移动，这时溶液的 pH值称为该蛋白质的等电点（pI ）。蛋白质的等电点和它所含的酸性氨基酸和碱性氨基酸的数量比例有关。表3-11给出了几种蛋白质中碱性氨基酸与酸性氨基酸残基(酰氯化的酸性氨基酸已减去)的数目和它们之间的比例，这个比例和等电点显示了一定的关系。
表3-11 蛋白质的氨基酸含量与等电点的关系蛋白质
酸性氨基酸（每克分子残基数）
碱性氨基酸(每克分子残基数)
碱性(酸性
等电点（pI）
胃蛋白酶
37
6
0.2
1.0
血清蛋白
32
99
1.2
4.7
血红蛋白
53
88
1.7
5.7
核糖核酸酶
7
20
2.9
9.5
蛋白质在等电点时，以两性离子的形式存在，其总净电荷为零，这样的蛋白质颗粒在溶液中因为没有相同电荷而互相排斥的影响，所以最不稳定，溶解度最小，极易借静电引力迅速结合成较大的聚集体，因而沉淀析出。同时在等电点时蛋白质的粘度、渗透压、膨胀性以及导电能力均为最小。当溶液的pH值高于或低于等电点时蛋白质的带电状况如下：
PH<pI pH=pI pH>pI
带正电荷 正负电荷相等 带负电荷根据蛋白质净电荷的差异来分离蛋白质的一种方法是电泳法(electrophoresis)。这种方法的依据是，在外电场的作用下，带电颗粒，如不处在等电状态的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。
目前对蛋白质分离有着高分辨率的电泳首推聚丙烯酰胺凝胶电泳。这种电泳方法因为聚丙烯酰胺凝胶系微孔介质，样品不易扩散，并且同时兼有分子筛的作用，分离效果相当好。如果将凝胶装入玻璃管中，蛋白质的不同组分形成环状圆盘，称为圆盘电泳。在铺有凝胶的玻璃板上进行的电泳称为平板电泳。还有等电聚焦电泳,这是因为蛋白质分子有一定的等电点，当它处在一个由阳极到阴极pH值梯度逐渐增加的介质中，并通过直流电时，它便“聚焦”在与其等电点相同的pH值位置上,等电点不同的蛋白质泳动后形成位置不同的区带而得到分离，这种电泳方法便称为等电聚焦电泳。此外还有双向电泳、免疫电泳等。而纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳也仍然在一定范围内应用。由于以上这些电泳方法可以将被分离物形成带状区域，因此称为区带电泳。
二、蛋白质的胶体性质及其沉淀分离
1．蛋白质的胶体性质
按照胶体化学的概念，胶体是这样定义的：把物质为1～100 nm的粒子在介质中分散所成的体系称为胶体。根据胶体物质的溶解性质可分为亲水胶体和疏水胶体。胶体溶液的稳定应具备三个条件：第一，分散相质点大小在 l～100nm之间，这样大小的质点在动力学上是稳定的，介质分子对这种质点碰撞的合力不等于零，使它能在介质中作不断的布朗运动；第二，分散相的质点带有同种电荷，互相排斥，不易聚集成大颗粒而沉淀；第三，分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层，如与水形成水化层，质点有了水化层，相互间不易靠拢聚集。
蛋白质分子的大小属于胶体质点的范围。蛋白质溶液是一种亲水胶体，蛋白质分子颗粒是分散相(disperse phase)，水是分散介质(disperse medium)，蛋白质分子表面的亲水基,如—NH2、—COOH、—OH以及—CO—NH— 等，在水溶液中能与水分子起水化作用，使蛋白质分子表面形成一个水化层。蛋白质分子表面上的可解离基团在适当的pH值条件下都带有相同的净电荷，与周围的反离子构成稳定的双电层。蛋白质溶液由于具有水化层与双电层两方面的稳定因素，所以作为胶体系统是相对稳定的。蛋白质溶液也和一般的胶体系统一样具有丁道尔现象、布朗运动以及不能通过半透膜等性质。
2．蛋白质的沉淀
蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。如果条件改变，破坏了蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。若向蛋白质溶液中加入适当的试剂，破坏它的水膜或中和它的电荷，就很容易使其失去稳定而发生沉淀。
沉淀蛋白质的方法有以下几种,
（1）盐析法 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐(硫酸按、硫酸钠或氯化钠等)，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。盐析沉淀一般不引起蛋白质变性。
（2）有机溶剂沉淀法 向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂(甲醇、乙醇或丙酮等)，因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。
（3）重金属盐沉淀法 当溶液pH值大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，这样就容易与重金属离子(Mg２＋,Pb２＋,Cu２＋,Ag＋等)结成不溶性盐而沉淀。
（4）某些酸类 如苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。这类沉淀反应经常被临床检验部门用来除去体液中干扰测定的蛋白质。
（5）加热变性沉淀法 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐促进蛋白质加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全和最迅速。我国很早便创造了将大豆蛋白质的浓溶液加热并点入少量盐卤（含MgCl）的制豆腐方法，这是成功地应用加热变性沉淀蛋白的一个例子。
上述蛋白质的沉淀包括两种情况，一是不影响蛋白质的空间结构，所得到的蛋白质具有生物活性；另一种是变性后的沉淀，它涉及空间结构的解体和生物活性的丧失。用盐析法或在低温时加入有机溶剂(将蛋白质用酸碱调节到等电点状态)等方法制取的蛋白质，仍然保持天然蛋白质的一切特性，如原有生物活性、将蛋白质重新溶解于水仍然成为稳定的胶体溶液等。但如在温度稍高的情况下加入有机溶剂来沉淀分离蛋白质或用有机溶剂沉淀分离得到的蛋白质没有及时与有机溶剂分开，都会引起蛋白质的性质改变，这是应加注意的。
三、蛋白质的变性与复性
1．变性作用的概念
天然蛋白质分子在某些理化因素的影响下，其分子内部原有的高度规律性结构发生变化，致使蛋白质的理化性质和生物学性质都有改变，但并不导致蛋白质一级结构的破坏，这种现象叫变性作用(denaturation)。蛋白质变性作用的实质是维持蛋白质分子特定结构的次级键和二硫键被破坏，引起天然构象解体，但主链共价键并未打断，即一级结构保持完好。
2．变性的原因、结果
能使蛋白质变性的因素很多，化学因素有强酸、强碱、尿素、胍、去污剂、重金属盐、三氯醋酸、磷钨酸、苦味酸、浓乙醇等；物理因素有加热(70～100℃)、剧烈振荡或搅拌、紫外线及X射线照射、超声波等。但不同的蛋白质对各种因素的敏感程度是不同的。
蛋白质变性过程中，往往出现下列现象：
(1)生物活性丧失：蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、抗原与抗体等的活性。生物活性的丧失是蛋白质变性的主要特征。
(2)一些侧链基团暴露出来：蛋白质变性时，有些原来在分子内部包藏而不易与化学试剂起反应的侧链基团由于结构的伸展松散而暴露出来。
(3)一些理化性质改变：蛋白质变性后，疏水基外露，溶解度降低，一般在等电点区域不溶解，分子相互凝集形成沉淀。其它如结晶能力丧失，球状蛋白质变性后分子形状也发生改变。
(4)生物化学性质的改变：蛋白质变性后，分子结构伸展松散，易为蛋白水解酶分解。
3．变性机理及其应用
目前认为蛋白质的变性作用主要是由蛋白质分子内部的结构发生改变所引起的。天然蛋白质分子内部通过氢键等次级键使整个分子具有紧密结构。变性后，氢键等次级键被破坏，蛋白质分子就从原来有秩序的卷曲紧密结构变为无秩序的松散伸展状结构，也就是二、三级以上的高级结构发生改变或破坏，但一级结构没有破坏。所以变性后的蛋白质在结构上虽有改变，但组成成分和相对分子质量不变。变性后的蛋白质溶解度降低是由于其高级结构受到破坏，使分子表面结构发生变化，亲水基团相对减少，原来藏在分子内部的疏水基团大量暴露在分子表面，使蛋白质颗粒不能与水相溶而失去水膜，很容易引起分子间相互碰撞发生聚集沉淀，或者随着二、三级结构的破坏，发生解离或聚合现象。
当变性因素除去后，变性蛋白质又可重新回复到天然构象。这一现象称为蛋白质的复性(renaturation)。是否所有的蛋白质的变性都是可逆的，这一问题至今仍有疑问。至少实践中未能使所有蛋白质在变性后都重新恢复活力。然而多数人都接受变性是可逆的概念，认为天然构象是处于能量最低的状态。有些蛋白质变性后之所以不能逆转，主要是所需条件复杂，不易满足的缘故。
蛋白质的变性与凝固已有许多实际应用，如豆腐就是大豆蛋白质的浓溶液加热加盐而成的变性蛋白凝固体。临床分析化验血清中非蛋白质成分，常常加三氯醋酸或钨酸使血液中的蛋白质变性沉淀而去掉。为鉴定尿中是否有蛋白质，常用加热法来检验。在急救重金属盐(如氯化高汞)中毒时，可给患者吃大量乳品或蛋清，其目的就是使乳品或蛋清中的蛋白质在消化道中与重金属离子结合成不溶解的变性蛋白质，从而阻止重金属离子被吸收进入体内，最后设法将沉淀物从肠胃中洗出。
此外，在制备蛋白质和酶制剂过程中，为了保持天然性质，就必须防止发生变性作用，因此在操作过程中必须注意保持低温，避开强酸、强碱、重金属盐类，防止振荡等。相反，那些不必需的杂蛋白则可通过变性作用而沉淀出去。
四、蛋白质的紫外吸收
组成蛋白质分子的20种氨基酸，由于酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸具有苯环的共轭双键结构，因而在紫外光区具有吸收特性。蛋白质一般都含有酪氨酸或色氨酸残基，利用这两种氨基酸的紫外吸收特性测定蛋白质的含量是很方便的。大多数蛋白质在波长280nm附近有一个吸收峰，故测定蛋白质含量时，选用的波长为280nm。
五、蛋白质的颜色反应
在蛋白质的分析工作中，常利用蛋白质分子中某些氨基酸或某些特殊结构与某些试剂产生颜色反应，作为测定的根据。重要的颜色反应如下：
（1）双缩脲反应（biuret reaction ) 双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。将尿素加热到180ＯC，则2分子脲素缩合成1分子双缩脲，并放出1分子氨，反应如下：
双缩脲在碱性溶液中能与硫酸酮反应产生红紫色络合物，此反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形成紫色络合物。通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应产生的颜色在540nm处比色，定量测定蛋白质。
（2）蛋白黄色反应 此反应是含有芳香族氨基酸的蛋白质，特别是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质所特有的反应。蛋白质溶液遇硝酸后，先产生白色沉淀，加热则白色沉淀变成黄色，再加碱颜色加深呈橙黄色。这是由于硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物。
（3）米伦氏反应（Millon reaction ) 蛋白质溶液中加入米伦试剂(硝酸和硝酸汞—硝酸和亚硝酸的混合物)后产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。含有酚基的化合物都有这个反应，故酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质都能与米伦试剂反应。
（4）乙醛酸反应 在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间就会出现紫色环，凡含有吲哚基的化合物都有这一反应。色氨酸及含色氨酸的蛋白质有此反应，不含色氨酸的白明胶就无此反应。
（5）酚试剂(福林试剂)反应 蛋白质分子一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能将福林试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物(即钼兰和钨兰的混合物)。这一反应常用来测定蛋白质含量。
（6）水合茚三酮反应 凡含有α- 氨基酸的蛋白质都能与水合茚三酮生成蓝紫色化合物。
**第七节 蛋白质的分离提纯及应用一、蛋白质分离提纯的一般原理
蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在。到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来。但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序以获得高纯度的制品。蛋白质提纯的总目标是增加制品纯度(purity)或比活力(specific activity)，设法除去变性的蛋白质和其他杂蛋白，且希望所得蛋白质的产量达到最高值。
分离提纯某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级和细分级三步。
第一步是前处理（pretreatment） 分离提纯某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丧失生物活性。为此，应根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。植物组织和细胞由于具有由纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶(cellulase)处理。细菌细胞的破碎比较麻烦，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的称为肽聚糖(peptidoglycan)的囊状分子，非常坚韧。破碎细胞的常用方法有超声波振荡、与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理等。组织和或细胞破碎以后，选择适当的介质(一般用缓冲液)把所要的蛋白质提取出来。
如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分中，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞浆等，则可用差速离心（differential centrifugation）方法将它们分开(表3-12)，收集该细胞组分作为下一步提纯的材料。这样可以一下子除去很多杂蛋白，使提纯工作容易得多。如果碰上所要的蛋白质与细胞膜或膜质细胞器相结合，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当的介质提取。
