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2,萃取分离
? 基本概念
? 2.1 有机溶剂萃取
? 2.2 双水相萃取
? 2.3 反胶团萃取
? 2.4 超临界流体萃取
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基本概念
? 萃取 extraction 是利用液体或超临界流体为溶
剂提取原料中目标产物的分离纯化操作。
? 萃取剂 extractant 萃取分离中的流体。
? 有机溶剂萃取 organic solvent extraction,简
称 溶剂萃取 solvent extraction
? 液固萃取或浸取 leaching
? 超临界流体萃取 supercritical fluid extraction
? 双水相萃取 aqueous two-phase extraction
? 反胶团萃取 reversed micelle extraction
? 液膜萃取
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基本概念
? 反萃取 back extraction 为进一步纯化目标产物，
在溶剂萃取分离过程中，调节水相条件，将目标产
物从有机相转入水相的萃取操作。
? 物理萃取 溶质根据相似相溶的原理在两相间达到分
配平衡而进行萃取的分离过程。
? 化学萃取 利用脂溶性萃取剂与溶质之间发生化学反
应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相分配的过
程。萃取剂与溶质之间的化学反应包括离子交换和
络合反应等。
? 化学萃取中通常用煤油、己烷、四氯化碳和苯等有机溶剂溶
解萃取剂，改善萃取相的物理性质，此时的有机溶剂称为 稀
释剂 diluent 。
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2.1 溶剂萃取
? 分配定律
? 在溶剂萃取过程中，将供提取的溶液称为料液；从料
液中待提取的物质称为溶质；用来萃取目的产物的溶
剂称为 萃取剂 ；溶质转移到萃取剂中与萃取剂形成的
溶液称为 萃取液 ；被萃取出溶质后的料液称 萃余液 。
? 平衡时溶质在两相中的浓度之比为一常数 K,即：
K ＝ 萃取相浓度 /萃余相浓度 ＝ c1／ c2 (2-1)
常温下 K为常数, c的单位通常用 mol/L或 U/ml。
? 式 (2-1)应用条件,(1)稀溶液； (2)溶质对溶剂之互溶
度没有影响； (3)必须是同一种分子类型, 即不发生
缔合或离解 。
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? 弱酸或弱碱性溶质还要考虑弱电解质在水相中的电
离平衡。如 penicillin是一类弱酸，在水中会有一部分
离解成负离子 (P·COO－ ),在萃取相乙酸丁酯等有机
相中则仅以游离酸分子 (P·COOH)的形态存在。
? 两相中的游离酸分子的分配平衡用分配系数 K0表征
? 电离平衡用电离常数 KP来表征。
图 2-1 青霉素的分配平衡与电离平衡
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? K0和 KP是客观存在的，但一般测定得到的是
[P·COOH＋ P·COO－ ]的总浓度 c2,在这种情
况下，
c1／ c2＝ K
这里的 K称之为表观分配系数。而 K和 K0、
KP的关系式可经理论推导如下：
K＝ K0[H＋ ]／ (Kp＋ [H＋ ]) (弱酸 ) (2-2)
K＝ K0Kp／ (Kp＋ [H＋ ]) (弱碱 ) (2-3)
? 由此可见，溶质在不互溶两相中的分配不仅
与本身的性质 (决定 KP),萃取溶剂 (决定 K0)有
关，也与水相的 pH有关。
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? 分离因数
? 若原来的料液中除溶质 A以外，还含有溶质 B,则由
于 A,B的分配系数不同,A和 B就得到了一定程度的
分离。如 A的分配系数较 B大，这样萃取剂对溶质 A和
B分离能力的大小可用分离因数 β来表征：
β＝ (c1A/c1B)／ (c2A/c2B)＝ (c1A/c2A)／ (c1B/c2B)
＝ KA／ KB (2-4)
下标 1,2分别代表萃取相和萃余相, A,B为溶质
如果 A是产物, B为杂质, 分离因数可写为：
β ＝ K产 ／ K杂
β越大, A,B的分离效果越好, 即产物与杂质越容
易分离 。
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? 水相条件的影响
? 由于产物所在的水相中往往还存在与产物性质
相近的杂质、未完全利用的底物、无机盐、其
他营养成分等。必须考虑这些物质对萃取过程
的影响。
(1) pH值
? 根据式 (2-2),(2-3)可见,pH值直接影响表观
分配系数。 pH除影响 K外，还可能对选择性有
影响。如青霉素在 pH 2萃取时，乙酸丁酯萃取
液中青霉烯酸可达青霉素含量的 12.5％，而在
pH 3的条件下萃取，则可降低至 4％。另外，
pH值还应尽量选择在使产物稳定的范围内。
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(2) 温度
? 温度会影响生化物质的稳定性。
? 影响分配系数 K。
(3) 盐析
? 无机盐类如硫酸铵、氯化钠等一般可降低产物
在水中的溶解度而使其更易于转入有机溶剂相
中，另一方面还能减小有机溶剂在水相中的溶
解度。如提取维生素 B12时，加入硫铵，可促使
维生素 B12自水相转移到有机相中；提取青霉素
时加入 NaCl,也有利于青霉素从水相转移到有
机溶剂相中。
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(4) 带溶剂
? 为提高分配系数 K,常添加带溶剂。 带溶剂 是指能和
产物形成复合物，促使产物更易溶于有机溶剂相中，
在一定条件下又要容易分解的物质。
? 青霉素作为一种酸，可用脂肪碱作为带溶剂。青霉素
能和正十二烷胺、四丁胺等形成复合物而溶于氯仿中。
这样萃取收率能够提高，且可以在较有利的 pH范围
内操作。这种正负离子结合成对的萃取，也称为 离子
对萃取 。
? 柠檬酸在酸性条件下，可与磷氧键类萃取剂如磷酸三
丁酯 (TBP)形成中性络合物而进入有机相
(C6H8O7·3TBP·2H2O),这种形成络合物的萃取称为
反应萃取 。
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? 萃取方式和理论收得率
