生物技术制药第五章 动物细胞制药第五章 动物细胞制药
第一节 概述
第二节 动物细胞的形态和生理特点
第三节 生产用动物细胞的要求和获得
第四节 动物细胞的培养条件和培养基
第五节 动物细胞培养的方法和操作方式
第六节 动物细胞生物反应器及其检测控制系统
第七节 动物细胞制药的前景和展望第一节 概述
（ 1）发现细胞和细胞学说创立。 1665年英国物理学家
Hooke通过自制的显微镜观察切成薄片的软木时看到死细胞的细胞壁。
（ 2）组织培养或细胞培养。 1885年德国生理盐水培养鸡胚组织，至 1907年，细胞体外培养宣布进入一个新时代。
（ 3）细胞工程学时代。对细胞进行人工改造及培养以使其为人类服务的时代，包括真核细胞的基因重组、导入、扩增和表达的理论和技术，细胞融合的理论和技术，
细胞器特别是细胞核移植的理论和技术，染色体改造的理论和技术，转基因动、植物的理论和技术，细胞大量培养的理论和技术，以及产物分离纯化的理论和技术。
（ 4）细胞工程制药成为现代制药技术中常用的手段。
第二节 动物细胞的形态和特点
一、动物细胞的形态
二、动物细胞的生理特点一、动物细胞的形态细胞的分化（或特化）
形态分化在离体培养同样也存在。
离体培养的细胞分为两类：
贴壁依赖型（ anchorage-dependent） 和非贴壁依赖型（ anchorage-independent），
前者可简称为贴壁细胞，后者可简称为悬浮细胞。
动物细胞结构图一、动物细胞的形态
1、贴壁细胞
这类细胞的生长必须有给以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长、增殖。
细胞在该表面生长一般形成两种形态，即成纤维样细胞型或上皮样细胞型 。 前者主要来源于中胚层组织的细胞，生长时呈放射状、旋涡状或火焰状走行；后者主要来源于外胚层和内胚层组织的细胞，生长时彼此紧密连接成单层细胞片。
一、动物细胞的形态
2、悬浮细胞
这类细胞的生长不依赖支持物表面，可在培养液中呈悬浮状态生长，如血液的淋巴细胞和用以生产干扰素的 Namalwa细胞等，细胞呈圆形。
3、兼性贴壁细胞
兼具上述两种生长方式的细胞，称为兼性贴壁细胞，如 CHO细胞、小鼠 L929细胞。当它们贴附在支持物表面上生长时呈上皮或成纤维细胞的形态，而当悬浮于培养基中生长时则呈圆形，但有时它们可相互支持贴附在一起生长。
二、动物细胞的生理特点
1、细胞的分裂周期长
一般为 12~48h,细胞分裂周期 =间期（ G1期 +S期
+G2期） +分裂期（ M期）
G1期：凡细胞无增殖活动时皆滞留在 G1期
S 期,DNA的合成，一般为 6~8小时
G2期,DNA量加倍,RNA合成和染色体螺旋化，
持续时间短，一般为 2~5h。
M期：一般持续时间很短，仅 0.5~1h。 相当于有丝分裂的中后期和末期，主要是染色体的变化、
分裂，并形成子细胞。
细胞分裂代数与培养中的代数及相互关系。
二、动物细胞的生理特点
2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象
大多数正常二倍体（ dipoid） 细胞的生长都需要一定的基质（如玻璃，塑料等）上贴附，伸展后才能生长增殖，其机制可能与电荷、钙镁离子的作用以及许多贴附因子有关。
当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，细胞与其周围细胞相互接触时，细胞才停止增殖。
保持一定的营养，细胞仍可存活一段时间，但细胞密度不再增加，该现象就称为接触抑制或密度依赖抑制现象。一旦细胞转化为异倍体后，该现象消失，细胞可多层生长，细胞密度可大大增加。
二、动物细胞的生理特点
3、正常二倍体细胞的生长寿命是有限的
当细胞培养开始，称之为原代培养，经过传代后，即成为有限细胞系，即有限的生长传代时间，取决于细胞来源的种族和年龄，人胚成纤维细胞约可培养 50代，鸡胚的 30代，小鼠的 8代。但是若向培养基中加入表皮生长因子，可使上皮细胞的寿命从原来的 50代增加至 150代。
当细胞突变为异倍体后，该细胞可转变成无限细胞系，或称连续细胞系。
二、动物细胞的生理特点
4、动物细胞对周围环境比较敏感
无细胞壁保护，因而外界的物理化学因素很容易产生影响。
5、动物细胞培养基的要求高
与细菌和植物细胞不同，其需要 12种必需氨基酸,8种以上的维生素、多种无机盐和微量元素、作为主要碳原的葡萄糖以及多种细胞生长因子和贴附因子，而且不同种类要求又有变化。
二、动物细胞的生理特点
6、动物细胞蛋白的合成途径和修饰功能与细菌不同
场所：游离的核糖体以及粗面内质网上的核糖体，前者合成的蛋白质都用于细胞质基质内，后者上合成的蛋白质是分泌性的和膜中的整合蛋白，多数为糖蛋白。
蛋白质上的糖链有的在内质网上加接，有的在高尔基体中加接。其中内质网中加接的是 N-链寡糖，在高尔基体内加接的是 O-链寡糖。
第三节 生产用动物细胞的要求和获得
一、生产用动物细胞的要求
二、生产动物细胞的获得
三、常用生产用动物细胞的特性
四、基因工程细胞的构建和筛选
五、细胞库的筛选一、生产用动物细胞的要求
（ 1）原代正常组织分离的细胞
（ 2）二倍体细胞，即使是传代细胞
（ 3）传代细胞用于生产
（ 4）按照 FDA对细胞株的要求，控制最终产品中 DNA残留量。
二、生产动物细胞的获得
原代细胞、已建立的二倍体细胞系、可无限期传代的转化细胞系，以及用这些细胞进行融合和重组的工程细胞系。
1、原代细胞：是直接取自动物组织、器官，
经过粉碎、消化而获得的细胞悬液。一般
1g组织约有 109个细胞。
2、二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。
转化细胞系：失去了正常细胞的特点，可以无限增殖。
三、常用生产用动物细胞的特性
（ 1） WI-38,1961年来源于女性高加索人正常胚肺组织的二倍体细胞系，核型 2n=46。
该细胞是成纤维细胞，能产生胶原，培养基用 BME（ Eagle’s basal medium） 加小牛血清,pH控制在 7.2，同工酶为 G6PD B型。
细胞的倍增时间为 24h,有限寿命为 50代，
上世纪 60年代被广泛用于制备疫苗。
（ 2） MRC-5,特性和用途与 WI-38相似，
1966年来源于 14周正常男性，对多种人的病毒敏感，用于疫苗的生产。
三、常用生产用动物细胞的特性
（ 3） CHO-K1,1957年从中国地鼠卵巢中分离的一株上皮样细胞。在培养时需加入脯氨酸。核型为 2n=20~22。 目前广泛用于构建工程细胞的是一株缺乏二氢叶酸还原酶的营养缺陷突变株 CHO-dhfr-,它常用的培养基为 DMEM培养基，加 0.1 mol/L次黄嘌呤和 0.01m mol/L胸苷，以及 10%小牛血清。
三、常用生产用动物细胞的特性
（ 4） BHK-21,1961年从 5只无性别的生长
1天的地鼠幼鼠的肾脏中分离的。现在广泛采用的是 1963年用单细胞分离的方法经 13
次的克隆的细胞。成纤维细胞,2n=44。 通常用的培养基为 DMEM培养基，添加 7%胎牛血清。过去多用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒和狂犬病疫苗，现在已被用于构建工程细胞。
三、常用生产用动物细胞的特性
（ 5） Vero,1962年来源于正常的成年非洲绿猴肾。是贴壁依赖的成纤维细胞,2n=60,高倍体率为 1.7%，可持续地进行培养。通常用的培养基为 199培养基，添加 5%胎牛血清。该细胞可支持多种病毒的增殖，包括脊髓灰质炎、狂犬病病毒，
已被批准用于人体。
（ 6） Namalwa,1972年来源于肯尼亚患有 Burkitt