表3-12 在不同离心力下沉降的细胞组分
离心场/g
时间/min
沉降的组分
1 000
5
真核细胞
4 000
10
叶绿体、细胞碎片、细胞核
15 000
20
线粒体、细菌
30 000
3 0
溶酶体、细菌细胞碎片
100 000
180～600
核糖体
第二步是粗分级(rough fractionation) 当蛋白质混合物提取液获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开。一般这一步采用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分组分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量的杂质，又能浓缩蛋白质溶液。
第三步是细分级，也就是样品进一步提纯。样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步提纯一般用层析法，包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析及亲和层析等。这些分离方法主要是根据以下原理将蛋白质分离纯化的：①以蛋白质电荷为依据的方法。大多数球蛋白的表面都有带电的氨基酸侧链，尽管游离氨基酸上的每一个可解离的侧链都有一个特定的pK值，但是蛋白质表面特定环境也会引起氨基酸侧链 pK值的微小变化。因此，即使那些根据组分而预测其电荷形式应相同的蛋白质，实际上它们的电荷性质也有微小的差异。这种差异已成为许多种蛋白质分离鉴定方法的基础。② 以分子量为依据的方法。其原理将在分子量测定里面讲。③ 以蛋白质的特异性相互作用为依据的方法。生物高分子，包括蛋白质分子具有能和某些相对应的专一分子可逆结合的特性。例如，酶的活性部位能和底物、抑制剂以及辅助因子专一性结合，同时，改变条件又能使这种结合解除。此外，酶的变构中心与变构因子之间、抗体与抗原之间都有类似的特性。这些被作用的对象物质称为配基。将配基固定在固相载体上，并且放进层析柱中，当样品通过它时，由于配基和相对应的蛋白质分子间有专一性的亲和作用，将通过某种次级键将这种蛋白质分子吸附在柱中，样品中的其他组分不产生专一性结合，都直接漏出层析柱。然后，便可应用洗脱剂将柱中的蛋白质洗脱出来。这种利用生物高分子和配基间可逆结合和解离的原理发展起来的层析方法就称为亲和层析。除以上方法外还可以选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后提纯步骤。用于细分级的方法一般规模较小，但分辨率高。
结晶是蛋白质分离提纯的最后步骤。尽管结晶并不能保证蛋白质的均一性，但只有某种蛋白质在溶液中数量占优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白质。蛋白质纯度越高，溶液越浓，就越容易结晶。结晶的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态，此时较易得到结晶。要得到适度的过饱和溶液，可通过控制温度、加盐盐析、加有机溶剂或调节pH值等方法来达到，接入晶种能加速结晶过程。由于结晶从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是鉴定制品是否处于天然状态的有力指标。
二、蛋白质含量的测定与纯度鉴定
在蛋白质分离提纯过程中，经常需要测定蛋白质的含量和检查某一蛋白质的提纯程度。这些分析工作包括：测定蛋白质总量、测定蛋白质混合物中某一特定蛋白质的含量和鉴定最后制品的纯度。测定蛋白质总量常用的方法有：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin—酚试剂法和紫外吸收法等。
测定蛋白质混合物中某一特定蛋白质的含量通常要用高度特异性的生物学方法。具有酶或激素性质的蛋白质可以利用它们的酶活性或激素活性来测定含量。有些蛋白质虽然没有酶或激素那样的生物学活性，但是大多数蛋白质当注入适当动物的血流时，会产生抗体。因此，利用抗体—抗原反应也可以测定某一特定蛋白质的含量。这些生物学方法的测定和总蛋白质测定配合起来，可以用来研究蛋白质分离过程中某一特定蛋白质的提纯程度。提纯程度常用这一特定成分与总蛋白之比表示，如每毫克蛋白质含多少活性单位（对酶蛋白来说，这一比例称为比活性）。提纯工作一直要进行到这个比例不再增加为止。
蛋白质制品纯度鉴定通常采用分辨率高的物理化学方法，如电泳分析、沉淀分析、扩散分析等。 纯的蛋白质在它稳定的范围内，在一系列不同pH值条件下进行电泳时，都以单一的泳动度移动，因此在界面移动电泳中，它的电泳图谱只有一个峰。同样地，在沉降分析中，纯的蛋白质在离心力影响下，以单一的沉降速度运动。
纯的蛋白质在一定溶剂系统中具有恒定的溶解度，而不依赖存在于溶液中未溶解固体的数量。用恒溶度法鉴定蛋白质纯度在理论上是严格的，在实验方法上是简便易行的。在严格规定的条件下，以加入的固体蛋白质对溶解的蛋白质作图。如果蛋白质制品是纯的，那么溶解度曲线只呈现一个折点，在折点以前，直线的斜率为1，在折点以后，斜率为零（图3-22）。不纯的蛋白质的溶解度曲线常常呈现两个以上的折点。
必须指出，任何单独一种鉴定只能认为是蛋白质分子均一性的必要条件而不是充分条件。事实上很少有几个蛋白质能够全部满足上面各种鉴定的严格要求，往往是在一种鉴定中表现为均一的蛋白质，在另一种鉴定中又表现为不均一的了。
三、蛋白质的相对分子质量测定
蛋白质相对分子质量很大，其变化范围在6 000～1 000 000或更大一些。下面介绍几种常见的测定蛋白质分子量的方法。
1．沉降法把蛋白质溶液放在离心机的特殊离心管中(图3-23)离心，蛋白质分子就发生沉降作用。沉降的速度与颗粒大小成正比。现代超速离心机利用高速马达，转速可达750 000r/min以上，离心力超过重力4000 000倍。分析用的超速离心机装有光学系统，可以记录沉降进行时蛋白质界面的位置。当溶液中所含的分子形状和大小相同时，则这些分子以相同速度移向离心管底，在溶质与溶剂之间产生清晰的界面。当溶液含有数种分子大小不同的蛋白质时则产生数个界面，每个界面存在一种蛋白质。从光学系统观察沉降界面可以得出蛋白质的沉降速度。当沉降面以恒速移动时，每单位离场的沉降速度称为沉降常数或沉降系数(sedimentation coefficient)，以S表示，一个S单位为1×10－１３/s。蛋白质的沉降常数S（20℃，水中）为 l×10－１３～200×10－１３，即1～200S。以后由S可以按照公式求出相对分子质量。
２.凝胶过滤法
凝胶过滤(gel filtration)是在层析柱中装入葡聚糖凝胶(如sephadex)，这种凝胶中具有大量微孔，这些微孔只允许较小的分子进入胶粒，而大于胶粒微孔的分子则不能进入胶粒而被排阻。当用洗脱液洗脱时，被排阻的分子，分子量大的先被洗脱下来，相对分子质量小的后下来。当凝胶柱用已知相对分子质量的蛋白质校准后，从被测样品在洗脱时出现的先后位置即可求出近似的相对分子质量。
3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法十二烷基硫酸钠(SDS)为一种去污剂，可使蛋白质变性并解离蛋白质。将用SDS处理过的蛋白质放在含有SDS的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，这些蛋白质的迁移率与其相对分子质量成反比，用已知相对分子质量的标准蛋白质进行校准，即可得出所测蛋白质的相对分子质量。
四、蛋白质的应用
蛋白质的应用范围也是很广泛的。①在临床化学分析上，不仅包括生物体化学成分的分析，也包括将各种酶的活力测定作为临床诊断的指标，如将乳酸脱氢酶同工酶的检定作为心肌梗塞的诊断指标，转氨酶作为肝病变的指标等。②许多蛋白制剂是安全有效的药品，如蛋白水解酶复剂作为消化药物广泛应用。胰岛素人胎盘丙种球蛋白、细胞色素c等也都是有效的药物。③酶法分析也应用于食品分析上，其对象主要是辅酶和有机酸。有些酶法分析很灵敏，如L-乳酸,DL-柠檬酸可测定范围为(0.2～10)μg／ml,(2～50)μg／ml。食品分析中还包括农药毒物分析，即利用毒物可以非竞争性抑制某些酶的活性，求出毒物在食品中的浓度。如果小麦受了 DDT的污染，可用牛红白球碳酸酐酶测定，检查精度为1g中含有10μg的毒物。④在一些工业生产上也常常利用酶制剂，如生丝的处理。天然生丝是互相粘着在一起的，为了使生丝分开，就要破坏粘着天然生丝的“天然胶水”。以肥皂和苏打水洗煮生丝，生丝的结构受到破坏；如果以酶制剂处理生丝，对生丝无害并可大大提高丝线的质量。⑤在日常生活中所使用的合成洗涤剂以蛋白水解酶为添料，可以除牛乳、蛋白、血液等不易去除的污物。⑥在农业生产上也有应用，如苏云金杆菌的Bt蛋白可用于防虫 。
总之，蛋白质的知识以及蛋白制品的利用已经成为某些生产和人们生活的组成部分，而且随着科学的发展应用范围会越来越广。
1．生物催化作用：蛋白质的一个最重要的生物学功能是作为有机体新陈代谢的催化剂——酶。几乎所有的酶都是蛋白质。生物体内的各种化学反应几乎都是在相应的酶参与下进行的。
2．作为结构成分：蛋白质另一个主要的生物学功能是作为有机体的结构成分。在高等动物里，胶原纤维是主要的细胞外结构蛋白，参与结缔组织和骨骼作为身体的支架。细胞里的片层结构，如细胞膜、线粒体、叶绿体和内质网等都是由不溶性蛋白质与脂质组成的。
3．运输的功能：另一类蛋白质具有运输的功能。脊椎动物的血红蛋白和无脊椎动物中的血蓝蛋白，某些色素蛋白如细胞色素c等起传递电子的作用。
4．运动功能：某些蛋白质与生物的运动有关，如肌球蛋白(myosin)和肌动蛋白(actin)是肌肉收缩系统的必要成分。细菌的鞭毛或纤毛蛋白也能产生类似的活动。近年来发现，在非肌肉的运动系统中普遍存在着运动蛋白。
5．储存功能：有些蛋白质具有贮藏氨基酸的功能，作为有机体及其胚胎或幼体生长发育的原料，如蛋类中的卵清蛋白（ovalbumin）、乳类中的酪蛋白（casein)、小麦种子中的麦醇溶蛋白等。
6．免疫防御：生物体防御体系中的抗体（antibody）也是蛋白质。它能识别病毒、细菌以及其他机体的细胞，并与之相结合而排除外来物质对有机体的干扰，起到保护机体的作用。
7．代谢调控：还有一些蛋白质具有激素的功能，对生物体内的新陈代谢起调节作用。如胰岛素参与血糖的调节，能降低血液中葡萄糖的含量。
8．其它作用：近代分子生物学的研究还表明，蛋白质在遗传信息的控制、细胞膜的通透性，以及高等动物的记忆、识别机构等方面都起到重要作用。
二、蛋白质的元素组成蛋白质是含氮的有机化合物，其含氮量占生物组织中一切含氮物质的绝大部分。氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征性元素，根据对大多数蛋白质的氮元素分析，其氮元素的含量都相当接近，一般在15%~17％，平均为16％，即100g蛋白质中含有16g氮。这是凯氏(Kjedahl）定氮法测定蛋白质含量的计算基础。
蛋白质含量＝蛋白氮×6,25
式中：6,25—16％的倒数，每测定１g氮相当于6,25g的蛋白质。
蛋白质除含有氮元素外，含有下述几种主要元素：C：50～55%； Ｈ：6～8％；Ｏ：20～30% ；Ｓ：0~4％。有些蛋白质含有少量的磷，还有些蛋白质含有微量的金属元素，例如铁、铜、锰、锌等。
三、蛋白质的分类
蛋白质可以按不同的方法分类。作为分类的依据主要有：分子的形状或空间构象；分子的溶解性；分子的组成情况；功能。
表3-1 简单蛋白质的分类蛋白质
性 质
清蛋白(albumin)
2.．球蛋白(globulin)
3．谷蛋白(glutelin)
4．醇溶蛋白(prolamine)
5．组蛋白(histone)
6．鱼精蛋白(protamine)
7．硬蛋白（scleroprotein）
溶于水及稀盐、稀酸或稀碱溶液，为饱和硫酸铵所沉淀。广泛存在于生物体内，如血清清蛋白、乳清蛋白等
为半饱和硫酸铵所沉淀，不溶于水而溶于稀盐溶液的称为优球蛋白( euglobulin)；溶于水的称为拟球蛋白(pseudoglobulin)。普遍存在于生物体内，如血清球蛋白、肌球蛋白和植物种子球蛋白等
不溶于水、醇及中性盐溶液，但易溶于稀酸或稀碱，如米谷蛋白(oryzenin)和麦谷蛋白(glutenin)等
不溶于水及无水乙醇，但溶于70%~80%的乙醇中。组成上的特点是脯氨酸和酰胺较多，非极性侧链远较极性侧链多。这类蛋白质主要存在于植物种子中，如玉米醇溶蛋白(zein)、麦醇溶蛋白(gliadin)等溶于水及稀酸，但为稀氨水所沉淀。分子中组氨酸、赖氨酸较多，分子呈碱性，如小牛胸腺组蛋白等
溶于水及稀酸，不溶于氨水。分子中呈碱性的氨基酸特别多，因此呈碱性，如鲑精蛋白(salmin)等
不溶于水、盐、稀酸或稀碱 。这类蛋白是动物体内作为结缔及保护功能的蛋白质,如角蛋白（keratin)、胶原(collagen)、网硬蛋白(reticulin)和弹性蛋白(elastin)等
按照分子的形状或空间构象可将蛋白质分为纤维状蛋白和球状蛋白两大类。纤维状蛋白分子很不对称，形状类似纤维。有的纤维状蛋白能溶于水，如肌肉的结构蛋白和血纤维蛋白原；有的纤维状蛋白不溶于水，如角蛋白、丝心蛋白以及胶原蛋白等。球状蛋白质分子的形状接近球形，空间构象比纤维状蛋白复杂。球状蛋白质的溶解性较好，能结晶，生物体内的蛋白质大多数属于这一类。
根据分子组成情况，可将蛋白质划分为单纯蛋白和结合蛋白两类。单纯蛋白不含有非蛋白质部分。这类蛋白质水解后的最终产物只有氨基酸。单纯蛋白质按其溶解性质的不同可分为白蛋白（或清蛋白）、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、精蛋白、组蛋白以及硬蛋白等（表3-1）。结合蛋白是指由单纯蛋白和非蛋白成分结合而成的蛋白质，包括核蛋白、色蛋白、磷蛋白、糖蛋白等（表3-2）。按照蛋白质的功能，则可划分为酶蛋白、结合蛋白、运输蛋白、受体蛋白、调节蛋白、防御蛋白、贮存蛋白、毒蛋白等（表3-3）。
表3-2 结合蛋白质的分类
蛋白质
性 质
1．核蛋白(nucleoprotein)
2．脂蛋白(lipoprotein)
3．糖蛋白(glycoprotein)和粘蛋白(mucoprotein)
4．磷蛋白(phosphoprotein)
5．血红素蛋白(hemoprotein)
6．黄素蛋白(flavoprotein)
7．金属蛋白(metalloprotein)
辅基是核酸，如脱氧核糖核蛋白、核糖体、烟草花叶病毒等
与脂质结合的蛋白质。脂质成分有磷脂、固醇和中性脂等，如血中的(1-脂蛋白、卵黄球蛋白(lipovitellin)等
辅基成分为半乳糖、甘露糖、己糖胺、己糖醛酸、唾液酸、硫酸或磷酸等，如卵清蛋白、(-球蛋白、血清类粘蛋白(seromucoid)等
磷酸基通过酯键与蛋白质中的丝氨酸或苏氨酸残基侧链相连，如酪蛋白、胃蛋白酶等