? 工业上萃取操作通常包括三个步骤：
混合 — 分离 — 溶剂回收
? 因而工业萃取的流程中须有混合器 (如搅拌混
合器 )、分离器 (如碟片式离心机 )和溶剂回收装
置 (如蒸馏塔 )。混合萃取和分离也可在同一台
设备内完成。
? 一般萃取过程很快，如果接触表面足够大，则
在 15~60 s之内就可完成。
? 萃取操作流程可分为单级萃取和多级萃取。
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? 单级萃取
? 如图 2-2所示。
图 2-2 单级萃取流程图
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? 萃取操作理论收得率的计算须符合以下两个假定：
① 萃取相和萃余相很快达到平衡
② 两相完全不互溶，在分离器中能完全分离。
? 设 K为分配系数,VF为料液体积,VS为萃取剂体积,E
为 萃取因子 (extraction factor)即萃取平衡后，溶质在萃
取相与萃余相中质量的比值，则：
E＝ K·VS／ VF＝ K／ m (2-5)
? 式中 m＝ VF／ VS＝ 料液体积／萃取剂体积
? 令未被萃取的体积分数为 φ,则：
φ＝ 1／ (E＋ 1) (2-6)
? 而理论收得率为：
1－ φ＝ E／ (E＋ 1) (2-7)
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? 多级萃取
? 为提高收率常常采用多级萃取，多级萃取又有多级逆
流萃取和多级错流萃取流程，如图 2-3和图 2-4所示。
图 2-3 多级错流萃取流程
图 2-4 多级逆流萃取流程
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? 由理论推导，经 n级萃取后，两种多级萃取流程的产物
收率分别为：
? 多级错流萃取流程：
1－ φ＝ 1－ [1／ (E1＋ 1)(E2＋ 1)…(E n＋ 1)] (2-8)
? 多级逆流萃取流程：
1－ φ＝ (En＋ 1－ E)／ (En＋ 1－ 1) (2-9)
图 2-5 三级逆流萃取设备流程
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? 例 1,赤霉素在 10℃, pH值 2.5时的分配系数 (乙酸
乙酯／水 )为 35，用等体积乙酸乙酯单级萃取一次
问理论收得率为多少？
? 解 1,E＝ 35× 1／ 1＝ 35
理论收得率 1－ φ ＝ 35／ (35＋ 1)＝ 97.2％
? 例 2,赤霉素二级错流萃取时，第一级用 1/2体积
乙酸乙酯，第二级用 1/10体积乙酸乙酯，问理论收
得率为多少？
? 解 2,E1＝ 35／ 2＝ 17.5 E2＝ 35／ 10＝ 3.5
理论收得率 1－ φ ＝ 1－ 1／ [(17.5＋ 1)× (35＋ 1)]
＝ 98.79％
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? 多级错流萃取由于溶剂分别加入各级萃取器，故萃
取推动力较大，萃取效果较好。缺点是需加入大量
的溶剂，因而产品浓度稀，需消耗较多的能量回收
溶剂。
? 例 3,赤霉素进行二级逆流萃取，乙酸乙酯用量为
1/2体积，问理论收得率为多少？
? 解 3,E＝ 35／ 2＝ 17.5 n＝ 2
理论收得率 1－ φ ＝ [17.53－ 17.5]／ [17.53－ 1]
＝ 99.7％
? 由上可见三种萃取过程中，以逆流萃取收率最高，
溶剂用量最少。因而也是工业上普遍采用的流程。
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5.2 双水相萃取
? 过滤和离心依赖于被分离颗粒的尺寸或密度的差异，
当希望收集微生物的细胞器、分离去除细胞碎片、提
取和浓缩胞内物质时，普通的过滤和离心技术就显得
力不从心了。
? 溶剂萃取法难于应用于蛋白质分离。
? 值得注意的是溶液的分相不一定完全依赖于有机溶剂，
在一定条件下，水相也可以形成两相甚至多相。于是
有可能将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个
水相转移到另一水相中，从而完成分离任务。
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? 1896年 Beijerinck观察到当把明胶与琼脂或把明胶和
可溶性淀粉的水溶液混合时，先得到一混浊不透明
的溶液，随后分成两相，上相含有大部分明胶，下
相含有大部分琼脂 (或可溶性淀粉 )。再如图 2-6中，
2.2％的葡聚糖水溶液与等体积的 0.72％甲基纤维素
钠的水溶液相混合并静置后，可得到两个粘稠的液
层。
图 2-6 葡聚糖与甲基纤维素钠的双水相体系
2005-3-21 20
? 上述现象称为聚合物的 不相溶性
(incompatibility)。 如果多种不相溶的聚合物混
在一起，就可得到多相体系，如硫酸葡聚糖、
葡聚糖、羟丙基葡聚糖和聚乙二醇相混时，可
形成四相体系。
? 聚合物的不相溶性主要是由于聚合物分子的空
间阻碍作用，相互间无法渗透，当聚合物的浓
度达到一定值时，就不能形成单一的水相，所
以具有强烈的相分离倾向。
? 某些聚合物的溶液与某些无机盐的溶液相混合
时，只要浓度达到一定值，也会形成两相，即
聚合物 -盐双水相体系，成相机理尚不清楚，
一种解释为“盐析”作用。
2005-3-21 21
? 某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后
可形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即
形成 双水相系统 (two aqueous phase system)。 利
用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性
质,Albertsson于 50年代后期开发了 双水相萃取法
(two aqueous phase extraction),又称 双水相分配
法 (two aqueous phase partitioning)。
? 70年代以后,Kula,Hustedt和 Johansson等发展了
双水相萃取技术在生物分离过程中的应用，为蛋白
质特别是胞内蛋白质的分离与纯化开辟了新的途径。
? 现在的研究已涉及到酶、核酸、生长激素、病毒等
各种物质的分离和提纯。
2005-3-21 22
2.2.1 双水相分离理论
? 双水相体系
? 广泛应用的双水相体系是聚乙二醇 (PEG)/葡聚糖
(Dex)体系。
? 聚合物与无机盐的混合溶液，例如,PEG/磷酸钾,
PEG/磷酸铵,PEG/硫酸钠等常用于生物产物的双
