基因工程药物概念性问题基因工程概念性问题
1、基因和基因组的概念
2、基因工程中常用的工具酶
3、基因工程克隆载体
4、基因治疗与转基因动物
1、基因和基因组
基因:基因是染色体上呈直线按顺序排列的遗传单位,基因是携带遗传信息的结构单位,又是控制遗传性状的功能单位。基因除编码序列外还应包括保证转录所必需的调控序列及位于编码区上游 5’端的启动子非编码序列、内含子和位于编码区下游 3’端的终止子非编码序列。
编码区是基因功能发挥的结构基因(或称功能基因),调控序列和启动子起调控启动作用,
终止的非编码区属于调控基因。
染色体总长不到 0.5m,而 DNA分子总长可达数米。染色体上的基因为 DNA分子。
1、基因和基因组
基因组是表示某物种单倍体的总 DNA,对于二倍体高等生物,其配子的 DNA总和即为一组基因组。
重叠基因( overlapping genes):不同基因的核苷酸序列有时为相邻的两个基因共用,将核苷酸彼此重叠的两个基因称为重叠基因。
病毒基因组
细菌基因组
真核生物基因组病毒基因组的特点
结构简单,无细胞结构。基因组由 DNA或 RNA
组成,可为单链或双链,亦可呈环状或线状。
基因组小,含基因数少。
基因组中存在调控元件和转录单元。
有重叠基因存在。
以 RNA为基因组的逆转录病毒。典型的逆转录病毒有三个基因,即由 gag(核心蛋白),pol
(逆转录酶)和 env(包膜蛋白)组成,其基因结构如图所示:
病毒基因组的特点
RNA基因组的两端含有 U3RU5两个完全相同的正向重复序列,从而在两末端形成了长末端重复序列( LTR)。 LTR为激活、增强和调节病毒复制的重要区段。因此 LTR在人类基因组中的整合也可促进其下游基因的活化和表达,如原癌基因被激活后致癌。
U3 U3R RU5 U5
病毒 DNA
LTR LTR
gag pol env
3'
5'
–DNA
+DNA
3'
5'
细菌基因组的特点
由一条双链 DNA组成,为无核仁、核膜的原核结构。
蛋白质基因通常是单拷贝基因。而 rRNA基因则是多拷贝的。
细菌中的结构基因中无内含子,无核膜,一般是边转录边在胞浆中直接合成蛋白质。
无基因重叠结构
DNA分子中有多种功能调控区,如复制起始区、复制终止区、转录启动区及转录终止区等,这些区域常具有反向重复序列。
细菌基因组的特点
质粒( plasmid)是染色体以外的遗传物质,是环状的
DNA分子。不同细菌中的质粒大小不一( 103~105bp)。
在酵母和其它真菌中也发现有质粒。
质粒 DNA的功能类型有三种:( 1) F质粒( F因子)
由称性质粒。控制菌毛形成,利于定居,质粒可由性菌毛来进行质粒传递和转移;( 2) R质粒(抗药性因子)能编码一种或几种抗菌素的抗性物质;( 3) col
质粒(大肠杆菌因子)质粒中含有编码大肠杆菌素的基因,编码的大肠杆菌素可使近缘的细菌致死或抑制生长。有的可编码毒素。
真核基因组的特点
大而复杂,人的单倍体基因组为 3× 109bp,比原核生物大数千倍,其体细胞基因组为双倍体,即有 2份同源的基因组。
存在大量低度、中度和高度重复序列
基因组中功能基因大多是不连续的,为断裂基因
( splitgene)中间被不编码蛋白质的插入序列内含子所隔开。
基因组中非编码区多于编码区,约占总 DNA的 90%。
基因组 DNA大多与蛋白质结合形成染色体,其中
DNA约占 35%,RNA占 5%,其余的 60%为组蛋白和非组蛋白。
真核基因组
C值和 C值矛盾:一个单倍体基因组中的全部
DNA量称为该物种 DNA的 C值( C value)。
单拷贝序列:一部分与蛋白质及酶类表达有关
中度重复序列:通常是非编码序列,与单拷贝基因间隔排列,少数成串排列在一个区域。
高度重复序列
多基因家族:、真核基因组中许多来源相同、
结构相似、功能相关的基因在染色体上成串存在,这样一组基因称为基因家族( gene
family)。
基因的新概念
移动基因( movable gene)又叫转位因子
( transposable elements),可以在染色体基因组上移动,甚至可在不同染色体间跃迁,故又称跳跃基因( jumping gene),后来称其为