辅基为血红素，它是卟啉类化合物，卟啉环中心含有金属，如含铁的血红蛋白、细胞色素c，含镁的叶绿素蛋白，含铜的血蓝蛋白(hemocyanin)等
辅基为黄素腺嘌呤二核苷酸，如琥珀酸脱氢酶、D-氨基酸氧化酶等
与金属直接结合的蛋白，如铁蛋白(ferritin)含铁,乙醇脱氢酶含锌,黄嘌呤氧化酶含钼和铁等
表3-3 蛋白质按生物功能的分类
类型及举例
功能或存在
1.酶(enzymes)
核糖核酸酶(Rnese)
细胞色素C(cytochyome C)
木瓜蛋白酶(papain)
2.储藏蛋白(storage protein)
麦醇溶蛋白(gliadin)
玉米醇溶蛋白(zein)
酪蛋白(casein)
卵清蛋白(ovalbumin)
3.运输蛋白(transport protein)
血红蛋白(hemoglobin)
血蓝蛋白(hemocyanin)
肌红蛋白(myogloin)
血清清蛋白(serum albumin)
β1 -脂蛋白(β1-lipoprotein)
4.收缩蛋白(contractile protein)
肌球蛋白(myosin)
肌动蛋白(actin)
5.保护蛋白(protective protein)
抗体(antibodies)
6.补体(complement)
7.结构蛋白
糖蛋白( glycoprotein )
α-角蛋白(α- keratin )
胶原蛋白( collagen )
水解RNA
转移电子
水解多肽
小麦的种子蛋白
玉米的种子蛋白
牛乳蛋白
鸡蛋清蛋白
在血液中运输O2(脊椎动物)
在血液中运输O2(无脊椎动物)
在肌肉中运输O2
在血液中运输脂肪酸
在血液中运输脂类
肌原纤维的静止纤维
肌原纤维的移动纤维
与异蛋白形成复合体
与抗原抗体系统形成复合体
细胞外壳及壁
皮肤、羽毛、毛发、角
结缔组织
上述蛋白质的分类并不是绝对的，彼此间是有联系的。例如，组蛋白属于单纯蛋白，若它和DNA结合在一起时，则把它们合称为核蛋白，就属于结合蛋白类。
第二节 氨基酸
蛋白质是一类含氮的生物大分子，结构复杂，功能多样。经酸、碱或蛋白酶处理，使蛋白质彻底水解可以得到各种氨基酸。现在已证明氨基酸是蛋白质的基本组成单位，组成蛋白质的氨基酸共有20种。目前从各种生物体中发现的氨基酸已有180多种，除去组成蛋白质的20种氨基酸外，其余氨基酸被称为非蛋白质氨基酸。组成蛋白质的氨基酸称为蛋白质氨基酸。
一、蛋白质氨基酸的一般结构特点及其分类
氨基酸是含有氨基及羧基的有机化合物。从蛋白质水解产物中分离出来的常见的20种氨基酸除脯氨酸外，其余19种氨基酸在结构上的共同特点是与羧基相邻的(-碳原子上都有一个氨基，因而称为(-氨基酸。结构通式如下,
从结构上看，除甘氨酸外，所有(-氨基酸的(-碳原子都是不对称碳原子（asymmetric carbon）或称手性中心，因此都具有旋光性，都能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋通常用（－）表示，右旋通常用（＋）表示。其次每种氨基酸都有D-和L-型两种立体异构体，这是与甘油醛相比较确定的。书写时将羧基写在(-碳原子的上端，则氨基在左边的为L-型，氨基在右边的为D-型（如图3-1）。
必须指出，构型与旋光方向二者之间没有直接对应关系。各种L-型氨基酸中有的为左旋有的为右旋，即便同一种L-型氨基酸，在不同溶剂中测定时，其比旋光值和旋光方向也会不同。从蛋白质水解得到的 (- 氨基酸都属于L-型的，所以习惯上书写氨基酸都不标明构型和旋光方向。
从(-氨基酸的结构通式可以知道，各种(-氨基酸的区别就在于侧链R基团的不同，即是说，不同的氨基酸有不同的R基团。这样，组成蛋白质的20种常见氨基酸可以按照R基的化学结构或极性大小进行分类。在这里，我们将按照各种氨基酸侧链R基团的极性差别进行分类。这对于认识蛋白质的性质、结构与功能更为有利。按照这种分类方法可将氨基酸分为四大类：即非极性或疏水性的侧链R基氨基酸；极性但不带电荷的R基氨基酸；带正电荷的R基氨基酸；带负电荷的R基氨基酸表（表3-4~表3-7）。注意，这些氨基酸的解离条件是指在细胞生理pH值范围内。
图3- 1 丙氨酸的一对对映体与L -和D -甘油醛的绝对构型的立体关系表3-4 具有非极性或疏水的R基团的氨基酸氨基酸名称
R集团
三字母符号
单字母符号
丙 氨 酸
（alanune）
缬 氨 酸
（valine）
亮 氨 酸
（leucine）
异 亮 氨 酸
（isoleucine）
Ala
Val
Leu
Ile
A
V
L
I
氨基酸名称
R集团
三字母符号
单字母符号
脯 氨 酸
（proline）
苯 丙 氨 酸
（phenylalanine）
色 氨 酸
（tryptophan）
甲 硫 氨 酸
（methionine）
Pro
Phe
Trp
Met
P
F
W
M
表3-4这一组中共有8种氨基酸（丙、缬、亮、异、脯、笨、色、硫）。4种带有脂肪烃侧链的氨基酸，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2种含芳香环氨基酸：苯丙氨酸和色氨酸；1种含硫氨基酸即甲硫氨酸；1种亚氨基酸：脯氨酸。这组氨基酸在水中的溶解度比极性R基氨基酸小。其中以丙氨酸的R基疏水性最小。
表3-5这一组中有7种氨基酸。这组氨基酸比非极性R基氨基酸易溶于水。它们的侧链中含有不解离的极性基，能与水形成氢键。丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸中侧链的极性是由于它们的羟基造成的；天冬酰胺和谷氨酰胺R基极性是它们的酰胺基引起的；半胱氨酸则是由于含有巯基的缘故。甘氨酸的侧链介于极性与非极性之间，有时也把它归入非极性类，但是它的R基只不过是一个氢原子，对极性强的(-氨基和(-羧基影响极小。这一组氨基酸中半胱氨酸和酪氨酸的R基极性最强。半胱氨酸中的巯基和酪氨酸中的酚羟基，虽然在pH=7时电离很弱，但与这组氨基酸中的其他氨基酸侧链相比失去质子的倾向大得多。
表3-6属于这一类的是两种酸性氨基酸，它们都含有两个羧基，并且第二个羧基在pH值6~7范围内也完全解离，因此分子带负电荷。
表3-7这一类氨基酸在pH=7时携带净正电荷，又叫碱性氨基酸。赖氨酸除(-氨基外，在脂肪链的( 位置上还有一个氨基；精氨酸含有一个带正电荷的胍基；组氨酸有一个咪唑基。在pH=6.0时，组氨酸分子50％以上质子化，但在pH=7.0时，质子化的分子不到10％。组氨酸是R基的pK值在7附近的唯一种氨基酸。
表3-5 具有极性不带电荷的R基团的氨基酸氨基酸名称
R 基 团
三字母符号
单字母符
甘 氨 酸
（glycine）
Gly
G
丝 氨 酸
（serine)
Ser
S
苏 氨 酸
（threonine)
Thr
T
半 胱 氨 酸
(cysteine)
Cys
C
酪 氨 酸
（tyrosine）
Tyr
Y
天 冬 酰 胺
(asparagine)
Asn
N
谷 氨 酰 胺
（glutamine）
Gln
Q
表3-6 R基团带负电荷的氨基酸氨基酸名称
R 基 团
三字母符号
单字母符号
天 冬 氨 酸
（aspartic acid）
Asp
D
谷 氨 酸
（glutamic acid）
Glu
E
表3-7 R基团带正电荷的氨基酸
氨基酸名称
R 基 团
三字母符号
单字母符号
赖 氨 酸
（lysine）
Lys
K
精 氨 酸
(argnine)
Arg
R
组 氨 酸
（histidine）
His
H
总之，氨基酸的结构特点是：
１、α-氨基酸：参与组成蛋白质的20种氨基酸,除脯氨酸是一种α-亚氨基酸外,其余的都是α-氨基酸
２、式中Ｒ表示侧链，２0种蛋白质氨基酸在结构上的差别仅在于侧链基团R的不同。
３、除没有手性碳原子的甘氨酸外,其它蛋白质氨基酸均为L-型氨基酸。
二、稀有的蛋白质氨基酸蛋白质组成中，除了20种常见氨基酸（基本氨基酸）外，从少数蛋白质中还分离出一些稀有氨基酸，它们都是相应常见氨基酸的衍生物。如4-羟脯氨酸（4-hydroxyproline），存在于动物的纤维蛋白、胶原蛋白及某些植物蛋白（如烟草细胞壁的糖蛋白）；又如胶原蛋白中的5-羟赖氨酸（5-hydroxylysine）和肌球蛋白中的6-N-甲基赖氨酸（6-N-methyllysine）都是赖氨酸的衍生物。
三、非蛋白质氨基酸
有些氨基酸以游离或结合态存在于各种细胞或组织中，但不存在于蛋白质中。生物体内已发现数百种非蛋白质氨基酸。大部分是常见氨基酸的衍生物，但也有D-型和一些β、γ或δ-氨基酸。如参与细菌细胞壁组成的肽聚糖中存在有D-谷氨酸和D-丙氨酸，短菌杆肽S（gramicidin）中的D-苯丙氨酸等。
这些非蛋白质氨基酸中，有些是重要的代谢物前体或中间产物。如β-丙氨酸是维生素B3（泛酸）的前体；瓜氨酸（citrulline）和鸟氨酸（ornithine）是合成精氨酸的前体。γ-氨基丁酸是一种神精递质。
四、氨基酸的理化性质
1．两性解离与等电点依照Bronsted - Lowry的酸碱质子理论，酸是质子(H＋)供体（donor），碱是质子的受体（acceptor）。酸碱的相互关系如下：
HA＝A－＋H＋
酸 碱 质子这里原始的酸（HA）和生成的碱（A-）被称为共轭酸-碱对。
根据这一理论，氨基酸在水中的偶极离子既起酸（质子供体）的作用：
也起碱（质子受体）的作用。
同一个氨基酸分子上带有能释放出质子的-NH3＋正离子和能接受质子的-COO－负离子，是两性离子。氨基酸具有两性解离的特点，因此是两性电解质。
完全质子化的氨基酸可以看成是多元酸，侧链不能解离的中性氨基酸可看作是二元酸，酸性氨基酸和碱性氨基酸可视为三元酸。现以甘氨酸为例说明氨基酸的解离情况。 它分步解离如下：
(3.1)
(3.2)
在上列公式中，K′1和K′2分别代表α-碳原子上的-COO－和-N＋H3 的表观解离常数。如果侧链 R基上有可解离的基团，其表观解离常数用K′R表示。
物质的表观解离常数可以用测定滴定曲线的实验方法求得。当lmol甘氨酸溶于水时，溶液的pH值约等于6，如果用标准NaOH进行滴定，以加入的NaOH的摩尔数对pH值作图，则得滴定曲线B(图3-2)在 pH值9.6处有一拐点。从甘氨酸的解离公式(3.2)可知，当滴定至H3＋N—CH2—COO－有一半变成H2N—CH2—COO－，即[ R０]＝[ R－]时,则K′2＝[H＋],两边各取负对数得pK′2=pH，这就是曲线B拐点处的pH值(9.6)。如果用标准盐酸滴定，以加入的盐酸摩尔数对pH值作图，则得滴定曲线A，在pH值2.34处有一拐点。同样，从解离公式(3.1)可知,pK′1＝2.34，这里 H3＋N—CH2—COO—和H3＋N—CH2—COOH的摩尔浓度相等，即[R＋]＝[R０]。如果利用PH=p K′+lg[质子受体]/[质子供体]以及所给的pK′1值和pK′2值等数据，即可计算出任一pH值条件下一种氨基酸的各种离子的比例。
图3-2 甘氨酸的解离曲线（方框内表示在解离曲线拐点处的pH值时所具有的离子形式）
为了判断滴定曲线上的两个拐点——pH值2.34和9.60究竟代表甘氨酸中哪个基团的解离，可以把它们与脂肪酸和脂肪胺的pK′值进行对比。脂肪酸中的—COOH基 pK′值一般在4～5，脂肪胺中的—N＋H3的pK′值一般在9～10。所以最可能的是pK1′＝2.34代表甘氨酸中—COOH基的解离，pK2′＝9.60代表甘氨酸中—N＋H3基的解离。甘氨酸中的—COOH基的酸性要比醋酸(pK′＝4.76)强100多倍，这是因为邻近的—N＋H3基的正电荷对—COOH的质子(H＋)产生静电排斥因而增强了—COOH基释放质子的趋势，用下式表示：
含一氨基一羧基和不解离R基的氨基酸都具有类似甘氨酸的滴定曲线。这类氨基酸的pK′值相当于pK1′的范围为2.0～3.0，pK2′为9.0～10.0 （见表3-8）。带有可解离R基的氨基酸，相当于三元酸，有三个pK′值，因此滴定曲线比较复杂。
从甘氨酸的解离公式或解离曲线可以看到，氨基酸的带电状况与溶液的pH值有关，改变pH值可以使氨基酸带上正电荷或负电荷，也可以使它处于正负电荷数相等即净电荷为零的兼性离子状态。图3-2中曲线A和B之间的拐点(pI=5.97)就是甘氨酸处于净电荷为零时的pH值，称为等电点(isoelectric point，缩写为pI)或等电pH值(pHI)。在等电pH值时，氨基酸在电场中既不向正极也不向负极移动，即处于兼性离子(极少数为中性分子)状态，少数离子成阳离子和阴离子，但解离成阳离子和阴离子的数目相等。
对侧链R基不解离的中性氨基酸来说，其等电点是它的pKl′和pK2′的算术平均值。
在等电点以上的任何pH值，氨基酸带净负电荷，并因此在电场中向正极移动。在低于等电点的任一 pH值，氨基酸带有净正电荷，在电场中向负极移动。在一定pH值范围内，氨基酸溶液的pH值离等电点越远，氨基酸所携带的净电荷越大。
20种基本氨基酸，除组氨酸外，在生理pH值(pH值为7左右)下都没有明显的缓冲容量。因为这些氨基酸的pK′值都不在pH值7附近(表3-8)，而缓冲容量只在接近pK′值时才显现出来。从表3-8和图3-2可见，组氨酸咪唑基的pK′R值为6.0，在pH值为7附近有明显的缓冲作用。
表3-8 氨基酸的表观解离常数和等电点氨基酸
pK1′（-COOH）
pK2′（-NH3）
pKR′(R—基团)
pI
甘氨酸
2.34
9.60
5.97
丙氨酸
2.34
9.69
6.02
缬氨酸
2.32
9.62
5.97
亮氨酸
2.36
9.60
5.98
异亮氨酸
2.36
9.68
6.02
丝氨酸
2.21
9.15
5.68
苏氨酸
2.63
10.43
6.53
天冬氨酸
2.09
9.82
3.86(β-COOH)
2.97
天冬酰胺
2.02
8.8
5.41
谷氨酸
2.19
9.67
4.25(γ-COOH)
3.22
谷氨酰胺
2.17
9.13
5.65
精氨酸
2.17
9.04
12,48（胍基）
10.76
赖氨酸
2.18
8.95
10,53（ε-NH2）
9.74
组氨酸
1.82
9.17
6,00( 咪唑基)
7.59
半胱氨酸
1.71
8.33
10,78( —SH)
5.02
甲硫氨酸
2.28
9.21
5.75
苯丙氨酸
1.83
9.13
5.48
酪氨酸
2.20
9.11
10,07(—OH)
5.66
色氨酸
2.38
9.39
5.89
脯氨酸
1.99
10.60
6.30
注：除半胱氨酸是30℃时的测定值外，其他氨基酸都是25℃时的测定值。
2．吸收光谱参与蛋白质组成的20种氨基酸，在可见光区域都没有光吸收，但在远紫外区域(＜220 nm均有光吸收。在近紫外区域(220～300 nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。因为它们的R 基含有苯环共轭双键系统。酪氨酸的最大光吸收波长在275 nm，苯丙氨酸的在257 nm，色氨酸的在280 nm。
蛋白质由于含有这些氨基酸，因此也有紫外吸收能力。一般最大光吸收在波长280 nm处，因此利用分光光度法能很方便地测定蛋白质的含量。但是在不同的蛋白质中这些氨基酸的含量不同，所以它们的消光系数（或称吸收系数）是不完全一样的。