水相萃取。
? 分离某一生物大分子，两相系统的选择原则，必须
有利于目的物的萃取和分离，同时又要兼顾到聚合
物的物理性质。如甲基纤维素和聚乙烯醇，因其粘
度太高而限制了它们的应用。 PEG和 Dex因其无毒
性和良好的可调性而得到广泛应用。
2005-3-21 23
? 相图
? 双水相的形成条件和定量关系常用相图表示，图 2-7是
PEG／ Dex体系的相图。 TCB称为 双节线 (binodal),双
节线以上的区域为
两相区。上相组成用
T(Top)表示，下相组
成用 B(Bottom)表示。
? 连接 T,B两点的线段
TB称为 系线 (tie line)，
系线上各点处系统的
总浓度不同，但均分
成组成相同而体积不
同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则。
图 2-7 PEG／ Dex体系相图
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? 如点 M为整个系统的组成，该系统实际上由 T,B所
代表的两相组成,vT表示上相体积,vB表示下相体积，
则：
vT／ vB＝ BM／ MT (2-10)
? 系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度, 系线越
长, 两相间的性质差别越大 。 当点 M向下移动时, 系
线长度缩短, 两相差别减小, 到达 C点时, 系线长度
为 0,两相间差别消失而成为一相, 因此 C点为 系统
临界点 (critical point)。
? 双节线的位置和形状与聚合物的相对分子质量有关 。
聚合物 Dex的相对分子质量越高, 相分离所需的浓度
越低；两种聚合物相对分子质量相差越大, 双节线
的形状越不对称, 见图 2-8。
2005-3-21 25
PEG的相对分子质量固
定 (PEG6000)而 Dex的相
对分子质量如下：
1.D5 (Mn2800,Mr3400)
2.D17(Mn23000,Mr30000)
3.D24(Mn23000)
4.D37(Mn88000,Mr179000)
5.D43(Mn180000,Mr460000)
6.D170(Mn630000，
Mr2200000)
Mn— 数均分子量
Mr— 重均分子量
图 2-8 PEG／ Dex体系的双节线和临界点
2005-3-21 26
? 物质在两相中的分配
? 和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系
数 K表示。
K ＝ cT／ cB
式中 cT,cB分别代表上相, 下相中溶质的浓度 。
? K与温度, 压力以及溶质和溶剂的性质有关, 与溶质
的浓度无关 。
? 影响分配系数的主要因素, 可用 Gerson公式表示：
－ lgK＝ A Δγ＋ δΔφ＋ β (2-11)
式中 A—— 表面积； Δγ—— 两相表面自由能之差
δ—— 电荷数； Δφ—— 电位差； β—— 标准化学位和活
度系数等组成的常数
2005-3-21 27
? 表面自由能可用来量度表面的相对憎水性，改变
成相聚合物的种类。聚合物的平均分子量和相对
分子质量分布，都能影响相的疏水性。
? 一般地，大分子的表面积 A都很大,Δγ的微小变
化都会引起蛋白质大分子的分配系数产生很大变
化；加入系统的盐，以及体系的 pH会影响相间电
位差 Δφ和蛋白质所带的电荷数 δ,因而也对分配
系数产生大的影响。
? 由于影响分配系数的因素很多，加上各因素间又
互相影响，因此定量地将蛋白质的一些分子性质
与分配系数关联起来是困难的，最佳的双水相操
作条件还得依靠实验来获得。
2005-3-21 28
2.2.2 影响分配平衡的参数
? 影响物质分配的因素主要有：
? 聚合物及成相盐的种类及浓度
? 聚合物的平均分子量
? 体系的 pH值及其他盐的种类及浓度
? 菌体或细胞的种类及含量、体系温度等。
2005-3-21 29
? 聚合物及其分子量的影响
? 不同聚合物，水相系统显示不同的疏水性，水
溶液中聚合物的疏水性依下列次序递增：葡萄
糖硫酸盐＜甲基葡萄糖＜葡萄糖＜羟丙基葡聚
糖＜甲基纤维素＜聚乙烯醇＜聚乙二醇＜聚丙
三醇，这种疏水性的差别对目的产物与相的相
互作用是重要的。
? 同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加，其
大小的选择依赖于萃取过程的目的方向，若想
在上相获得较高的蛋白质收率，对于 PEG/盐
系统，应降低 PEG聚合物的平均分子量，相
反，若想在下相获得较高的蛋白质收率则平均
分子量应增加。
2005-3-21 30
? 双水相萃取糖化酶的结果 (见表 5-4) 表明,PEG平均
分子量增大，分配系数减少。当分子量为 400时,K＞
1,酶主要分布于上相，当分子量大于 400时,K＜ 1，
酶主要分布于下相。主要原因是随着 PEG分子量的增
大，其端基数目减小，因而疏水性增加，使糖化酶在
上相的表面张力增大，而使 λ＜ 0,从而转入下相，为
了使酶分布于上相，应选用分子量为 400的 PEG。
表 2-1 PEG平均分子量对分配平衡的影响
系统 K 相体积 产率％
PEG400 (31.36％ )— (NH4)2SO4 (14.05％ ) 6.28 4.75 96.8
PEG1000 (21.77％ )— (NH4)2SO4 (12.76％ ) 0.26 3.0 43.5
PEG4000 (12.67％ )— (NH4)2SO4 (12.14％ ) 0.30 4.1 59.8
PEG6000 (15.76％ )— (NH4)2SO4 (12.34％ ) 0.03 1.2 2.1
2005-3-21 31
? 在 PEG/Dex双水相系统中,PEG分子量的减少，会
使蛋白质的 K值明显增大，如图 5-13。
? Dex水解程度的不同，对 K值也有一定的影响。
○普鲁兰酶
(12％ PEG,1％ DexT 500，
100mmol／ L Na3PO4,pH7.5)
□ 1,4-α -葡聚糖磷酸酶
(9.3％ PEG,7％ DexT 500，
50mmol／ L Na3PO4,pH7.8)
● 亮氨酰基 -tRNA合成酶
9.2％ PEG,6.3％ DexT 500，
73mmol／ L Na3PO4,pH7.8)
图 2-9 PEG平均分子量对分配率的影响
2005-3-21 32
? 系线长度对分配平衡的影响
? 相图中系线长度由组成的总浓度决定，在临界点附近，
系线长度趋向于零，上相和下相的组成相同，因此，分
配系数应该是 1，随着聚合物和成相盐浓度增大，系线
长度增加，上相和下相相对组成的差别就增大，产物如
酶在两相中的表面张力差别也增大，这将会极大地影响
分配系数，使酶富集于上相。