淋巴瘤的病人体中，后在瑞典构建的一株人的类淋巴母细胞，高细胞有 2.8%的高倍体率，多数细胞有 12~14条标记染色体，单条 X染色体，无 Y染色体。通常用的培养基为 RPMI 1640,添加 7%胎牛血清。用于大规模生产?-干扰素。
三、常用生产用动物细胞的特性
（ 7） SP2/0-Ag14,该细胞是 1978年中通过融合的方法，从有抗羊红细胞活性的 BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系 P3X63Ag8融合的杂交瘤
SP2/HL-Ag亚克隆中分离得到。它不分泌任何免疫球蛋白抗体链，能耐受 8-氮鸟嘌呤（ 8-
azaguanine） 20?g/ml,但在含 HAT选择培养基中不能存活。通常用的培养基为 DMEM培养基，添加 10%胎牛血清。该细胞系已被广泛地用于单克隆抗体杂交瘤细胞的制备和抗体的生产。近年来正在被开发为生产其他药品的高表达宿主三、常用生产用动物细胞的特性
（ 8） Sf-9,1983年从亲代 IPLB-SF21 AE中克隆形成。亲代细胞则在 1977年从秋粘虫
（ Spodoptera frugiperda)的蛹卵组织中分离获得。它对苜宿尺蠖核型多角体病毒
（ Autographa california MNPV） 和其他杆状病毒（ Baculovirus） 高度敏感。通常用的培养基为 Grace培养基，添加 3.3g/L 水解乳蛋白和 3.3g/L酵母浸液，以及 10%胎牛血清。
目前已经被广泛用于高效表达外来蛋白制品。
四、基因工程细胞的构建和筛选
原代细胞、二倍体细胞系和转化细胞系三者在生产中都有使用，但在生产中采用更多的、更有前景的是融合细胞及采用基因工程手段构建的各种工程细胞。当前被用以构建工程细胞的动物细胞有 CHO-dhfr-、
BHK-21,Namalwa,Vero,SP2/0和 Sf-9等细胞。
那么如何获得动物工程细胞呢？
四、基因工程细胞的构建和筛选
1、真核细胞基因表达载体的构建
2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
1、真核细胞基因表达载体的构建
目前一般使用的载体有两类：一是病毒载体，如牛痘病毒、腺病毒和逆转录病毒和杆状病毒等。牛痘病毒已被广泛地用来构建成多价疫苗，腺病毒和逆转录病毒载体正被试用用于基因治疗中，而杆状病毒载体 -昆虫细胞系统已被成功地用于 300多种外源基因的高效表达。
用杆状病毒做载体有许多优点：（ 1）该病毒基因组是双链 DNA,容易进行重组；（ 2）插入 7~8kb的 DNA不影响正常病毒粒子的形成；（ 3）多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒子；（ 4）多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的 20~30%；（ 5）用光学显微镜可看到多角体，容易以此为标记物来挑选阳性克隆；（ 6）如果用家蚕杆状病毒，还可在蚕体直接表达外源基因。
1、真核细胞基因表达载体的构建
另一类是质粒载体，而且常常是穿梭质粒载体，即在细菌和哺乳动物细胞两者体内都能扩增。构建此类载体一般含有如下基本成分,（ 1）允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。多数含有质粒 pBR322或其衍生载体
pAT153的序列，包括能使质粒在细菌体内复制的起始位点和抗生素标记基因。（ 2）含有能使基因转录表达的调控元件，在 5’端转录起动需要有启动子，包括帽状位点（ RNA转录起始点）上游约 30碱基处的 TATA框和上游 70~90碱基处的 CAAT框序列和增强子。当前构建载体的许多启动子序列都来自病毒。也有其它来源的启动子。此外，在基因 3’端应有终止序列,RNA 3’端的切割序列和 poly A序列等。近来有人在载体里加入显性活动调控区（ DCR）序列，以此来克服因载体整合在宿主基因组位点而产生的表达水平降低。
1、真核细胞基因表达载体的构建
（ 3）能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。一般有两类标记：一类仅适合用于密切相关的突变细胞株，
如采用标记基因 hgprt,tk和 aprt等基因，它们仅适用于
hgprt-,tk--和 aprt--等基因缺失的细胞株。另一类是显性作用基因，如 neo基因，它能使氨基糖苷抗生素 — 新霉素磷酸化而失活，从而使原来对新霉素敏感的哺乳动物细胞一旦获得含该基因的载体后，就能在含该抗生素的培养基中存活。（ 4）有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。最常用的是编码二氢叶酸还原酶的基因。该酶的扩增可防止氨甲喋呤（ MTX） 对细胞的毒害作用。
利用该原理，在构建载体时可有意识地将它与目的基因重组在一起，当在培养基内增加 MTX浓度时，就会促使
dhfr基因的扩增，同时也会使其毗邻的目的基因随之扩增，从而大大提高表达量。类似的扩增系统还有谷氨酰胺合成酶和腺苷脱氢酶等系统。
2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
（ 1） DNA导入动物细胞方法：
融合法 化学法 物理法 病毒法细胞融合法 DNA-磷酸钙沉淀法 电穿孔法 重组逆转录病毒脂质体介导法 DEAE-葡聚糖法 显微注射法 重组 DNA病毒原生质融合法 染色体介导法 基因枪法 多瘤病毒样颗粒微细胞介导法鬼影红细胞介导法介导法介导法
2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
（ 2）筛选：
外源基因导入动物细胞的效率是很低的，首先要依靠构建载体内的选择标记采用相应的筛选系统，
如用 HAT（ 次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）选择系统，筛选 tk+,hgprt+的转化细胞；用 GPT
（ HAT,黄嘌呤、甘氨酸、霉酚酸）选择系统，
筛选 gpt+的转化细胞；用 G418（ Geneticin） 选择系统，筛选 Neor的转化细胞；用 MTX选择系统，
筛选 dhfr+的转化细胞，等等。其次是对选出的细胞进行克隆和亚克隆使其纯化。最后在多数情况下需利用其扩增系统，不断增加其基因拷贝数，
从而获得高效表达而稳定的工程细胞株。
五、细胞库的建立
除原代细胞外，其它的细胞株、细胞系都需要建细胞库加以保存。按照我国和美国
FDA的规定，用于生产的工程细胞必须建立两个细胞库：原始细胞库（ master cell
bank,MCB） 和生产用细胞库
（ manugacture’s working cell bank,MWCB）
或称工作细胞库（ working cell bank，
WCB）。
五、细胞库的建立
储存于 MCB的细胞应该是单一来源的均质的细胞，对于二倍体细胞应该是群体倍增水平尽可能低的细胞。储存时应具有该细胞详细档案，包括：
（ 1）该细胞系的历史：来源、动物的年龄和性别、细胞分离的方法和所用的培养材料等（若来源于人，则还需要知道该人的病史，以便检查是否存在着病原体）；（ 2）该细胞的特性：形态、
生长特性如倍增时间和分种比等。种源的特性，
如核型、同工酶、细胞抗原、以及特异的标记染色体等。若是用于生产的重组细胞，在需有载体构建的资料、基因拷贝数、表达产物的性质和产量及其稳定性等。（ 3）对各种有害因子的检查结果：细菌、真菌、支原体和各种病毒，包括逆转录病毒等。
五、细胞库的建立
