生物技术制药第六章 植物细胞制药第六章 植物细胞制药第一节 概述第二节 植物细胞的形态和生理特性第三节 植物细胞培养的基本技术第四节 影响植物次级代谢产物累积的因素第五节 植物细胞培养的生物反应器第六节 进展与展望第一节 概述高等植物次级代谢产物极其丰富多样，
除药用之外，许多次级代谢产物还是食品、化工和农业化学的重要原料。
人们通过研究，一方面通过化学合成的方法来生产，另一方面通过植物细胞培养方法来生产。目前已经研究过的近 300
种植物细胞培养物可以生产 400多种人们感兴趣的成分。
一、基本概念
1、植物组织和细胞培养植物组织和细胞培养是指在无菌和人工控制的营养（培养基）及环境条件（光照、温度等）
下，研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术。
植物无菌培养技术分如下几类：①幼苗及较大植株的培养，即为植物培养（ plant
culture）；②从植物各种器官的外植体增殖而形成的愈伤组织的培养叫做,愈伤组织培养,（ callus culture）；③能够保持较好分散性的离体细胞或较小细胞团的液体培养，称为,悬浮培养,（ suspension culture）；④离体器官的培养，如茎尖、根尖、叶片、花器官各部分原基或未成熟的花器官各部分以及未成熟果实的培养，称为,器官培养,
（ organ culture）；⑤未成熟或成熟的胚胎的离体培养，则称为,胚胎培养,（ embryo
culture）。
1、植物组织和细胞培养
2、悬浮培养悬浮培养是指在液体培养基中，能够保持良好分散性的细胞和小的细胞聚集体的培养。在此培养条件下组织化水平较低。
3、细胞培养细胞培养是指利用单个细胞进行液体或固体培养，诱导其增殖及分化。其目的是为了得到单细胞无性繁殖系。
4、分生组织培养分生组织培养（ meristem culture）又称生长锥培养，是指在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。分生组织，如茎尖分生组织的部位仅限于顶端圆锥区，其长度不超过 0.1mm。研究表明，通过组织培养技术进行植物的快速繁殖试验时往往并没有利用这么小的外植体，而是利用较大的茎尖组织，通常包括 1~2个叶原基。
5、外植体外植体（ explant）是指用于植物组织（细胞）培养的器官或组织（的切段），植物的各部位如根、茎、叶、花、果、穗、
胚珠、胚乳、花药和花粉等均可作为外植体进行组织培养。
6、器官形成器官形成（ organogenesis）一般是指在组织培养或悬浮培养物中芽、根或花等器官的分化与形成。或者在先形成的小根基部迅速形成愈伤组织，然后再形成芽；或者在不同部位分别形成芽或根之后，再形成维管组织而将二者连成一个轴，最后形成小植株。
如果培养过程中小植株的发生途径与正常的受精卵发育方式极为近似时，通常称为胚胎形成
（ embryogenesis）。当在体细胞或花药培养中培养物是小孢子这样的 单倍体细胞，其所形成的胚胎结构叫做,胚状体,（ embryoid,or embryo-like）或,不定胚,（ adventitious embryo）。
7、无性繁殖系无性繁殖系（ clone）又叫克隆，是指使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同种外植体而获得越来越多的无性繁殖后代而言，如根无性系、组织无性系、悬浮培养物无性系等。
在上述无性系的培养中，有时其局部的组织无论在结构、生长速度以及颜色方面都表现出明显的区别，如继续进行选择培养，则从同一无性系可分离形成二个或多个不同的系列，该系列称为,无性系的变异体,（ clonal variant）。
8、突变体细胞本身发生遗传变异或应用诱变处理发生的遗传变异所得的新细胞，即为突变体（ mutant）。由单细胞形成的无性系称为,单细胞无性系,；如果这种单细胞无性系是从同一组织分离得到的，并彼此不同时，叫做,单细胞变异体,。
9、继代培养由最初的外植体上切下的新增殖的组织，
培养一代称为,第一代培养,。连续多代的培养即为,继代培养,（ subculture），
又称,连续培养,。但习惯上,连续培养,一词多用于不断加入新的培养基，
并连续收集培养物以保持平衡而进行的长期不转移的悬浮培养。
10、次级代谢和次级代谢产物人们把除了核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白质及糖类（这些成分通常称为初级代谢产物）
以外，具有如下特征的成分称为次级代谢产物：
①有明显的分类学区域界限；②其合成需在一定的条件下才能发生；③缺乏明确的生理功能；
④是生命的多余成分。现代定义：次级代谢作用是特殊蛋白质内源化合物的合成、代谢及分解作用的综合体现。上述作用的结果导致了次级代谢产物的产生，如生物碱、黄酮体、萜类、
有机酸、木质素等。
二、植物细胞培养的发展简史
19世纪上半页,Schleiden和 Schwann提出了细胞学说；
20世纪初，德国著名植物学家 Haber landt依据细胞理论，首次提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直至单个细胞的观点；
20世纪 20年代初至 30年代，在胚胎培养和器官培养领域中取得了一些成果。 Hanning首次在无机盐溶液及有机营养成分的培养基上成功地培养了萝卜和辣根菜的胚，观察到离体胚均能正常发育，同时发现有促进提早萌发成苗的事实。
自此植物器官与营养需求之间关系研究、原生质体、
培养基以及培养方法的研究获得了高度重视，基因工程技术也被用于植物次级代谢产物的生产中。
第二节 植物细胞的形态和生理特性一、植物细胞的形态植物细胞的形态多种多样，随植物种类、存在部位和功能的不同而异。
游离的或排列疏松的薄壁细胞多呈球形、类圆形和椭圆形；排列紧密的细胞多呈角形；具有支持作用的细胞，细胞壁常增厚，呈类圆形、纺锤形等；具有输导作用的细胞则多呈管状。
植物细胞大小不一。植物基本组织细胞体积较大，
种子植物薄壁细胞的直径在 20~100微米之间；储藏组织细胞的直径可达 1mm。苎麻纤维一般为 200mm，
有的可达 500mm以上。最长的细胞是无节乳管，长达数米至数十米不等。
二、植物细胞的结构特征根据典型细胞核的有无可将生物细胞分为原核细胞（ prokaryotic cell）和真核细胞（ eukaryotic
cell）。真核细胞有典型的、为双层膜所包被着的细胞核，原核细胞中只有类核（ nucleoid）。
类核没有核膜包被，常常只有一条 DNA，其周围即为细胞质。高等植物的细胞均为真核细胞。
与动物细胞及微生物细胞相比，植物细胞有 3
个特点，即具有细胞壁、液泡和质体（如叶绿体）见书中图。
三、细胞后含物和生理活性物质细胞中除含有生命的原生质体外，还有许多非生命的物质，它们均为细胞代谢过程中的产物。
一类是后含物，系储藏物质或废弃物质，分布于液泡内，如糖类（ saccharide）、盐类
（ salts）、生物碱、苷、有机酸、挥发油等；
另一类为生理活性物质，对细胞内生化代谢和生理活动起着调节作用，含量虽少，但其生理作用却非常重要，如酶、维生素、植物激素和抗生素等。
三、细胞后含物和生理活性物质
1、细胞后含物
（ 1）生物碱 生物碱（ alkaloide）是一类含氮的有机化合物，广布于植物界。含生物碱较多的植物科有：茄科、罂粟科、小檗科、豆科、夹竹桃科等。按照植物化学分类学的观点，亲缘关系相近的植物，常含有化学结构相似的成分。此外，一种植物所含的同一类成分中也经常存在多种化学成分，如人参中含有几十种人参皂苷。它们均属于三萜皂苷类成分。中草药中含有多种生物碱，