? 仍以 PEG— (NH4)2SO4系统双水相萃取糖化酶为例，增
加 PEG400的浓度有利于酶在上相的分配，当 PEG400
浓度在 25％～ 27％时，分配系数高达 47.3，浓度过高则
不利于酶的分配；在 PEG400浓度固定为 26％时，增加
(NH4)2SO4的浓度，糖化酶的分配系数也增大，这主要
是由于 (NH4)2SO4盐析作用影响增强的缘故，最适浓度
为 16％，过高也不好，酶蛋白会因盐析作用过强而产生
沉淀。
2005-3-21 33
? 体系中无机盐离子的影响
? 在 PEG/Dex中，无机盐离子在两相中也有不同的分
配 (见表 2-2)，因此在两相间形成电位差。由于各相要
保持电中性，这对带电生物大分子，如蛋白质和核酸
等的分配，产生很大的影响。
表 2-2 一些无机离子的分配系数
正离子 分配系数 K＋ 负离子 分配系数 K－
K＋ 0.824 I－ 1.42
Na＋ 0.889 Br－ 1.21
NH4＋ 0.92 Cl－ 1.12
Li＋ 0.996 F－ 0.912
2005-3-21 34
? 在体系中加入适当的盐类，会大大促进带相反电荷
的两种蛋白质的分离。
? 当 pH 6.9时，溶菌酶带正
电，卵蛋白带负电。
? 在 PEG/Dex体系中加入
NaCl,产生电位差，上
相电位小于下相电位，
导致带正电荷的溶菌酶
大量迁移到上相，其 K
值增大，而带负电荷的
卵蛋白迁移到下相，从
而使溶菌酶和卵蛋白得
以较好地分离。 图 2-10 加入 NaCl对卵蛋白和溶菌酶分配的影响
相系统,8％ Dex 500；
8％ PEG 4000，
0.5mmol／ L Na3PO4；
pH6.9
2005-3-21 35
? 体系 pH的影响
? pH会影响蛋白质中可离解基团的离解度，因而改变蛋
白质所带电荷和分配系数；另外,pH还影响系统缓冲
物质磷酸盐的离解程度，从而影响分配系数。
? pH微小的变化有时会使蛋白质的 K改变 2～ 3个数量级。
? 对一种特定的蛋白质，在不同盐系统中,pH和其分配
系数之间的关系应不同，而在等电点时，得到的均为
不带电时分子的分配系数。对不同的盐系统，其等电
点时的分配系数应相等，两条 pH和分配系数关系的曲
线必交于一点，该点所对应的 pH值即为该特定蛋白质
的等电点。根据这一原则测定蛋白质等电点的方法，
称为交错分配法 (Cross partitioning),如图 2-11所示。
2005-3-21 36
图 2-11 血清蛋白在两种盐系统中
分配系数 K 与 pH 的关系 (交错分配 )
2005-3-21 37
? 体系温度的影响
? 温度影响相图，同时影响分配率和蛋白质的生物活
性。一般地，临界点附近，温度对分配率的影响较
大，远离临界点时，影响较小。
? 在考虑温度对分配率的影响时，必须考虑到过程的
冷量消耗和分离过程中蛋白质的停留时间。由于亲
水聚合物的多元醇或多糖结构保护了蛋白质，蛋白
质在双水相中的稳定性增加，所以一般都可在室温
下操作。从省掉冷却系统的室温操作过程中各相前
后温度的变化可知，分离后上、下相的温度上升不
多，说明无冷却系统的室温操作是可行的。
2005-3-21 38
2.2.3 双水相萃取技术的应用
? 双水相萃取技术目前较多地应用于胞内酶的提取和
精制上。
? 用双水相萃取技术处理细胞匀浆液，既可方便地除
去细胞碎片，还可使酶得到精制。
? 要成功地运用双水相萃取方法，应满足下列条件
① 欲提取的酶和细胞碎片应分配在不同的相中；
② 酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时一
次萃取，就能得到较高的收率；
③ 两相用离心机很容易分离。
2005-3-21 39
? 在双水相体系中，通常将目的蛋白质分配在上相
(PEG),而细胞碎片分配在下相 (盐 )。
? 表 5-6中蛋白质在多数情况下收率能达到 90％；分配
系数 K在 2～ 20之间，一般能大于 3；很多杂蛋白也能
同时除去。 PEG／ 盐系统应用得很广泛，主要由于
PEG价格低廉以及该系统选择性。
? 萃取操作时单位重量相系统中匀浆液的加入量一般
每 1 kg萃取相系统以处理 200～ 400 g湿菌体为宜。
? 使用 PEG／ 盐系统提取胞内酶时，使细胞碎片分配
到下相中是比较容易的，如用 18%的 PEG 1550,7
％ 磷酸钾系统处理 20％湿细胞碎片时，细胞碎片能
全部转入下相 (盐相 )。
2005-3-21 40
图 2-12 三步萃取流程示意图
2005-3-21 41
? 分配在上相中的蛋白质可通过加入适量的盐 (有时也补
充适量的 PEG),进行第二次双水相萃取，目的是除
去核酸和多糖，它们的亲水性较强，因而易分配在盐
相中，蛋白质就停留在上相 PEG中
? 在第三次萃取中，应使蛋白质分配在盐相 (如调节 pH)，
以便和主体 PEG分离，色素因其憎水性而通常分配在
上相；盐相中的蛋白质可用超滤法弃除残余的 PEG，
主体 PEG可循环使用。
? 双水相萃取法另一优点为易于放大，分配系数 K值重
复性好，故可直接放大。下面以甲酸脱氢酶 (FDH)的
分步提取和纯化来进一步说明双水相在胞内酶提取中
的应用。
2005-3-21 42
图 2-13 连续萃取流程示意图
2005-3-21 43
2.2.4 双水相萃取技术的进展
? 进一步提高目的蛋白的纯度
? 目的物还含有少量的核酸和多糖，进一步提
高目的蛋白的纯度，可从双水相体系和萃取
操作方式两方面进行改进。
? 近年来发展起来的 PEG衍生物。如在 PEG上
引入亲和基团或离子基团,(CH3)3N＋ -PEG-
N＋ (CH3)3,ConA-PEG-ConA等。目的蛋白
的得率和纯度都有很大的提高。
? 可采用多级萃取。
2005-3-21 44
? 廉价双水相体系的开发
? 生物工程中得到应用的两种双水相体系，即高聚物／
高聚物和高聚物 /盐体系。两种体系比较见表 2-3。
表 2-3 两种双水相体系的比较
体系 优点 缺点
PEG/dextran 盐浓度低, 活性损失小 价格贵, 粘度大, 分相困难
PEG/盐 成本低、粘度小 盐浓度高，活性损失大，界面吸附多
? 从表可见，高聚物 /高聚物体系对活性物质变性作用小，
界面吸附少，但价格高。因而寻找廉价的高聚物 /高聚
物双水相体系是双水相萃取技术应用的一个重要发展
方向。
2005-3-21 45
? 目前比较成功的是用变性淀粉 PPT
（ hydroxypropyl derivative of starch）代替昂
贵的 Dextran。
? PPT/PEG体系比 PEG/盐体系稳定。和
PEG/dextran体系相图非常相似：
①蛋白质溶解度大。蛋白质在 PPT浓度到 15％以
前没有沉淀，而在 PEG浓度大于 5％时，溶解
度显著地减小。