储存于 MWCB的细胞应该是从 MCB来的，
或从单一安瓿来，或从多个安瓿在融化即刻混合在一起的，然后经培养扩增到一定数量后，再分装储存形成的细胞库。同样该细胞库也必须建立档案，而且需要进行无菌性和无细胞交叉污染的检查。生产时需确定其最高使用的传代数。
第四节 动物细胞的培养条件和培养基
为了使细胞培养在体外培养成功，需要一些基本条件,（ 1）绝对无菌操作；
（ 2）足够的营养供应，排除有害物质包括极其微量的离子掺入；（ 3）适量氧气供应；（ 4）随时清除细胞代谢中产生的有害产物；（ 5）有良好的适于生存外界环境，包括 pH,渗透压和离子浓度等；（ 6）及时分种，保持合适的细胞密度。
第四节 动物细胞的培养条件和培养基
一、动物细胞的培养条件
二、动物细胞培养基的种类和组成一、动物细胞的培养条件
1、器材的清洗和消毒
器材的清洗：一般来说，需经浸泡、刷洗、泡酸和冲洗四个步骤，用过的器材最好尽快地浸泡在
3%的磷酸三钠溶液内过夜，以除去蛋白质和残余细胞等污垢。
器材的消毒灭菌：主要通过物理方法和化学方法来达到严格无菌的操作过程。书中表 5-4是细胞培养中常用的消毒剂、浓度和使用场合的列表。
尽量避免使用抗生素，但在工业生产中还是经常使用的。常用抗生素及其浓度见表 5-5
一、动物细胞的培养条件
2、水质
蒸馏、离子交换、电渗析、反渗透、
中空纤维过滤等单独使用或配合使用，制备纯水，一般要求金属离子含量很低，电阻值在 18M?以上。动物细胞制药用水，要求去热源。
一、动物细胞的培养条件
3,pH
pH的高低对细胞各种酶的活性、细胞壁的通透性以及许多蛋白的功能都有重要的影响。动物细胞培养的最适 pH为 7.2~7.4，低于 6.8或高于 7.6时会对细胞产生不利影响，严重时会引起细胞退变甚至死亡。一般来说，传代细胞比原代细胞对
pH变动的耐受性强，细胞量多时比细胞量少时耐受性强。细胞代谢也会造成 pH变化，可用缓冲体系来稳定细胞周围环境的 pH。 书中给出了部分缓冲体系，可以参考。
一、动物细胞的培养条件
4、渗透压
在细胞培养的所有操作中，为了使与细胞接触的所有液体都保持有较合适的渗透压和 pH,一般都需要使用平衡盐溶液
（ balanced salt solution,BSS）,它由无机盐和葡萄糖组成。表 5-6列出了几种常用平衡盐溶液（ BSS） 组成 /g·L-1。
二、动物细胞培养基的种类和组成
细胞种系不同对培养基的要求亦有差异，主要有三类：天然培养基、合成培养基和无血清培养基。
1、天然培养基：在细胞培养的早期阶段使用的培养基，主要为来自天然的材料如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。
2、合成培养基：优点是成分明确，组分稳定，
可大量生产供应。动物细胞培养中常用的有 BME、
MEM,DMEM,HAM F12,RPMI 1640以及
ISOCOV,199和 McCoy等，构成这些培养基的主要成分见书中表 5-7。
二、动物细胞培养基的种类和组成
上述合成培养基中主要有氨基酸、维生素、糖类、
无机盐以及其它一些特定成分如核酸的前体腺苷、
鸟苷等。
为了给细胞培养以更大的方便，以便于其增殖或贴附生长，长向培养基中加入一定量的动物血清，
常用的是添加 5%~10%的小牛血清，杂交瘤细胞的培养中，血清可能要求的更高，常用 10~20%
的胎牛血清。血清的作用机制可能为：（ 1）提供有利于细胞生长增殖所需要的各种生长因子和激素；（ 2）提供有利于细胞贴壁所需要的贴附因子和伸展因子；（ 3）提供可识别金属、激素、
维生素和脂类的结合蛋白；（ 4）提供细胞生长所必须的脂肪酸和微量元素。
二、动物细胞培养基的种类和组成
3、无血清培养基
无血清培养基的优点如下,①提高了细胞培养的可重复性，避免，避免了由于血清批之间差异的影响；②减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；③供应充足、稳定；④
细胞产品容易纯化；⑤避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；⑥减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于实验结果的分析。
目前已经有市售无血清培养基（书中表 5-8所示）。无血清培养基中都是在合成培养基内加入不同种类的添加剂所构成，大致有以下几类：
（ 1）激素和生长因子：使用最多的是胰岛素，促进糖原和脂肪酸的合成，对细胞生长有刺激作用。
（ 2）结合蛋白：最经常被补充的是铁传递蛋白和白蛋白。为了便于纯化，有时可用硫酸亚铁、柠檬酸铁、葡萄糖酸铁代替铁传递蛋白。
（ 3）贴附和伸展因子：目前多数无血清培养基只适用于悬浮细胞，真正能用以培养贴壁细胞的很少，
也很贵，原因在于它们均缺少必需的贴附和伸展因子，除这些因子外，有的还添加维生素 A酸和重组的小肽，它可与细胞的受体结合。
（ 4）其它有利于细胞生长的因子和元素：它们包括有消除氧自由基损害的谷胱甘肽，某些微量元素，
如硒等。
第五节 动物细胞培养的方法和操作方式
一、动物细胞大规模培养的方法
从生产实际来看，动物细胞的大规模培养主要可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁 -悬浮培养。
二、动物细胞培养的操作方式
无论是哪种培养，其操作方式与细菌培养一样，
一般可分为分批式操作、补料 -分批（或流加式）
操作、半连续式操作、连续式操作和灌流式操作，
其中补料 -分批（或流加式）操作在用细菌生产时被普遍采用，但在动物细胞培养中用得较少。
其中分批式、半连续式和灌流式比较重要。
一、动物细胞大规模培养的方法
1、悬浮培养（ suspension culture）
适用于一切种类的非贴壁依赖性细胞（悬浮细胞），也适用于兼性贴壁细胞。目前生产中用于悬浮培养的设备主要是通气搅拌式生物反应器和气升式生物反应器。
2、贴壁培养
一切贴壁依赖性细胞，也适用于兼性贴壁细胞。
适用的细胞种类广，较容易采用灌流培养的方式使细胞达到高密度；不足之处是操作比较麻烦，
需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧效果差。另一种被普遍采用的贴壁培养方法是固定化生物反应器，但由于该反应器中传质和传氧常出现梯度式不均一现象，
故放大受到限制。
一、动物细胞大规模培养的方法
贴壁培养和悬浮培养的另一个不同之处是在传代或扩大培养时，常常需要用酶将其从基质上消化下来。
3、贴壁 -悬浮培养，或称假悬浮培养
（ 1）微载体培养：创造大的贴附面积，供细胞贴附生长增殖，载体体积小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，充分发挥悬浮培养的一切优点。理想的微载体应具备：生物相容性、无毒性、表面惰性、比重适当
（ 1.030~1.045g/ml）,粒径均一，在 60~250?m
之间（溶胀后）、光学透明、柔软、耐高压灭菌温度、反复多次使用、制备简单、原料充分。
80年代以后发展的多孔微载体或微球，有商品出售。
一、动物细胞大规模培养的方法
3、贴壁 -悬浮培养，或称假悬浮培养
（ 2）包埋或微囊培养：将细胞包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。一般载体材料为：人工合成的
polymer,糖类如纤维素等、蛋白质如胶原、纤维蛋白等。此方法的优点之一是可采用多种生物反应器进行大规模培养。
（ 3）结团培养：利用细胞本身形成结团的特点，
相互结团后再用悬浮的方法培养，操作简便，节省了用于微载体的成本。
