微 生 物 的 生长 及 其 控 制第 六 章
Cncnc-micro
测定微生物生长繁殖的方法微生物的生长规律影响微生物生长的主要环境因素微生物培养法概论有害微生物的控制内容提要
测生长量计繁殖数测定生长繁殖的方法测定生长繁殖的方法
Cncnc-micro
微生物的纯培养纯培养 的分离方法稀释倒平板法划线法选择培养基分离法单细胞挑取法
Viable cell count
1.dilute sample
1 ml
9 ml
10 100 1000 104 105 106 107
cell no/ml
2,plate out 0.1 ml
Inoculating an agar plate to obtain single colonies
Mixed culture
Pure culture
Mixed culture
Oral swab
Swab
from sole
of shoe
Each colony was examined
microscopically
选择培养基分离法
1.dilute sample
1 ml
9 ml
10 100 1000 104 105 106 107
牛肉膏培养基土豆培养基高氏培养基
……
含 N量法
DNA/RNA法叶绿素法菌体内重要组成测定法测生长量 (直接法 )
称重量法测体积法
N× 6.25=Pr
Cncnc-micro
比 浊 法生理指标法测生长量 (间接法 )
计繁殖数比例计数法血球计数板法液体稀释法平板菌落计数法滤膜培养法各种型号的全自动血球计数仪微生物的连续培养微生物的生长规律微生物的个体生长和同步生长
Cncnc-micro
单细胞微生物的典型生长曲线微生物的高密度培养离心法抑制ＤＮＡ合成法获得同步生长 (synchronous growth)的方法：
诱导法选择法过滤法同步培养 (synchronous culture)
Cncnc-micro
使培养基中细菌同时分裂，处于相同的生长阶段叫同步生长。
生长曲线 (growth curve)描述细菌生长规律总菌数活菌数培养时间
Ⅱ,指数期 Ⅲ,稳定期 Ⅳ,衰亡期Ⅰ,延滞期细菌数目
（
个/m
l
）
对数 Ⅱ Ⅲ ⅣⅠ
缩短延滞期的意义和方法延滞期 (lag phase)
出现原因本期特点影响本期限长短因素
Cncnc-micro
延滞期 出现原因把细菌接种到新鲜的培养基中培养时，
并不立即进行分裂繁殖，细菌增殖数为０，
这时 需要合成多种酶，辅酶和某些中间代谢产物，要经过一个调整和适应过程 。
Cncnc-micro
延滞期特点生长速率常数等于零菌体粗大代谢活力强对不良条件抵抗能力降低
ＲＮＡ含量增加
Cncnc-micro
影响延滞期限长短因素接种龄接种量培养基成分
Cncnc-micro
缩短延滞期的意义和方法可以缩短生产周期,提高设备利用率 。
接种对数生长期的菌种，采用最适菌龄加大接种量用与培养菌种相同组成分的培养基
Cncnc-micro
指数期 (对数期 )(exponential phase)
特点该期的细菌生产中多被用做种子和科学试验材料
① 活菌数和总菌数接近
② 酶系活跃，代谢旺盛。
③ 生长速率最大,generation time最短。
④ 细胞的化学组成及形态,生理特性比较一致
Cncnc-micro
x2
x1
t2t1 培养时间
Lg 细胞数 /ml
t2 - t1
3.322(lgx2-lgx1)生长速率常数 R=
t2 - t1
3.322(lgx2-lgx1)
代时 G=
指数 期生长的数学模型繁殖代数 n=3.322(lgx2-lgx1)
影响 指数期 的因素菌种营养成分营养物浓度培养温度
Cncnc-micro
稳定期 (stationary phase)
出现原因 营养的消耗有害代谢产物积累
PH值 EH值等理化条件不适出现原因
Cncnc-micro
营养物比例失调稳定期 特点活菌数保持相对稳定，总菌数达最高水平。
细菌代谢物积累达到最高峰。