3．除甘氨酸外都具有旋光性
4．重要化学反应
氨基酸的化学反应主要是指它的(-氨基和α-羧基以及侧链上的功能团所参与的那些反应。
（1）与亚硝酸反应 在室温下亚硝酸能与含游离α-氨基的氨基酸起反应，定量地放出氮气，氨基酸被氧化成羟酸(含亚氨基的脯氨酸则不能与亚硝酸反应)。其反应式如下：
在标准条件下测定生成的氮气体积，即可计算出氨基酸的量，用此方法反应很快，也较为准确，是定量测定氨基酸的方法之一（此反应是Vanslyke氨基氮测定法的基础）。此法还可用于蛋白质水解程度的测定。
这里值得注意的是生成的氮气(N2)只有一半来自氨基酸。此外应该指出，除α-NH2外，赖氨酸的ε-NH2也能与亚硝酸反应，但速度较慢。而α-NH2作用3～4min即完成反应。
（2）与2，4-二硝基氟苯的反应 在弱碱性溶液中，氨基酸的α- 氨基很容易与2，4-二硝基氟苯（DNFB）作用，生成稳定的黄色2，4-二硝基苯基氨基酸（简写为DNP-氨基酸）。
这个反应首先被英国的Sanger用来鉴定多肽或蛋白质的N末端氨基酸。
（3）与异硫氰酸苯酯反应 在弱碱性条件下，氨基酸中的α-氨基还可以与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，产生相应的苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸）。在无水酸中，PTC-氨基酸即环化为苯硫乙内酰脲（PTH），后者在酸中极稳定。
这些衍生物是无色的，可用层析法加以分离鉴定。这个反应首先被Edman用于鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸。它在多肽和蛋白质的氨基酸顺序分析方面占有重要地位。
（4）与茚三酮反应 在氨基酸的分析化学中，具有特殊意义的是氨基酸与茚三酮的反应。茚三酮在弱酸性溶液中与α-氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氨、脱羧反应，最后茚三酮与反应物──氨和还原茚三酮发生作用，生成蓝紫色物质。其反应如下,
用纸层析或柱层析把各种氨基酸分开后，利用茚三酮显色可以定性或定量测定各种氨基酸。定量释放的CO2用测压法测量，从而计算出参加反应的氨基酸量。
两个亚氨基酸──脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应形成黄色化合物。
第三节 肽
一、肽键、肽链、肽单位、氨基酸残基和肽的命名一个氨基酸的α-羧基和另一个氨基酸的α-氨基脱水缩合而成的化合物叫肽。氨基酸之间脱水后形成的键叫肽键(peptide bond)，又称为酰胺键，写作—CO—NH—（反式立体结构）。最简单的肽由两个氨基酸组成，称为二肽(dipeptide)，其中包含一个肽键。含有三个、四个氨基酸的肽分别称为三肽、四肽。10个以上氨基酸所生成的肽称为多肽，多肽为链状结构，所以多肽也叫多肽链。肽链中氨基酸由于参加肽键的形成已经不是原来完整的分子，因此称为氨基酸残基（amino acid residue）。多肽链中每一氨基酸单位在形成肽键时都丢失1分子水。严格地说每形成一个肽键丢失1分子水，因此丢失的水分子数比氨基酸残基数少1个。一条多肽链通常在一端含有一个游离的末端氨基，在另一端含有一个游离的末端羧基。这两个游离的末端基团有时连接而成环状肽(cyclic peptide)。肽的命名是根据参与其组成的氨基酸残基来确定的。规定从肽链的NH2末端氨基酸残基开始，称为某氨基酰某氨基酰……某氨基酸。例如，具有下列化学结构的五肽命名为丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸，简写为 Ser—Gly－Tyr—Ala—Leu。
肽链也像氨基酸一样具有极性，通常总是把NH2末端氨基酸残基放在左边,COOH末端氨基酸残基放在右边。除特别指明者外，上面举例的五肽丝氨酸残基一侧为NH2末端，亮氨酸残基一侧为 COOH末端。注意，反过来书写的 Leu—Ala—Tyr—Gly—Ser是与前者不同的另一种五肽。从上面五肽的化学结构可以看出，肽链中的骨干是由右示单位规则地重复排列而成的，称之为共价主链(main backbond)。各种肽链的主链结构都是一样的，但侧链R基的顺序即氨基酸残基顺序不同。肽链主链上的重复结构称为肽单位( peptideunit )或肽基(peptide group)。肽键的实际结构是一个共振杂化体（resonance hybrid）。由于氮电子离域形成了包括肽键的羰基氧、羰基碳和酰胺氮在内的O—C—N(系统，因此主链肽键C—N具有双键性质而不能自由旋转，据测定C—N单键的键长是0.148nm；C＝N双键的键长是0.127nm；据预测肽键（共振杂化体）中的C…N的键长应介于两者之间。X-射线衍射分析证实，肽键中C…N的键长为0.132nm，结果肽键的所有4个原子和与之相连的两个α-碳原子（习惯上称为Cα）都处于一个平面内，此刚性结构的平面称为肽平面（peptide plane）或酰胺平面（图3-3），每一个肽单位实际上就是一个肽平面。肽平面内的C＝O与N—H呈反式排列，各原子间的键长和键角都是固定的。
二、重要的寡肽及其应用
在生物体内,氨基酸通过肽键连接,除了合成蛋白质多肽链外,还能合成一些具有调节功能的小分子肽,称为生物活性肽。肽广泛存在于动植物组织中，有一些在生物体内具有特殊功能。据近年来对活性肽的研究，生物的生长发育、细胞分化、大脑活动、肿瘤病变、免疫防御、生殖控制、抗衰老、生物钟规律及分子进化等均涉及到活性肽。
（1）谷胱甘肽 动植物细胞中都含有一种三肽，称为还原型谷胱甘肽(reduced glutathion) 即(-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，因为它含有游离的－SH，所以常用GSH来表示。它的分子中有一特殊的(-肽键，是谷氨酸的(-羧基与半胱氨酸的α-氨基缩合而成，显然这与蛋白质分子中的肽键不同。结构式如下,
还原型谷肽甘肽(GSH) 氧化型谷胱甘肽(GSSG)
由于GSH中含有一个活泼的巯基，很容易氧化，两分子GSH脱氢以二硫键相连就成为氧化型谷胱甘肽(GSSG)。谷胱甘肽作为清除剂与有害的氧化剂作用可以保护含巯基的蛋白质，还是某些酶的辅酶，在体内氧化还原过程中起重要作用。
（2）脑啡肽 在小的活性肽中一类称为脑啡肽(enkephalins)的物质近年来很引人注意。它是一类比吗啡更有镇痛作用的五肽物质。1975年底将其结构搞清，并从猪脑中分离出两种类型的脑啡肽。其结构如下：
甲硫氨酸型脑啡肽(Met-脑啡肽)
H· Tyr· Gly· Gly· Phe·Met·OH
亮氨酸型脑啡肽(Leu-脑啡肽)
H· Tyr· Gly· Gly· phe· Leu·OH
由于脑啡肽类物质是高等动物脑组织中原来就有的，因此对它们进行深入研究不仅有可能人工合成出一类既有镇痛作用而又不会像吗啡那佯使病人上瘾的药物来，更重要的是为分子神经生物学的研究开阔了思路，从而可以在分子基础上阐明大脑的活动。
（3）加压素 加压素是脑下垂体后叶所分泌的多肽激素，由九个肽组成，呈环状结构，其简式如下：
加压素的功能是促进血管平滑肌收缩和抗利尿作用，因此临床上用于治疗尿崩症和肺咯血。
第四节 蛋白质的分子结构
蛋白质是生物体中功能最多样化的生物大分子。它们在功能上的多样化决定于构象上的多样化。蛋白质的基本结构是由氨基酸残基构成的多肽链，再由一条或一条以上的多肽链按一定的方式组合成具有特定结构的生物活性分子。随着肽链数目、氨基酸的组成及其排列顺序不同就形成了不同的蛋白质。
根据对不同种类、不同形状、不同功能的蛋白质三维结构的研究，已确认蛋白质的结构有不同的层次，人们为了认识的方便通常将其分为一级结构、二级结构、超二级结构、结构域、三级结构及四级结构。
一、蛋白质的一级结构
1．一级结构的含义及重要性
1969年，国际纯化学和应用化学协会经过讨论，规定一级结构只指肽链中的氨基酸的排列顺序，其他内容属于一般的化学结构。这种规定对于讨论“一级结构决定高级结构”这一命题是有意义的。
1953年，Sanger等人经过将近10年的努力，首次完成了牛胰岛素的氨基酸顺序的测定，目前一级结构已经测定的蛋白质数量日益增多，主要的有胰岛素、细胞色素c、血红蛋白、肌红蛋白、烟草花叶病毒蛋白、牛胰核糖核酸酶及溶菌酶等。
胰岛素是一级结构首先被揭示的蛋白质，是动物胰岛细胞分泌的一种激素蛋白。胰岛素分子由51个氨基酸残基组成，相对分子质量为5734，它由两条肽链组成，一条称为A链，是21肽；另一条称为B链，是30肽。A链和B链由两对二硫键连接起来。在A链内还有一个由二硫键形成的链内小环(图3-4)。
图3-4 牛胰岛素的化学结构
Pr一级结构研究的内容：多肽链的数目、排列顺序、链内或链间二硫键的形成。
测定一级结构的意 义在于：（1） 不仅使人工合成有生物活性的蛋白质和多肽成为可能，而且对于揭示一级结构与生物功能间的关系也有着特别重要的意义。我国生化工作者根据胰岛素的氨基酸顺序于1965年用人工方法合成了具有生物活性的牛胰岛素，第一次成功地完成了蛋白质的全合成，为生物化学的发展作出了重大贡献。此外，（2） 人们可以从比较生物化学（Comparative biochemistry）的角度分析比较功能相同、而种属来源不同的蛋白质的一级结构差异，为生物进化提供生物化学依据；（3）也可以分析比较同种蛋白质的个体差异，为遗传疾病的诊治提供可靠依据。镰刀形红细胞分贫血病在非洲人中比较常见患者的红细胞合成了一种不正常的血红蛋白（HbS），正常人的血红蛋白（HbA），研究发现差别在于AA顺序上，即HbA：β-链N-端第6位AA为Glu；
HbS：β-链N-端第6位AA为Val；
因为Glu在生理PH下为带负电荷的极性R基团AA，Val在生理PH下为非极性R基团AA，就使得分子表面的减少，影响分子的正常聚集，致使体积下降，溶解度降低，血球随之收缩为镰刀形，以致输氧能力下降，细胞变得脆弱发生溶血。
2,测定一级结构的基本原理和方法
人们已知的数百种多肽和蛋白质顺序的测定，大都是采用F,Sanger实验室所确立的方法。基本上包括从多肽链的某一自由末端起依次将氨基酸残基切下并逐个进行鉴定。但是，在特定的分解反应中，要使所需产物的产率达到100％实际上是很困难的。这样就会给长肽链顺序的测定带来一些问题。因为当末端残基逐步分解时，每切下一个残基都会产生相应短的肽链产物，而每一步产物的量在反应体系内所占的比例将依次减小；相反，从最短肽链上切下的氨基酸与前几步尚未反应的较长肽链上所切下的氨基酸相混的机会不断增多。这是一个根本性的化学限制因素。正是这个因素决定了氨基酸顺序测定的战略，也就是说，应该先把多肽链降解成足够短的顺序以便使化学反应能够产生可靠的结果，然后再把这些结果组合成整条多肽链的顺序。在蛋白质顺序测定中实际所采用的步骤是：
（1）将待测蛋白质进行纯化
（2）拆开所有二硫键 若多肽链之间或多肽链内部存在二硫键，在测定肽链的氨基酸顺序之前必须把二硫键拆开，以获得伸展的肽链，这样才能进行氨基酸顺序的测定。最常用的方法是还原法和氧化法。还原法是用过量的巯基乙醇(mercaptoethanol) 或二硫苏糖醇（dithiothr eitol,简称DTT）等巯基化合物使二硫键拆开被还原为半胱氨酸残基的巯基（——SH）。为防止巯基被氧化需要对巯基加以保护，常用的保护剂是碘乙酸。氧化法常用过甲酸（CHOOOH）作为氧化剂使二硫键氧化成半胱氨磺酸。
S S
A链
S S
胰岛素
S S
B链
β-巯基乙醇
SH SH
A链
SH SH
SH SH
B链
碘乙酸
SCH2COOH SCH2COOH
A链
SCH2COOH SCH2COOH
SCH2COOH SCH2COOH
B链
（3）测定氨基末端和羧基末端的氨基酸 要识别氨基末端的氨基酸可以通过二硝基氟苯(DNFB)与之反应，然后经过酸水解,FDNB标记的氨基末端氨基酸即被释放出来，它具有较深的颜色，可根据它在薄层层析或纸电泳中的迁移特性进行鉴定。
羧基末端氨基酸的化学测定法至今还不能令人满意。该法是将肽链用无水肼在100℃条件下进行处理，由于其他所有的氨基酸残基都变成相应的氨基肼化合物，只有羧基末端氨基酸仍以游离氨基酸形式存在，因此可用层析法分离鉴定，或者可以将肽链用羧肽酶进行限制性酶解。由于反应产物中的游离氨基酸主要是羧基末端氨基酸，因而可用层析法鉴定其类型。
（4）至少要用两种不同的方法将多肽链专一性地裂解成小肽段 要完成这一步骤可用肽链内切酶，它能催化多肽链在特定的位点上发生分解。图3-5所列举的四种专一性的酶通常用于这一步骤。与溴化氢进行反应是一种特有的化学方法，它能使多肽链在甲硫氨酸残基处专一性地发生裂解，并且同时将羧基末端的甲硫氨酸转变成高丝氨酸内酯。尽管由甲硫氨酸转变而来的这一反应产物与20种天然氨基酸有所不同，但是通过它进一步转变成高丝氨酸还是容易鉴定的。
胰蛋白酶 R1＝Lys或 Arg侧链(专一要求，水解速度快)；
R2＝Pro(抑制水解)
糜蛋白酶 R1＝Phe、Trp或 Tyr(水解速度快)； Leu,Met或 His (水解速度次之)
R2＝Pro(抑制水解)
嗜热菌蛋白酶 R1＝Leu,Ile,Phe,Trp,Val,Tyr或 Met(疏水性强的残基，水解速度快)
R2＝Gly或 Pro(不水解)
R1或 R3＝Pro(抑制水解)
胃蛋白酶 R 1和 R2＝Phe,Leu,Trp,Tyr以及其他疏水性残基(水解速度快)
R1＝Pro(不水解)
图3-5 几种蛋白水解酶(内肽酶)的专一性
（5）小肽段的分离及氨基酸顺序测定 由完整的蛋白质多肽链裂解而成的肽段的分离通常采用离子交换层析法。肽段经过分离以后可用不同的方法进行分析，既可以测定它们的氨基酸组成，也可以测定它们的氨基酸顺序。用前面介绍的苯异硫氰酸法可以测定分离后的肽段的氨基酸顺序，这种方法又叫Edman降解法，它是将多肽链上的氨基酸从氨基末端逐个切下，以乙内酰苯硫脲的衍生物形式释放出来，而这些衍生物可以根据它们的薄层层析性质进行测定。
测定肽段的氨基酸顺序还可以使用顺序分析仪，它是将Edman降解法自动化。测定速度有很大提高，也比人工测定精确。
（6）用片段重叠法确定整个肽链的氨基酸顺序 在各个肽段的顺序确定下来以后，接着就要弄清这些肽段在完整的蛋白质中是怎样衔接的。在这一步中，必须对用两种不同的专一性分解方法得来的肽段进行顺序分析。只有这样，才足以确定蛋白质的完整顺序。因为两套顺序中含有交叠顺序，就是说，在用第一种专一性分解方法所产生的肽段中，那些具有游离氨基或游离羧基的残基原先在完整的蛋白质肽链内是连接着的，这些残基在用第二种专一性分解方法所产生的肽段中将重新出现在顺序的内部。
蛋白质一级结构的顺序测定完成后，将未拆开二硫键的同一种蛋白质再一次进行专一性的酶解，由此就可以确定完整的蛋白质中二硫键的位置。
二、蛋白质的空间构象和维持构象的作用力