二、动物细胞培养的操作方式
1、分批式操作
一种是将细胞和培养基一次性加入反应器内进行培养，此后细胞不断增长，产物不断形成和积累，
最后将条件培养基（ conditioned medium）,即经培养已含有细胞产物的培养基，或连同细胞一并取出，培养结束。
另一种是先将细胞和培养基加入反应器，待细胞生长至一定密度后，向反应器内加入诱导剂或病毒等，经一端时间作用后，将反应物取出，如产生 Namalwa干扰素和疫苗等。
二、动物细胞培养的操作方式
2、半连续式操作
该方式是当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，取出部分培养物，或单纯是条件培养基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样数量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。该操作方式在动物细胞培养和药品生产中被广泛采用，它的优点是操作简便，生产效率高，可长期进行生产，反复收获产品，而且可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。
二、动物细胞培养的操作方式
3、灌流式操作
该方式是当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。它与连续式操作不同之处在于取出部分条件培养基时，绝大部分细胞仍保留在反应器内，而连续式培养则同时也取出了部分细胞。该操作方式是近代用动物细胞培养生产各种药品最被推崇的方式。它的优点是：①
细胞可处在较稳定的良好的环境中，有害代谢物浓度低；②可极大地提高细胞密度，从而极大地提高了产品产量；③产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温下保存，有利于产品质量的提高；④培养基的比消耗率较短，加之产量质量的提高，生产成本明显降低。
二、动物细胞培养的操作方式
灌流式操作在某些生物反应器中是唯一可行的操作方式，如中空纤维生物反应器、固定床或流化床式反应器、膜式生物反应器等。在这些反应器中，细胞已被固定，在取出部分条件培养基和补充新鲜培养基和补充新鲜培养基时，细胞基本上都被保留反应器中，故采用该操作不存在困难。
但在微载体培养、悬浮培养和结团培养中，就存在一个如何使条件培养基和细胞、载体分离的问题。为了解决该问题，目前采用的方法有与旋转轴连在一起的滤网、有专门用于悬浮细胞的中空纤维分离器、超声波分离器和靠微载体自重沉降分离的上细下粗的排液柱以及靠离心分离的专用离心机等。
第六节 动物细胞生物反应器及其检测控制系统
理想的动物生物反应器必须具备如下一些基本要求：
①体系中的其它材料，对细胞必须无毒性；
②生物反应器结构的传质、传热和混合性能好；
③密封性能良好，可避免一切外来微生物的污染；
④培养环境多种物化参数可自动检测和调节控制，控制的精确度高，且能保持环境质量的均一；
⑤可长期连续运转，尤其对于动物细胞而言；
⑥容器加工制造时要求内面光滑，无死角；
⑦拆装、连接和清洁方便，耐高压蒸汽消毒便于操作消毒；
⑧设备成本尽可能低。
反应器可分为实验室规模、中试规模和生产规模。
第六节 动物细胞生物反应器及其检测控制系统
一、动物细胞生物反应器的类型和其基本结构；
二、动物细胞生物反应器的检测控制系统；
一、动物细胞生物反应器的类型和其基本结构
1、搅拌罐式生物反应器
通过借鉴细菌发酵罐得到的动物细胞反应器，有如下特点：（ 1）罐体的高径比一般采用 1~1.5,1，利于增大与空气的接触面；培养动物的罐底为圆形，
以避免细胞和载体沉积在周边；（ 2）为防止搅拌产生的切力损伤细胞，搅拌速度慢，一般在
20~100r/min,故多数倾向于采用较大的倾斜式桨叶搅拌器或船舶推进式桨叶搅拌器；（ 3）一般采用无气泡通气系统，以解决由于气泡破裂时产生的应力对细胞的损伤；（ 4）高密度、长时间培养以及提高反应器的生产效率考虑，反应器常常需要配备有进出液体系统，以便进行灌流培养，并有使细胞与培养基分离使细胞保留在反应器内的装置。
搅拌罐式生物反应器在目前仍然是重要的生产设备。
一、动物细胞生物反应器的类型和其基本结构
2、气升式生物反应器
该反应器的特点见图 5-
4，与搅拌式生物反应器相比，具有剪切力小，混合均一，氧和营养的传递好，由于没有了机械搅拌的结构，有利于设备的密封，降低了造价。高径比一般在 10,1左右。
一、动物细胞生物反应器的类型和其基本结构
3、中空纤维式生物反应器
图 5-5一是由数百乃至数千根中空纤维集束组成的反应器，纤维的材料为聚砜或丙烯共聚物，纤维壁厚为 50~100?m,呈多孔性，
内层为超滤膜，内腔直径为 200?m,两端用环氧树脂等材料将纤维粘和在一起，并使内腔开口于外加的塑料圆筒，使形成两个隔开的腔。
④培养基进口 ⑤中空纤维外部空间（ ESC） ⑥培养基出口
① ESC出口
②中空纤维
③细胞接种管一、动物细胞生物反应器的类型和其基本结构
3、中空纤维式生物反应器
该反应器占地空间小，产品产量、质量高，生产成本低。不足之处在于：①不能重复使用；②不能耐受高压灭菌，需用环氧乙烷或其它消毒剂灭菌；③难以取样检测。为克服这些不足，新型平床式中空纤维生物反应器被开发出来，见书中图
5-6。培养原代人胚肾细胞时，用无血清培养基，
细胞在 5周内一直很稳定地产生尿激酶。
一、动物细胞生物反应器的类型和其基本结构
4、透析袋或膜式生物反应器
在动物细胞培养过程中，会产生一些代谢产物，如乳酸和氨等，对细胞的生长和产物的产生会产生抑制作用，因此有些学者设计了透析袋或膜式反应器，它们可将这些有害代谢产物透析或过滤掉，从而使细胞生长至更高密度，同时可根据需要选用不同相对分子质量的膜，使产物保留在膜内或与细胞分离开。
一、动物细胞生物反应器的类型和其基本结构
5、固定床或流化床式生物反应器
结构较简单，装填的材料可以是一切对细胞无毒、
又有利于细胞贴附的材料，有实心载体和有孔载体两类。
（ 1） Verax公司推出的 CF-IMMO培养系统见后面图 5-8，或 SF-2000流化床生物反应器，该类反应器专用于比重较大的微球的培养。微球由胶原制成，直径为 500?m,孔径为约 20~40?m,比重较大，为 1.6~1.8g/ml,因为其中加入了钛微粒。
液流向上时，微球在一定范围内浮动或旋转，保证了微球内细胞可获得充分的营养和氧。
（ 2） NBS公司在原来的笼式通气搅拌式基础上，还开发出新型的生物反应器，如
CelliGen plus生物反应器，其是将通气搅拌与固定床巧妙结合的一种新型生物反应器，
见书中图 5-9。
二、动物细胞生物反应器的检测控制系统
1、培养过程中需检测的物化参数
有些需要在线检测，如温度,pH,搅拌速度、溶氧等；有些则需要取样离线检测，
如活细胞数、氨基酸浓度分析、葡萄糖乳酸和铵离子的检测等，有些则需在检测后计算后才能获得，如细胞的群体倍增时间、
细胞的比增长率、葡萄糖消耗率、乳酸产率 ]生物反应器生产率等。
2、主要参数的检测和控制方法
根据需求各种参数都可以进行检测和控制。
第七节 动物细胞制药的前景和展望
一、提高产量、降低成本和改进质量方面的研究
二、转基因动物的研究：转基因动物中转基因方法尚不成熟，现有的高效载体不多，整合的位置随意性大，成功率从而降低。此外，转基因动物的健康有时也成问题，一是产品对动物的健康影响，
二是产品对人体健康的影响。
第七节 动物细胞制药的前景和展望
三、组织工程的研究
所谓组织工程，即通过对细胞的大量培养，
并用细胞直接作为一种治疗手段用于临床，
或用培养的细胞进一步加工构成一种组织，
如人造皮肤、人造肝脏、人造胰腺、人造血管和人造骨等，并用于临床治疗。