芽孢杆菌这时开始形成芽孢。
这是生产收获时期。
Cncnc-micro
衰亡期 (decline phase/death phase)
特点细菌死亡数大于增殖数,活菌数明显减少,群体衰落细胞出现多形态,大小不等的 畸形,变成衰退型细胞死亡,出现自溶现象。
Cncnc-micro
连续培养 (continuous culture)(open culture)
将微生物臵于一定容积的培养基中培养，最后一次收获，叫分批培养，将微生物放在恒定的容积的流动系统中培养称为连续培养。
优点：缩短发酵周期；便于自动控制；产物质要 量均一缺点：菌种易退化；易染杂菌
Cncnc-micro
微生物的高密度培养
（ high cell-density culture,HCDC）
指微生物在液体培养基中细胞群体密度超过常规培养 10倍以上时的生长状态或培养技术。现代高密度培养技术主要是用于基因工程菌生产多肽类药物。
选取最佳培养基成分和各成分含量补料提高溶解氧的浓度防止有害代谢产物的生成影响微生物生长的主要环境因素
Cncnc-micro
温度
PH
氧 气温度生长速度温度停此生长 致死最低 最高最适嗜冷微生物（低温微生物）
中温微生物嗜热微生物（高温微生物）
低温对微生物的影响嗜冷微生物 （低温微生物）
Ｅ系在低温下仍能起催化作用细胞膜含较多的不饱合脂肪酸在低温下仍具有通透性。 上下班嗜冷机制：
Cncnc-micro
嗜热微生物 的嗜热机制细胞内的Ｅ具强抗热性产生的多胺，热亚胺和高温精胺物质对蛋白质等组织结构具有保护作用。 一一一一一口口口核酸也具有热稳定性的保护结构。
细胞膜含有较多的饱和脂肪酸和直链脂肪酸，
使膜具有稳定性。 上低温对微生物的影响代谢降低生长繁殖停滞仍然存活常在低温下对菌种和食品保藏。
Cncnc-micro
PH
影响细胞膜透性与稳定性影响物质溶解度影响细胞表面电荷分布因此影响微生物生长、繁殖，发育。
各类微生物能够生长的 PH值较宽，
但细胞内部 PH值 却接近中性。
Cncnc-micro
微生物的活动也能改变环境中的 PH值嗜酸性微生物嗜碱性微生物耐酸及耐碱微生物根据氢离子浓度对微生物分类
Cncnc-micro
氧气专性好氧菌（ obligate or strict aerobes）
兼性厌氧菌（ facultative anaerobes）
Cncnc-micro
耐氧菌（ aerotolerant anaerobes）
厌氧菌（ anaerobes）
微好氧菌（ microaerophilic bacteria）
超氧化物歧化酶 （ SOD）和 过氧化氢酶
（ Catalase ）
超氧化物歧化酶（ SOD）
功能：使好氧菌免受超氧化物阴离子自由基的毒害
2H2O2 _Catalase_?2H2O + O2
过氧化氢酶（ Catalase ）
厌氧菌（ anaerobes）
将环境中氧吸掉；抽真空；深层培养氧对其有毒能量来源于发酵无氧呼吸环式光合磷酸化或甲烷发酵
O2,-超氧阴离子自由基 普遍存在
H2O+1/2O2过氧化氢酶（好氧菌）
2H2O过氧化氢酶
（耐氧菌）NADH2 NAD
O2,+2H+ H2O2+O2- SOD
（好氧菌及耐氧菌）
1
1
1
细胞内缺泛 SOD、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶
A,+ B,A:B共价结合 均裂固体培养法液体培养法好氧菌的固体培养厌氧菌的固体培养好氧菌的液体培养厌氧菌的液体培养试管培养三角瓶（摇瓶）
台式发酵罐高层琼脂柱厌氧培养皿
Hungate rool-tube technique
厌氧罐厌氧手套箱微生物培养法实验室培养法生产实践中的培养微生物装臵固体培养法液体培养法好氧菌 -曲法培养 厌氧菌 -堆积培养发酵罐（ Fermenter）
.
.
.
.
.
.
.
.
..
.
.
..
.
.
.
.
Brewer 皿
...,......,.....,....