我们已经认识到不同的蛋白质有不同的氨基酸组成和不同的氨基酸排列顺序。但是，这不是蛋白质之间区别的全部。事实上，通过对蛋白质结构的研究，发现每种蛋白质都能在它特定的一级结构基础上选择它特定的空间构象去完成它特定的生物功能。为了运送氧，血红蛋白的肽链必须按照它所选择的方式折叠；核糖核酸酶必须达到它一定的构象才能同核糖核酸结合并降解它。蛋白质的空间构象就是指蛋白质分子中的原子或基团在三维空间的排列、分布及肽链的走向。
1．构型与构象的概念构象和构型是两个容易混淆的概念。 一个分子内的原子间的关系在化学家的手中表达成平面式，例如某种氨基酸，我们通常写成平面结构式,
但这仅仅是为了表达和交流的方便。分子内原子间的关系是立体的。构象和构型就是从不同的角度来表述这种立体的关系。构型(configuration)是指不对称碳原子所连接的四个不同的原子或基团在空间中的两种不同的排列（图3-6）。而构象( conformation)是指一个由几个碳原子组成的分子，因一些单键的旋转而形成的不同碳原子上各取代基团或原子的空间排列。构型的改变必然会引起共价键的破坏，并形成一些新键（如氨基酸由D型变成L型）。构象的改变并不需要共价键的断裂，只需要单键的旋转就可以产生新的构象。
多肽链的共价主链形式上都是单键。因此，可以设想一个多肽主链将可能有无限多种构象，并且由于热运动，任何一种特定的多肽构象还将发生不断变化。然而目前已知一个蛋白质的多肽链在维持生物体正常运转的温度和pH值条件下，只有一种或很少几种构象。这种天然构象保证了它的生物活性，并且相当稳定，甚至蛋白质被分离出来以后，仍然保持着天然状态。这一事实说明了天然蛋白质主链上的单链并不能自由旋转。
图3-6 立体异构体的构型
（这种异构体没有共价键的破裂不能互变）
2．蛋白质构象的作用力现已知道，维持和稳定蛋白质分子构象的作用力有氢键、疏水作用力、范德华力、离子键和二硫键(图3-7)。
图3-7 维持蛋白质三级结构的各种作用力
① 离子键；② 氢键； ③ 疏水作用； ④ 范德华力； ⑤ 二硫键
(1) 氢键 由电负性较强的原子与氢形成的基团如N－H和O－H具有很大偶极距，成键电子云分布偏向电负性大的原子核，因此氢原子核周围的电子分布就少，正电荷的氢核（质子）就在外侧裸露。这一正电荷氢核遇到另一个电负性强的原子时，就产生静电吸引，即所谓的氢键（hydrogen bond）。
x — H … y
这里x、y是电负性强的原子（N、O、S等），x—H是共价键。H…y是氢键 。x是氢（质子）的供体，y是氢（质子）的受体。氢键具有两个重要特征，一个是方向性，相互吸引的方向沿氢受体y的孤电子对轨道轴，受体y与供体x之间的角度接近180o；另一个是饱和性，表现在一般情况下x—H只能和一个y原子相结合。饱和性是由于H原子较小，而供体和受体的原子都相当大，这样它们将排斥另一个受体原子再与氢结合。
氢键在维持蛋白质的结构中起着极其重要的作用。多肽链主链上的羰基氧和酰胺氢之间形成的氢键是维持蛋白质二级结构的主要作用力。除此之外，氢键还可以在侧链与侧链、侧链与介质水、主链肽基与侧链或主链肽基与水之间形成。大多数蛋白质所采取的折叠策略是使主链肽基之间形成最大数目的分子内氢键（如α-螺旋，β-折叠），与此同时保持大部分能成氢键的侧链处于蛋白质分子的表面而与水相互作用。
(2) 疏水作用力 疏水作用力(hydrophobic iteraction)是指非极性基团即疏水基团为了避开水相而群集在一起的集合力。水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子内部，这种现象就是疏水作用或疏水效应。也曾称为疏水键。它在维持蛋白质的三级结构方面占有突出的地位。疏水作用其实并不是疏水基团之间有什么吸引力的缘故，而是疏水基团或疏水侧链出自避开水的需要而被迫接近。当然，当疏水基团接近到等于范德华间距时，相互间将有弱的范德华引力。
疏水作用在室温范围内随温度的升高而增加。超过最高温度(40～60℃，因侧链不同而异)后复又减弱。
(3) 范德华力 在物质的聚集状态中，分子与分子之间存在着一种较弱的作用力。早在1873年范德华就已注意到这种力的存在，并考虑这种力的影响和分子本身占有体积的事实，提出了著名的范德华状态方程。以后，人们把中性分子或中性原子之间的作用力称为范德华力。
范德华力包括两种类型的相互作用：一种是吸引作用；另一种是排斥作用。前者称为范德华引力；后者称为范德华斥力。一般认为，范德华引力有三种表现形式：① 极性基团之间偶极与偶极的相互吸引(取向力)；② 极性基团的偶极与非极性基团的诱导偶极之间的相互吸引(诱导力)；③ 非极性基团瞬时偶极之间的相互吸引(色散力)。其共同的特点是：引力随作用基团之间距离的增大而迅速减小，但两个作用基团只相互吸引，并不相碰。因为当它们靠得很近时，电子云之间会发生排斥，从而产生范德华斥力。因此上述两个基团之间的作用距离是由范德华引力和范德华斥力的平衡来决定的。这种距离称为范德华间距。两个共价键键合的原子之间的范德华间距等于它们各自的范德华半径之和。
迄今所测得的蛋白质构象都显示出蛋白质分子内的基团是紧密堆积的。这表明，在蛋白质分子内无疑存在着范德华力，它对维持和稳定蛋白质的三、四级结构具有一定贡献。
(4) 离子键 离子键又称盐键、盐桥或静电作用力。它是由带相反电荷的两个基团间的静电吸引所形成的。
在蛋白质分子中，通常有带正电荷的基团和带负电荷的基团。其中，带正电荷的基团有：N—末端的α-NH3＋，肽链中赖氨酸残基的ε-NH3＋等；带负电荷的基团有：C—末端的α-COO-，肽链中天门冬氨酸残基的β-COO-，谷氨酸残基的γ-COO-。在蛋白质空间结构与环境都适宜的情况下，正负电荷基团中有一部分是相互接近而形成离子键的。
高浓度的盐、过高或过低的 pH值可以破坏蛋白质构象中的离子键。如果溶液中的pH值比羧基的 pK值低 l~2个 pH单位，或者比氨基的pK值高l~2个 pH值单位，由于上述基团的解离状态或带电状态发生改变，因而它们之间就不能形成离子键。这也是强酸强碱之所以能使蛋白质变性的主要原因。
（5）二硫键 二硫键(disulfide bond)又称为二硫桥或硫硫桥，是两个硫原子之间所形成的共价键。它可以把不同的肽链或同一条肽链的不同部分连接起来，对维持和稳定蛋白质的构象具有重要作用。
二硫键并不指令多肽链的折叠，假如蛋白质中所有二硫键相继被还原，将引起蛋白质的天然构象改变和生物活性丧失。在许多情况下，二硫键可以选择性地被还原，这些实验证明，某些二硫键是生物活性所必需的，另一些二硫键则不是生物活性所必需的，但与维持蛋白质的稳定有关。在绝大多数情况下，二硫键是在多肽链的β-转角附近形成的。
3．立体化学原理
在本章第三节中介绍过，肽平面是一个刚性平面，肽平面内的C＝O与N—Ｈ键呈反式排列，各原子间的键长和键角都是固定的。肽链主链上只有α- 碳原子连接的两个键，如Cα—N1键和Cα—C2键是单键，能自由旋转。绕Cα—N 1键旋转的角度称为Φ角，绕Cα—C 2键旋转的角度称为Ψ角（如图3-3）。原则上Φ和Ψ可以取－180o和+180o之间的任一值，这样多肽链的所有可能构象都能用Φ和Ψ这两个构象角称（为二面角）来描述。当Φ的旋转键N1—Cα两侧的N1—C1和Cα—C2呈顺式时，规定Φ＝0o；同样，Ψ的旋转键Cα—C2两侧的Cα— N1和C 2—N2呈顺式时，规定Ψ＝Oo(图3-8)。从Cα向N1看(见图3-3)，沿顺时针方向旋转 Cα—N1键所形成的Φ角规定为正值，逆时针旋转为负值；从Cα向C2看，沿顺时针旋转Cα—C2键所形成的Ψ角规定为正值，逆时针旋转为负值。
图3-8 相当于Φ＝0o，Ψ＝0o时的构象
由于相邻平面的H原子和O原子之间的空间重叠，
此构象实际上不允许存在。Φ和Ψ同时旋转180o，
则转变为完全伸展的肽链构象（见图3-3）
若把肽链上的原子看作具有特定范德华半径的坚硬球体并制成模型进行模拟试验，人们很快会发现Φ与Ψ角的许多组合不可能存在，因为主链上的原子之间或主链上的原子与
侧链R基团之间会发生空间相撞。例如，图3-9所示的Φ＝0°，Ψ＝0°的构象显然是不可能存在的，若对Φ、Ψ角的所有可能的组合进行观察，则会发现，由于各种各样不利的空间效应，真正能够存在的构象为数有限。在Ramachandran图（简称拉氏图或拉氏构象图），即图3-9上已经表示出构象所允许的Φ、Ψ区域，其中实线封闭的区域是一般允许区，这个区域内的任何二面角所规定的肽链构象都是立体化学所允许的；而虚线封闭的区域是最大允许区(临界限制区)，这个区域内的任何二面角所规定的肽链构象虽是立体化学可以允许的，但不够稳定。该图清楚地表明了允许区域是怎样受到多肽主链和侧链基团的空间效应的限制。不过这里所假设的原子基团是具有特定范德华半径的刚性球体。事实上，分子中的原子并不是刚性球体，所以蛋白质中真正的两面角的大小范围比图中所定的还要大一些。
图3-9 Ramachandran构象图
C＝胶原螺旋；β＝反平行式β－折叠；βP＝平行式β－折叠；
αR和αL ＝右手和左手α－螺旋； 310＝310－螺旋；π＝4．4 16－螺旋。
拉氏图表示的是某些蛋白质Φ，Ψ构象测定值的分布情况。这些蛋白质的三维结构是根据结晶学得知的，它们中的大多数处在空间效应允许的范围内。甘氨酸残基通常例外，其他氨基酸因空间阻碍而不能呈现的构象对甘氨酸来说都是可以的。因为甘氨酸中的R基团是氢原子，与其他氨基酸中同Cα相连的CH2 或CH3基团比较起来小得多。这就消除了主链上的原子与 R基团之间的许多空间效应。当R基团不是氢原子时，氨基酸的构象有可能会受到限制。
总之，我们可以理解，立体化学所允许的构象被限制的如此严格，原因就在于肽链的基本几何特征使肽链上各种原子基团之间产生了不同的空间效应。
三、蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构主要是指蛋白质多肽链中有规则重复的构象。二级结构的基本类型有α-螺旋,β-折叠、β-转角和无规卷曲。它们广泛存在于天然蛋白质内。但各种类型的二级结构并不是均匀地分布在蛋白质中。某些蛋白质，如血红蛋白和肌红蛋白含有大量的α-螺旋，而另一些蛋白质如铁氧还蛋白（ferrredoxin）则不含任何的(-螺旋。不同蛋白质中β-折叠的含量和β-转角的数目也有很大的变化。
1．α-螺旋
α-螺旋(α-he1ix)是蛋白质中最常见、含量最丰富的二级结构。（1） α-螺旋中每个残基(Cα)成对二面角Φ和Ψ各自取同一数值，Φ＝－57o，Ψ＝－48o 即形成具有周期性规则的构象。（2） 多肽链主链环绕中心轴螺旋式的上升，每隔3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈，沿螺旋轴方向上升0.54nm，每个残基绕轴旋转100 o，沿轴上升0.15nm(图3-10)。（3）α-螺旋中氨基酸残基的侧链（R）伸向外侧。（4） 相邻的螺圈之间形成链内氢键，氢键的取向几乎与中心轴平行 。氢键是由肽键上的 N—H中的氢和它后面(N端)第四个残基上的中的氧之间形成的,
n=3
N端 C端这里,n＝3表示氢键封闭的环共包含13个原子(3×3+4)。常用3.613螺旋(n＝3)代表α-螺旋，其中3.6指每圈螺旋含3.6个残基，3.6的右下角的13表示氢键封闭的环内含13个原子。
蛋白质中α-螺旋有左手螺旋和右手螺旋两种，（5）迄今研究过的所有天然蛋白质的α-螺旋绝大多数都是右手螺旋，原因是右手螺旋比左手螺旋稳定。左手α-螺旋虽然很稀少，但也会偶然出现。例如，在嗜热菌蛋白酶中就有很短一段左手α-螺旋，由Asp—Asn—Gly—Gly(226～229)组成。蛋白质多肽链能否形成α-螺旋结构以及形成的螺旋体是否稳定决定于它们的氨基酸组成和排列顺序，如多肽链中有脯氨酸时，α-螺旋就被中断，并产生一个“结节”。这是因为脯氨酸的α-亚氨基上的氢原子参与肽键的形成后，再没有多余的氢原子形成氢键，所以多肽链顺序上有脯氨酸残基时，肽链就拐弯。不再形成α-螺旋。
2．β-折叠(β-pleated sheet )
蛋白质中另一类常见的二级结构是β-折叠(图3-11)。两条或多条几乎完全伸展的肽链并排在一起便形成β-折叠，这时相邻肽链主链上的－NH和C=O之间形成有规则的氢键。
反平行式β-折叠 平行式β-折叠图3-11 β-折叠的平行式和反平行式
由于主链上各个肽单位所包含的NH基和羰基处于反式位置，所以只要把其余的肽键加到折叠片上就能使β-折叠延伸为多股结构。β-折叠可以有两种不同的排列方式。一种是平行式（parallel），肽链的排列方向（N→C）是一顺的，即所有肽链的N末端都在同一方向；另一种反平行式（antiparallel），肽链的极性一顺一倒，N末端间隔同向，如图3-12所示，无论是平行β-折叠还是反平行β-折叠，构成这两种折叠的肽链的构象特点是R基团在折叠片两侧的指向正反交错，而且肽平面基本上都在某一片层的平面上，以保证肽链与肽链之间形成较强的氢键。反平行式β-折叠在纤维轴上的重复周期为0.7nm，而平行式β-折叠是0.65nm，因此平行式的折叠程度略大于反平行式的。
图3-12 β-折叠构象（反平行式）
β-折叠的特点：
(1)是一种肽链相当伸展的结构,肽链中的肽键平面之间折叠成锯齿状
(2) 相邻肽键之间形成氢键维持其稳定性
(3) 两条或多条几乎完全伸展的肽链并排在一起，肽链的走向有正、反两种
(4) R侧链交替分布在片层两侧
3．β-转角
β-转角（β-turn）也称为回折（reverse turn ）、β-弯曲（β-bend ）或发夹结构（hairpin structure ），肽链主链出现1800的回折，这种回折称为β-转角。它是球状蛋白质中发现的又一种二级结构。它有三种类型，每种类型都有4个氨基酸残基（图3-13）。在所有这三种类型的β-转角中，弯曲处的第一个残基的C＝O和第四个残基的NH之间形成一个4→1氢键，产生一种不很稳定的环形结构。类型Ⅰ和类型Ⅱ的关系在于中心肽单位旋转了180o。类型Ⅱ中C３几乎无例外地是甘氨酸残基，否则由于空间位阻，不能形成氢键。类型Ⅲ是在第一个和第三个残基之间形成的一小段3１０-螺旋。类型Ⅰ和类型Ⅲ几乎没有区别，因为它们的C１α的构象是相同的，并且C２α 的构象也相差很小。目前发现的β-转角多数都处在球状蛋白质分子表面，在这里改变多肽链的方向阻力
图3-13 β-转角的三种类型比较小。经考查，β-转角在球状蛋白质中含量是十分丰富的，约占全部残基的1/4。β-转角的构象是由第二残基（C２α）和第三残基（C３α）的二面角（Φ２，Ψ２ ； Φ３,Ψ３）所规定的。类型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的特征二面角见表3-9。
表3-9 类型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的特征二面角类 型
Φ２
Ψ２
Φ３
Ψ３
I
－60°
－30°
－90°
0°
II
－60°
＋120°
＋80°
0°
III
－60°
－30°
－60°
－30°
4．无规则卷曲(nonregular coil)