第一节 概述
第二节 动物细胞的形态和生理特点
第三节 生产用动物细胞的要求和获得
第四节 动物细胞的培养条件和培养基
第五节 动物细胞培养的方法和操作方式
第六节 动物细胞生物反应器及其检测控制系统
第七节 动物细胞制药的前景和展望第一节 概述
（ 1）发现细胞和细胞学说创立。 1665年英国物理学家
Hooke通过自制的显微镜观察切成薄片的软木时看到死细胞的细胞壁。
（ 2）组织培养或细胞培养。 1885年德国生理盐水培养鸡胚组织，至 1907年，细胞体外培养宣布进入一个新时代。
（ 3）细胞工程学时代。对细胞进行人工改造及培养以使其为人类服务的时代，包括真核细胞的基因重组、导入、扩增和表达的理论和技术，细胞融合的理论和技术，
细胞器特别是细胞核移植的理论和技术，染色体改造的理论和技术，转基因动、植物的理论和技术，细胞大量培养的理论和技术，以及产物分离纯化的理论和技术。
（ 4）细胞工程制药成为现代制药技术中常用的手段。
第二节 动物细胞的形态和特点
一、动物细胞的形态
二、动物细胞的生理特点一、动物细胞的形态细胞的分化（或特化）
形态分化在离体培养同样也存在。
离体培养的细胞分为两类：
贴壁依赖型（ anchorage-dependent） 和非贴壁依赖型（ anchorage-independent），
前者可简称为贴壁细胞，后者可简称为悬浮细胞。
动物细胞结构图一、动物细胞的形态
1、贴壁细胞
这类细胞的生长必须有给以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长、增殖。
细胞在该表面生长一般形成两种形态，即成纤维样细胞型或上皮样细胞型 。 前者主要来源于中胚层组织的细胞，生长时呈放射状、旋涡状或火焰状走行；后者主要来源于外胚层和内胚层组织的细胞，生长时彼此紧密连接成单层细胞片。
一、动物细胞的形态
2、悬浮细胞
这类细胞的生长不依赖支持物表面，可在培养液中呈悬浮状态生长，如血液的淋巴细胞和用以生产干扰素的 Namalwa细胞等，细胞呈圆形。
3、兼性贴壁细胞
兼具上述两种生长方式的细胞，称为兼性贴壁细胞，如 CHO细胞、小鼠 L929细胞。当它们贴附在支持物表面上生长时呈上皮或成纤维细胞的形态，而当悬浮于培养基中生长时则呈圆形，但有时它们可相互支持贴附在一起生长。
二、动物细胞的生理特点
1、细胞的分裂周期长
一般为 12~48h,细胞分裂周期 =间期（ G1期 +S期
+G2期） +分裂期（ M期）
G1期：凡细胞无增殖活动时皆滞留在 G1期
S 期,DNA的合成，一般为 6~8小时
G2期,DNA量加倍,RNA合成和染色体螺旋化，
持续时间短，一般为 2~5h。
M期：一般持续时间很短，仅 0.5~1h。 相当于有丝分裂的中后期和末期，主要是染色体的变化、
分裂，并形成子细胞。
细胞分裂代数与培养中的代数及相互关系。
二、动物细胞的生理特点
2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象
大多数正常二倍体（ dipoid） 细胞的生长都需要一定的基质（如玻璃，塑料等）上贴附，伸展后才能生长增殖，其机制可能与电荷、钙镁离子的作用以及许多贴附因子有关。
当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，细胞与其周围细胞相互接触时，细胞才停止增殖。
保持一定的营养，细胞仍可存活一段时间，但细胞密度不再增加，该现象就称为接触抑制或密度依赖抑制现象。一旦细胞转化为异倍体后，该现象消失，细胞可多层生长，细胞密度可大大增加。
二、动物细胞的生理特点
3、正常二倍体细胞的生长寿命是有限的
当细胞培养开始，称之为原代培养，经过传代后，即成为有限细胞系，即有限的生长传代时间，取决于细胞来源的种族和年龄，人胚成纤维细胞约可培养 50代，鸡胚的 30代，小鼠的 8代。但是若向培养基中加入表皮生长因子，可使上皮细胞的寿命从原来的 50代增加至 150代。
当细胞突变为异倍体后，该细胞可转变成无限细胞系，或称连续细胞系。
二、动物细胞的生理特点
4、动物细胞对周围环境比较敏感
无细胞壁保护，因而外界的物理化学因素很容易产生影响。
5、动物细胞培养基的要求高
与细菌和植物细胞不同，其需要 12种必需氨基酸,8种以上的维生素、多种无机盐和微量元素、作为主要碳原的葡萄糖以及多种细胞生长因子和贴附因子，而且不同种类要求又有变化。
二、动物细胞的生理特点
6、动物细胞蛋白的合成途径和修饰功能与细菌不同
场所：游离的核糖体以及粗面内质网上的核糖体，前者合成的蛋白质都用于细胞质基质内，后者上合成的蛋白质是分泌性的和膜中的整合蛋白，多数为糖蛋白。
蛋白质上的糖链有的在内质网上加接，有的在高尔基体中加接。其中内质网中加接的是 N-链寡糖，在高尔基体内加接的是 O-链寡糖。
第三节 生产用动物细胞的要求和获得
一、生产用动物细胞的要求
二、生产动物细胞的获得
三、常用生产用动物细胞的特性
四、基因工程细胞的构建和筛选
五、细胞库的筛选一、生产用动物细胞的要求
（ 1）原代正常组织分离的细胞
（ 2）二倍体细胞，即使是传代细胞
（ 3）传代细胞用于生产
（ 4）按照 FDA对细胞株的要求，控制最终产品中 DNA残留量。
二、生产动物细胞的获得
原代细胞、已建立的二倍体细胞系、可无限期传代的转化细胞系，以及用这些细胞进行融合和重组的工程细胞系。
1、原代细胞：是直接取自动物组织、器官，
经过粉碎、消化而获得的细胞悬液。一般
1g组织约有 109个细胞。
2、二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。
转化细胞系：失去了正常细胞的特点，可以无限增殖。
三、常用生产用动物细胞的特性
（ 1） WI-38,1961年来源于女性高加索人正常胚肺组织的二倍体细胞系，核型 2n=46。
该细胞是成纤维细胞，能产生胶原，培养基用 BME（ Eagle’s basal medium） 加小牛血清,pH控制在 7.2，同工酶为 G6PD B型。
细胞的倍增时间为 24h,有限寿命为 50代，
上世纪 60年代被广泛用于制备疫苗。
（ 2） MRC-5,特性和用途与 WI-38相似，
1966年来源于 14周正常男性，对多种人的病毒敏感，用于疫苗的生产。
三、常用生产用动物细胞的特性
（ 3） CHO-K1,1957年从中国地鼠卵巢中分离的一株上皮样细胞。在培养时需加入脯氨酸。核型为 2n=20~22。 目前广泛用于构建工程细胞的是一株缺乏二氢叶酸还原酶的营养缺陷突变株 CHO-dhfr-,它常用的培养基为 DMEM培养基，加 0.1 mol/L次黄嘌呤和 0.01m mol/L胸苷，以及 10%小牛血清。
三、常用生产用动物细胞的特性
（ 4） BHK-21,1961年从 5只无性别的生长
1天的地鼠幼鼠的肾脏中分离的。现在广泛采用的是 1963年用单细胞分离的方法经 13
次的克隆的细胞。成纤维细胞,2n=44。 通常用的培养基为 DMEM培养基，添加 7%胎牛血清。过去多用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒和狂犬病疫苗，现在已被用于构建工程细胞。
三、常用生产用动物细胞的特性
（ 5） Vero,1962年来源于正常的成年非洲绿猴肾。是贴壁依赖的成纤维细胞,2n=60,高倍体率为 1.7%，可持续地进行培养。通常用的培养基为 199培养基，添加 5%胎牛血清。该细胞可支持多种病毒的增殖，包括脊髓灰质炎、狂犬病病毒，
已被批准用于人体。
（ 6） Namalwa,1972年来源于肯尼亚患有 Burkitt