②粘度小。 PPT的动力粘度只是粗 Dextran的 1/2，
因而可以大大改善传质效果。
③价格便宜。
2005-3-21 46
? 双水相萃取技术同其他分离技术结合
① 双水相体系同生物转化相结合
? 将双水相萃取同生物转化结合在一起，可解决
在许多生物转化中存在的两个问题：一是由于
双水相体系对菌体及酶没有毒性，同时又可将
产物萃入上相，所以可消除产物抑制效应；二
是使分布在下相的细胞 (酶 )循环使用，从而为
固定化细胞及酶的应用开辟了新路。
② 双水相萃取同膜分离技术结合
? 可解决双水相体系容易乳化和生物大分子在两
相界面的吸附等问题并能加快萃取速率。
2,萃取分离
? 基本概念
? 2.1 有机溶剂萃取
? 2.2 双水相萃取
? 2.3 反胶团萃取
? 2.4 超临界流体萃取
2005-3-21 2
基本概念
? 萃取 extraction 是利用液体或超临界流体为溶
剂提取原料中目标产物的分离纯化操作。
? 萃取剂 extractant 萃取分离中的流体。
? 有机溶剂萃取 organic solvent extraction,简
称 溶剂萃取 solvent extraction
? 液固萃取或浸取 leaching
? 超临界流体萃取 supercritical fluid extraction
? 双水相萃取 aqueous two-phase extraction
? 反胶团萃取 reversed micelle extraction
? 液膜萃取
2005-3-21 3
基本概念
? 反萃取 back extraction 为进一步纯化目标产物，
在溶剂萃取分离过程中，调节水相条件，将目标产
物从有机相转入水相的萃取操作。
? 物理萃取 溶质根据相似相溶的原理在两相间达到分
配平衡而进行萃取的分离过程。
? 化学萃取 利用脂溶性萃取剂与溶质之间发生化学反
应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相分配的过
程。萃取剂与溶质之间的化学反应包括离子交换和
络合反应等。
? 化学萃取中通常用煤油、己烷、四氯化碳和苯等有机溶剂溶
解萃取剂，改善萃取相的物理性质，此时的有机溶剂称为 稀
释剂 diluent 。
2005-3-21 4
2.1 溶剂萃取
? 分配定律
? 在溶剂萃取过程中，将供提取的溶液称为料液；从料
液中待提取的物质称为溶质；用来萃取目的产物的溶
剂称为 萃取剂 ；溶质转移到萃取剂中与萃取剂形成的
溶液称为 萃取液 ；被萃取出溶质后的料液称 萃余液 。
? 平衡时溶质在两相中的浓度之比为一常数 K,即：
K ＝ 萃取相浓度 /萃余相浓度 ＝ c1／ c2 (2-1)
常温下 K为常数, c的单位通常用 mol/L或 U/ml。
? 式 (2-1)应用条件,(1)稀溶液； (2)溶质对溶剂之互溶
度没有影响； (3)必须是同一种分子类型, 即不发生
缔合或离解 。
2005-3-21 5
? 弱酸或弱碱性溶质还要考虑弱电解质在水相中的电
离平衡。如 penicillin是一类弱酸，在水中会有一部分
离解成负离子 (P·COO－ ),在萃取相乙酸丁酯等有机
相中则仅以游离酸分子 (P·COOH)的形态存在。
? 两相中的游离酸分子的分配平衡用分配系数 K0表征
? 电离平衡用电离常数 KP来表征。
图 2-1 青霉素的分配平衡与电离平衡
2005-3-21 6
? K0和 KP是客观存在的，但一般测定得到的是
[P·COOH＋ P·COO－ ]的总浓度 c2,在这种情
况下，
c1／ c2＝ K
这里的 K称之为表观分配系数。而 K和 K0、
KP的关系式可经理论推导如下：
K＝ K0[H＋ ]／ (Kp＋ [H＋ ]) (弱酸 ) (2-2)
K＝ K0Kp／ (Kp＋ [H＋ ]) (弱碱 ) (2-3)
? 由此可见，溶质在不互溶两相中的分配不仅
与本身的性质 (决定 KP),萃取溶剂 (决定 K0)有
关，也与水相的 pH有关。
2005-3-21 7
? 分离因数
? 若原来的料液中除溶质 A以外，还含有溶质 B,则由
于 A,B的分配系数不同,A和 B就得到了一定程度的
分离。如 A的分配系数较 B大，这样萃取剂对溶质 A和
B分离能力的大小可用分离因数 β来表征：
β＝ (c1A/c1B)／ (c2A/c2B)＝ (c1A/c2A)／ (c1B/c2B)
＝ KA／ KB (2-4)
下标 1,2分别代表萃取相和萃余相, A,B为溶质
如果 A是产物, B为杂质, 分离因数可写为：
β ＝ K产 ／ K杂
β越大, A,B的分离效果越好, 即产物与杂质越容
易分离 。
2005-3-21 8
? 水相条件的影响
? 由于产物所在的水相中往往还存在与产物性质
相近的杂质、未完全利用的底物、无机盐、其
他营养成分等。必须考虑这些物质对萃取过程
的影响。
(1) pH值
? 根据式 (2-2),(2-3)可见,pH值直接影响表观
分配系数。 pH除影响 K外，还可能对选择性有
影响。如青霉素在 pH 2萃取时，乙酸丁酯萃取
液中青霉烯酸可达青霉素含量的 12.5％，而在
pH 3的条件下萃取，则可降低至 4％。另外，
pH值还应尽量选择在使产物稳定的范围内。
2005-3-21 9
(2) 温度
? 温度会影响生化物质的稳定性。
? 影响分配系数 K。
(3) 盐析
? 无机盐类如硫酸铵、氯化钠等一般可降低产物
在水中的溶解度而使其更易于转入有机溶剂相
中，另一方面还能减小有机溶剂在水相中的溶
解度。如提取维生素 B12时，加入硫铵，可促使
维生素 B12自水相转移到有机相中；提取青霉素
时加入 NaCl,也有利于青霉素从水相转移到有
机溶剂相中。
2005-3-21 10
(4) 带溶剂
? 为提高分配系数 K,常添加带溶剂。 带溶剂 是指能和
产物形成复合物，促使产物更易溶于有机溶剂相中，
在一定条件下又要容易分解的物质。
? 青霉素作为一种酸，可用脂肪碱作为带溶剂。青霉素
能和正十二烷胺、四丁胺等形成复合物而溶于氯仿中。
这样萃取收率能够提高，且可以在较有利的 pH范围
内操作。这种正负离子结合成对的萃取，也称为 离子
对萃取 。
? 柠檬酸在酸性条件下，可与磷氧键类萃取剂如磷酸三
丁酯 (TBP)形成中性络合物而进入有机相
(C6H8O7·3TBP·2H2O),这种形成络合物的萃取称为
反应萃取 。
2005-3-21 11
? 萃取方式和理论收得率
? 工业上萃取操作通常包括三个步骤：
混合 — 分离 — 溶剂回收
? 因而工业萃取的流程中须有混合器 (如搅拌混
合器 )、分离器 (如碟片式离心机 )和溶剂回收装
置 (如蒸馏塔 )。混合萃取和分离也可在同一台
设备内完成。
? 一般萃取过程很快，如果接触表面足够大，则
在 15~60 s之内就可完成。
? 萃取操作流程可分为单级萃取和多级萃取。
2005-3-21 12
? 单级萃取