如麻黄碱、咖啡、阿托品、喹啉、黄连素等，其生理活性都很强。
1、细胞后含物
（ 2）糖苷类 糖苷（ glucosides）是指某些有机化合物和糖经苷键结合而成的化合物，例如黄酮苷是黄酮苷元和糖连接而成。很多糖苷类化合物对疾病都有很好的治疗作用，如洋地黄毒苷有强心作用；
大黄中的蒽醌苷有强烈的泻下作用；紫草中紫草宁是紫草中蒽醌类化合物的总称，除作为天然色素（如口红）外，尚具有很好的抗癌活性。
1、细胞后含物
（ 3）挥发油挥发油（ volatile oil）是一类具有芳香气味，
在常温下易于挥发的油类。在伞形科、
姜科、唇形科等植物中多有分布。很多挥发油可作药用，如薄荷油、丁香油、
桉油等。
1、细胞后含物
（ 4）有机酸 有机酸（ organic acids）是糖类代谢的中间产物。植物果实中酸味以及细胞液的酸性反应，主要是由于有机酸的存在。常见的植物有机酸有：苹果酸、柠檬酸、水杨酸、酒石酸等。
2、生理活性物质生理活性物质是一类对细胞内的生化反应和生理活动起调节作用的物质的总称。
包括酶、维生素、植物激素和抗生素等。
（ 1）酶类酶（ enzymes）是一种有机催化剂。酶反应一般在常温、常压、中性水溶液中进行，高温、强酸、强碱和某些重金属离子，会使其失活。
2、生理活性物质
（ 2）维生素维生素（ vitamin）是一类复杂的有机物，
常参与酶的形成，对植物的生长、呼吸和物质代谢有调节作用，如对难以生根的植物，用维生素 B12处理后可促进不定根的生长。
2、生理活性物质
（ 3）植物激素植物激素是植物细胞原生质体产生的一类复杂的调节代谢的有机物质，对生理过程（如细胞分裂和繁殖）产生作用，
其量虽微，但作用甚大。
2、生理活性物质
（ 4）抗生素和植物杀菌素抗生素（ antibiotic）是由微生物（如某些菌类植物）产生的能杀死或抑制某些微生物生长的物质，如青霉素、链霉素等。
高等植物如葱、蒜、辣椒、萝卜等也能产生杀菌的物质，称为植物杀菌素（ plant
fungicidin）。
四、植物培养细胞的生理特性植物培养细胞不同生长阶段的持续时间及特征。
延迟期（ lag phase）
细胞分裂的初始期和最大生长期之间，其持续时间取决于培养前的条件、时期和 [培养基性质，
其特征是细胞数量、干重近乎恒定，细胞壁厚度达最大；高 RNA含量；高蛋白质合成能力；
高聚核糖体含量；有丝分裂加速；增加细胞的细胞质部分四、植物培养细胞的生理特性加速期（ acceleration phase）
细胞最大生长期和最大细胞浓度，最佳
DNA浓度和蛋白质累积率，持续时间 3~4
代，其特征为常数：干重 增加：细胞数、
DNA和蛋白质浓度 减少：有丝分裂活性、
RNA含量和蛋白质合成能力 增加细胞鲜种、干重及 RNA酶活性四、植物培养细胞的生理特性对数期（ log phase）
介于最大生长率和蛋白质合成完全停止期之间,其特征为蛋白质合成能力减退；变化：
聚核糖体浓度向有利于单核糖体和寡核糖体形成的方向减少稳定期（ stationary phase）
细胞数稳定,其特征为细胞高液泡化、极度脆弱、高度分化，有机化合物的浓度高。
四、植物培养细胞的生理特性由上所述可以知道，植物培养细胞重量的增加主要取决于对数期，而次级代谢产物的累积则主要在稳定期完成。当然植物细胞与哺乳动物细胞及微生物细胞有很多的不容，并由此导致了一系列生理生化等方面的差异，比如混合与传质等。就植物细胞而言，它们很少以单一细胞悬浮生长，而多以非均相集合体的细胞团形式存在。根据细胞系的来源、培养基及培养时间等的不同，细胞团的细胞数目在 2~200 之间，
直径为 2mm左右。
四、植物培养细胞的生理特性细胞团产生的原因有两个：（ 1）细胞分裂之后没有进行细胞分离；（ 2）在间歇培养过程中细胞处于对数生长后期时，开始分泌粘多糖和蛋白质，或者以其它形式形成粘性表面，从而形成细胞团。
植物细胞形态上的另一特性，就是其纤维素细胞壁使得其外骨架相当脆弱，表现为抗张力强度大，抗剪切能力小，故传统的搅拌式生物反应器容易损坏植物细胞的细胞壁。再者，植物细胞培养基黏度度比较高，且培养时间的延长，
细胞数量呈指数上升。
四、植物培养细胞的生理特性所有的植物都是好气性的，因此培养过程中需要不断地供氧。但是，与微生物细胞相反，它并不需要很高的气液传质速率，
而是要控制供氧量，以保持较低的溶氧水平。此外，大多数植物细胞液体培养的 pH
为 5~7，在此 pH水平，通气速率过高会驱除二氧化碳而抑制细胞生长，这个问题可通过在通气过程中加入一定浓度的二氧化碳来解决。注意光照的影响。
四、植物培养细胞的生理特性植物细胞液体培养过程中的泡沫问题不象微生物细胞培养时那么严重，泡沫的性质也不同。
气泡比微生物培养系统中的大，而且由于其含有蛋白质或粘多糖，黏度较大，细胞极易被包埋在泡沫中，并从循环的营养液中带出来，这就造成了非均相培养，通常需要采用化学或机械的方法加以控制，否则，随着泡沫和细胞数量的增加，混合和培养过程的稳定性就要受到影响。
四、植物培养细胞的生理特性在植物细胞液体培养过程中，细胞可能会黏附于培养的反应器壁、电极或挡板的表面上。细胞对表面的黏附及其在器壁上的生长特性，是人们目前正在研究的重点课题之一。通过改变培养基中某些离子的成分，可使表面吸附问题得到一定程度的改善。
第三节 植物细胞培养的基本技术一、植物材料的准备二、培养基及其组成三、培养方法一、植物材料的准备用于植物组织培养的外植体，必须是无杂菌材料。微生物在接触培养基时会大量繁殖，抑制培养物的生长，因此需灭菌处理。
许多化学试剂均能作为表面灭菌剂使用，原则上应尽可能选择那些灭菌后易于除去或容易分解的时间试剂。
灭菌剂的选择和处理时间的长短取决于所用材料对试剂的敏感性。对灭菌剂敏感的外植体的灭菌时间不宜过长；而不敏感的，灭菌时间则可适当延长。经常使用的灭菌剂如下表。
常用灭菌剂的效果比较灭菌剂 使用浓度 /% 去除难易程度 灭菌时间 /min 效果次氯酸 钙次氯酸钠过氧化氢溴 水硝 酸 银氯 化 汞抗 生 素
9 ~10
0.5 ~5
3~12
1~2
1
0.1~1
4~50mg/L
易易最易易较难较难中
5~30
5~30
5~15
2~10
5~30
2~10
30~60
很好很好好很好好最好较好植物不同组织（器官）的灭菌时间和步骤组织
（器官）
灭菌步骤 备注灭菌前处理 灭菌 灭菌后处理种子果实茎切段储藏器官叶片纯酒精中浸
10min，再用无菌水漂洗纯酒精漂洗自来水洗净，
再用酒精洗自来水自来水，吸干，纯酒精
100g/L次氯酸钙浸 20~30min，
再用 10g/L溴水浸 5min
20g/L次氯酸钠浸 10min
20g/L次氯酸钠浸 5~30min
20g/L次氯酸钠浸 20~30min
1g/L氯化汞浸
1min
无菌水洗 3次，在无菌水中发芽；或无菌水洗 5次，在湿无菌纸上发芽无菌水冲洗，再剖除内部组织的种子无菌水洗 3次无菌水洗 3次，滤纸吸干无菌水反复冲洗，
滤纸吸干用幼根或幼芽发生愈伤组织获得无菌苗选取嫩叶、
叶片平放在琼脂上一、植物材料的准备植物材料灭菌后，即可进行培养。接种的外植体的形状和大小要根据试验目的及具体情况而定。当然，如果所用外植体细胞多时，得到愈伤组织的机会必然也多。如要定量研究愈伤组织，则不仅外植体的大小要一致，而且其形状及组织部位也应基本类似。进行这类培养研究常常选用较大材料，如人参、胡萝卜或甜菜的贮藏根、马铃薯的块茎等。
二、培养基的及其组成培养基实际上是植物离体器官、组织或细胞等的无菌土壤，其特点是营养成分的可调控性。
植物组织和细胞培养所用培养基种类较多，但通常都含有无机盐、碳源、有机氮源、植物生长激素、维生素等化学成分。有商品化的培养基可以购买。
1、无机盐基本培养基是由各种浓度的无机盐溶液组成的，