淋巴瘤的病人体中，后在瑞典构建的一株人的类淋巴母细胞，高细胞有 2.8%的高倍体率，多数细胞有 12~14条标记染色体，单条 X染色体，无 Y染色体。通常用的培养基为 RPMI 1640,添加 7%胎牛血清。用于大规模生产?-干扰素。
三、常用生产用动物细胞的特性
（ 7） SP2/0-Ag14,该细胞是 1978年中通过融合的方法，从有抗羊红细胞活性的 BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系 P3X63Ag8融合的杂交瘤
SP2/HL-Ag亚克隆中分离得到。它不分泌任何免疫球蛋白抗体链，能耐受 8-氮鸟嘌呤（ 8-
azaguanine） 20?g/ml,但在含 HAT选择培养基中不能存活。通常用的培养基为 DMEM培养基，添加 10%胎牛血清。该细胞系已被广泛地用于单克隆抗体杂交瘤细胞的制备和抗体的生产。近年来正在被开发为生产其他药品的高表达宿主三、常用生产用动物细胞的特性
（ 8） Sf-9,1983年从亲代 IPLB-SF21 AE中克隆形成。亲代细胞则在 1977年从秋粘虫
（ Spodoptera frugiperda)的蛹卵组织中分离获得。它对苜宿尺蠖核型多角体病毒
（ Autographa california MNPV） 和其他杆状病毒（ Baculovirus） 高度敏感。通常用的培养基为 Grace培养基，添加 3.3g/L 水解乳蛋白和 3.3g/L酵母浸液，以及 10%胎牛血清。
目前已经被广泛用于高效表达外来蛋白制品。
四、基因工程细胞的构建和筛选
原代细胞、二倍体细胞系和转化细胞系三者在生产中都有使用，但在生产中采用更多的、更有前景的是融合细胞及采用基因工程手段构建的各种工程细胞。当前被用以构建工程细胞的动物细胞有 CHO-dhfr-、
BHK-21,Namalwa,Vero,SP2/0和 Sf-9等细胞。
那么如何获得动物工程细胞呢？
四、基因工程细胞的构建和筛选
1、真核细胞基因表达载体的构建
2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
1、真核细胞基因表达载体的构建
目前一般使用的载体有两类：一是病毒载体，如牛痘病毒、腺病毒和逆转录病毒和杆状病毒等。牛痘病毒已被广泛地用来构建成多价疫苗，腺病毒和逆转录病毒载体正被试用用于基因治疗中，而杆状病毒载体 -昆虫细胞系统已被成功地用于 300多种外源基因的高效表达。
用杆状病毒做载体有许多优点：（ 1）该病毒基因组是双链 DNA,容易进行重组；（ 2）插入 7~8kb的 DNA不影响正常病毒粒子的形成；（ 3）多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒子；（ 4）多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的 20~30%；（ 5）用光学显微镜可看到多角体，容易以此为标记物来挑选阳性克隆；（ 6）如果用家蚕杆状病毒，还可在蚕体直接表达外源基因。
1、真核细胞基因表达载体的构建
另一类是质粒载体，而且常常是穿梭质粒载体，即在细菌和哺乳动物细胞两者体内都能扩增。构建此类载体一般含有如下基本成分,（ 1）允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。多数含有质粒 pBR322或其衍生载体
pAT153的序列，包括能使质粒在细菌体内复制的起始位点和抗生素标记基因。（ 2）含有能使基因转录表达的调控元件，在 5’端转录起动需要有启动子，包括帽状位点（ RNA转录起始点）上游约 30碱基处的 TATA框和上游 70~90碱基处的 CAAT框序列和增强子。当前构建载体的许多启动子序列都来自病毒。也有其它来源的启动子。此外，在基因 3’端应有终止序列,RNA 3’端的切割序列和 poly A序列等。近来有人在载体里加入显性活动调控区（ DCR）序列，以此来克服因载体整合在宿主基因组位点而产生的表达水平降低。
1、真核细胞基因表达载体的构建
（ 3）能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。一般有两类标记：一类仅适合用于密切相关的突变细胞株，
如采用标记基因 hgprt,tk和 aprt等基因，它们仅适用于
hgprt-,tk--和 aprt--等基因缺失的细胞株。另一类是显性作用基因，如 neo基因，它能使氨基糖苷抗生素 — 新霉素磷酸化而失活，从而使原来对新霉素敏感的哺乳动物细胞一旦获得含该基因的载体后，就能在含该抗生素的培养基中存活。（ 4）有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。最常用的是编码二氢叶酸还原酶的基因。该酶的扩增可防止氨甲喋呤（ MTX） 对细胞的毒害作用。
利用该原理，在构建载体时可有意识地将它与目的基因重组在一起，当在培养基内增加 MTX浓度时，就会促使
dhfr基因的扩增，同时也会使其毗邻的目的基因随之扩增，从而大大提高表达量。类似的扩增系统还有谷氨酰胺合成酶和腺苷脱氢酶等系统。
2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
（ 1） DNA导入动物细胞方法：
融合法 化学法 物理法 病毒法细胞融合法 DNA-磷酸钙沉淀法 电穿孔法 重组逆转录病毒脂质体介导法 DEAE-葡聚糖法 显微注射法 重组 DNA病毒原生质融合法 染色体介导法 基因枪法 多瘤病毒样颗粒微细胞介导法鬼影红细胞介导法介导法介导法
2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
（ 2）筛选：
外源基因导入动物细胞的效率是很低的，首先要依靠构建载体内的选择标记采用相应的筛选系统，
如用 HAT（ 次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）选择系统，筛选 tk+,hgprt+的转化细胞；用 GPT
（ HAT,黄嘌呤、甘氨酸、霉酚酸）选择系统，
筛选 gpt+的转化细胞；用 G418（ Geneticin） 选择系统，筛选 Neor的转化细胞；用 MTX选择系统，
筛选 dhfr+的转化细胞，等等。其次是对选出的细胞进行克隆和亚克隆使其纯化。最后在多数情况下需利用其扩增系统，不断增加其基因拷贝数，
从而获得高效表达而稳定的工程细胞株。
五、细胞库的建立
除原代细胞外，其它的细胞株、细胞系都需要建细胞库加以保存。按照我国和美国
FDA的规定，用于生产的工程细胞必须建立两个细胞库：原始细胞库（ master cell
bank,MCB） 和生产用细胞库
（ manugacture’s working cell bank,MWCB）
或称工作细胞库（ working cell bank，
WCB）。
五、细胞库的建立
储存于 MCB的细胞应该是单一来源的均质的细胞，对于二倍体细胞应该是群体倍增水平尽可能低的细胞。储存时应具有该细胞详细档案，包括：
（ 1）该细胞系的历史：来源、动物的年龄和性别、细胞分离的方法和所用的培养材料等（若来源于人，则还需要知道该人的病史，以便检查是否存在着病原体）；（ 2）该细胞的特性：形态、
生长特性如倍增时间和分种比等。种源的特性，
如核型、同工酶、细胞抗原、以及特异的标记染色体等。若是用于生产的重组细胞，在需有载体构建的资料、基因拷贝数、表达产物的性质和产量及其稳定性等。（ 3）对各种有害因子的检查结果：细菌、真菌、支原体和各种病毒，包括逆转录病毒等。
五、细胞库的建立
储存于 MWCB的细胞应该是从 MCB来的，