? 如图 2-2所示。
图 2-2 单级萃取流程图
2005-3-21 13
? 萃取操作理论收得率的计算须符合以下两个假定：
① 萃取相和萃余相很快达到平衡
② 两相完全不互溶，在分离器中能完全分离。
? 设 K为分配系数,VF为料液体积,VS为萃取剂体积,E
为 萃取因子 (extraction factor)即萃取平衡后，溶质在萃
取相与萃余相中质量的比值，则：
E＝ K·VS／ VF＝ K／ m (2-5)
? 式中 m＝ VF／ VS＝ 料液体积／萃取剂体积
? 令未被萃取的体积分数为 φ,则：
φ＝ 1／ (E＋ 1) (2-6)
? 而理论收得率为：
1－ φ＝ E／ (E＋ 1) (2-7)
2005-3-21 14
? 多级萃取
? 为提高收率常常采用多级萃取，多级萃取又有多级逆
流萃取和多级错流萃取流程，如图 2-3和图 2-4所示。
图 2-3 多级错流萃取流程
图 2-4 多级逆流萃取流程
2005-3-21 15
? 由理论推导，经 n级萃取后，两种多级萃取流程的产物
收率分别为：
? 多级错流萃取流程：
1－ φ＝ 1－ [1／ (E1＋ 1)(E2＋ 1)…(E n＋ 1)] (2-8)
? 多级逆流萃取流程：
1－ φ＝ (En＋ 1－ E)／ (En＋ 1－ 1) (2-9)
图 2-5 三级逆流萃取设备流程
2005-3-21 16
? 例 1,赤霉素在 10℃, pH值 2.5时的分配系数 (乙酸
乙酯／水 )为 35，用等体积乙酸乙酯单级萃取一次
问理论收得率为多少？
? 解 1,E＝ 35× 1／ 1＝ 35
理论收得率 1－ φ ＝ 35／ (35＋ 1)＝ 97.2％
? 例 2,赤霉素二级错流萃取时，第一级用 1/2体积
乙酸乙酯，第二级用 1/10体积乙酸乙酯，问理论收
得率为多少？
? 解 2,E1＝ 35／ 2＝ 17.5 E2＝ 35／ 10＝ 3.5
理论收得率 1－ φ ＝ 1－ 1／ [(17.5＋ 1)× (35＋ 1)]
＝ 98.79％
2005-3-21 17
? 多级错流萃取由于溶剂分别加入各级萃取器，故萃
取推动力较大，萃取效果较好。缺点是需加入大量
的溶剂，因而产品浓度稀，需消耗较多的能量回收
溶剂。
? 例 3,赤霉素进行二级逆流萃取，乙酸乙酯用量为
1/2体积，问理论收得率为多少？
? 解 3,E＝ 35／ 2＝ 17.5 n＝ 2
理论收得率 1－ φ ＝ [17.53－ 17.5]／ [17.53－ 1]
＝ 99.7％
? 由上可见三种萃取过程中，以逆流萃取收率最高，
溶剂用量最少。因而也是工业上普遍采用的流程。
2005-3-21 18
5.2 双水相萃取
? 过滤和离心依赖于被分离颗粒的尺寸或密度的差异，
当希望收集微生物的细胞器、分离去除细胞碎片、提
取和浓缩胞内物质时，普通的过滤和离心技术就显得
力不从心了。
? 溶剂萃取法难于应用于蛋白质分离。
? 值得注意的是溶液的分相不一定完全依赖于有机溶剂，
在一定条件下，水相也可以形成两相甚至多相。于是
有可能将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个
水相转移到另一水相中，从而完成分离任务。
2005-3-21 19
? 1896年 Beijerinck观察到当把明胶与琼脂或把明胶和
可溶性淀粉的水溶液混合时，先得到一混浊不透明
的溶液，随后分成两相，上相含有大部分明胶，下
相含有大部分琼脂 (或可溶性淀粉 )。再如图 2-6中，
2.2％的葡聚糖水溶液与等体积的 0.72％甲基纤维素
钠的水溶液相混合并静置后，可得到两个粘稠的液
层。
图 2-6 葡聚糖与甲基纤维素钠的双水相体系
2005-3-21 20
? 上述现象称为聚合物的 不相溶性
(incompatibility)。 如果多种不相溶的聚合物混
在一起，就可得到多相体系，如硫酸葡聚糖、
葡聚糖、羟丙基葡聚糖和聚乙二醇相混时，可
形成四相体系。
? 聚合物的不相溶性主要是由于聚合物分子的空
间阻碍作用，相互间无法渗透，当聚合物的浓
度达到一定值时，就不能形成单一的水相，所
以具有强烈的相分离倾向。
? 某些聚合物的溶液与某些无机盐的溶液相混合
时，只要浓度达到一定值，也会形成两相，即
聚合物 -盐双水相体系，成相机理尚不清楚，
一种解释为“盐析”作用。
2005-3-21 21
? 某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后
可形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即
形成 双水相系统 (two aqueous phase system)。 利
用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性
质,Albertsson于 50年代后期开发了 双水相萃取法
(two aqueous phase extraction),又称 双水相分配
法 (two aqueous phase partitioning)。
? 70年代以后,Kula,Hustedt和 Johansson等发展了
双水相萃取技术在生物分离过程中的应用，为蛋白
质特别是胞内蛋白质的分离与纯化开辟了新的途径。
? 现在的研究已涉及到酶、核酸、生长激素、病毒等
各种物质的分离和提纯。
2005-3-21 22
2.2.1 双水相分离理论
? 双水相体系
? 广泛应用的双水相体系是聚乙二醇 (PEG)/葡聚糖
(Dex)体系。
? 聚合物与无机盐的混合溶液，例如,PEG/磷酸钾,
PEG/磷酸铵,PEG/硫酸钠等常用于生物产物的双
水相萃取。
? 分离某一生物大分子，两相系统的选择原则，必须
有利于目的物的萃取和分离，同时又要兼顾到聚合
物的物理性质。如甲基纤维素和聚乙烯醇，因其粘
度太高而限制了它们的应用。 PEG和 Dex因其无毒
性和良好的可调性而得到广泛应用。
2005-3-21 23
? 相图
? 双水相的形成条件和定量关系常用相图表示，图 2-7是
PEG／ Dex体系的相图。 TCB称为 双节线 (binodal),双
节线以上的区域为
两相区。上相组成用
T(Top)表示，下相组
成用 B(Bottom)表示。
? 连接 T,B两点的线段
TB称为 系线 (tie line)，
系线上各点处系统的
总浓度不同，但均分
成组成相同而体积不
同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则。
图 2-7 PEG／ Dex体系相图
2005-3-21 24
? 如点 M为整个系统的组成，该系统实际上由 T,B所
代表的两相组成,vT表示上相体积,vB表示下相体积，
则：
vT／ vB＝ BM／ MT (2-10)