这些无机盐又有,大量元素,和,微量元素,
之分。大量元素是指使用浓度大于 30mg/L时的无机元素，包括 N,S,P,K,Mg,Ca,Cl和钠，
而微量元素是指浓度低于 30mg/L的无机元素，
如 Fe,B,Mn,I和 Mo，以及极微量的 Cu和 Zn。
某些情况下，还可加入 Ni,Co和 Al。这些微量元素作为辅因子或对酶合成而言，都是必须的，
如镍对脲酶的合成就是至关重要的。
2、碳源植物细胞培养物通常均为异养细胞。因此人们经常使用碳水化合物、肌醇作为碳源，有时也用甘油、乳糖和半乳糖等化合物。有些培养物还可通过同化二氧化碳而获得所需的能量，此所谓光自养培养物。在某些情况下，培养基固化剂也可作为补充能量和碳源之用。
此外，某些天然提取物对愈伤组织的诱导和培养也有重要意义，如椰子乳（椰子的液体胚乳），常用浓度为 10%；也可用 0.5%的酵母提取物或 5%~10%的番茄汁等。
3、植物生长调节剂植物激素是指植物代谢过程中形成的生长调节物质，在极低浓度（ <1?M）时即能调节植物的生育过程，并能从合成部位转运到作用部位而发挥作用。植物激素只限于天然产生的调节物质，到目前位置，已发现植物组织中可以形成
5种植物激素，即生长素、分裂素、赤霉素、
脱落酸和乙烯。植物生长调节剂既包括人工合成的具有生理活性的化合物，也包括一些天然的化合物以及植物激素。
4、有机氮源使用较多的有机氮源为蛋白质水解产物
（如谷氨酰胺）或各种氨基酸。有机氮源对细胞的早期生长有利，氨基酸的加入主要是为了代替或增加氮源的供应，
但应注意的是苏氨酸、甘氨酸和缬氨酸可通过灭活位于叶绿体和细胞质上的谷氨酸合成酶而降低氮的利用，而精氨酸通常具有补偿此灭活作用的能力。
5、维生素植物细胞通常是维生素自养型的，但在大多数情况下，其自身合成的量均不能满足植物细胞的需要，即使是光合成活性细胞或组织也是如此。故对大多数培养基而言，除了必需加入的 B族维生素
（如 B1,B6和泛酸）外，通常还需加入一定量的生物素和肌醇，后者是构成磷酸肌醇（细胞膜脂质部分含磷酸肌醇
2%~8%）极性端的部分。
三、培养方法植物细胞培养，按培养对象来说，可分为原生质体培养和单倍体细胞培养；按照培养基类型可分为固体培养和液体培养；按培养方式可分为悬浮细胞培养和固定化细胞培养。
三、培养方法固体培养和液体培养两种方法基本上是在微生物培养方法的基础上发展起来的。所谓固体培养系统实际上包括利用琼脂作为支撑物的固体培养和固定化细胞培养。
固体培养是在培养基中加入一定量的凝固剂，经加热溶解后，分别装入培养用的容器中，冷却后凝结成固体培养基。固体培养的特点是简便易行、所占空间小。但也有缺点，主要是不均衡现象。
固体培养和液体培养互相配合是组织（细胞）培养的常规操作。常用的固化剂有琼脂、藻酸盐
（ alginate）、角叉藻聚糖（ carrageenan）、明胶
（ gelatin）、羟乙基纤维素、聚丙烯酰胺、淀粉和硅胶等。最常用的凝固剂是琼脂，最适浓度 0.6~1.0%。
三、培养方法温度是培养中重要的因素，一般控制在 25?1℃ 之间。
有些植物材料在诱导愈伤组织时需要在黑暗条件下进行，但诱导愈伤组织的器官分化和其他材料的培养都需要光照。光照以每天 16h为宜。
由于植物组织在培养基上生长要不断消耗营养、散失水分和累积代谢物，必将影响培养物的进一步生长。因此外植体在培养三周左右必须转换至新鲜培养基上，以保持正常生长。移换一次培养基称一次继代培养。一种外植体经过一定次数的继代培养，
其培养物就可用于悬浮培养。
三、培养方法液体培养系统包括小规模的悬浮培养和大规模的成批培养、半连续和连续培养。悬浮培养可分为静止和振荡两类。静止液体培养和固体培养一样，也具有简便易行的特点，而且培养基还不会产生营养物质浓度差的现象。振荡液体培养，是使悬浮细胞在液体培养基中，并不断振动下进行培养。这样可以防止上述静止培养的许多缺点。通常培养基的体积约占容器体积的 20%。
三、培养方法
1、成批培养法将培养基一次性地加入反应器，接种、培养一定时间后收获细胞的操作方式称为成批培养法。
植物细胞培养过程中，次级代谢产物的大量累积往往发生在细胞生长的稳定期，人们基于此原理设计了植物细胞的两步培养法，即使用两个生物反应器，第一个反应器用于细胞生物量的累积，第二个反应器用于次级代谢产物的生产。
三、培养方法
2、半连续培养法在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法称为半连续培养法。
3、连续培养法利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境长期维持恒定的方法。
三、培养方法
4、固定化培养法植物次级代谢产物的累积主要在细胞生长的稳定期，
表明细胞成块而趋于分化时，细胞块中各个细胞处于一定理化梯度之下，此现象与完整植株类似，由此人们提出了植物细胞固定化培养技术。
固定化培养采用的固定化反应器有网状多孔板、尼龙网套和中空纤维膜等多种类型，将细胞固定于尼龙套内，或固定于中孔纤维反应器的膜表面，或固定于网状多孔板上，放入培养液中进行培养，或连续流入新鲜培养液，进行连续培养及连续收集培养产物，也可通入净化空气以代替搅拌。优点是细胞位置固定，易于获得高密度细胞群体及维持细胞间的物理化学梯度，利于细胞组织化，易于控制条件。
第四节 影响植物次级代谢产物累积的因素在植物组织和细胞培养过程中，影响植物次级代谢产物产生和累积的因素主要有：①生物条件：外植体、季节、休眠、分化等；②物理条件：温度、光（光照时间、光强、光质）、通气（ O2）,pH和渗透压等；③化学条件：无机盐（ N,P,K等）、碳源、植物生长调节剂、
维生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物质、
前体等；④工业培养条件：培养罐类型、通气、
搅拌和培养方法等。
一、外植体选择不同外植体的悬浮细胞培养物，其最大次级代谢产物的累积时间各异。同一化合物可以在不同外植体的不同生长阶段中累积，有的次级代谢产物累积是在延迟期进行，有的则在加速期累积，当然也有的累积时间与细胞生长曲线同步，，
还有的则在稳定期大量累积次级代谢产物。
二、培养条件的影响
1、培养环境的内在因素
（ 1）接种和诱导：外植体的大小不仅影响所诱导的组织和细胞的生长，而且也关系到其次级代谢产物的生产能力，如长春花培养物中蛇根碱的合成要求其外植体直径在 1~12cm之间，在此条件下才能分泌噻吩类成分。次级代谢产物的产率与外植体大小、细胞密度及营养成分密切相关，如在紫草的细胞培养中，当营养成分的供给为 1400mg/L时，细胞干重为 2.8g/L。然而，
细胞生长率的增加有时会导致次级代谢产物产量的降低。外植体的大小可能是使某些次级代谢产物含量发生变化的原因之一，此类现象常见于一些高产细胞株经继代培养之后。前处理也可影响累积方式。
二、培养条件的影响
1、培养环境的内在因素
（ 2）基本培养基组成,基本培养基的各种成分是愈伤组织和悬浮细胞培养的物质基础，尤其在稳定期次级代谢产物累积时更是如此。①磷：②
氮：③铜：
（ 3）碳源,碳源通常以光自养培养中的 CO2或异养培养中的糖类两种形式提供，其性质和数量往往对培养细胞的生物量有很大的影响。 CO2可以诱导某些特征反应，如在金苹果的悬浮细胞培养中，高浓度 CO2可产生一种特有的苹果香味。
植物细胞培养中使用最多的碳源是糖类，
对次级代谢产物的影响主要取决于所使用的糖类的种类及细胞次级代谢产物的生物合成过程。
碳源对长春花悬浮细胞培养中次级代谢作用的影响次级代谢产物 糖类乳糖（ 6%） 蔗糖（ 3%） 甘露糖醇
（ 0.3~0.6mol/L）
长春花碱 /mg?L-1
蛇根碱 /mg? L-1
游离氨基酸 /mol?
