4,色谱分离
Chromatographic resolution
也称色谱法 （ chromatography）
色谱分离是分离科学的一次革命。
主要内容
4.1 概述
4.2 色谱分离的分类
4.3 生物工程中的色谱分离
4.4 色谱分离的基本理论
4.5 吸附色谱
4.6 离子交换色谱
4.7 分配色谱
4.8 凝胶色谱
4.9 高速逆流色谱
4.10 径向色谱分离法
4.11 连续环状色谱分离法
4.1 概述
4.1.1 色谱法的定义
4.1.2 色谱法的发展简史
4.1.3 色谱法的特点
4.1.1 色谱法的定义
? 色谱法 chromatography
? 是利用混合物中各组分在两相中分配系数不
同，当流动相推动样品中的组分通过固定相
时，在两相中进行连续反复多次分配，从而
形成差速移动，达到分离的方法。
①凡是色谱分离都具有 stationary phase和
mobile phase 。
②固定相是不动的，流动相对固定相作相对的
运动。
③被分离的组分与流动相和固定相有不同的作
用力。这种作用力有吸附力，溶解力,离子
交换能力等。在色谱分析中常用分配系数来描
述组分对流动相和固定相的作用力的差别：
K= Cs/Cm
分配系数的差异是色谱分离的根本原因 。
4.1.2 色谱法的发展史
? 色谱法的诞生
? 常见的分离方式如过滤、蒸馏、沉淀、结晶、离
心、萃取、膜分离等在分离复杂的混合物时就显
得力不从心了。
? 1903年,M,C,Tswett
进行了分离植物叶中各
种色素的实验。创立了
色谱法。
It is very instructive to observe the adsorption
phenomena during filtration through a powder.
First a colourless,then a yellow （ carotene） liquid
flows out from the bottom of the funnel,while a
bright green ring forms at the top of the inulin
column,below which a yellow ring soon appears.
On subsequent washing of the inulin column with
pure ligroin,both rings,the green and the yellow,
are considerably widened and move down the
column.
M.S,Tswett
Tr,Varshav,Obshch,Estestvoispyt.,Otd,Biol.,
14 （ 1903） 20
? 然而，在 20多年时间里，他的新分离方法并没有受
到科学界的重视。其中一个重要原因是德国著名化
学家 R,Willst?tter对色谱法的排斥和不信任。
? Willst?tter（ 1915年获诺贝尔化学奖获得者） 1913年
在其名著“叶绿素的研究”中，称色谱法是一种
“离奇的方法”，认为它不适用于制备工作，在吸
附过程中，试样组分可能发生化学变化。他写道：
,色谱法只能在试样很少的情况下使用，似乎不适
合于制备目的 ……,
? Willst?tter的观点，即过分强调制备工作，也反映出
当时有机化学家的一种普遍态度。因此，茨维特的
技术是超越其时代的。
? 1930年 12月，奥地利 22岁研究生 E,Lederer
到海得堡 R,Kuhn领导的化学研究所研究类
胡萝卜素。他对文献进行了仔细考察，从文
献中了解到茨维特的色谱技术。在 Kuhn的
指导下，他用碳酸钙作吸附剂，在一小色柱
中，成功地 分离了 ?-,?-,?-胡萝卜素,并
发表了三篇论文，公布了他们的研究成果。
这标志着色谱法的复兴。
? Karrer在 1937年,Kuhn在 1938年,Ruzicka在
1939年相继获诺贝尔化学奖。从此以后，色
谱法得到普遍的公认，成为最有效的分离提
纯手段。
? 色谱法的发展
? 1931年,Kuhn,Lederer用氧化铝和碳酸钙分
离了 ?-,?-,?-胡萝卜素后才引起重视。
Tswett的方法是借助于各组分在固定相中吸附
能力的强弱不同而进行分离的，称为 吸咐色谱
adsorption chromatography。
? 1935年,Adams和 Holmes 合成了离子交换树
脂，并用于色谱分离，从而诞生了离子交换色
谱法。