多肽链主链骨架上的若干肽段在空间的排布有些是有规则的，如能形成α-螺旋、β-折叠、β-转角的构象，而有些却没有规则。这些肽段在空间的不规则排布称为无规则卷曲。无规则卷曲，有人又称之为无规则构象、无规线团、自由折叠或回转。在一般球蛋白分子中，往往含有大量的无规则卷曲，它使蛋白质肽链从整体上形成球状构象。
综上所述，我们可以看出，蛋白质的二级结构通常是指蛋白质多肽链主链在空间中的走向，一般形成有规律的构象，并以氢键来维持主链构象的稳定。这级水平的构象不涉及氨基酸残基的侧链基团在空间的排列。
四、超二级结构和结构域
随着对蛋白质空间结构研究的深入，在二级结构和三级结构之间还可以进一步细分为超二级结构和结构域。
超二级结构（super-secondary structure）
在蛋白质中，特别是球蛋白中，蛋白质不只是有二级结构，经常可以看到由若干相邻的二级结构单元(即α-螺旋、β-折叠片和β-转角等)组合在一起，彼此相互作用，形成有规则、在空间上能辨认的二级结构组合体，充当三级结构的构件称为超二级结构。
已知的超二级结构有三种基本组合形式，即α- 螺旋的组合(αα)，β-折叠组合(βββ)，α-螺旋和β-折叠的组合(βαβ)。
（1）αα 结构 这是一种由两股或三股右手α- 螺旋彼此缠绕而成的左手超螺旋(superhelix)(图3-14a)，重复距离约为14nm。由于超卷曲，螺旋的主链的Φ和Ψ角与正常的α-螺旋略有偏差，每圈螺旋为3.5个残基，而不是通常的3.6个残基。沿轴的重复距离由0.54nm缩短到0.51nm。螺旋之间可能作用的侧链是非极性侧链，它向着超螺旋内部，躲开与水接触；其他的是极性侧链，处于蛋白质分子的表面，与水接触。单个的α-螺旋每隔7个残基重复一次。疏水侧链处于螺旋一侧，位于重复单位的第三到第四个残基。螺旋链之间非极性侧链互相装配紧密，超螺旋的稳定性主要是非极性侧链间的范德华力相互作用的结果。
(2) βαβ结构 最简单的βαβ组合是由二段平行式的β-链和一段连接链组成的，此超二级结构称为βXβ单位(图3-14b)。连接链或是α-螺旋或是无规则卷曲，它大体上反平行于β-链。最常见的βαβ组合是由三段平行式的β-链和二段α-螺旋链构成(图3-14c)，此超二级结构称为Rossmann-折叠（Rossmann-fold ）。几乎在所有的实例（已知有一个例外）中连接链都是以右手交叉连接方式处于β-折叠片的一侧。这是一种拓扑现象，它是由于β-链倾向于右手扭转（twisting）而产生的。
(3) βββ结构 β-曲折是另一种常见的超二级结构，由在一级结构上连续、在β-折叠中相邻的三条反平行式β-链通过紧凑的β-转角连接而成(图3-14d)。
回形拓扑结构（“Greek Key”topology）也是反平行式β-折叠片中常出现的一种超二级结构(图3-14e)。这种结构直接用希腊陶瓷花瓶上的一种常见的图案命名，称为拓扑结构。这种拓扑结构有两种可能的回旋方向，但实际上只存在其中的一种。这种选择的基础尚未确定。
2．结构域结构域(structural domain)或称为辖区，是多肽链在超二级结构的基础上组装而成的。多肽链首先是在某些区域相邻的氨基酸残基形成有规则的二级结构，然后主要又是相邻的二级结构片段集装在一起形成超二级结构。超二级结构以特定的组合方式连接，在一个较大的蛋白质分子中形成两个或多个在空间上可以明显区分的折叠实体，这种实体称为结构域。最常见的结构域含100～200个氨基酸残基，少至40个左右，多至400个以上。结构域是蛋白质三级结构的组件单位，多肽链的折叠最后一步是结构域的缔合。对于那些较小的蛋白质分子或亚基来说，结构域和三级结构往往是一个意思，也就是说这些蛋白质是单结构域的。
从结构形成的角度看，一条长的多肽链先分别折叠成几个相对独立的区域再缔合成三级结构（图3-15），要比整条多肽链直接折叠成三级结构更为合理。从功能角度看，很多多结构域酶的活性中心都位于结构域之间，通过结构域容易构造具有特定三维排布的活性中心。由于结构域之间常常只有一段肽链相连，形成所谓“铰链区”(hinge negion)，使结构域容易发生相对运动，但这种柔性的铰链不可能在亚基之间存在，因为它们之间没有共价键连接，如作较大的运动，亚基将完全分开。结构域之间的这种柔性(fiexibility )将有利于活性中心结合底物和施加应力，有利于别构中心结合调节物和发生别构效应。
图3-15 卵溶菌酶（egg lysozyme）的三级结构结构域是多肽链在超二级结构的基础上组装而成的，组装的基本方式有限。多肽链的手性对蛋白质结构的组织产生很大影响。精细构象能的计算表明，最稳定的β-链构象具有轻度右手扭转倾向。β-链的这种右手扭转倾向实际上给所有已知的蛋白质带来两个不同但又有联系的结构效果。这些效果对蛋白质结构的组织十分重要，因为扭转的β-链常是构成蛋白质结构的骨架。一个效果反应在球状蛋白质中平行β-折叠片的β-链间的交叉连接都是右手的，这一点曾在超二级结构βαβ组合中看到 ；另一个效果反映在对球状蛋白质中平行β-折叠片的几何形状的影响。球状蛋白质中大的平行β-折叠片是由多个βαβ超二级结构组装而成的，组装后β-折叠片的形状取决于相邻β-链间氢键的排列式样。有的形成β-圆桶（β-barrel）或称圆柱（cylinder），如丙糖磷酸异构酶(triose phosphate isomerase )和丙酮酸激酶结构域I（Pyruvafie Kinase domain I ）的结构所示（图3-16a），它们的中心部分是平行的β-链组成的内桶，周围由α-螺旋组成外桶，内外桶紧挨在一起，中心空间只能容纳折叠片的疏水侧链。有的形成马鞍形（saddle shape ），如乳酸脱氢酶结构域I（lactatedehydrogenase doamin I ）黄素氧还蛋白（flavodoxin）的结构（如图3-16b）。这里马鞍形平行β-折叠片的两侧各有一层α- 螺旋和环（loop ）。
球状蛋白质中一个稳定的α-螺旋组装方式是4-α-螺旋索（4-α-helicalbandle） 。在此排布四个约等长的α-螺旋依次与其最近邻的螺旋相连，螺旋索的横截面大体呈方形，如蚯蚓血红蛋白(hemerythrin)的结构(如图3-17)。上面介绍了结构域的一些组织式样。有时，一种蛋白质中的结构域彼此十分不同，如木瓜蛋白酶(papain)中的两个结构域。但在有些蛋白质中结构域彼此极其相似，如硫氰酸酶(rhodanase)。两个相似的结构域经常是二重对称
磷酸丙糖异构酶（侧面） 磷酸丙糖异构酶（顶面） 丙酮酸激酶结构域1
a
乳酸脱氢酶结构域1（侧面） 乳酸脱氢酶结构域1（顶面） 磷酸甘油酸激酶结构域2
b
轴的关系。一个亚基中两个结构域之间的紧密程度不一，有的两个结构域各自独立成球状实体，中间仅由一段柔性的肽链连接；有的相互间接触面宽而紧密，整个亚基的外表是一个平整的球面。此外还有一些中间类型也是常见的，如磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase)的整个亚基伸长，结构域之间有一裂沟。
五、蛋白质的三级结构
1．蛋白质三级结构的概念及特点蛋白质分子的三级结构是指一条多肽链在二级结构(包括超二级结构和结构域)的基础上进一步盘曲或折叠，形成包括主、侧链在内的专一性空间排布。对于单链蛋白质，三级结构就是分子本身的特征性主体结构；对于多链蛋白质，三级结构则是各组成链(亚基)的主链和侧链的空间排布。生物体重要的生命活动都与蛋白质的三级结构直接相关并且对三级结构有严格要求。 所以三级结构是蛋白质构象中一个至关重要的等级式层次，从整体观念看，它实际包含着除亚基缔合以外的蛋白质分子结构的全部内容。据不完全统计，到目前为止已经确定的蛋白质结构大约有200种，从中看到可供选择的空间排布是多种多样的，因为蛋白质每一个不同的顺序总是与一种独特的三级结构相关联的。然而，经仔细比较发现许多蛋白质的三级结构具有某些相似之处，其基本特征是,
（1）在蛋白质分子中，一条多肽链往往是通过一部分α- 螺旋、一部分β-折叠、一部分β-转角和一部分无规则卷曲形成紧密的球状构象。
在两条链之间或一条肽链的不同肽段之间，有时存在着平行β-折叠或反平行β-折叠。β-折叠的含量因蛋白质的不同而异。
在180°的肽链转折处往往有α-转角。
在螺旋与螺旋之间、β-折叠与β-折叠之间或者螺旋与β-折叠之间往往是无规则卷曲。
（2）在蛋白质分子中，大多数非极性侧链总是埋在分子的内部形成疏水核；而大多数极性侧链总是暴露在分子的表面，形成亲水区。极性基团的种类、数目与排布决定了蛋白质的功能。
有不少较大的蛋白质分子含有几个区域即结构域，它们都是紧密的球状构象。结构域的划分往往是与功能相联系的。
（3）在蛋白质分子的表面，往往有一个内陷的空穴（裂隙、凹槽、袋）。此空穴往往是疏水区，能够容纳一个或两个小分子配体或大分子配体的一部分。对酶分子的活性来说，此空穴正好容纳一个或两个小分子底物，或大分子底物的一部分，此即酶分子的活性部位。对肌红蛋白、血红蛋白、细胞色素c来说，此空穴正好容纳一个血红素分子。
（4）主要靠疏水键、氢键、盐键等维持其稳定性。
2．肌红蛋白的三级结构与功能
肌红蛋白(myoglobin)是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质。在潜水哺乳类如鲸、海豹和海豚的肌肉中肌红蛋白含量特别丰富，以致使它们的肌肉呈棕色。由于肌红蛋白储氧使这些动物能长时间潜在水下。 肌红蛋白在功能和结构上和血红蛋白极为相近。它由一条多肽链构成，有153个氨基酸残基及一个血红素（heme）辅基，相对分子质量为17 800。1963年Kendrew及其同事由鲸肌红蛋白的 X射线衍射图案测定了它的空间结构(图3-18)。肌红蛋白整个分子是按照复杂而不对称的方式盘绕成一个圆中空的结构。肌红蛋白的特点是整个分子中肽链有77％呈α-螺旋体构象。有8段长度为7～24个氨基酸残基的α-螺旋体。在拐角处，α-螺旋体受到破坏，在这些拐角都有一段l～8个氨基酸残基的松散肽链，在 C—末端也有一段5个氨基酸残基的松散肽链。肌红蛋白中四个脯氨酸残基各自处在一个拐弯处，一些难成α-螺旋体的氨基酸，如异亮氨酸、丝氨酸等，也在此处出现。肌红蛋白整个分子显得十分致密结实，分子内部只有一个适于包含4个水分子的空间。具有极性基团侧链的氨基酸残基几乎全部分布在分子的表面，这些氨基酸残基侧链上的极性基团正可以与水分子结合，而使肌红蛋白成为可溶性，而非极性的残基则被埋在分子内部，不与水接触。血红素辅基垂直地伸出分子表面，并通过组氨酸残基与肌红蛋白分子内部相连。在吡咯中央的Fe原子的配体中，四个是平面卟啉分子的N，组氨酸残基的咪唑基是它的第五个配位体，第六个配体处于“开放”状态，用作O２结合部位。
图3-18 抹香鲸肌红蛋白的三级结构
(根据0.2nm分辨率的资料分析所得的结构)
六、蛋白质的四级结构
1．有关四级结构的一些概念许多生物活性蛋白质是由两条或多条肽链构成，肽链与肽链之间并不是通过共价键相连，而是由非共价键缔合在一起。每条多肽链都有自已的一级、二级和三级结构。在这种蛋白质中，每条肽链就被称为亚基或亚单位（subunit）。亚基一般只是一条多肽链，但有的亚基由二条或多条多肽链组成，这些多肽链相互间以二硫键相连。蛋白质分子的亚基数目一般为偶数，其中含2个或4个亚基的蛋白质占多数，奇数亚基构成的蛋白质就目前所知，只不过10多种。由二个亚基组成的称为二（聚）体蛋白质，由四个亚基组成的称为四（聚）体蛋白质，由二个或多个亚基组成的蛋白质统称寡聚蛋白质或多体蛋白质（multimericprotein ）。所谓蛋白质的四级结构就是指各个亚基在寡聚蛋白质的天然构象中的几何位置和它们之间的相互关系。在四级结构中，亚基可以是相同的或不同的，由相同亚基构成的四级结构叫均一四级结构，由不同亚基构成的四级结构叫非均一四级结构。无四级结构的蛋白质称为单体蛋白质。单独的一个亚基无生物活性，只有当各亚基有机结合在一起，才能发挥正常的生物活性在生物分子缔合的研究中，亚基、原体（profomer)的概念尚无严格定义，它们都是一词多义，有时它们等同，有时它们各异。一般认为，具有四级结构的蛋白质中每个球状蛋白质称为亚基。亚基在蛋白质分子中的空间排布问题是四级结构研究的重要内容，根据X射线结构分析和电子显微镜的观察，多数寡聚蛋白质分子亚基的排列是对称的，对称性是四级结构蛋白质分子最重要的性质之一。对称的寡蛋白质分子是由二个或多个不对称的等同结构成分组成的。这种等同结构成分被称为原体，原体一般就是亚基，但是原体可以是二个或多个亚基的聚集体。例如，血红蛋白分子是由二个原体组成的对称二体，其中每个原体是由α- 亚基（一条α珠蛋白链）和β-亚基（一条β珠蛋白链〕所构成的聚集体（αβ）。这里把原体看作单体，所以称血红蛋白为二体。如果以亚基为单体，血红蛋白则为四体。
2．血红蛋白的结构血红蛋白是一种寡聚蛋白质，由四个亚基组成。根据X射线晶体结构分析揭示，血红蛋白分子接近于一个球体，直径5.5nm，相对分子质量为65 000 。它由两条α-链和两条β-链组成，是一个含有两种不同亚基的四聚体。每一个亚基含有一个血红素辅基。α-链由141个氨基酸组成，β-链由146个氨基酸组成，各自都有一定的排列次序。α-链和β- 链的一级结构差别较大，但它们的三级结构大致相同，并和肌红蛋白极相似，如β-链的主链经几次弯曲和转动也是形成8个肽段的α-螺旋体，在N—端和C—端以及各个α-螺旋肽段之间都有长短不一的非螺旋松散链。β-链自身转折后，疏水侧链在分子内部，极性基团暴露在分子表面。血红蛋白分子中四条链（α、α、β、β）各自折叠卷曲形成三级结构，再通过分子表面的一些次级键(主要是离子键和氢键)的结合而联系在一起，互相凹凸镶嵌排列，形成一个四聚体的功能单位（图3-19）。
图3-19 脱氧血红蛋白β-亚基的三级结构，α-亚基和肌红蛋白的三级结构与此极其相似第五节 蛋白质结构与功能的关系蛋白质的结构与功能之间具有高度的统一性，蛋白质分子具有的多种多样的生物功能是以其化学组成和极其复杂的结构为基础的。这不仅在于其一定的化学结构，而且还在于一定的空间构象。研究蛋白质的结构与生物功能的关系正成为当前分子生物学的一个重要方面。
一、蛋白质的一级结构与生物功能的关系
1．同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化
同源蛋白质（homologous protein）是指在不同的有机体中实现同一功能的蛋白质。例如细胞色素c（cytochrome c）广泛存在于需氧生物细胞的线粒体中，在生物氧化过程中起传递电子的作用。不同种属来源的同源蛋白质一般具有相同长度或接近相同长度的多肽链。同源蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨基酸对所有的种属来说都是相同的，因此称为不变残基（invariant residue）。但是其他位置的氨基酸因种属不同有相当大的变化，因此称为可变残基（variable residue）。同源蛋白质的氨基酸顺序中这样的相似性被称为顺序同源（sequence homology）现象。