L-1
50
——
——
16.60
1.40
0.55
——
21.50
2.86
1、培养环境的内在因素
（ 4）植物生长调节剂植物生长调节剂在植物细胞培养中起着非常重要的作用，这种作用有时可能是关键性的。但是植物材料和生理状态的差异，无一定的规律可循，
必须通过仔细的实验观察才能确定其合适的数量和种类。如 Furuya在培养烟草细胞时发现，加入
IAA时培养物中有尼古丁生成，但 2,4-D存在时则不合成该化合物。说明不同植物激素及其不同组合形式均可显著影响代谢产物的产生。
（ 5） O2和 pH
① O2,培养细胞生长过程需要维持其正常呼吸作用，悬浮细胞培养和固定化细胞培养时供氧方式有所不同，前者可采用搅拌和通气方式，搅拌速度通常为 120~160r/min，过快易导致细胞破裂；后者仅能采用通气方式，一般使用含 5%CO2的洁净空气，通气量应适当，过多或过少均影响细胞生长及次级代谢产物的合成。
② pH：一般来说，最有利于培养细胞生长的 pH在
5~6之间。常用的培养基均具有一定的缓冲性质，
在培养过程中培养液的 pH变化较小。
（ 6）渗出物（ exudates）：在细胞悬浮培养后期，
培养液中常含有各种代谢产物，如某些初级代谢产物和次级代谢产物以及某些酸性物质、醇类、水解蛋白或活性蛋白等。如落花生悬浮培养细胞培养的后期培养液中含有 27种多肽成分。此外，培养细胞分泌产物的量也取决于培养物的发育阶段，如在多叶羽扁豆悬浮细胞培养中，在活跃的生长期初期，
酶的分泌量就达到了稳定期的水平，尔后酶活性随乙醇量的增加而降低。
次级代谢产物的累积往往在水解酶活性增加之前进行。
2、两步培养法培养基的组成是细胞生长和次级代谢产物的形成最直接、也是最重要的影响因素。为了得到最佳生长和最佳次级代谢产物，提出了两步法。第一步主要使用适合细胞生长的培养基，称为生长培养基（ growth medium）第二步主要用适于次级代谢产物合成的培养基，称为生产培养基。
两种培养基往往有较大的区别，前者是为了实现细胞的高生产率，后者通常具有较低含量的硝酸盐和磷酸盐，并含有较低的糖份或较少的碳源。书中介绍了长春花细胞培养中生长培养基与生产培养基的区别主要为前者使用了肌醇及维生素类成分，而后者则不含上述成分，在生长调节剂的使用上，前者应用 2,4-D刺激细胞生长，而后者加入 6-BA以便利于次级代谢产物的产生。
3、诱导子植物抗毒素（ phytoalexins）是指在植物防御系统内能对抗微生物进攻的某些次级代谢产物
（根据其功能又称为,后感染防御物质,）。
尽管在有些情况下代谢产物可能会连续合成，
但在另外一些情况下只有细胞被刺激时才能产生植物抗毒素，或仅在被诱导时其产量才能增加。
触发形成植物抗毒素信号的物质称为诱导子。
从广义上讲，诱导子是能够诱导植物细胞中一个反应，并形成特征性自身防御反应的分子。
3、诱导子诱导子的分类有两种：一种是根据在细胞内或细胞外形成而将其分为内源性诱导子和外源性诱导子，
另一种是根据其来源分为生物诱导子（ biotic elicitors）
和非生物诱导子（ abiotic elicitors），现多采用后者。
生物诱导子是指植物体在防御过程中为对抗微生物感染而产生的物质，主要包括分生孢子（ conidia），
降解细胞壁的酶类、细胞壁碎片、有机体产生的代谢物等成分。初生细胞壁中富含由半乳糖醛酸组成的多糖成分,1%的浓度就足以诱导植物产生抗毒素，
但其活性一般低于外源性?-庚糖苷。非生物诱导子是指所有不是植物细胞中天然成分但又能触发植物细胞形成抗毒素信号的物质。生物诱导子和非生物诱导子在其量效关系上也有区别。
3、诱导子诱导子的类型与所产生的次级代谢产物的类型没有直接关系，各种生物合成途径所必须的酶也并不是对酶个诱导子的刺激都产生反应，如在园欧芹悬浮细胞培养中,UV（非生物诱导子）对黄酮生物合成过程中所涉及的酶类有诱导作用，
而在苯丙烷代谢中，只有生物诱导子才能与有关酶发生反应。
4、培养环境的外部因素
（ 1）温度 培养物中次级代谢产物产生的最佳温度为 20~28℃ 。在一定温度（ ≤15 ℃ ）下，细胞不再生长，次级代谢产物也不再产生。但应该指出的是，
在某些极端情况下（如 30 ℃ ），细胞也能正常生长。
终产物和中间产物的累积，甚至与其生物合成直接相关的化合物，也并非需要相同的温度。低温对次级代谢产物产生的影响类似于 2,4-D的抑制作用。
当培养温度与培养物正常生长所要求的温度相差很大时，可引起某些应激效应以及对次级代谢产物产生的激活作用。温度的变化尚可引起产物类型在质和量上的改变，个别情况下由于激活了新的生物合成途径也可能产生新的代谢物质。
4、培养环境的外部因素
（ 2）搅拌频率 植物培养细胞的产率与发酵罐的搅拌速度有关，具体表现在发酵液中的溶氧浓度和机械搅拌对细胞所产生的剪切力上，如上述因素对海巴戟长方形细胞（累积蒽醌类成分）、产生甜菜苷（ betanine）的甜菜（ Beta
vulgaris）细胞和累积蛇根碱的长春花细胞等的影响就非常明显。但搅拌频率也不宜过小，如低于 28r/min时，次级代谢产物的生物合成反应就有可能发生反转。
4、培养环境的外部因素
（ 3）培养容器的影响 植物培养细胞次级代谢产物的产生可因为所用培养容器的大小和搅拌装置的不同而得到不同的结果。如小规模实验室培养所用的培养容器（ 50~500ml）具有较高的氧转移率，通过简单的定期搅拌，培养物的每个部位均可得到比大规模培养更好的氧供应。用于生产次级代谢产物反应器中的搅拌器对细胞产率可产生一定的影响，这些差异及由剪切力引起的不良影响可通过使用气升式发酵罐或一个沿水平轴转动的发酵罐而予以避免。但因为植物细胞生长和次级代谢产物的生产过程是完全分离的，所以这对细胞生产过程会有不利影响。
延长稳定期就意味着延长培养时间，从而增加成本、
增大污染机会等，可以通过两步培养等方法解决。
4、培养环境的外部因素
（ 4）光的影响 光照时间、光质和光强对次生代谢产物（如黄酮、黄酮醇、花色素苷、挥发油等）的累积都有一定影响。
第五节 植物细胞培养的生物反映器要研制适合于高等植物细胞大量培养的生物反应器，首先应对植物细胞的特性有所了解。植物细胞的发酵培养借鉴了微生物发酵的经验，
但植物细胞和微生物相比存在着很多差异：植物细胞的直径为 10?m~100?m，比细菌和真菌细胞大 10~100倍；植物细胞的纤维素壁具有较差的抗剪切能力；植物细胞的呼吸率低，对氧的需求也低。此外，植物细胞培养生物反应器的设计与各类植物细胞的不同生理特征和代谢方式有关，同时也与培养方式相联系。
反应器的选择取决于生产细胞的密度、
通气量以及所提供的营养成分的分散程度。根据通气和搅拌系统的类型可将生物反应器分为以下几类：
①摇瓶
②搅拌型生物反应器
③环流生物反应器和鼓泡塔生物反应器。
目前主要用于植物细胞大规模培养的生物反应器有一、机械搅拌式生物反应器二、鼓泡塔生物反应器三、气升式生物反应器四、转鼓式生物反应器五、固定化细胞生物反应器第六节 进展与展望一、诱导子在植物细胞培养中加入诱导子可以提高次级代谢产物的产量，并可促进产物分泌到培养基中。
诱导子的作用随诱导子种类的不同而异，如在紫杉醇的细胞工程研究中,Christen等向培养基中加入高压灭活的壳囊孢菌菌丝体和青霉菌的孢子，或加入硫酸矾和 3,4-二氯苯氧基三乙基胺等，可促进短叶红豆杉的悬浮细胞生长，并分泌更多的紫杉醇。
二、前体饲喂前体饲喂是增加次级代谢产物产率的重要方法。
生物合成研究结果表明，次级代谢物的形成，
依赖于 3种主要原材料（结构范围,building
block）的供应，即：①莽草酸：属芳香化合物，
是芳香氨基酸、肉桂酸和某些多酚化合物的前体；②氨基酸：形成生物碱及肽类抗生素类，
包括青霉素类和头孢菌素类；③乙酸：是聚乙炔类、前列腺素类、大环抗生素类、多酚类、
类异戊二烯等的前体。