? 1941年 A,J,P,Martin和 R,L,M,Synge发明了
分配色谱法（ partition chromatography） 。
1952年获诺贝尔化学奖。
Archer John Porter Martin Richard Laurence Millington Synge
? 1941年 Martin和 Synge提出用气体代替液体作流
动相的可能性。
? 1952年 James和 Martin发表了从理论到实践比较
完整的 气液色谱法 gas-liquid chromatography。
? 1957年 Golay开创了开管柱气相色谱法 open-
tubular column chromatography,即 毛细管柱
气相色谱法 capillary column chromatography。
? 1956年 Van Deemter等在前人研究的基础上发
展了描述色谱过程的速率理论。
? 1965年 Giddings总结和发展了前人的色谱理论 。
? 1944年 R,Consden,A,H,Gorden和 Martin等发
展了 纸色谱 。
? 1949年 Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合剂
制作薄层板使 薄层色谱法（ thin layer
chromatography） 得以实际应用,1956年 E,
Stahl对 TLC的标准化、规范化及应用面做了大
量工作并 开发出薄层色谱板涂布器之后，才使
TLC得到广泛地应用。
? 1959年 Porath和 Flodin提出了 凝胶色谱法 （ gel
chromatography ） 。
? 1967年 Porath,Axen和 Ernback成功地创立了 亲
和色谱法 （ affinity chromatography ） 。
? 20世纪 60年代初,Giddings将气 -液色谱理论用
于液 -液色谱，同时 把高压泵和化学键合固定相
用于液相色谱,于 60年代末出现了 高效液相色
谱 （ HPLC） 。
? 20世纪 80年代初毛细管 超临界流体色谱 （ SFC）
得到发展,90年代未得到较广泛的应用。
? 20世纪 80年代初由 Jorgenson等集前人经验而
发展起来的 毛细管电泳 （ Capillary
electrophoresis,CE）,在 90年代得到广泛的
发展和应用。
? 同时集 HPLC和 CE优点的 毛细管电色谱 在 20世纪
90年代后期受到重视。
4.1.3 色谱法的特点
? 分离效率高
? 可选操作参数多
? 应用范围广
? 高灵敏度的在线检测快速
? 分离与过程自动化操作
4.2 色谱分离的分类
? 按分离机理不同分类
? 按固定相及流动相的状态分类
? 按固定相形状分类
? 其他分类方法
4.2.1 按分离机理不同分类
? 吸附色谱
? Adsorption chromatography,AC是指混合物随
流动相通过固定相 （ 吸附剂 ） 时，由于固定相
对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方
法。
? 吸附作用力可以是 物理吸附作用,也可以是 化
学吸附作用 。物理吸附的特点是选择性低，吸
附速度较快，吸附过程可逆；化学吸附的特点
是有一定选择性，吸附速度较慢，不易解吸。
物理吸附和化学吸附可以同时发生，在一定条
件下也可以互相转化。
? 吸附色谱是各种色谱分离技术中应用最早的
一类，传统的吸附色谱以各种无机材料为吸
附剂。
? 在此基础上发展起来的新的吸附色谱技术，
如 疏水作用色谱 （ hydrophobic interaction
chromatography,HIC）, 金属螯合作用色谱
（ metal chelation chromatography,MCC）
和 共价作用色谱 （ covalent interaction
chromatography,CIC） 等，所用吸附剂一般
为有机基质并通过化学修饰后制成，它们都
有比较明确的作用机理，即 疏水作用, 螯合
作用 和 共价作用 。
? 离子交换色谱
? 离子交换色谱 （ ion exchange
chromatography,IEC） 是基于离子交换原理
进行的色谱分离。广泛用于生物大分子的分离
纯化中。
? 亲和色谱
? 亲和色谱 （ affinity chromatography,AFC）
是将与目的产物具有特异亲和力的生物分子固