或从单一安瓿来，或从多个安瓿在融化即刻混合在一起的，然后经培养扩增到一定数量后，再分装储存形成的细胞库。同样该细胞库也必须建立档案，而且需要进行无菌性和无细胞交叉污染的检查。生产时需确定其最高使用的传代数。
第四节 动物细胞的培养条件和培养基
为了使细胞培养在体外培养成功，需要一些基本条件,（ 1）绝对无菌操作；
（ 2）足够的营养供应，排除有害物质包括极其微量的离子掺入；（ 3）适量氧气供应；（ 4）随时清除细胞代谢中产生的有害产物；（ 5）有良好的适于生存外界环境，包括 pH,渗透压和离子浓度等；（ 6）及时分种，保持合适的细胞密度。
第四节 动物细胞的培养条件和培养基
一、动物细胞的培养条件
二、动物细胞培养基的种类和组成一、动物细胞的培养条件
1、器材的清洗和消毒
器材的清洗：一般来说，需经浸泡、刷洗、泡酸和冲洗四个步骤，用过的器材最好尽快地浸泡在
3%的磷酸三钠溶液内过夜，以除去蛋白质和残余细胞等污垢。
器材的消毒灭菌：主要通过物理方法和化学方法来达到严格无菌的操作过程。书中表 5-4是细胞培养中常用的消毒剂、浓度和使用场合的列表。
尽量避免使用抗生素，但在工业生产中还是经常使用的。常用抗生素及其浓度见表 5-5
一、动物细胞的培养条件
2、水质
蒸馏、离子交换、电渗析、反渗透、
中空纤维过滤等单独使用或配合使用，制备纯水，一般要求金属离子含量很低，电阻值在 18M?以上。动物细胞制药用水，要求去热源。
一、动物细胞的培养条件
3,pH
pH的高低对细胞各种酶的活性、细胞壁的通透性以及许多蛋白的功能都有重要的影响。动物细胞培养的最适 pH为 7.2~7.4，低于 6.8或高于 7.6时会对细胞产生不利影响，严重时会引起细胞退变甚至死亡。一般来说，传代细胞比原代细胞对
pH变动的耐受性强，细胞量多时比细胞量少时耐受性强。细胞代谢也会造成 pH变化，可用缓冲体系来稳定细胞周围环境的 pH。 书中给出了部分缓冲体系，可以参考。
一、动物细胞的培养条件
4、渗透压
在细胞培养的所有操作中，为了使与细胞接触的所有液体都保持有较合适的渗透压和 pH,一般都需要使用平衡盐溶液
（ balanced salt solution,BSS）,它由无机盐和葡萄糖组成。表 5-6列出了几种常用平衡盐溶液（ BSS） 组成 /g·L-1。
二、动物细胞培养基的种类和组成
细胞种系不同对培养基的要求亦有差异，主要有三类：天然培养基、合成培养基和无血清培养基。
1、天然培养基：在细胞培养的早期阶段使用的培养基，主要为来自天然的材料如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。
2、合成培养基：优点是成分明确，组分稳定，
可大量生产供应。动物细胞培养中常用的有 BME、
MEM,DMEM,HAM F12,RPMI 1640以及
ISOCOV,199和 McCoy等，构成这些培养基的主要成分见书中表 5-7。
二、动物细胞培养基的种类和组成
上述合成培养基中主要有氨基酸、维生素、糖类、
无机盐以及其它一些特定成分如核酸的前体腺苷、
鸟苷等。
为了给细胞培养以更大的方便，以便于其增殖或贴附生长，长向培养基中加入一定量的动物血清，
常用的是添加 5%~10%的小牛血清，杂交瘤细胞的培养中，血清可能要求的更高，常用 10~20%
的胎牛血清。血清的作用机制可能为：（ 1）提供有利于细胞生长增殖所需要的各种生长因子和激素；（ 2）提供有利于细胞贴壁所需要的贴附因子和伸展因子；（ 3）提供可识别金属、激素、
维生素和脂类的结合蛋白；（ 4）提供细胞生长所必须的脂肪酸和微量元素。
二、动物细胞培养基的种类和组成
3、无血清培养基
无血清培养基的优点如下,①提高了细胞培养的可重复性，避免，避免了由于血清批之间差异的影响；②减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；③供应充足、稳定；④
细胞产品容易纯化；⑤避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；⑥减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于实验结果的分析。
目前已经有市售无血清培养基（书中表 5-8所示）。无血清培养基中都是在合成培养基内加入不同种类的添加剂所构成，大致有以下几类：
（ 1）激素和生长因子：使用最多的是胰岛素，促进糖原和脂肪酸的合成，对细胞生长有刺激作用。
（ 2）结合蛋白：最经常被补充的是铁传递蛋白和白蛋白。为了便于纯化，有时可用硫酸亚铁、柠檬酸铁、葡萄糖酸铁代替铁传递蛋白。
（ 3）贴附和伸展因子：目前多数无血清培养基只适用于悬浮细胞，真正能用以培养贴壁细胞的很少，
也很贵，原因在于它们均缺少必需的贴附和伸展因子，除这些因子外，有的还添加维生素 A酸和重组的小肽，它可与细胞的受体结合。
（ 4）其它有利于细胞生长的因子和元素：它们包括有消除氧自由基损害的谷胱甘肽，某些微量元素，
如硒等。
第五节 动物细胞培养的方法和操作方式
一、动物细胞大规模培养的方法
从生产实际来看，动物细胞的大规模培养主要可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁 -悬浮培养。
二、动物细胞培养的操作方式
无论是哪种培养，其操作方式与细菌培养一样，
一般可分为分批式操作、补料 -分批（或流加式）
操作、半连续式操作、连续式操作和灌流式操作，
其中补料 -分批（或流加式）操作在用细菌生产时被普遍采用，但在动物细胞培养中用得较少。
其中分批式、半连续式和灌流式比较重要。
一、动物细胞大规模培养的方法
1、悬浮培养（ suspension culture）
适用于一切种类的非贴壁依赖性细胞（悬浮细胞），也适用于兼性贴壁细胞。目前生产中用于悬浮培养的设备主要是通气搅拌式生物反应器和气升式生物反应器。
2、贴壁培养
一切贴壁依赖性细胞，也适用于兼性贴壁细胞。
适用的细胞种类广，较容易采用灌流培养的方式使细胞达到高密度；不足之处是操作比较麻烦，
需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧效果差。另一种被普遍采用的贴壁培养方法是固定化生物反应器，但由于该反应器中传质和传氧常出现梯度式不均一现象，
故放大受到限制。
一、动物细胞大规模培养的方法
贴壁培养和悬浮培养的另一个不同之处是在传代或扩大培养时，常常需要用酶将其从基质上消化下来。
3、贴壁 -悬浮培养，或称假悬浮培养
（ 1）微载体培养：创造大的贴附面积，供细胞贴附生长增殖，载体体积小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，充分发挥悬浮培养的一切优点。理想的微载体应具备：生物相容性、无毒性、表面惰性、比重适当
（ 1.030~1.045g/ml）,粒径均一，在 60~250?m
之间（溶胀后）、光学透明、柔软、耐高压灭菌温度、反复多次使用、制备简单、原料充分。
80年代以后发展的多孔微载体或微球，有商品出售。
一、动物细胞大规模培养的方法
3、贴壁 -悬浮培养，或称假悬浮培养
（ 2）包埋或微囊培养：将细胞包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。一般载体材料为：人工合成的
polymer,糖类如纤维素等、蛋白质如胶原、纤维蛋白等。此方法的优点之一是可采用多种生物反应器进行大规模培养。
（ 3）结团培养：利用细胞本身形成结团的特点，
相互结团后再用悬浮的方法培养，操作简便，节省了用于微载体的成本。
二、动物细胞培养的操作方式
1、分批式操作