三、两相法培养两相法培养的基本出发点是在细胞外创造一个次级代谢产物的储存单元。该培养方法可以加入固相或疏水液相，形成两相培养系统，从而达到收集分泌物的目的。该法可减轻产物本身对细胞代谢的抑制作用，并可保护产物免受培养基中催化酶或酸对产物的影响。此外，由于产物在固相或疏水液相中的积累简化了下游处理过程。
两相法培养系统必须满足如下条件：①
添加的固相（如树脂）或液相对细胞无毒害作用，不影响细胞生长和产物的合成；②产物易被固相吸附或被有机相溶解；③两相易分离；④如为固相，不可吸附培养基中的添加成分，如植物生长调节剂、有机成分等。
四、毛状根和冠瘿瘤培养对双子叶植物病原菌根瘤农杆菌和发根农杆菌发病机理的研究，发现了两种农杆菌的原生质体中，分别含有 Ti质粒和 Ri
质粒，大小约 200kb。植物遭受感染后，
农杆菌能将质粒中的一段转移 DNA片段整合到植物细胞核的 DNA基因编码上，作为表现型，从被感染处长出冠瘿瘤或毛状根（ hairy-root）。将冠瘿瘤或毛状根作为培养系统，可进行有机化合物的生产。
除药用之外，许多次级代谢产物还是食品、化工和农业化学的重要原料。
人们通过研究，一方面通过化学合成的方法来生产，另一方面通过植物细胞培养方法来生产。目前已经研究过的近 300
种植物细胞培养物可以生产 400多种人们感兴趣的成分。
一、基本概念
1、植物组织和细胞培养植物组织和细胞培养是指在无菌和人工控制的营养（培养基）及环境条件（光照、温度等）
下，研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术。
植物无菌培养技术分如下几类：①幼苗及较大植株的培养，即为植物培养（ plant
culture）；②从植物各种器官的外植体增殖而形成的愈伤组织的培养叫做,愈伤组织培养,（ callus culture）；③能够保持较好分散性的离体细胞或较小细胞团的液体培养，称为,悬浮培养,（ suspension culture）；④离体器官的培养，如茎尖、根尖、叶片、花器官各部分原基或未成熟的花器官各部分以及未成熟果实的培养，称为,器官培养,
（ organ culture）；⑤未成熟或成熟的胚胎的离体培养，则称为,胚胎培养,（ embryo
culture）。
1、植物组织和细胞培养
2、悬浮培养悬浮培养是指在液体培养基中，能够保持良好分散性的细胞和小的细胞聚集体的培养。在此培养条件下组织化水平较低。
3、细胞培养细胞培养是指利用单个细胞进行液体或固体培养，诱导其增殖及分化。其目的是为了得到单细胞无性繁殖系。
4、分生组织培养分生组织培养（ meristem culture）又称生长锥培养，是指在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。分生组织，如茎尖分生组织的部位仅限于顶端圆锥区，其长度不超过 0.1mm。研究表明，通过组织培养技术进行植物的快速繁殖试验时往往并没有利用这么小的外植体，而是利用较大的茎尖组织，通常包括 1~2个叶原基。
5、外植体外植体（ explant）是指用于植物组织（细胞）培养的器官或组织（的切段），植物的各部位如根、茎、叶、花、果、穗、
胚珠、胚乳、花药和花粉等均可作为外植体进行组织培养。
6、器官形成器官形成（ organogenesis）一般是指在组织培养或悬浮培养物中芽、根或花等器官的分化与形成。或者在先形成的小根基部迅速形成愈伤组织，然后再形成芽；或者在不同部位分别形成芽或根之后，再形成维管组织而将二者连成一个轴，最后形成小植株。
如果培养过程中小植株的发生途径与正常的受精卵发育方式极为近似时，通常称为胚胎形成
（ embryogenesis）。当在体细胞或花药培养中培养物是小孢子这样的 单倍体细胞，其所形成的胚胎结构叫做,胚状体,（ embryoid,or embryo-like）或,不定胚,（ adventitious embryo）。
7、无性繁殖系无性繁殖系（ clone）又叫克隆，是指使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同种外植体而获得越来越多的无性繁殖后代而言，如根无性系、组织无性系、悬浮培养物无性系等。
在上述无性系的培养中，有时其局部的组织无论在结构、生长速度以及颜色方面都表现出明显的区别，如继续进行选择培养，则从同一无性系可分离形成二个或多个不同的系列，该系列称为,无性系的变异体,（ clonal variant）。
8、突变体细胞本身发生遗传变异或应用诱变处理发生的遗传变异所得的新细胞，即为突变体（ mutant）。由单细胞形成的无性系称为,单细胞无性系,；如果这种单细胞无性系是从同一组织分离得到的，并彼此不同时，叫做,单细胞变异体,。
9、继代培养由最初的外植体上切下的新增殖的组织，
培养一代称为,第一代培养,。连续多代的培养即为,继代培养,（ subculture），
又称,连续培养,。但习惯上,连续培养,一词多用于不断加入新的培养基，
并连续收集培养物以保持平衡而进行的长期不转移的悬浮培养。
10、次级代谢和次级代谢产物人们把除了核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白质及糖类（这些成分通常称为初级代谢产物）
以外，具有如下特征的成分称为次级代谢产物：
①有明显的分类学区域界限；②其合成需在一定的条件下才能发生；③缺乏明确的生理功能；
④是生命的多余成分。现代定义：次级代谢作用是特殊蛋白质内源化合物的合成、代谢及分解作用的综合体现。上述作用的结果导致了次级代谢产物的产生，如生物碱、黄酮体、萜类、
有机酸、木质素等。
二、植物细胞培养的发展简史
19世纪上半页,Schleiden和 Schwann提出了细胞学说；
20世纪初，德国著名植物学家 Haber landt依据细胞理论，首次提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直至单个细胞的观点；
20世纪 20年代初至 30年代，在胚胎培养和器官培养领域中取得了一些成果。 Hanning首次在无机盐溶液及有机营养成分的培养基上成功地培养了萝卜和辣根菜的胚，观察到离体胚均能正常发育，同时发现有促进提早萌发成苗的事实。
自此植物器官与营养需求之间关系研究、原生质体、
培养基以及培养方法的研究获得了高度重视，基因工程技术也被用于植物次级代谢产物的生产中。
第二节 植物细胞的形态和生理特性一、植物细胞的形态植物细胞的形态多种多样，随植物种类、存在部位和功能的不同而异。
游离的或排列疏松的薄壁细胞多呈球形、类圆形和椭圆形；排列紧密的细胞多呈角形；具有支持作用的细胞，细胞壁常增厚，呈类圆形、纺锤形等；具有输导作用的细胞则多呈管状。
植物细胞大小不一。植物基本组织细胞体积较大，
种子植物薄壁细胞的直径在 20~100微米之间；储藏组织细胞的直径可达 1mm。苎麻纤维一般为 200mm，
有的可达 500mm以上。最长的细胞是无节乳管，长达数米至数十米不等。
二、植物细胞的结构特征根据典型细胞核的有无可将生物细胞分为原核细胞（ prokaryotic cell）和真核细胞（ eukaryotic
cell）。真核细胞有典型的、为双层膜所包被着的细胞核，原核细胞中只有类核（ nucleoid）。
类核没有核膜包被，常常只有一条 DNA，其周围即为细胞质。高等植物的细胞均为真核细胞。
与动物细胞及微生物细胞相比，植物细胞有 3
个特点，即具有细胞壁、液泡和质体（如叶绿体）见书中图。
三、细胞后含物和生理活性物质细胞中除含有生命的原生质体外，还有许多非生命的物质，它们均为细胞代谢过程中的产物。
一类是后含物，系储藏物质或废弃物质，分布于液泡内，如糖类（ saccharide）、盐类
（ salts）、生物碱、苷、有机酸、挥发油等；
另一类为生理活性物质，对细胞内生化代谢和生理活动起着调节作用，含量虽少，但其生理作用却非常重要，如酶、维生素、植物激素和抗生素等。
三、细胞后含物和生理活性物质
1、细胞后含物