定化后作为固定相从混合物中分离目的产物的
过程。
? 亲和作用是特殊的吸附作用。
? 分配色谱
? Distribution chromatography,DC又称为液液
色谱，其原理是利用混合物中各物质在两液相
中的分配系数不同而分离。
? 分配色谱可分为 正相色谱 （ normal phase
chromatography,NPC） 和 反相色谱
（ reversed phase chromatography,RPC） 。
? 离子对色谱 ion-pair chromatography。
? 凝胶色谱
? 凝胶色谱 （ gel chromatography,GC）以凝胶
为固定相，是一种根据各物质分子大小不同而
进行分离的色谱技术，因而又称为分子筛色谱
（ molecular sieve chromatography,MSC）；
空间排阻色谱 （ size exclusion
chromatography,SEC）。
? 凝胶色谱分为两大类,凝胶过滤色谱 （ gel
filtration chromatography,GFC）和 凝胶渗透
色谱 （ gel permeation chromatography，
GPC） 。
? 电色谱
? 电色谱 （ electrochromatography） 是电泳和
液相色谱的融合技术 。 所谓电色谱是采用电渗
流来推动流动相, 使得峰扩展只与溶质扩散系
数有关, 因而使电色谱的理论塔板数远远高于
液相色谱 。 同时由于引入了高效液相色谱的固
定相, 使电色谱具备了高效液相色谱固定相所
具有的选择性, 使它不仅能分离带电物质 。 也
能分离中性化合物 。
4.2.2 按固定相及流动相的状态分类
? 气相色谱 GC
? 气相色谱 （ gas chromatography,GC） 仅限于
能够气化的物质，且主要用于分析。气相色谱
包括 气液色谱 GLC,气固色谱 GSC。
? 液相色谱 LC
? 液相色谱 （ liquid phase chromatography，
LPC） 可分为液液色谱 LLC,液固色谱 LSC。
? 超临界流体色谱
? 超 临 界 流 体 色 谱 （ supercritical fluid
chromatography,SFC） 是 20世纪 80年代中期
发展起来的一种新的色谱分离技术, 其流动相
为超临界流体 。
4.2.3 按固定相形状分类
? 柱色谱 （ column chromatography）
? 平面色谱 （ planar chromatography）
? 纸上层析 （ paper chromatography ）
? 薄层色谱 （ thin layer chromatography）
4.2.4 其他分类方法
? 按使用领域不同对色谱仪的分类
1,分析用色谱仪
? 又可分为实验室用色谱仪、在工业生产流程中
为在线连续使用的色谱仪和便携式色谱仪。
2,制备用色谱仪
? 又可分为实验室用制备型色谱仪和工业用大型
制造纯物质的制备色谱仪。制备型色谱仪可以
完成一般分离方法难以完成的纯物质制备任务，
如纯化学试剂的制备，蛋白质的纯化。
? 根据操作压力不同进行分类
? 可分为 低压色谱分离 （ ＜ 0.5 MPa）, 中压色
谱分离 （ 0.5～ 5 MPa） 和 高压色谱分离 （ 5～
50 MPa） 。
? 低压色谱分离的装置比较简单，操作费用低，
但流动相流动速率慢，分离时间长，常常使生
物活性物质活性降低。
? 高压色谱分离技术的特点是，流动相流动速率
高，分离时间短，分辨率高。缺点是设备费昂
贵，此外在高压作用下有些生物物质有变性的
可能。
? 根据展开方式进行分类
? 根据洗脱操作时展开方式的不同可分为为 洗
脱展开 （ elution development）, 迎头分析
（ frontal analysis） 和 顶替展开
（ displacement development） 三种。
? 洗脱展开 （ elution chromatography） 。
? 迎头分析法与一般的固定床吸附操作相同，大
量料液连续输入到色谱柱中，直到在出口处发
生溶质穿透 （ breakthrough） 。
? 迎头分析中各个溶质按其在固定相和流动相间
分配系数的大小次序穿透，只有最先穿透的
（ 分配系数最小 ） 的组分能以纯粹的状态得到
部分回收，之后的流出液均为双组分或双组分
以上的混合物。
? 顶替展开与洗脱展开相似，唯一不同之处是：
顶替展开所采用的洗脱液 （ 流动相 ） 中含有