高层琼脂柱 亨盖特技术
<> <> <>
厌氧罐
anaerobic jar
Anaerobic Glove Box
厌氧菌的培养
Different culture methods
Liquid Culture
Batch culture Batch & Continuous culture
10 ml 20 ml- 1 L 1 L - >1000L
Fermentor
挂曲小曲红曲近代人工踏制大曲 A whole process of DA-QU prepation
fermenter
fermenter
有害微生物的控制
Cncnc-micro
几个基本概念物理灭菌因素的代表 — 高温化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂消毒 (disinfection)：杀死或消除物体上的病原微生物的方法灭菌（ sterilition）：杀死物体上全部微生物的方法防腐 (antisepsis)：用理化方法防止抑制微生物生长的方法几个基本概念化疗 (chemotherapy)：利用对病源菌具有高度毒力而对宿主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病源微生物的生长繁殖高温灭菌辐射作用高渗作用干燥超声波
Cncnc-micro
控制微生物的物理因素高温灭菌多数细菌，酵母菌和霉菌的营养细胞和病毒在
50-65 oＣ 10 min可以致死。 F
一般噬菌体 65－ 80 oＣ致死，
放线菌霉菌的孢子比营养细胞抗热性强，
76－ 80 oＣ 10min可以杀死 B
细菌芽孢，在 100 oＣ下５－ 20min才能致死，
嗜热脂肪芽孢杆菌可在 80 oＣ条件下生活，
在 120 oＣ,12min才能杀死,BBBBBBBBBBB
同种微生物老龄菌比幼菌耐热。
Cncnc-micro
高温灭菌干热灭菌 (dry heat sterilization)
湿热灭菌 (mosist heat sterilization)
焚烧灭菌法：常用与废弃物动物尸体等处理。
烘烤灭菌法；实验室用干燥箱烘烤接种工具。
Cncnc-micro
湿热灭菌 (mosist heat sterilization)
煮沸灭菌法（煮沸消毒法）
高压蒸汽灭菌法间歇灭菌法巴斯德消毒法：（巴氏消毒法）
该法比干热灭菌效果好，因为蛋白质在有水的情况下容易凝固，如含水 50％，蛋白质凝固温度为 56oＣ ；含水６％蛋白质凝固温度为 160-170oＣ
Cncnc-micro
煮沸灭菌法（煮沸消毒法）
物品在水中煮沸 15min，可杀死所有营养细胞和一部分芽孢。在水中加入１％的
Ｎ a2CO3或２－５％的碳酸效果更好。此法适合注射器和解剖用具的消毒。
Cncnc-micro
高压蒸汽灭菌
(normal autoclving)
是湿热灭中最好方法，通常在
1.05kg/cm2,的压力下面（此时温度 121oＣ ）处理 15－ 30min。
要排冷，否则会形成假压，虽然压力达到要求，温度却达不到相应高度，而影响灭菌效果。
间歇灭菌法 (fractional sterilization)
是用常压蒸汽反复几次进行灭菌的方法。
Cncnc-micro
主要用于不宜高压灭菌的培养基,不耐热的药物和营养物等方法是将待灭菌物品臵于蒸锅内加热到沸腾维持 15-30min
杀死营养细胞，取出冷却后在 37oＣ 恒温培养 24小时，使芽孢萌发，再用此法灭菌，反复三次，即可达到灭菌目的。
巴氏消毒法 (pasteurization)
是食品（牛奶）酿造（啤酒）工业中常用的方法。
Cncnc-micro
具体做法是 61.7－ 62.8oＣ 处理 30min或 71.6oＣ 度处理 15min，
这样即可杀死病原微生物。又不致损坏营养，可保留食品饮料原有用味。
根据结核杆菌在 62oＣ 下 15min被致死。 低温维持法 ;
高温瞬时灭菌辐射可见光紫外线 （非电离辐射）
Cncnc-micro
X射线与 r射线
Ｏ ２ 紫外线 ０ ３ ０ ２ ＋｛ O｝
紫外线（非电离辐射）
杀菌机制：
诱导核酸形成胸腺嘧啶二聚体，从而干扰
GGGGGGGG了核酸的复制 H
Cncnc-micro
各种微生物对紫外线抗性干细胞强于湿细胞芽孢，孢子强于营养细胞多倍体 ＞ 二倍体 ＞ 单倍体
Cncnc-micro
X射线与 r射线直接学说间接学说
r射线是放射性元素 Co60发射出的高能射线，
F 具强穿透能力,500－干伦琴剂量用于诱变育种,10万伦琴以上具杀菌作用。 G
Cncnc-micro
Cncnc-micro
高渗作用等渗溶液对微生物生长有利细菌处于低渗液中会吸水膨胀乃至破裂细胞处于高渗液中会脱水引起质壁分离导致死亡。 J