（ 1）生物碱 生物碱（ alkaloide）是一类含氮的有机化合物，广布于植物界。含生物碱较多的植物科有：茄科、罂粟科、小檗科、豆科、夹竹桃科等。按照植物化学分类学的观点，亲缘关系相近的植物，常含有化学结构相似的成分。此外，一种植物所含的同一类成分中也经常存在多种化学成分，如人参中含有几十种人参皂苷。它们均属于三萜皂苷类成分。中草药中含有多种生物碱，
如麻黄碱、咖啡、阿托品、喹啉、黄连素等，其生理活性都很强。
1、细胞后含物
（ 2）糖苷类 糖苷（ glucosides）是指某些有机化合物和糖经苷键结合而成的化合物，例如黄酮苷是黄酮苷元和糖连接而成。很多糖苷类化合物对疾病都有很好的治疗作用，如洋地黄毒苷有强心作用；
大黄中的蒽醌苷有强烈的泻下作用；紫草中紫草宁是紫草中蒽醌类化合物的总称，除作为天然色素（如口红）外，尚具有很好的抗癌活性。
1、细胞后含物
（ 3）挥发油挥发油（ volatile oil）是一类具有芳香气味，
在常温下易于挥发的油类。在伞形科、
姜科、唇形科等植物中多有分布。很多挥发油可作药用，如薄荷油、丁香油、
桉油等。
1、细胞后含物
（ 4）有机酸 有机酸（ organic acids）是糖类代谢的中间产物。植物果实中酸味以及细胞液的酸性反应，主要是由于有机酸的存在。常见的植物有机酸有：苹果酸、柠檬酸、水杨酸、酒石酸等。
2、生理活性物质生理活性物质是一类对细胞内的生化反应和生理活动起调节作用的物质的总称。
包括酶、维生素、植物激素和抗生素等。
（ 1）酶类酶（ enzymes）是一种有机催化剂。酶反应一般在常温、常压、中性水溶液中进行，高温、强酸、强碱和某些重金属离子，会使其失活。
2、生理活性物质
（ 2）维生素维生素（ vitamin）是一类复杂的有机物，
常参与酶的形成，对植物的生长、呼吸和物质代谢有调节作用，如对难以生根的植物，用维生素 B12处理后可促进不定根的生长。
2、生理活性物质
（ 3）植物激素植物激素是植物细胞原生质体产生的一类复杂的调节代谢的有机物质，对生理过程（如细胞分裂和繁殖）产生作用，
其量虽微，但作用甚大。
2、生理活性物质
（ 4）抗生素和植物杀菌素抗生素（ antibiotic）是由微生物（如某些菌类植物）产生的能杀死或抑制某些微生物生长的物质，如青霉素、链霉素等。
高等植物如葱、蒜、辣椒、萝卜等也能产生杀菌的物质，称为植物杀菌素（ plant
fungicidin）。
四、植物培养细胞的生理特性植物培养细胞不同生长阶段的持续时间及特征。
延迟期（ lag phase）
细胞分裂的初始期和最大生长期之间，其持续时间取决于培养前的条件、时期和 [培养基性质，
其特征是细胞数量、干重近乎恒定，细胞壁厚度达最大；高 RNA含量；高蛋白质合成能力；
高聚核糖体含量；有丝分裂加速；增加细胞的细胞质部分四、植物培养细胞的生理特性加速期（ acceleration phase）
细胞最大生长期和最大细胞浓度，最佳
DNA浓度和蛋白质累积率，持续时间 3~4
代，其特征为常数：干重 增加：细胞数、
DNA和蛋白质浓度 减少：有丝分裂活性、
RNA含量和蛋白质合成能力 增加细胞鲜种、干重及 RNA酶活性四、植物培养细胞的生理特性对数期（ log phase）
介于最大生长率和蛋白质合成完全停止期之间,其特征为蛋白质合成能力减退；变化：
聚核糖体浓度向有利于单核糖体和寡核糖体形成的方向减少稳定期（ stationary phase）
细胞数稳定,其特征为细胞高液泡化、极度脆弱、高度分化，有机化合物的浓度高。
四、植物培养细胞的生理特性由上所述可以知道，植物培养细胞重量的增加主要取决于对数期，而次级代谢产物的累积则主要在稳定期完成。当然植物细胞与哺乳动物细胞及微生物细胞有很多的不容，并由此导致了一系列生理生化等方面的差异，比如混合与传质等。就植物细胞而言，它们很少以单一细胞悬浮生长，而多以非均相集合体的细胞团形式存在。根据细胞系的来源、培养基及培养时间等的不同，细胞团的细胞数目在 2~200 之间，
直径为 2mm左右。
四、植物培养细胞的生理特性细胞团产生的原因有两个：（ 1）细胞分裂之后没有进行细胞分离；（ 2）在间歇培养过程中细胞处于对数生长后期时，开始分泌粘多糖和蛋白质，或者以其它形式形成粘性表面，从而形成细胞团。
植物细胞形态上的另一特性，就是其纤维素细胞壁使得其外骨架相当脆弱，表现为抗张力强度大，抗剪切能力小，故传统的搅拌式生物反应器容易损坏植物细胞的细胞壁。再者，植物细胞培养基黏度度比较高，且培养时间的延长，
细胞数量呈指数上升。
四、植物培养细胞的生理特性所有的植物都是好气性的，因此培养过程中需要不断地供氧。但是，与微生物细胞相反，它并不需要很高的气液传质速率，
而是要控制供氧量，以保持较低的溶氧水平。此外，大多数植物细胞液体培养的 pH
为 5~7，在此 pH水平，通气速率过高会驱除二氧化碳而抑制细胞生长，这个问题可通过在通气过程中加入一定浓度的二氧化碳来解决。注意光照的影响。
四、植物培养细胞的生理特性植物细胞液体培养过程中的泡沫问题不象微生物细胞培养时那么严重，泡沫的性质也不同。
气泡比微生物培养系统中的大，而且由于其含有蛋白质或粘多糖，黏度较大，细胞极易被包埋在泡沫中，并从循环的营养液中带出来，这就造成了非均相培养，通常需要采用化学或机械的方法加以控制，否则，随着泡沫和细胞数量的增加，混合和培养过程的稳定性就要受到影响。
四、植物培养细胞的生理特性在植物细胞液体培养过程中，细胞可能会黏附于培养的反应器壁、电极或挡板的表面上。细胞对表面的黏附及其在器壁上的生长特性，是人们目前正在研究的重点课题之一。通过改变培养基中某些离子的成分，可使表面吸附问题得到一定程度的改善。
第三节 植物细胞培养的基本技术一、植物材料的准备二、培养基及其组成三、培养方法一、植物材料的准备用于植物组织培养的外植体，必须是无杂菌材料。微生物在接触培养基时会大量繁殖，抑制培养物的生长，因此需灭菌处理。
许多化学试剂均能作为表面灭菌剂使用，原则上应尽可能选择那些灭菌后易于除去或容易分解的时间试剂。
灭菌剂的选择和处理时间的长短取决于所用材料对试剂的敏感性。对灭菌剂敏感的外植体的灭菌时间不宜过长；而不敏感的，灭菌时间则可适当延长。经常使用的灭菌剂如下表。
常用灭菌剂的效果比较灭菌剂 使用浓度 /% 去除难易程度 灭菌时间 /min 效果次氯酸 钙次氯酸钠过氧化氢溴 水硝 酸 银氯 化 汞抗 生 素
9 ~10
0.5 ~5
3~12
1~2
1
0.1~1
4~50mg/L
易易最易易较难较难中
5~30
5~30
5~15
2~10
5~30
2~10
30~60
很好很好好很好好最好较好植物不同组织（器官）的灭菌时间和步骤组织
（器官）
灭菌步骤 备注灭菌前处理 灭菌 灭菌后处理种子果实茎切段储藏器官叶片纯酒精中浸
10min，再用无菌水漂洗纯酒精漂洗自来水洗净，
再用酒精洗自来水自来水，吸干，纯酒精
100g/L次氯酸钙浸 20~30min，
再用 10g/L溴水浸 5min
20g/L次氯酸钠浸 10min
20g/L次氯酸钠浸 5~30min
20g/L次氯酸钠浸 20~30min
1g/L氯化汞浸
1min
无菌水洗 3次，在无菌水中发芽；或无菌水洗 5次，在湿无菌纸上发芽无菌水冲洗，再剖除内部组织的种子无菌水洗 3次无菌水洗 3次，滤纸吸干无菌水反复冲洗，
滤纸吸干用幼根或幼芽发生愈伤组织获得无菌苗选取嫩叶、
叶片平放在琼脂上一、植物材料的准备植物材料灭菌后，即可进行培养。接种的外植体的形状和大小要根据试验目的及具体情况而定。当然，如果所用外植体细胞多时，得到愈伤组织的机会必然也多。如要定量研究愈伤组织，则不仅外植体的大小要一致，而且其形状及组织部位也应基本类似。进行这类培养研究常常选用较大材料，如人参、胡萝卜或甜菜的贮藏根、马铃薯的块茎等。
二、培养基的及其组成培养基实际上是植物离体器官、组织或细胞等的无菌土壤，其特点是营养成分的可调控性。