顺序同源的生物学意义从细胞色素c分子上看得最清楚。细胞色素c是一种传递电子的载体，分子中含有血红素，相对分子质量为12 400，由64个氨基酸残基组成。血红素Fe上的两个配位键与His及Met络合。细胞色素c是一种古老的蛋白质，从低等生物到高等生物，包括人类在内都有细胞色素c。现在已经对将近100个生物种属(包括动物、植物、真菌、细菌等)的细胞色素c的一级结构进行了测定和比较，发现亲缘关系越近，其结构越相似。例如，人和黑猩猩、猴、狗、金枪鱼、飞蛾、酵母的细胞色素c比较，则可变的氨基酸残基数目依次为0、1、10、21、31和44。细胞色素c的氨基酸顺序分析资料已被用来核对各个物种之间的分类学关系，以及绘制进化树（evolutionary tree），即系统发生树（图3-20）。根据进化树不仅可以研究从单细胞有机体到多细胞有机体的生物进化过程，而且可以粗略估计现存的各类种属生物的分歧时间（表3-10）。
表3-10 各种有机体的细胞色素c中氨基酸顺序的差异及分歧时间比较项
氨基酸顺序中差异的数目
分歧时间
/百万年
比较项
氨基酸顺序中差异的数目
分歧时间
/百万年
人—猴
1
50~60
哺乳类—鸡
10~15
280
人—马
12
70~75
哺乳类－鲔
17~21
400
人—狗
10
70~75
脊椎动物－酵母
43~48
1 100
猪—牛—羊
0
马—牛
3
60~65
虽然各种生物在亲缘关系上差别很大，但与功能密切相关部分的氨基酸顺序都有共同处，在25种生物来源的细胞色素c中，发现只有35个氨基酸残基完全不变。这35个氨基酸残基中除11个残基(第70到80个残基)是在一起形成一个肽段外，其它的不变残基则分散在肽链的一定位置上(图3-21)。细胞色素c实现它的功能只需要肽链中的一定位置上的一部分氨基酸顺序，如第十四和第十七位置上的半胱氨酸残基可能保证了与辅基血红素连接的必要位置。第70到80位置上的不变肽段可能是细胞色素c与酶相结合的部分。这样部分顺序稳定的肽链可能在形成构象时已能实现它的生物功能。
2．一级结构的变异与分子病
蛋白质分子化学结构中的细微差异，在某些情况下可能引起生物功能的显著变化，甚至使有机体出现病态现象，突出的例子如镰刀型贫血病(sickle-cell anemia)。该病在非洲人中比较常见，其显著的特点是有相当一部分红血球的形状是镰刀状或新月状。这是由于病人的血红蛋白分子（用HbS表示）与正常人的血红蛋白分子（HbA）相比，在574个氨基酸中只有两个氨基酸的差异引起的，正常人HbA的β-链N－端第6位氨基酸为谷氨酸,而病人HbS的β-链N－端第6位氨基酸为缬氨酸。
β-链N－端氨基酸排列顺序,
HbA,H2N—Val—His—Leu—Thr—Pro—Glu—Glu—Lys…………COO－
HbS,H2N—Va1—His—Leu—Thr—Pro—Va1—Glu—Lys…………COO－
由于这二个氨基酸性质上的差别（谷氨酸在生理pH值下为带负电荷R基氨基酸，而缬氨酸却是一种非极性R基氨基酸〕，就使得HbS分子表面的负电荷数减少，影响分子的正常聚集，致使体积下降，溶解度降低，血球随之收缩成镰刀形，以致输氧功能下降，细胞变得脆弱发生溶血。血红蛋白是由两条α-链和两条β-链共574个氨基酸构成的蛋白质，仅仅只有两条β-链的两个氨基酸残基发生改变，竟导致功能上如此重大的变化，足见结构与功能关系的高度统一。
血红蛋白一级结构的改变是由于编码它的基因发生了点突变。这种因基因突变产生异常蛋白从而导致的先天性疾病叫做分子病或遗传病。血红蛋白一级结构发生改变而导致的分子病的例子很多，镰刀形红细胞贫血病只是其中的一种。了解到分子病发生的原因后，可以设计出一些新药给予治疗。例如，异氰酸盐（H—N＝C＝O），可以与HbS的N—端缬氨酸残基上的游离氨基结合，使其氨甲酰化，可以恢复其分子表面的电荷数，从而改善病情。
二、三级结构与功能的关系
蛋白质特定的生理功能是由它特定的空间构象决定的。蛋白质空间构象被破坏时，它失去了执行生理功能的能力：酶不再具有催化作用，蛋白激素不再起调节代谢的作用，膜蛋白不再作为通透的载体。改变蛋白质周围的环境，就有可能破坏蛋白质天然的三级结构，使之丧失功能，形成部分松散或称为变性的蛋白质。
20世纪60年代初,F,While和 C,B,Anfinsen所做的一系列经典的实验就已经证明情况确实如此。他们选择牛胰核糖核酸酶（RNase)为研究对象，以它的变性和复性加以说明。核糖核酸酶是一个含4个二硫键和124个氨基酸残基的酶，当天然的核糖核酸酶在8mol(L尿素存在下用巯基乙醇处理后，则分子内四个二硫键破裂，整个肽链松散成无规线团，同时酶活性也完全丧失。但当用透析方法将尿素和巯基乙醇除去后，核糖核酸酶活性又可逐渐恢复，最后达到原来活性的95％～100％，并且复原后的产物的物理化学性质与天然的核糖核酸酶完全一样。值得注意的是，在复原过程中，肽链上的8个巯基借空气中的氧重新氧化成四个二硫键时，它们的配对完全与天然分子中的相同，准确无误。可见蛋白质的三级结构与它的功能之间的统一。
第六节 蛋白质的重要性质由于蛋白质是由氨基酸组成的，因此它具有某些与氨基酸有关的性质。但它与氨基酸有着质的区别，表现出单个氨基酸所没有的性质。认识和理解蛋白质的性质，对于蛋白质的分离、纯化工作以及研究蛋白质的结构与功能等都是极为重要的。
一、蛋白质的两性解离及电泳蛋白质分子由氨基酸组成，而氨基酸是两性电解质，虽然蛋白质多肽链中的氨基酸的α-氨基和α- 羧基都已结合成肽键，但是N—末端和C—末端仍具有游离的α-氨基和α-羧基。组成蛋白质的许多氨基酸具有可解离的侧链基团，如ε-氨基、β- 羧基、γ-羧基、咪唑基、胍基、酚基、巯基等，这些侧链基团在一定的pH值条件下可以释放或接受H+,它们构成了蛋白质两性解离的基础。基于上述两方面的原因，我们说蛋白质是两性电解质。在一定的pH值条件下能解离为带电基团，从而使蛋白质带电。当溶液在某一特定 pH值的条件下使蛋白质所带正电荷与负电荷恰好相等，即总净电荷为零时，在电场中，蛋白质分子既不向阳极移动，也不向阴极移动，这时溶液的 pH值称为该蛋白质的等电点（pI ）。蛋白质的等电点和它所含的酸性氨基酸和碱性氨基酸的数量比例有关。表3-11给出了几种蛋白质中碱性氨基酸与酸性氨基酸残基(酰氯化的酸性氨基酸已减去)的数目和它们之间的比例，这个比例和等电点显示了一定的关系。
表3-11 蛋白质的氨基酸含量与等电点的关系蛋白质
酸性氨基酸（每克分子残基数）
碱性氨基酸(每克分子残基数)
碱性(酸性
等电点（pI）
胃蛋白酶
37
6
0.2
1.0
血清蛋白
32
99
1.2
4.7
血红蛋白
53
88
1.7
5.7
核糖核酸酶
7
20
2.9
9.5
蛋白质在等电点时，以两性离子的形式存在，其总净电荷为零，这样的蛋白质颗粒在溶液中因为没有相同电荷而互相排斥的影响，所以最不稳定，溶解度最小，极易借静电引力迅速结合成较大的聚集体，因而沉淀析出。同时在等电点时蛋白质的粘度、渗透压、膨胀性以及导电能力均为最小。当溶液的pH值高于或低于等电点时蛋白质的带电状况如下：
PH<pI pH=pI pH>pI
带正电荷 正负电荷相等 带负电荷根据蛋白质净电荷的差异来分离蛋白质的一种方法是电泳法(electrophoresis)。这种方法的依据是，在外电场的作用下，带电颗粒，如不处在等电状态的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。
目前对蛋白质分离有着高分辨率的电泳首推聚丙烯酰胺凝胶电泳。这种电泳方法因为聚丙烯酰胺凝胶系微孔介质，样品不易扩散，并且同时兼有分子筛的作用，分离效果相当好。如果将凝胶装入玻璃管中，蛋白质的不同组分形成环状圆盘，称为圆盘电泳。在铺有凝胶的玻璃板上进行的电泳称为平板电泳。还有等电聚焦电泳,这是因为蛋白质分子有一定的等电点，当它处在一个由阳极到阴极pH值梯度逐渐增加的介质中，并通过直流电时，它便“聚焦”在与其等电点相同的pH值位置上,等电点不同的蛋白质泳动后形成位置不同的区带而得到分离，这种电泳方法便称为等电聚焦电泳。此外还有双向电泳、免疫电泳等。而纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳也仍然在一定范围内应用。由于以上这些电泳方法可以将被分离物形成带状区域，因此称为区带电泳。
二、蛋白质的胶体性质及其沉淀分离
1．蛋白质的胶体性质
按照胶体化学的概念，胶体是这样定义的：把物质为1～100 nm的粒子在介质中分散所成的体系称为胶体。根据胶体物质的溶解性质可分为亲水胶体和疏水胶体。胶体溶液的稳定应具备三个条件：第一，分散相质点大小在 l～100nm之间，这样大小的质点在动力学上是稳定的，介质分子对这种质点碰撞的合力不等于零，使它能在介质中作不断的布朗运动；第二，分散相的质点带有同种电荷，互相排斥，不易聚集成大颗粒而沉淀；第三，分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层，如与水形成水化层，质点有了水化层，相互间不易靠拢聚集。
蛋白质分子的大小属于胶体质点的范围。蛋白质溶液是一种亲水胶体，蛋白质分子颗粒是分散相(disperse phase)，水是分散介质(disperse medium)，蛋白质分子表面的亲水基,如—NH2、—COOH、—OH以及—CO—NH— 等，在水溶液中能与水分子起水化作用，使蛋白质分子表面形成一个水化层。蛋白质分子表面上的可解离基团在适当的pH值条件下都带有相同的净电荷，与周围的反离子构成稳定的双电层。蛋白质溶液由于具有水化层与双电层两方面的稳定因素，所以作为胶体系统是相对稳定的。蛋白质溶液也和一般的胶体系统一样具有丁道尔现象、布朗运动以及不能通过半透膜等性质。
2．蛋白质的沉淀
蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。如果条件改变，破坏了蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。若向蛋白质溶液中加入适当的试剂，破坏它的水膜或中和它的电荷，就很容易使其失去稳定而发生沉淀。
沉淀蛋白质的方法有以下几种,
（1）盐析法 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐(硫酸按、硫酸钠或氯化钠等)，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。盐析沉淀一般不引起蛋白质变性。
（2）有机溶剂沉淀法 向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂(甲醇、乙醇或丙酮等)，因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。
（3）重金属盐沉淀法 当溶液pH值大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，这样就容易与重金属离子(Mg２＋,Pb２＋,Cu２＋,Ag＋等)结成不溶性盐而沉淀。
（4）某些酸类 如苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。这类沉淀反应经常被临床检验部门用来除去体液中干扰测定的蛋白质。
（5）加热变性沉淀法 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐促进蛋白质加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全和最迅速。我国很早便创造了将大豆蛋白质的浓溶液加热并点入少量盐卤（含MgCl）的制豆腐方法，这是成功地应用加热变性沉淀蛋白的一个例子。
上述蛋白质的沉淀包括两种情况，一是不影响蛋白质的空间结构，所得到的蛋白质具有生物活性；另一种是变性后的沉淀，它涉及空间结构的解体和生物活性的丧失。用盐析法或在低温时加入有机溶剂(将蛋白质用酸碱调节到等电点状态)等方法制取的蛋白质，仍然保持天然蛋白质的一切特性，如原有生物活性、将蛋白质重新溶解于水仍然成为稳定的胶体溶液等。但如在温度稍高的情况下加入有机溶剂来沉淀分离蛋白质或用有机溶剂沉淀分离得到的蛋白质没有及时与有机溶剂分开，都会引起蛋白质的性质改变，这是应加注意的。
三、蛋白质的变性与复性
1．变性作用的概念
天然蛋白质分子在某些理化因素的影响下，其分子内部原有的高度规律性结构发生变化，致使蛋白质的理化性质和生物学性质都有改变，但并不导致蛋白质一级结构的破坏，这种现象叫变性作用(denaturation)。蛋白质变性作用的实质是维持蛋白质分子特定结构的次级键和二硫键被破坏，引起天然构象解体，但主链共价键并未打断，即一级结构保持完好。
2．变性的原因、结果
能使蛋白质变性的因素很多，化学因素有强酸、强碱、尿素、胍、去污剂、重金属盐、三氯醋酸、磷钨酸、苦味酸、浓乙醇等；物理因素有加热(70～100℃)、剧烈振荡或搅拌、紫外线及X射线照射、超声波等。但不同的蛋白质对各种因素的敏感程度是不同的。
蛋白质变性过程中，往往出现下列现象：
(1)生物活性丧失：蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、抗原与抗体等的活性。生物活性的丧失是蛋白质变性的主要特征。
(2)一些侧链基团暴露出来：蛋白质变性时，有些原来在分子内部包藏而不易与化学试剂起反应的侧链基团由于结构的伸展松散而暴露出来。
(3)一些理化性质改变：蛋白质变性后，疏水基外露，溶解度降低，一般在等电点区域不溶解，分子相互凝集形成沉淀。其它如结晶能力丧失，球状蛋白质变性后分子形状也发生改变。
(4)生物化学性质的改变：蛋白质变性后，分子结构伸展松散，易为蛋白水解酶分解。
3．变性机理及其应用
目前认为蛋白质的变性作用主要是由蛋白质分子内部的结构发生改变所引起的。天然蛋白质分子内部通过氢键等次级键使整个分子具有紧密结构。变性后，氢键等次级键被破坏，蛋白质分子就从原来有秩序的卷曲紧密结构变为无秩序的松散伸展状结构，也就是二、三级以上的高级结构发生改变或破坏，但一级结构没有破坏。所以变性后的蛋白质在结构上虽有改变，但组成成分和相对分子质量不变。变性后的蛋白质溶解度降低是由于其高级结构受到破坏，使分子表面结构发生变化，亲水基团相对减少，原来藏在分子内部的疏水基团大量暴露在分子表面，使蛋白质颗粒不能与水相溶而失去水膜，很容易引起分子间相互碰撞发生聚集沉淀，或者随着二、三级结构的破坏，发生解离或聚合现象。
当变性因素除去后，变性蛋白质又可重新回复到天然构象。这一现象称为蛋白质的复性(renaturation)。是否所有的蛋白质的变性都是可逆的，这一问题至今仍有疑问。至少实践中未能使所有蛋白质在变性后都重新恢复活力。然而多数人都接受变性是可逆的概念，认为天然构象是处于能量最低的状态。有些蛋白质变性后之所以不能逆转，主要是所需条件复杂，不易满足的缘故。