与固定相的亲和力比料液中各个组分都大的
物质，这种物质称为顶替剂 （ displacer） 。
顶替剂将料液中所含溶质按其与固定相亲和
力的大小不同从柱中次序顶替 （ 洗脱 ） 出来。
顶替展开法可使溶质区带得到浓缩，适于大
量处理稀溶液。
? 根据流动方式进行分类
? 一般色谱操作中流动相从固定床的一端输入，
沿轴向流向另一端，属于 轴向流色谱 （ axis
flow chromatography） 。
? 径向流色谱 （ radial flow chromatography） 是
在柱心设一通透性细管，料液及流动相从柱的
圆周引入，从外表面沿径向流向柱心，透过中
心管流出。
? 连续环状色谱 （ continuous annular
chromatography） 。
? 拟移动床色谱 （ simulated moving bed
chromatography） 。
4.3 生物工程中的色谱分离
? 色谱和电泳是目前所知最好的两种分离方法，
其塔板数可达百万数量级。在基因工程产品
中，色谱分离占有核心地位。
? 色谱分离的规模
? 色谱分离方法的选择
? 分析色谱与工业色谱的比较
4.3.1 色谱分离的规模
? 与一般分离技术相比，色谱分离的规模是相
当小的。根据分离时一次进样量的多少，色
谱分离的规模可分为如下 4类：
? 色谱分析：＜ 10 mg
? 半制备 （ 或称中等规模制备 ）, 10～ 50 mg
? 制备 （ 或称样品制备 ）, 0.1～ 10 g
? 工业生产：＞ 20 g
4.3.2 色谱分离方法的选择
? 应用色谱分离方法制备和生产生物体组成成分，
包括各种初级代谢产物、次级代谢产物以及各
种生物大分子，使用色谱技术来分离纯化这些
物质时常根据如下几个方面来选择不同的色谱
分离方法。
① 目的产物的分子结构、物理化学特性、及分子
量的大小；
② 主要杂质，特别是分子结构、大小和理化特性
与目的产物相近的杂质的成分与含量；
③ 目的产物在色谱分离过程中生理活性的稳定性。
4.3.3 分析色谱与工业色谱的比较
? 应用色谱技术范围的不同
? 分析色谱的流动相包括气相和液相，固定相形
状包括柱、纸和薄板，而制备和工业色谱主要
是采用以液相为流动相的柱色谱。
? 操作上的不同
? 在分析色谱中, 进样量愈小愈好, 因此出现了
当今的微型毛细管柱色谱；在制备和工业色谱
中, 则要求进样量越多越好, 色谱柱也应适当
大些, 从而出现了大直径的径向色谱柱 （ radial
flow chromatographic column,RFCC） 。
? 色谱分离理论上的不同
1,理论塔板数的不同
? 对于生物大分子而言，分离的好坏往往与理
论塔板数没有明显的关系。
2,分配系数的不同
? 线性色谱与非线性色谱
3,样品保留值与峰高的不同
? 制备色谱和工业色谱中，不能根据保留值定
性，色谱的峰高也不能作为制备色谱和工业
色谱定量分析的指标。
4.4 色谱分离的基本理论
4.4.1 塔板理论
4.4.2 速率理论
4.4.1 塔板理论
? 塔板理论 Plate Theory就是把分配色谱柱比作一
个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组
分在两相间的分配行为，挥发度大的组分最先
从, 塔顶, （即柱出口）逸出，由于流动相连
续地进入柱内，为了便于研究组分在两相间的
分配行为。
? 塔板理论的基本假设,
①柱由完全相同的不连续的体积单元组成，每
一个体积单元犹如精馏塔中的一块塔板，而它
在柱内又是不存在的，故称理论塔板。
②每一块塔板的一部分空间为固定相所占据，
另一部分空间为流动相所占据。这后一部分空
间称为塔板体积（ ?Vm）。流动相从柱入口以
一个个 ?Vm 体积,脉冲式 地加入。
③组分在每块塔板上的两相间瞬时达到平衡。
④分配系数在所有塔板上都为常数，与组分浓
度无关即相当于线性等温线的情况。
⑤忽略塔板间的纵向分子扩散。
? 流出曲线
经 N次平衡后，流动相中的组分分数 q与在固定
相组分分数 p符合二项式分布：
（ p+q） N
上例中 K=1,p=q=1/2,展开为：
（ p+q） 4=p4+4qp3+6q2p2+4q3p+q4
=1/16+1/4+3/8+1/4+1/16
若 K=2,p=0.667,q=0.333,则
（ p+q）
4=0.198+0.395+0.296+0.099+0.012
当 N≥50时，流出曲线对称呈正态分布。
进流动相 平衡 K=1