? 系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度, 系线越
长, 两相间的性质差别越大 。 当点 M向下移动时, 系
线长度缩短, 两相差别减小, 到达 C点时, 系线长度
为 0,两相间差别消失而成为一相, 因此 C点为 系统
临界点 (critical point)。
? 双节线的位置和形状与聚合物的相对分子质量有关 。
聚合物 Dex的相对分子质量越高, 相分离所需的浓度
越低；两种聚合物相对分子质量相差越大, 双节线
的形状越不对称, 见图 2-8。
2005-3-21 25
PEG的相对分子质量固
定 (PEG6000)而 Dex的相
对分子质量如下：
1.D5 (Mn2800,Mr3400)
2.D17(Mn23000,Mr30000)
3.D24(Mn23000)
4.D37(Mn88000,Mr179000)
5.D43(Mn180000,Mr460000)
6.D170(Mn630000，
Mr2200000)
Mn— 数均分子量
Mr— 重均分子量
图 2-8 PEG／ Dex体系的双节线和临界点
2005-3-21 26
? 物质在两相中的分配
? 和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系
数 K表示。
K ＝ cT／ cB
式中 cT,cB分别代表上相, 下相中溶质的浓度 。
? K与温度, 压力以及溶质和溶剂的性质有关, 与溶质
的浓度无关 。
? 影响分配系数的主要因素, 可用 Gerson公式表示：
－ lgK＝ A Δγ＋ δΔφ＋ β (2-11)
式中 A—— 表面积； Δγ—— 两相表面自由能之差
δ—— 电荷数； Δφ—— 电位差； β—— 标准化学位和活
度系数等组成的常数
2005-3-21 27
? 表面自由能可用来量度表面的相对憎水性，改变
成相聚合物的种类。聚合物的平均分子量和相对
分子质量分布，都能影响相的疏水性。
? 一般地，大分子的表面积 A都很大,Δγ的微小变
化都会引起蛋白质大分子的分配系数产生很大变
化；加入系统的盐，以及体系的 pH会影响相间电
位差 Δφ和蛋白质所带的电荷数 δ,因而也对分配
系数产生大的影响。
? 由于影响分配系数的因素很多，加上各因素间又
互相影响，因此定量地将蛋白质的一些分子性质
与分配系数关联起来是困难的，最佳的双水相操
作条件还得依靠实验来获得。
2005-3-21 28
2.2.2 影响分配平衡的参数
? 影响物质分配的因素主要有：
? 聚合物及成相盐的种类及浓度
? 聚合物的平均分子量
? 体系的 pH值及其他盐的种类及浓度
? 菌体或细胞的种类及含量、体系温度等。
2005-3-21 29
? 聚合物及其分子量的影响
? 不同聚合物，水相系统显示不同的疏水性，水
溶液中聚合物的疏水性依下列次序递增：葡萄
糖硫酸盐＜甲基葡萄糖＜葡萄糖＜羟丙基葡聚
糖＜甲基纤维素＜聚乙烯醇＜聚乙二醇＜聚丙
三醇，这种疏水性的差别对目的产物与相的相
互作用是重要的。
? 同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加，其
大小的选择依赖于萃取过程的目的方向，若想
在上相获得较高的蛋白质收率，对于 PEG/盐
系统，应降低 PEG聚合物的平均分子量，相
反，若想在下相获得较高的蛋白质收率则平均
分子量应增加。
2005-3-21 30
? 双水相萃取糖化酶的结果 (见表 5-4) 表明,PEG平均
分子量增大，分配系数减少。当分子量为 400时,K＞
1,酶主要分布于上相，当分子量大于 400时,K＜ 1，
酶主要分布于下相。主要原因是随着 PEG分子量的增
大，其端基数目减小，因而疏水性增加，使糖化酶在
上相的表面张力增大，而使 λ＜ 0,从而转入下相，为
了使酶分布于上相，应选用分子量为 400的 PEG。
表 2-1 PEG平均分子量对分配平衡的影响
系统 K 相体积 产率％
PEG400 (31.36％ )— (NH4)2SO4 (14.05％ ) 6.28 4.75 96.8
PEG1000 (21.77％ )— (NH4)2SO4 (12.76％ ) 0.26 3.0 43.5
PEG4000 (12.67％ )— (NH4)2SO4 (12.14％ ) 0.30 4.1 59.8
PEG6000 (15.76％ )— (NH4)2SO4 (12.34％ ) 0.03 1.2 2.1
2005-3-21 31
? 在 PEG/Dex双水相系统中,PEG分子量的减少，会
使蛋白质的 K值明显增大，如图 5-13。
? Dex水解程度的不同，对 K值也有一定的影响。
○普鲁兰酶
(12％ PEG,1％ DexT 500，
100mmol／ L Na3PO4,pH7.5)
□ 1,4-α -葡聚糖磷酸酶
(9.3％ PEG,7％ DexT 500，
50mmol／ L Na3PO4,pH7.8)
● 亮氨酰基 -tRNA合成酶
9.2％ PEG,6.3％ DexT 500，
73mmol／ L Na3PO4,pH7.8)
图 2-9 PEG平均分子量对分配率的影响
2005-3-21 32
? 系线长度对分配平衡的影响
? 相图中系线长度由组成的总浓度决定，在临界点附近，
系线长度趋向于零，上相和下相的组成相同，因此，分
配系数应该是 1，随着聚合物和成相盐浓度增大，系线
长度增加，上相和下相相对组成的差别就增大，产物如
酶在两相中的表面张力差别也增大，这将会极大地影响
分配系数，使酶富集于上相。
? 仍以 PEG— (NH4)2SO4系统双水相萃取糖化酶为例，增
加 PEG400的浓度有利于酶在上相的分配，当 PEG400
浓度在 25％～ 27％时，分配系数高达 47.3，浓度过高则
不利于酶的分配；在 PEG400浓度固定为 26％时，增加
(NH4)2SO4的浓度，糖化酶的分配系数也增大，这主要
是由于 (NH4)2SO4盐析作用影响增强的缘故，最适浓度
为 16％，过高也不好，酶蛋白会因盐析作用过强而产生
沉淀。
2005-3-21 33
? 体系中无机盐离子的影响
? 在 PEG/Dex中，无机盐离子在两相中也有不同的分
配 (见表 2-2)，因此在两相间形成电位差。由于各相要
保持电中性，这对带电生物大分子，如蛋白质和核酸
等的分配，产生很大的影响。
表 2-2 一些无机离子的分配系数
正离子 分配系数 K＋ 负离子 分配系数 K－
K＋ 0.824 I－ 1.42
Na＋ 0.889 Br－ 1.21
NH4＋ 0.92 Cl－ 1.12
Li＋ 0.996 F－ 0.912
2005-3-21 34
? 在体系中加入适当的盐类，会大大促进带相反电荷
的两种蛋白质的分离。
? 当 pH 6.9时，溶菌酶带正
电，卵蛋白带负电。
? 在 PEG/Dex体系中加入