insertion sequences(现在一般叫 IS elements)。
现在已发现在细菌中存在着三种类型的转位因子,相对分子质量小于 2000bp的一般叫插入序列( IS),大于 2000bp的称为转位子
( Transposon,Tn),第三种类型为噬菌体 Mu
和 D108。
2、基因工程中常用的工具酶
基因的重组与分离涉及一系列相互关联的酶促反应。
在众多的核酸酶中,限制性核酸内切酶(又称限制酶,restriction enzyme)和 DNA连接酶( ligase)的发现和应用,才真正使分子的体外切割和连接成为可能。
限制性核酸内切酶是一类能够识别双链 DNA分子中的某种特定核苷酸序列,并由此切割双链 DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。
在核酸内切酶的作用下,侵入细菌的“外源 DNA分子被切割成不同大小的片段,而细菌本身的 DNA由于修饰酶的保护作用,可免于自身限制酶的降解。
限制性核酸内切酶分类和命名
分类:即 Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 型酶主要特性 Ⅰ 型 Ⅱ 型 Ⅲ 型
1、限制和修饰作用单一多功能的酶 分开的核酸内切酶和甲基化酶具有一种共同亚基的双功能酶
2、限制酶的蛋白结构
3种不同的酶 单一的成分 2种不同的亚基
3、限制作用所需辅助因子
ATP,mg2+,S- 腺苷甲硫氨酸
mg2+ ATP,mg2+( S- 腺苷甲硫氨酸)
4、切割位点 可能随机切割 位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点
3'端 24~26bp
5、序列特异性的切割不是 是 是
6、在 DNA克隆中的用处无用 非常有用 有用限制酶的命名
( 1)用属名的头一个字母和种名的头两个字母,组成的 3
个字母的略语表示寄主菌的物种名称。例如大肠杆菌
( escherichia coli)用 Eco表示,流感嗜血菌( haemophilus
influenzae)用 Hin表示。
( 2)用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型,例如
EcoR。如果限制和修饰体系在遗传上是由病毒或质粒引起的,则在缩写的寄主菌的种名右下方附加一个标注字母,
表示为染色体外成分。例如 EcoR I,EcoP I。
( 3)如果一种特殊的寄主菌株,具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字。如流感嗜血菌 Rd菌株的几个限制与修饰体系分别表示为 Hind I,Hind II,Hind III等。
( 4)原先的命名现在得到简化,原则为:把所有略语字写成一行;命名酶名称不再特别标出限制酶或修饰酶,即略去 R与 M字母。
II型限制性核酸内切酶的基本特性
( 1)在 DNA分子双链的特异性识别序列部位,
切割 DNA分子形成链的断裂;
( 2) 2个单链断裂部位在 DNA分子上的分布,
通常不是彼此直接相对的;
( 3)断裂的结果形成的 DNA片段,也往往具有互补的单链延伸末端,但平末端例外。
绝大多数的 II型限制酶都能识别由 4,5,6或 7
个核苷酸组成的特定核苷酸序列。该序列称为识别序列。
切割位点
C-C-G-C-G-G
切割位点
G-G-C-G-C-C
5'
3'
3'
5'
对称轴
DNA连接酶和 DNA分子的体外连接
目前已知有 3种方法可以用来在体外连接
DNA片段:第一种是用 DNA连接酶连接具有粘性末端的 DNA 片段;第二种方法是用
T4DNA连接酶直接将平末端的 DNA片段加上 Poly( dA) -Poly(dT)尾巴之后,再用
DNA连接酶将它们连接起来;第三种是,
先在 DNA片段末端加上化学合成的衔接物,
使之形成粘性末端之后,再用 DNA连接酶连接。
其它工具酶
( 1)大肠杆菌 DNA聚合酶 I( E,Coli
DNA Pol I)