植物组织和细胞培养所用培养基种类较多，但通常都含有无机盐、碳源、有机氮源、植物生长激素、维生素等化学成分。有商品化的培养基可以购买。
1、无机盐基本培养基是由各种浓度的无机盐溶液组成的，
这些无机盐又有,大量元素,和,微量元素,
之分。大量元素是指使用浓度大于 30mg/L时的无机元素，包括 N,S,P,K,Mg,Ca,Cl和钠，
而微量元素是指浓度低于 30mg/L的无机元素，
如 Fe,B,Mn,I和 Mo，以及极微量的 Cu和 Zn。
某些情况下，还可加入 Ni,Co和 Al。这些微量元素作为辅因子或对酶合成而言，都是必须的，
如镍对脲酶的合成就是至关重要的。
2、碳源植物细胞培养物通常均为异养细胞。因此人们经常使用碳水化合物、肌醇作为碳源，有时也用甘油、乳糖和半乳糖等化合物。有些培养物还可通过同化二氧化碳而获得所需的能量，此所谓光自养培养物。在某些情况下，培养基固化剂也可作为补充能量和碳源之用。
此外，某些天然提取物对愈伤组织的诱导和培养也有重要意义，如椰子乳（椰子的液体胚乳），常用浓度为 10%；也可用 0.5%的酵母提取物或 5%~10%的番茄汁等。
3、植物生长调节剂植物激素是指植物代谢过程中形成的生长调节物质，在极低浓度（ <1?M）时即能调节植物的生育过程，并能从合成部位转运到作用部位而发挥作用。植物激素只限于天然产生的调节物质，到目前位置，已发现植物组织中可以形成
5种植物激素，即生长素、分裂素、赤霉素、
脱落酸和乙烯。植物生长调节剂既包括人工合成的具有生理活性的化合物，也包括一些天然的化合物以及植物激素。
4、有机氮源使用较多的有机氮源为蛋白质水解产物
（如谷氨酰胺）或各种氨基酸。有机氮源对细胞的早期生长有利，氨基酸的加入主要是为了代替或增加氮源的供应，
但应注意的是苏氨酸、甘氨酸和缬氨酸可通过灭活位于叶绿体和细胞质上的谷氨酸合成酶而降低氮的利用，而精氨酸通常具有补偿此灭活作用的能力。
5、维生素植物细胞通常是维生素自养型的，但在大多数情况下，其自身合成的量均不能满足植物细胞的需要，即使是光合成活性细胞或组织也是如此。故对大多数培养基而言，除了必需加入的 B族维生素
（如 B1,B6和泛酸）外，通常还需加入一定量的生物素和肌醇，后者是构成磷酸肌醇（细胞膜脂质部分含磷酸肌醇
2%~8%）极性端的部分。
三、培养方法植物细胞培养，按培养对象来说，可分为原生质体培养和单倍体细胞培养；按照培养基类型可分为固体培养和液体培养；按培养方式可分为悬浮细胞培养和固定化细胞培养。
三、培养方法固体培养和液体培养两种方法基本上是在微生物培养方法的基础上发展起来的。所谓固体培养系统实际上包括利用琼脂作为支撑物的固体培养和固定化细胞培养。
固体培养是在培养基中加入一定量的凝固剂，经加热溶解后，分别装入培养用的容器中，冷却后凝结成固体培养基。固体培养的特点是简便易行、所占空间小。但也有缺点，主要是不均衡现象。
固体培养和液体培养互相配合是组织（细胞）培养的常规操作。常用的固化剂有琼脂、藻酸盐
（ alginate）、角叉藻聚糖（ carrageenan）、明胶
（ gelatin）、羟乙基纤维素、聚丙烯酰胺、淀粉和硅胶等。最常用的凝固剂是琼脂，最适浓度 0.6~1.0%。
三、培养方法温度是培养中重要的因素，一般控制在 25?1℃ 之间。
有些植物材料在诱导愈伤组织时需要在黑暗条件下进行，但诱导愈伤组织的器官分化和其他材料的培养都需要光照。光照以每天 16h为宜。
由于植物组织在培养基上生长要不断消耗营养、散失水分和累积代谢物，必将影响培养物的进一步生长。因此外植体在培养三周左右必须转换至新鲜培养基上，以保持正常生长。移换一次培养基称一次继代培养。一种外植体经过一定次数的继代培养，
其培养物就可用于悬浮培养。
三、培养方法液体培养系统包括小规模的悬浮培养和大规模的成批培养、半连续和连续培养。悬浮培养可分为静止和振荡两类。静止液体培养和固体培养一样，也具有简便易行的特点，而且培养基还不会产生营养物质浓度差的现象。振荡液体培养，是使悬浮细胞在液体培养基中，并不断振动下进行培养。这样可以防止上述静止培养的许多缺点。通常培养基的体积约占容器体积的 20%。
三、培养方法
1、成批培养法将培养基一次性地加入反应器，接种、培养一定时间后收获细胞的操作方式称为成批培养法。
植物细胞培养过程中，次级代谢产物的大量累积往往发生在细胞生长的稳定期，人们基于此原理设计了植物细胞的两步培养法，即使用两个生物反应器，第一个反应器用于细胞生物量的累积，第二个反应器用于次级代谢产物的生产。
三、培养方法
2、半连续培养法在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法称为半连续培养法。
3、连续培养法利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境长期维持恒定的方法。
三、培养方法
4、固定化培养法植物次级代谢产物的累积主要在细胞生长的稳定期，
表明细胞成块而趋于分化时，细胞块中各个细胞处于一定理化梯度之下，此现象与完整植株类似，由此人们提出了植物细胞固定化培养技术。
固定化培养采用的固定化反应器有网状多孔板、尼龙网套和中空纤维膜等多种类型，将细胞固定于尼龙套内，或固定于中孔纤维反应器的膜表面，或固定于网状多孔板上，放入培养液中进行培养，或连续流入新鲜培养液，进行连续培养及连续收集培养产物，也可通入净化空气以代替搅拌。优点是细胞位置固定，易于获得高密度细胞群体及维持细胞间的物理化学梯度，利于细胞组织化，易于控制条件。
第四节 影响植物次级代谢产物累积的因素在植物组织和细胞培养过程中，影响植物次级代谢产物产生和累积的因素主要有：①生物条件：外植体、季节、休眠、分化等；②物理条件：温度、光（光照时间、光强、光质）、通气（ O2）,pH和渗透压等；③化学条件：无机盐（ N,P,K等）、碳源、植物生长调节剂、
维生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物质、
前体等；④工业培养条件：培养罐类型、通气、
搅拌和培养方法等。
一、外植体选择不同外植体的悬浮细胞培养物，其最大次级代谢产物的累积时间各异。同一化合物可以在不同外植体的不同生长阶段中累积，有的次级代谢产物累积是在延迟期进行，有的则在加速期累积，当然也有的累积时间与细胞生长曲线同步，，
还有的则在稳定期大量累积次级代谢产物。
二、培养条件的影响
1、培养环境的内在因素
（ 1）接种和诱导：外植体的大小不仅影响所诱导的组织和细胞的生长，而且也关系到其次级代谢产物的生产能力，如长春花培养物中蛇根碱的合成要求其外植体直径在 1~12cm之间，在此条件下才能分泌噻吩类成分。次级代谢产物的产率与外植体大小、细胞密度及营养成分密切相关，如在紫草的细胞培养中，当营养成分的供给为 1400mg/L时，细胞干重为 2.8g/L。然而，
细胞生长率的增加有时会导致次级代谢产物产量的降低。外植体的大小可能是使某些次级代谢产物含量发生变化的原因之一，此类现象常见于一些高产细胞株经继代培养之后。前处理也可影响累积方式。
二、培养条件的影响
1、培养环境的内在因素
（ 2）基本培养基组成,基本培养基的各种成分是愈伤组织和悬浮细胞培养的物质基础，尤其在稳定期次级代谢产物累积时更是如此。①磷：②
氮：③铜：
（ 3）碳源,碳源通常以光自养培养中的 CO2或异养培养中的糖类两种形式提供，其性质和数量往往对培养细胞的生物量有很大的影响。 CO2可以诱导某些特征反应，如在金苹果的悬浮细胞培养中，高浓度 CO2可产生一种特有的苹果香味。
植物细胞培养中使用最多的碳源是糖类，
对次级代谢产物的影响主要取决于所使用的糖类的种类及细胞次级代谢产物的生物合成过程。
碳源对长春花悬浮细胞培养中次级代谢作用的影响次级代谢产物 糖类乳糖（ 6%） 蔗糖（ 3%） 甘露糖醇
（ 0.3~0.6mol/L）
长春花碱 /mg?L-1
蛇根碱 /mg? L-1
游离氨基酸 /mol?