Cncnc-micro
控制微生物的化学物质 (因素 )
表面消毒剂抗代谢物抗生素化学治疗剂溶液状态气体状态生物药物素酸和碱重金属极其盐类有机化合物氧化剂卤素染色剂表面活性剂
Cncnc-micro
表面消毒剂 (surface disinfactant)
酸和碱
Cncnc-micro
前面讲过微生物细胞中的 DNA,RNA,CL，
Pr,E只有在中性条件下才能体现活性,因此强酸碱具杀菌作用。医院病房常用乙酸消毒。
重金属极其盐类是杀菌剂和防腐剂，作用最强的是 Hg,Ag,Cu,作用机理：使蛋白质变性，使酶失活。（与 E的－ SH结合。）
0·02－ 0·2％ Hgcl2（升汞）溶液对大多数细菌有致死作用。
CuSO4对真菌,藻类有强杀伤力,波尔多 （ CuSO4＋碳 ） 防植物病害。
另外还有砷，铋、锑的化合物是治疗梅毒的特效药。
0·1－ 1％ AgNO3 可消毒皮肤,1％浓度新生儿点眼预防眼炎
Cncnc-micro
有机化合物醇、醛、酚是常用的杀菌剂。
杀菌机制
① 损伤 CW
② 使蛋白质变性（细胞膜,E失活）
③ 抑制脱氢酶，氧化酶活性。
Cncnc-micro
有机化合物甲醛：纯甲醛为气体,37－ 40％水液为福尔马林。
醇是脱水剂蛋白质变性剂,70％乙醇杀菌效果最好。
酚,3－ 5％的石碳酸溶液几分钟即可致死细菌甲酚杀菌力最强，煤酚皂液（来苏尔）为甲酚和肥皂的混合液 。
Cncnc-micro
氧化剂
K2MnO4使菌体蛋白质氧化，使酶失活。 77777
0·1－ 3％浓度可用于皮肤,果品,餐具,消毒。
H2O2清洗伤口。
Cncnc-micro
酪 AA+I2→ 二碘酪氨酸卤素碘杀菌力强,3－ 7％碘溶于 70－ 83％的乙醇中成碘酒。
氯及氯化物常用于水及食品消毒与水结合放出原子氧（ O）用于消毒。 上下氯，碘是常用的消毒剂
Cncnc-micro
染色剂干扰菌体氧化还原电位阻碍芽孢的形成。
Cncnc-micro
表面活性剂具有降低表面张力效应的物质叫表面活性剂。
常用的有新吉尔灭等，去污剂，肥皂等。 一落表面张力降低可抑菌或杀菌。 五彩缤纷
Cncnc-micro
抗代谢物 (antimetabolite)
有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物很相似，以至可以和特定的酶结合，从而阻碍了酶的功能。干扰代谢的正常代谢。这些物质称为抗代谢物。
Cncnc-micro
叶酸 磺胺类药物氨基酸 5－甲基色氨酸吡哆醇 异烟肼嘌呤 6－巯基嘌呤抗代谢物代谢物二氢蝶啶 二氢蝶酸 二氢叶酸 四氢叶酸核 酸氨基酸前 体
PABA
酶 ① 酶 ② 酶 ③
Glu TMPCOOHH2NNH2 SO2 R
COOHH2N
NH2 SO2 R
磺胺药 (sulphonamides,sulfa drugs)抑菌机理
TMP:三甲基苄二氨嘧啶
(磺胺增效剂 )
选择素力是由微生物在代谢过程中产生 （ 有的可人工合成 ） 具有一定浓度下抑制或杀死其他微生物的有机化合物。
每种抗生素都有一定的杀菌范围，称为抗菌谱。 G
抗生素的诞生神奇的抗生素抗药性抗生素 (antibiotic)
抗生素的诞生
1928年 A.Fleming发现青霉素
1940弗罗里 提纯出青霉素各种抗生素被相继发现并应用人工合成半合成抗生素被相继开发出来青霉素（ penicillin）
英国科学家 A.Fleming爵士与弗莱明共同获得 1945年诺贝尔生理学和医学奖,
1940提纯出青霉素澳大利亚病理学家霍华德,弗罗里人工合成半合成抗生素被相继开发出来
6-氨基青霉烷酸神奇 的抗生素抑制细胞壁的形成影响细胞膜的功能干扰蛋白质合成抑制核酸复制和固醇结合影响细胞膜透性作用于呼吸链影响能量利用氨苄青霉素（ ampicillin）
和蛋白结合影响膜屏蔽作用白点是强度各异的抗生素，最底下的青霉素完全没有黑环，显示它对链球菌已毫无作用抗药性 (antibiotic resistance)
菌体内产生了钝化或分解药物的酶 F
改变细胞膜的透性而导致抗药性细胞内被药物作用的部位发生了改变，目前典型的例子是核糖体发生了改变。 J
抗生素 ＋核糖体 → 结合 → 蛋白质不能合成救护途径泵出机制第一次用药剂量要足避免在一个时期或长期多次使用同种抗生素不同抗生素（或其他药物）混合使用对现有抗生素改造筛选新抗生素可怕的抗药性 (antibiotic resistance)
Cncnc-micro
生物药物素 (biopharmaceutin)
具有多种生理活性的比抗生素疗效更为广泛的微生物次生代谢产物
Cncnc-micro
酶抑制剂免疫调节剂受体拮抗剂抗氧化剂
…...