一种是将细胞和培养基一次性加入反应器内进行培养，此后细胞不断增长，产物不断形成和积累，
最后将条件培养基（ conditioned medium）,即经培养已含有细胞产物的培养基，或连同细胞一并取出，培养结束。
另一种是先将细胞和培养基加入反应器，待细胞生长至一定密度后，向反应器内加入诱导剂或病毒等，经一端时间作用后，将反应物取出，如产生 Namalwa干扰素和疫苗等。
二、动物细胞培养的操作方式
2、半连续式操作
该方式是当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，取出部分培养物，或单纯是条件培养基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样数量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。该操作方式在动物细胞培养和药品生产中被广泛采用，它的优点是操作简便，生产效率高，可长期进行生产，反复收获产品，而且可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。
二、动物细胞培养的操作方式
3、灌流式操作
该方式是当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。它与连续式操作不同之处在于取出部分条件培养基时，绝大部分细胞仍保留在反应器内，而连续式培养则同时也取出了部分细胞。该操作方式是近代用动物细胞培养生产各种药品最被推崇的方式。它的优点是：①
细胞可处在较稳定的良好的环境中，有害代谢物浓度低；②可极大地提高细胞密度，从而极大地提高了产品产量；③产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温下保存，有利于产品质量的提高；④培养基的比消耗率较短，加之产量质量的提高，生产成本明显降低。
二、动物细胞培养的操作方式
灌流式操作在某些生物反应器中是唯一可行的操作方式，如中空纤维生物反应器、固定床或流化床式反应器、膜式生物反应器等。在这些反应器中，细胞已被固定，在取出部分条件培养基和补充新鲜培养基和补充新鲜培养基时，细胞基本上都被保留反应器中，故采用该操作不存在困难。
但在微载体培养、悬浮培养和结团培养中，就存在一个如何使条件培养基和细胞、载体分离的问题。为了解决该问题，目前采用的方法有与旋转轴连在一起的滤网、有专门用于悬浮细胞的中空纤维分离器、超声波分离器和靠微载体自重沉降分离的上细下粗的排液柱以及靠离心分离的专用离心机等。
第六节 动物细胞生物反应器及其检测控制系统
理想的动物生物反应器必须具备如下一些基本要求：
①体系中的其它材料，对细胞必须无毒性；
②生物反应器结构的传质、传热和混合性能好；
③密封性能良好，可避免一切外来微生物的污染；
④培养环境多种物化参数可自动检测和调节控制，控制的精确度高，且能保持环境质量的均一；
⑤可长期连续运转，尤其对于动物细胞而言；
⑥容器加工制造时要求内面光滑，无死角；
⑦拆装、连接和清洁方便，耐高压蒸汽消毒便于操作消毒；
⑧设备成本尽可能低。
反应器可分为实验室规模、中试规模和生产规模。
第六节 动物细胞生物反应器及其检测控制系统
一、动物细胞生物反应器的类型和其基本结构；
二、动物细胞生物反应器的检测控制系统；
一、动物细胞生物反应器的类型和其基本结构
1、搅拌罐式生物反应器
通过借鉴细菌发酵罐得到的动物细胞反应器，有如下特点：（ 1）罐体的高径比一般采用 1~1.5,1，利于增大与空气的接触面；培养动物的罐底为圆形，
以避免细胞和载体沉积在周边；（ 2）为防止搅拌产生的切力损伤细胞，搅拌速度慢，一般在
20~100r/min,故多数倾向于采用较大的倾斜式桨叶搅拌器或船舶推进式桨叶搅拌器；（ 3）一般采用无气泡通气系统，以解决由于气泡破裂时产生的应力对细胞的损伤；（ 4）高密度、长时间培养以及提高反应器的生产效率考虑，反应器常常需要配备有进出液体系统，以便进行灌流培养，并有使细胞与培养基分离使细胞保留在反应器内的装置。
搅拌罐式生物反应器在目前仍然是重要的生产设备。
一、动物细胞生物反应器的类型和其基本结构
2、气升式生物反应器
该反应器的特点见图 5-
4，与搅拌式生物反应器相比，具有剪切力小，混合均一，氧和营养的传递好，由于没有了机械搅拌的结构，有利于设备的密封，降低了造价。高径比一般在 10,1左右。
一、动物细胞生物反应器的类型和其基本结构
3、中空纤维式生物反应器
图 5-5一是由数百乃至数千根中空纤维集束组成的反应器，纤维的材料为聚砜或丙烯共聚物，纤维壁厚为 50~100?m,呈多孔性，
内层为超滤膜，内腔直径为 200?m,两端用环氧树脂等材料将纤维粘和在一起，并使内腔开口于外加的塑料圆筒，使形成两个隔开的腔。
④培养基进口 ⑤中空纤维外部空间（ ESC） ⑥培养基出口
① ESC出口
②中空纤维
③细胞接种管一、动物细胞生物反应器的类型和其基本结构
3、中空纤维式生物反应器
该反应器占地空间小，产品产量、质量高，生产成本低。不足之处在于：①不能重复使用；②不能耐受高压灭菌，需用环氧乙烷或其它消毒剂灭菌；③难以取样检测。为克服这些不足，新型平床式中空纤维生物反应器被开发出来，见书中图
5-6。培养原代人胚肾细胞时，用无血清培养基，
细胞在 5周内一直很稳定地产生尿激酶。
一、动物细胞生物反应器的类型和其基本结构
4、透析袋或膜式生物反应器
在动物细胞培养过程中，会产生一些代谢产物，如乳酸和氨等，对细胞的生长和产物的产生会产生抑制作用，因此有些学者设计了透析袋或膜式反应器，它们可将这些有害代谢产物透析或过滤掉，从而使细胞生长至更高密度，同时可根据需要选用不同相对分子质量的膜，使产物保留在膜内或与细胞分离开。
一、动物细胞生物反应器的类型和其基本结构
5、固定床或流化床式生物反应器
结构较简单，装填的材料可以是一切对细胞无毒、
又有利于细胞贴附的材料，有实心载体和有孔载体两类。
（ 1） Verax公司推出的 CF-IMMO培养系统见后面图 5-8，或 SF-2000流化床生物反应器，该类反应器专用于比重较大的微球的培养。微球由胶原制成，直径为 500?m,孔径为约 20~40?m,比重较大，为 1.6~1.8g/ml,因为其中加入了钛微粒。
液流向上时，微球在一定范围内浮动或旋转，保证了微球内细胞可获得充分的营养和氧。
（ 2） NBS公司在原来的笼式通气搅拌式基础上，还开发出新型的生物反应器，如
CelliGen plus生物反应器，其是将通气搅拌与固定床巧妙结合的一种新型生物反应器，
见书中图 5-9。
二、动物细胞生物反应器的检测控制系统
1、培养过程中需检测的物化参数
有些需要在线检测，如温度,pH,搅拌速度、溶氧等；有些则需要取样离线检测，
如活细胞数、氨基酸浓度分析、葡萄糖乳酸和铵离子的检测等，有些则需在检测后计算后才能获得，如细胞的群体倍增时间、
细胞的比增长率、葡萄糖消耗率、乳酸产率 ]生物反应器生产率等。
2、主要参数的检测和控制方法
根据需求各种参数都可以进行检测和控制。
第七节 动物细胞制药的前景和展望
一、提高产量、降低成本和改进质量方面的研究
二、转基因动物的研究：转基因动物中转基因方法尚不成熟，现有的高效载体不多，整合的位置随意性大，成功率从而降低。此外，转基因动物的健康有时也成问题，一是产品对动物的健康影响，
二是产品对人体健康的影响。
第七节 动物细胞制药的前景和展望
三、组织工程的研究
所谓组织工程，即通过对细胞的大量培养，
并用细胞直接作为一种治疗手段用于临床，
或用培养的细胞进一步加工构成一种组织，
如人造皮肤、人造肝脏、人造胰腺、人造血管和人造骨等，并用于临床治疗。