DNA聚合酶 I由两种亚基组成,带有 3种酶活性。它的大亚基相对分子量为 7900,
带有聚合活性和 3’外切核酸酶活性,小亚基只有 5’外切核酸酶的活性。
其它工具酶
( 2) DNA聚合酶 I大片段( klenow酶)
klenow酶的相对分子量为 7600。是经过
Subtillisin(枯草杆菌)蛋白酶或胰蛋白酶分解 DNA聚合酶,切除小亚基,只保留大亚基部分。所以这种酶具有 DNA聚合酶的活性和 3’外切酶的活性,但是没有 5’外切核酸酶活性。
其它工具酶
( 3) T4DNA连接酶
此酶是从噬菌体 T4感染的 E,coli中分离的,
和 klenow大片段一样,具有 5’-3’聚合酶活性和 3’-5’外切酶活性。其外切酶活性比 E,coli DNA聚合酶 I的活性高 200倍,
此外,T4聚合酶有第三种活力 ——取代反应。
其它工具酶
( 4)逆转录酶
这是一种有效的转录 RNA为 DNA的酶。又称为依赖 RNA的 DNA聚合酶。其产物 DNA又称为
cDNA,即互补 DNA。最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒( AMV)的逆转录酶,
由?和?两条亚基组成,其相对分子质量分别为
65000和 95000,这种酶具有聚合酶活性和外切割酶活性。(外切活性:如从 DNA-RNA杂交链中特异性地降解 RNA链,进而保留新合成的
DNA链。
其它工具酶
( 5)末端脱氧核苷酰转移酶
从小牛胸腺或髓细胞中分离得到的,它催化
DNA片段上的 3’-OH端加接脱氧核苷酸。合成的方向是从底物的 5’端向 3’端进行。
( 6)核酸酶 S1
是从半曲霉菌中分离得到,可以降解单链 DNA
和 RNA,产生 5’磷酸化单核苷酸或寡聚核苷酸。
又称单链特异的核酸酶。
其它工具酶
( 7)核酸酶 BAL31
从乳白短杆菌细胞中分离的。它能以渐进的方式从线型 DNA分子的 3’,5’两边同时降解,形成小的寡聚核苷酸片段或单核苷酸。
在基因工程中可被用于组建 DNA的物理图谱以及造成克隆 DNA分子的末端缺失。
其它工具酶
( 8)外切核酸酶 III
从大肠杆菌中分离得到,功能是将带有 3’-OH
末端的双链 DNA从 3’到 5’端方向切除,产生 5’
单核苷酸。此外该酶还带有内切核酸酶活性、
RNaseH活性和 3’磷酸酶活性。
在基因工程中制备单链 DNA,以便用作 DNA聚合酶反应的 DNA模板;
在基因工程中制备对 DNA有特异性的探针。
其它工具酶
( 9) T4多聚核苷酸激酶
此酶能将 ATP上的?位磷酸转移到 DNA或
RNA的 5’-OH上,酶作用底物是 单链或双链带有 5’-OH末端的 DNA或 RNA。
其它工具酶
( 10)碱性磷酸酶
从细菌中分离得到的碱性磷酸酶称为
BAP酶,从小牛内脏中分离制备的酶称为 CAP酶。该酶的功能是以单链或双链
DNA,RNA为基质,将 DNA或 RNA片段
5’端的磷酸切除。
其它工具酶
( 11)甲基化酶
大部分大肠杆菌菌株中含有两种与 DNA
甲基化作用有关的酶,有 dam甲基化酶和
dcm甲基化酶。
3、基因克隆载体
基因工程中所用的载体,主要有 5类,a、
质粒,主要指人工构建的质粒; b、噬菌体?的衍生物; c,cosmid; d、单链 DNA
噬菌体 M13; e、动物病毒。
载体的本质是 DNA(少数为 RNA)。
质粒
细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体之外的一种遗传成分,它是由环形双链的
DNA组成的复制子。除了酵母的杀伤质粒
( killer plasmid)是一种 RNA质粒外,迄今已知的所有质粒否是这种类型的 DNA分子(见下图)
质粒命名一般为小写 p代表质粒,后接两个大写字母代表发现者或实验室,数字代表编号。
质粒以三种形式存在:超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋。
环形质粒分子环形染色体
DNA
大肠杆菌细胞可移动质粒控制质粒 DNA转移的基因抗菌素抗性基因