蛋白质的变性与凝固已有许多实际应用，如豆腐就是大豆蛋白质的浓溶液加热加盐而成的变性蛋白凝固体。临床分析化验血清中非蛋白质成分，常常加三氯醋酸或钨酸使血液中的蛋白质变性沉淀而去掉。为鉴定尿中是否有蛋白质，常用加热法来检验。在急救重金属盐(如氯化高汞)中毒时，可给患者吃大量乳品或蛋清，其目的就是使乳品或蛋清中的蛋白质在消化道中与重金属离子结合成不溶解的变性蛋白质，从而阻止重金属离子被吸收进入体内，最后设法将沉淀物从肠胃中洗出。
此外，在制备蛋白质和酶制剂过程中，为了保持天然性质，就必须防止发生变性作用，因此在操作过程中必须注意保持低温，避开强酸、强碱、重金属盐类，防止振荡等。相反，那些不必需的杂蛋白则可通过变性作用而沉淀出去。
四、蛋白质的紫外吸收
组成蛋白质分子的20种氨基酸，由于酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸具有苯环的共轭双键结构，因而在紫外光区具有吸收特性。蛋白质一般都含有酪氨酸或色氨酸残基，利用这两种氨基酸的紫外吸收特性测定蛋白质的含量是很方便的。大多数蛋白质在波长280nm附近有一个吸收峰，故测定蛋白质含量时，选用的波长为280nm。
五、蛋白质的颜色反应
在蛋白质的分析工作中，常利用蛋白质分子中某些氨基酸或某些特殊结构与某些试剂产生颜色反应，作为测定的根据。重要的颜色反应如下：
（1）双缩脲反应（biuret reaction ) 双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。将尿素加热到180ＯC，则2分子脲素缩合成1分子双缩脲，并放出1分子氨，反应如下：
双缩脲在碱性溶液中能与硫酸酮反应产生红紫色络合物，此反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形成紫色络合物。通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应产生的颜色在540nm处比色，定量测定蛋白质。
（2）蛋白黄色反应 此反应是含有芳香族氨基酸的蛋白质，特别是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质所特有的反应。蛋白质溶液遇硝酸后，先产生白色沉淀，加热则白色沉淀变成黄色，再加碱颜色加深呈橙黄色。这是由于硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物。
（3）米伦氏反应（Millon reaction ) 蛋白质溶液中加入米伦试剂(硝酸和硝酸汞—硝酸和亚硝酸的混合物)后产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。含有酚基的化合物都有这个反应，故酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质都能与米伦试剂反应。
（4）乙醛酸反应 在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间就会出现紫色环，凡含有吲哚基的化合物都有这一反应。色氨酸及含色氨酸的蛋白质有此反应，不含色氨酸的白明胶就无此反应。
（5）酚试剂(福林试剂)反应 蛋白质分子一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能将福林试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物(即钼兰和钨兰的混合物)。这一反应常用来测定蛋白质含量。
（6）水合茚三酮反应 凡含有α- 氨基酸的蛋白质都能与水合茚三酮生成蓝紫色化合物。
**第七节 蛋白质的分离提纯及应用一、蛋白质分离提纯的一般原理
蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在。到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来。但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序以获得高纯度的制品。蛋白质提纯的总目标是增加制品纯度(purity)或比活力(specific activity)，设法除去变性的蛋白质和其他杂蛋白，且希望所得蛋白质的产量达到最高值。
分离提纯某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级和细分级三步。
第一步是前处理（pretreatment） 分离提纯某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丧失生物活性。为此，应根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。植物组织和细胞由于具有由纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶(cellulase)处理。细菌细胞的破碎比较麻烦，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的称为肽聚糖(peptidoglycan)的囊状分子，非常坚韧。破碎细胞的常用方法有超声波振荡、与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理等。组织和或细胞破碎以后，选择适当的介质(一般用缓冲液)把所要的蛋白质提取出来。
如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分中，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞浆等，则可用差速离心（differential centrifugation）方法将它们分开(表3-12)，收集该细胞组分作为下一步提纯的材料。这样可以一下子除去很多杂蛋白，使提纯工作容易得多。如果碰上所要的蛋白质与细胞膜或膜质细胞器相结合，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当的介质提取。
表3-12 在不同离心力下沉降的细胞组分
离心场/g
时间/min
沉降的组分
1 000
5
真核细胞
4 000
10
叶绿体、细胞碎片、细胞核
15 000
20
线粒体、细菌
30 000
3 0
溶酶体、细菌细胞碎片
100 000
180～600
核糖体
第二步是粗分级(rough fractionation) 当蛋白质混合物提取液获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开。一般这一步采用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分组分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量的杂质，又能浓缩蛋白质溶液。
第三步是细分级，也就是样品进一步提纯。样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步提纯一般用层析法，包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析及亲和层析等。这些分离方法主要是根据以下原理将蛋白质分离纯化的：①以蛋白质电荷为依据的方法。大多数球蛋白的表面都有带电的氨基酸侧链，尽管游离氨基酸上的每一个可解离的侧链都有一个特定的pK值，但是蛋白质表面特定环境也会引起氨基酸侧链 pK值的微小变化。因此，即使那些根据组分而预测其电荷形式应相同的蛋白质，实际上它们的电荷性质也有微小的差异。这种差异已成为许多种蛋白质分离鉴定方法的基础。② 以分子量为依据的方法。其原理将在分子量测定里面讲。③ 以蛋白质的特异性相互作用为依据的方法。生物高分子，包括蛋白质分子具有能和某些相对应的专一分子可逆结合的特性。例如，酶的活性部位能和底物、抑制剂以及辅助因子专一性结合，同时，改变条件又能使这种结合解除。此外，酶的变构中心与变构因子之间、抗体与抗原之间都有类似的特性。这些被作用的对象物质称为配基。将配基固定在固相载体上，并且放进层析柱中，当样品通过它时，由于配基和相对应的蛋白质分子间有专一性的亲和作用，将通过某种次级键将这种蛋白质分子吸附在柱中，样品中的其他组分不产生专一性结合，都直接漏出层析柱。然后，便可应用洗脱剂将柱中的蛋白质洗脱出来。这种利用生物高分子和配基间可逆结合和解离的原理发展起来的层析方法就称为亲和层析。除以上方法外还可以选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后提纯步骤。用于细分级的方法一般规模较小，但分辨率高。
结晶是蛋白质分离提纯的最后步骤。尽管结晶并不能保证蛋白质的均一性，但只有某种蛋白质在溶液中数量占优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白质。蛋白质纯度越高，溶液越浓，就越容易结晶。结晶的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态，此时较易得到结晶。要得到适度的过饱和溶液，可通过控制温度、加盐盐析、加有机溶剂或调节pH值等方法来达到，接入晶种能加速结晶过程。由于结晶从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是鉴定制品是否处于天然状态的有力指标。
二、蛋白质含量的测定与纯度鉴定
在蛋白质分离提纯过程中，经常需要测定蛋白质的含量和检查某一蛋白质的提纯程度。这些分析工作包括：测定蛋白质总量、测定蛋白质混合物中某一特定蛋白质的含量和鉴定最后制品的纯度。测定蛋白质总量常用的方法有：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin—酚试剂法和紫外吸收法等。
测定蛋白质混合物中某一特定蛋白质的含量通常要用高度特异性的生物学方法。具有酶或激素性质的蛋白质可以利用它们的酶活性或激素活性来测定含量。有些蛋白质虽然没有酶或激素那样的生物学活性，但是大多数蛋白质当注入适当动物的血流时，会产生抗体。因此，利用抗体—抗原反应也可以测定某一特定蛋白质的含量。这些生物学方法的测定和总蛋白质测定配合起来，可以用来研究蛋白质分离过程中某一特定蛋白质的提纯程度。提纯程度常用这一特定成分与总蛋白之比表示，如每毫克蛋白质含多少活性单位（对酶蛋白来说，这一比例称为比活性）。提纯工作一直要进行到这个比例不再增加为止。
蛋白质制品纯度鉴定通常采用分辨率高的物理化学方法，如电泳分析、沉淀分析、扩散分析等。 纯的蛋白质在它稳定的范围内，在一系列不同pH值条件下进行电泳时，都以单一的泳动度移动，因此在界面移动电泳中，它的电泳图谱只有一个峰。同样地，在沉降分析中，纯的蛋白质在离心力影响下，以单一的沉降速度运动。
纯的蛋白质在一定溶剂系统中具有恒定的溶解度，而不依赖存在于溶液中未溶解固体的数量。用恒溶度法鉴定蛋白质纯度在理论上是严格的，在实验方法上是简便易行的。在严格规定的条件下，以加入的固体蛋白质对溶解的蛋白质作图。如果蛋白质制品是纯的，那么溶解度曲线只呈现一个折点，在折点以前，直线的斜率为1，在折点以后，斜率为零（图3-22）。不纯的蛋白质的溶解度曲线常常呈现两个以上的折点。
必须指出，任何单独一种鉴定只能认为是蛋白质分子均一性的必要条件而不是充分条件。事实上很少有几个蛋白质能够全部满足上面各种鉴定的严格要求，往往是在一种鉴定中表现为均一的蛋白质，在另一种鉴定中又表现为不均一的了。
三、蛋白质的相对分子质量测定
蛋白质相对分子质量很大，其变化范围在6 000～1 000 000或更大一些。下面介绍几种常见的测定蛋白质分子量的方法。
1．沉降法把蛋白质溶液放在离心机的特殊离心管中(图3-23)离心，蛋白质分子就发生沉降作用。沉降的速度与颗粒大小成正比。现代超速离心机利用高速马达，转速可达750 000r/min以上，离心力超过重力4000 000倍。分析用的超速离心机装有光学系统，可以记录沉降进行时蛋白质界面的位置。当溶液中所含的分子形状和大小相同时，则这些分子以相同速度移向离心管底，在溶质与溶剂之间产生清晰的界面。当溶液含有数种分子大小不同的蛋白质时则产生数个界面，每个界面存在一种蛋白质。从光学系统观察沉降界面可以得出蛋白质的沉降速度。当沉降面以恒速移动时，每单位离场的沉降速度称为沉降常数或沉降系数(sedimentation coefficient)，以S表示，一个S单位为1×10－１３/s。蛋白质的沉降常数S（20℃，水中）为 l×10－１３～200×10－１３，即1～200S。以后由S可以按照公式求出相对分子质量。
２.凝胶过滤法
凝胶过滤(gel filtration)是在层析柱中装入葡聚糖凝胶(如sephadex)，这种凝胶中具有大量微孔，这些微孔只允许较小的分子进入胶粒，而大于胶粒微孔的分子则不能进入胶粒而被排阻。当用洗脱液洗脱时，被排阻的分子，分子量大的先被洗脱下来，相对分子质量小的后下来。当凝胶柱用已知相对分子质量的蛋白质校准后，从被测样品在洗脱时出现的先后位置即可求出近似的相对分子质量。
3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法十二烷基硫酸钠(SDS)为一种去污剂，可使蛋白质变性并解离蛋白质。将用SDS处理过的蛋白质放在含有SDS的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，这些蛋白质的迁移率与其相对分子质量成反比，用已知相对分子质量的标准蛋白质进行校准，即可得出所测蛋白质的相对分子质量。
四、蛋白质的应用
蛋白质的应用范围也是很广泛的。①在临床化学分析上，不仅包括生物体化学成分的分析，也包括将各种酶的活力测定作为临床诊断的指标，如将乳酸脱氢酶同工酶的检定作为心肌梗塞的诊断指标，转氨酶作为肝病变的指标等。②许多蛋白制剂是安全有效的药品，如蛋白水解酶复剂作为消化药物广泛应用。胰岛素人胎盘丙种球蛋白、细胞色素c等也都是有效的药物。③酶法分析也应用于食品分析上，其对象主要是辅酶和有机酸。有些酶法分析很灵敏，如L-乳酸,DL-柠檬酸可测定范围为(0.2～10)μg／ml,(2～50)μg／ml。食品分析中还包括农药毒物分析，即利用毒物可以非竞争性抑制某些酶的活性，求出毒物在食品中的浓度。如果小麦受了 DDT的污染，可用牛红白球碳酸酐酶测定，检查精度为1g中含有10μg的毒物。④在一些工业生产上也常常利用酶制剂，如生丝的处理。天然生丝是互相粘着在一起的，为了使生丝分开，就要破坏粘着天然生丝的“天然胶水”。以肥皂和苏打水洗煮生丝，生丝的结构受到破坏；如果以酶制剂处理生丝，对生丝无害并可大大提高丝线的质量。⑤在日常生活中所使用的合成洗涤剂以蛋白水解酶为添料，可以除牛乳、蛋白、血液等不易去除的污物。⑥在农业生产上也有应用，如苏云金杆菌的Bt蛋白可用于防虫 。
总之，蛋白质的知识以及蛋白制品的利用已经成为某些生产和人们生活的组成部分，而且随着科学的发展应用范围会越来越广。