L-1
50
——
——
16.60
1.40
0.55
——
21.50
2.86
1、培养环境的内在因素
（ 4）植物生长调节剂植物生长调节剂在植物细胞培养中起着非常重要的作用，这种作用有时可能是关键性的。但是植物材料和生理状态的差异，无一定的规律可循，
必须通过仔细的实验观察才能确定其合适的数量和种类。如 Furuya在培养烟草细胞时发现，加入
IAA时培养物中有尼古丁生成，但 2,4-D存在时则不合成该化合物。说明不同植物激素及其不同组合形式均可显著影响代谢产物的产生。
（ 5） O2和 pH
① O2,培养细胞生长过程需要维持其正常呼吸作用，悬浮细胞培养和固定化细胞培养时供氧方式有所不同，前者可采用搅拌和通气方式，搅拌速度通常为 120~160r/min，过快易导致细胞破裂；后者仅能采用通气方式，一般使用含 5%CO2的洁净空气，通气量应适当，过多或过少均影响细胞生长及次级代谢产物的合成。
② pH：一般来说，最有利于培养细胞生长的 pH在
5~6之间。常用的培养基均具有一定的缓冲性质，
在培养过程中培养液的 pH变化较小。
（ 6）渗出物（ exudates）：在细胞悬浮培养后期，
培养液中常含有各种代谢产物，如某些初级代谢产物和次级代谢产物以及某些酸性物质、醇类、水解蛋白或活性蛋白等。如落花生悬浮培养细胞培养的后期培养液中含有 27种多肽成分。此外，培养细胞分泌产物的量也取决于培养物的发育阶段，如在多叶羽扁豆悬浮细胞培养中，在活跃的生长期初期，
酶的分泌量就达到了稳定期的水平，尔后酶活性随乙醇量的增加而降低。
次级代谢产物的累积往往在水解酶活性增加之前进行。
2、两步培养法培养基的组成是细胞生长和次级代谢产物的形成最直接、也是最重要的影响因素。为了得到最佳生长和最佳次级代谢产物，提出了两步法。第一步主要使用适合细胞生长的培养基，称为生长培养基（ growth medium）第二步主要用适于次级代谢产物合成的培养基，称为生产培养基。
两种培养基往往有较大的区别，前者是为了实现细胞的高生产率，后者通常具有较低含量的硝酸盐和磷酸盐，并含有较低的糖份或较少的碳源。书中介绍了长春花细胞培养中生长培养基与生产培养基的区别主要为前者使用了肌醇及维生素类成分，而后者则不含上述成分，在生长调节剂的使用上，前者应用 2,4-D刺激细胞生长，而后者加入 6-BA以便利于次级代谢产物的产生。
3、诱导子植物抗毒素（ phytoalexins）是指在植物防御系统内能对抗微生物进攻的某些次级代谢产物
（根据其功能又称为,后感染防御物质,）。
尽管在有些情况下代谢产物可能会连续合成，
但在另外一些情况下只有细胞被刺激时才能产生植物抗毒素，或仅在被诱导时其产量才能增加。
触发形成植物抗毒素信号的物质称为诱导子。
从广义上讲，诱导子是能够诱导植物细胞中一个反应，并形成特征性自身防御反应的分子。
3、诱导子诱导子的分类有两种：一种是根据在细胞内或细胞外形成而将其分为内源性诱导子和外源性诱导子，
另一种是根据其来源分为生物诱导子（ biotic elicitors）
和非生物诱导子（ abiotic elicitors），现多采用后者。
生物诱导子是指植物体在防御过程中为对抗微生物感染而产生的物质，主要包括分生孢子（ conidia），
降解细胞壁的酶类、细胞壁碎片、有机体产生的代谢物等成分。初生细胞壁中富含由半乳糖醛酸组成的多糖成分,1%的浓度就足以诱导植物产生抗毒素，
但其活性一般低于外源性?-庚糖苷。非生物诱导子是指所有不是植物细胞中天然成分但又能触发植物细胞形成抗毒素信号的物质。生物诱导子和非生物诱导子在其量效关系上也有区别。
3、诱导子诱导子的类型与所产生的次级代谢产物的类型没有直接关系，各种生物合成途径所必须的酶也并不是对酶个诱导子的刺激都产生反应，如在园欧芹悬浮细胞培养中,UV（非生物诱导子）对黄酮生物合成过程中所涉及的酶类有诱导作用，
而在苯丙烷代谢中，只有生物诱导子才能与有关酶发生反应。
4、培养环境的外部因素
（ 1）温度 培养物中次级代谢产物产生的最佳温度为 20~28℃ 。在一定温度（ ≤15 ℃ ）下，细胞不再生长，次级代谢产物也不再产生。但应该指出的是，
在某些极端情况下（如 30 ℃ ），细胞也能正常生长。
终产物和中间产物的累积，甚至与其生物合成直接相关的化合物，也并非需要相同的温度。低温对次级代谢产物产生的影响类似于 2,4-D的抑制作用。
当培养温度与培养物正常生长所要求的温度相差很大时，可引起某些应激效应以及对次级代谢产物产生的激活作用。温度的变化尚可引起产物类型在质和量上的改变，个别情况下由于激活了新的生物合成途径也可能产生新的代谢物质。
4、培养环境的外部因素
（ 2）搅拌频率 植物培养细胞的产率与发酵罐的搅拌速度有关，具体表现在发酵液中的溶氧浓度和机械搅拌对细胞所产生的剪切力上，如上述因素对海巴戟长方形细胞（累积蒽醌类成分）、产生甜菜苷（ betanine）的甜菜（ Beta
vulgaris）细胞和累积蛇根碱的长春花细胞等的影响就非常明显。但搅拌频率也不宜过小，如低于 28r/min时，次级代谢产物的生物合成反应就有可能发生反转。
4、培养环境的外部因素
（ 3）培养容器的影响 植物培养细胞次级代谢产物的产生可因为所用培养容器的大小和搅拌装置的不同而得到不同的结果。如小规模实验室培养所用的培养容器（ 50~500ml）具有较高的氧转移率，通过简单的定期搅拌，培养物的每个部位均可得到比大规模培养更好的氧供应。用于生产次级代谢产物反应器中的搅拌器对细胞产率可产生一定的影响，这些差异及由剪切力引起的不良影响可通过使用气升式发酵罐或一个沿水平轴转动的发酵罐而予以避免。但因为植物细胞生长和次级代谢产物的生产过程是完全分离的，所以这对细胞生产过程会有不利影响。
延长稳定期就意味着延长培养时间，从而增加成本、
增大污染机会等，可以通过两步培养等方法解决。
4、培养环境的外部因素
（ 4）光的影响 光照时间、光质和光强对次生代谢产物（如黄酮、黄酮醇、花色素苷、挥发油等）的累积都有一定影响。
第五节 植物细胞培养的生物反映器要研制适合于高等植物细胞大量培养的生物反应器，首先应对植物细胞的特性有所了解。植物细胞的发酵培养借鉴了微生物发酵的经验，
但植物细胞和微生物相比存在着很多差异：植物细胞的直径为 10?m~100?m，比细菌和真菌细胞大 10~100倍；植物细胞的纤维素壁具有较差的抗剪切能力；植物细胞的呼吸率低，对氧的需求也低。此外，植物细胞培养生物反应器的设计与各类植物细胞的不同生理特征和代谢方式有关，同时也与培养方式相联系。
反应器的选择取决于生产细胞的密度、
通气量以及所提供的营养成分的分散程度。根据通气和搅拌系统的类型可将生物反应器分为以下几类：
①摇瓶
②搅拌型生物反应器
③环流生物反应器和鼓泡塔生物反应器。
目前主要用于植物细胞大规模培养的生物反应器有一、机械搅拌式生物反应器二、鼓泡塔生物反应器三、气升式生物反应器四、转鼓式生物反应器五、固定化细胞生物反应器第六节 进展与展望一、诱导子在植物细胞培养中加入诱导子可以提高次级代谢产物的产量，并可促进产物分泌到培养基中。
诱导子的作用随诱导子种类的不同而异，如在紫杉醇的细胞工程研究中,Christen等向培养基中加入高压灭活的壳囊孢菌菌丝体和青霉菌的孢子，或加入硫酸矾和 3,4-二氯苯氧基三乙基胺等，可促进短叶红豆杉的悬浮细胞生长，并分泌更多的紫杉醇。
二、前体饲喂前体饲喂是增加次级代谢产物产率的重要方法。
生物合成研究结果表明，次级代谢物的形成，
依赖于 3种主要原材料（结构范围,building
block）的供应，即：①莽草酸：属芳香化合物，
是芳香氨基酸、肉桂酸和某些多酚化合物的前体；②氨基酸：形成生物碱及肽类抗生素类，
包括青霉素类和头孢菌素类；③乙酸：是聚乙炔类、前列腺素类、大环抗生素类、多酚类、
类异戊二烯等的前体。
三、两相法培养两相法培养的基本出发点是在细胞外创造一个次级代谢产物的储存单元。该培养方法可以加入固相或疏水液相，形成两相培养系统，从而达到收集分泌物的目的。该法可减轻产物本身对细胞代谢的抑制作用，并可保护产物免受培养基中催化酶或酸对产物的影响。此外，由于产物在固相或疏水液相中的积累简化了下游处理过程。
两相法培养系统必须满足如下条件：①
添加的固相（如树脂）或液相对细胞无毒害作用，不影响细胞生长和产物的合成；②产物易被固相吸附或被有机相溶解；③两相易分离；④如为固相，不可吸附培养基中的添加成分，如植物生长调节剂、有机成分等。
四、毛状根和冠瘿瘤培养对双子叶植物病原菌根瘤农杆菌和发根农杆菌发病机理的研究，发现了两种农杆菌的原生质体中，分别含有 Ti质粒和 Ri
质粒，大小约 200kb。植物遭受感染后，
农杆菌能将质粒中的一段转移 DNA片段整合到植物细胞核的 DNA基因编码上，作为表现型，从被感染处长出冠瘿瘤或毛状根（ hairy-root）。将冠瘿瘤或毛状根作为培养系统，可进行有机化合物的生产。