NaCl,产生电位差，上
相电位小于下相电位，
导致带正电荷的溶菌酶
大量迁移到上相，其 K
值增大，而带负电荷的
卵蛋白迁移到下相，从
而使溶菌酶和卵蛋白得
以较好地分离。 图 2-10 加入 NaCl对卵蛋白和溶菌酶分配的影响
相系统,8％ Dex 500；
8％ PEG 4000，
0.5mmol／ L Na3PO4；
pH6.9
2005-3-21 35
? 体系 pH的影响
? pH会影响蛋白质中可离解基团的离解度，因而改变蛋
白质所带电荷和分配系数；另外,pH还影响系统缓冲
物质磷酸盐的离解程度，从而影响分配系数。
? pH微小的变化有时会使蛋白质的 K改变 2～ 3个数量级。
? 对一种特定的蛋白质，在不同盐系统中,pH和其分配
系数之间的关系应不同，而在等电点时，得到的均为
不带电时分子的分配系数。对不同的盐系统，其等电
点时的分配系数应相等，两条 pH和分配系数关系的曲
线必交于一点，该点所对应的 pH值即为该特定蛋白质
的等电点。根据这一原则测定蛋白质等电点的方法，
称为交错分配法 (Cross partitioning),如图 2-11所示。
2005-3-21 36
图 2-11 血清蛋白在两种盐系统中
分配系数 K 与 pH 的关系 (交错分配 )
2005-3-21 37
? 体系温度的影响
? 温度影响相图，同时影响分配率和蛋白质的生物活
性。一般地，临界点附近，温度对分配率的影响较
大，远离临界点时，影响较小。
? 在考虑温度对分配率的影响时，必须考虑到过程的
冷量消耗和分离过程中蛋白质的停留时间。由于亲
水聚合物的多元醇或多糖结构保护了蛋白质，蛋白
质在双水相中的稳定性增加，所以一般都可在室温
下操作。从省掉冷却系统的室温操作过程中各相前
后温度的变化可知，分离后上、下相的温度上升不
多，说明无冷却系统的室温操作是可行的。
2005-3-21 38
2.2.3 双水相萃取技术的应用
? 双水相萃取技术目前较多地应用于胞内酶的提取和
精制上。
? 用双水相萃取技术处理细胞匀浆液，既可方便地除
去细胞碎片，还可使酶得到精制。
? 要成功地运用双水相萃取方法，应满足下列条件
① 欲提取的酶和细胞碎片应分配在不同的相中；
② 酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时一
次萃取，就能得到较高的收率；
③ 两相用离心机很容易分离。
2005-3-21 39
? 在双水相体系中，通常将目的蛋白质分配在上相
(PEG),而细胞碎片分配在下相 (盐 )。
? 表 5-6中蛋白质在多数情况下收率能达到 90％；分配
系数 K在 2～ 20之间，一般能大于 3；很多杂蛋白也能
同时除去。 PEG／ 盐系统应用得很广泛，主要由于
PEG价格低廉以及该系统选择性。
? 萃取操作时单位重量相系统中匀浆液的加入量一般
每 1 kg萃取相系统以处理 200～ 400 g湿菌体为宜。
? 使用 PEG／ 盐系统提取胞内酶时，使细胞碎片分配
到下相中是比较容易的，如用 18%的 PEG 1550,7
％ 磷酸钾系统处理 20％湿细胞碎片时，细胞碎片能
全部转入下相 (盐相 )。
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图 2-12 三步萃取流程示意图
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? 分配在上相中的蛋白质可通过加入适量的盐 (有时也补
充适量的 PEG),进行第二次双水相萃取，目的是除
去核酸和多糖，它们的亲水性较强，因而易分配在盐
相中，蛋白质就停留在上相 PEG中
? 在第三次萃取中，应使蛋白质分配在盐相 (如调节 pH)，
以便和主体 PEG分离，色素因其憎水性而通常分配在
上相；盐相中的蛋白质可用超滤法弃除残余的 PEG，
主体 PEG可循环使用。
? 双水相萃取法另一优点为易于放大，分配系数 K值重
复性好，故可直接放大。下面以甲酸脱氢酶 (FDH)的
分步提取和纯化来进一步说明双水相在胞内酶提取中
的应用。
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图 2-13 连续萃取流程示意图
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2.2.4 双水相萃取技术的进展
? 进一步提高目的蛋白的纯度
? 目的物还含有少量的核酸和多糖，进一步提
高目的蛋白的纯度，可从双水相体系和萃取
操作方式两方面进行改进。
? 近年来发展起来的 PEG衍生物。如在 PEG上
引入亲和基团或离子基团,(CH3)3N＋ -PEG-
N＋ (CH3)3,ConA-PEG-ConA等。目的蛋白
的得率和纯度都有很大的提高。
? 可采用多级萃取。
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? 廉价双水相体系的开发
? 生物工程中得到应用的两种双水相体系，即高聚物／
高聚物和高聚物 /盐体系。两种体系比较见表 2-3。
表 2-3 两种双水相体系的比较
体系 优点 缺点
PEG/dextran 盐浓度低, 活性损失小 价格贵, 粘度大, 分相困难
PEG/盐 成本低、粘度小 盐浓度高，活性损失大，界面吸附多
? 从表可见，高聚物 /高聚物体系对活性物质变性作用小，
界面吸附少，但价格高。因而寻找廉价的高聚物 /高聚
物双水相体系是双水相萃取技术应用的一个重要发展
方向。
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? 目前比较成功的是用变性淀粉 PPT
（ hydroxypropyl derivative of starch）代替昂
贵的 Dextran。
? PPT/PEG体系比 PEG/盐体系稳定。和
PEG/dextran体系相图非常相似：
①蛋白质溶解度大。蛋白质在 PPT浓度到 15％以
前没有沉淀，而在 PEG浓度大于 5％时，溶解
度显著地减小。
②粘度小。 PPT的动力粘度只是粗 Dextran的 1/2，
因而可以大大改善传质效果。
③价格便宜。
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? 双水相萃取技术同其他分离技术结合
① 双水相体系同生物转化相结合
? 将双水相萃取同生物转化结合在一起，可解决
在许多生物转化中存在的两个问题：一是由于
双水相体系对菌体及酶没有毒性，同时又可将
产物萃入上相，所以可消除产物抑制效应；二
是使分布在下相的细胞 (酶 )循环使用，从而为
固定化细胞及酶的应用开辟了新路。
② 双水相萃取同膜分离技术结合
? 可解决双水相体系容易乳化和生物大分子在两
相界面的吸附等问题并能加快萃取速率。