1/4 2/4 1/4
1/8 3/8 3/8 1/8
1/2
1/16 ? 3/8 ? 1/16
? 柱效
n =5.54（ tR/W1/2） 2 =16（ tR/W） 2
neff=5.54（ tR’/W1/2） 2=16（ tR’/W） 2
Heff=L/Neff
? 分配色谱与精馏的差别
4.4.2 速率理论 Rate Theory
? 塔板理论满意地解释了色谱流出曲线呈高斯分
布；论证了组分的保留值与分配系数间的关系；
并能成功地用于塔板数的计算。
? 塔板理论的局限性
? 塔板理论作了五个不符合实际的假设。它还排
除了一个极其重要的参数 —— 流动相速度，并
忽略了两相体积的大小。由于排除了流动相速
度这一参数，因而不能解释在不同流动相速度
时的柱效不同的原因。
从本质上说，塔板理论的缺点在于忽视了组分
分子在两相中扩散和传质的动力学过程。
? 色谱过程中的扩散和传质
? 对速率理论作出全面解释的是荷兰化学家 Van
Deemter等，以后又由美国化学家 J,Calvin
Giddings作了进一步的改进。
? 当组分的谱带向柱出口迁移时，在非理想线性
色谱状态下必然要展宽。
? 在柱内有四种受动力学控制的过程，使谱带偏
离理想状态而展宽。
? 这四种过程是涡流扩散、纵向分子扩散、流动
相中传质和固定相中传质。
? 涡流扩散 eddy diffusion
? 当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于
受到固定相颗粒的障碍，不断改变方向，使组
分分子在前进中形成紊乱的类似, 涡流, 的流
动，导致谱带展宽，故称涡流扩散。
? 由 涡流 扩散引起的展宽程度可表示为：
?2e=2?dpL
?为填充不规则因子，它决定于固定相颗粒的直
径 dp、粒度范围和填充情况； L为柱长。
? 纵向分子扩散 longitudinal diffusion
纵向分子扩散指沿 x轴方向的扩散，它是由浓度
梯度造成的。由纵向分子扩散引起的展宽程度可
表示为：
?2l=2?DmL/u
?为弯曲因子，亦称阻碍因子，它反映固定相颗
粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况，一般
小于 1； u为流动相线速； Dm为组分在流动相中
的扩散系数。 Dm?1/√M。 同一组分在氢气中的
扩散系数要大于在氮气中的扩散系数，因此用氢
气作流动相对，纵向分子扩散更严重。
? 流动相中传质阻力
组分从流动相主体扩散到流动相与固定相的界面，
以便发生相转移，妨碍这一扩散过程的阻力称为
流动相传质阻力。由流动相传质阻力所引起的展
宽程度可表示为：
?2m= ?dp2Lu/Dm
?是由柱填充性质决定的因子，与固定相性质及
构型有关。 dp为固定相颗粒的平均直径。
影响展宽的因素有,dp,u,Dm,L
? 固定相中传质阻力
组分到达两相界面后，就要扩散到固定相内部达
到分配平衡，然后又返回两相界面。妨碍这一过
程的阻力称为固定相传质阻力。由固定相中传质
阻力引起的谱带展宽程度可表示为：
?2s= qk’df2Lu/（（ 1+k’） 2Ds）
q 是与固定相性质、构型有关的因子，对均匀液
膜,q为 2/3； k’为分配比。 df为固定液的平均
厚度。 Ds为组分在固定相中扩散系数。
影响 ?2s 因素有,df,Ds,u,L,k’
对于吸附色谱，其分配平衡受吸附 -解吸动力学
速率控制,固定相中传质阻力引起的谱带展宽程
度可表示为：
?2sa= 2k’Lu/（（ 1+k’） 2Kd）
Kd为吸附速率常数。
? 速率理论方程式
H= ?2/L= ?2e+ ?2l+ ?2m+ ?2s
= 2?dp+2?Dm/u+?dp2u/Dm+qk’df2u/((1+k’)2Ds)
H=A+B/u+Cu
这里 A— 涡流扩散相
B— 纵向扩散相
C— 传质阻力相
4.5 吸附色谱
? 吸附色谱的一般操作
? 羟基磷灰石色谱
? 疏水作用色谱
? 金属螯合色谱
? 共价作用色谱
? 吸附剂（固定相）对不同物质的吸附力不同而
使混合物分离的。
? 无机基质 吸附色谱 （多种作用力）
? 疏水作用吸附色谱 （疏水作用）
? 共价作用吸附色谱 （共价键）
? 金属螯合作用吸附色谱 （螯合作用）
? 离子交换色谱和亲和色谱 也可归类于吸附色谱。
4.5.1 吸附色谱的一般操作
? 吸附剂的选择
? 按化合物的种类可分成无机基质色谱填料和
有机基质色谱填料两大类；
? 按形状可分成球形和无定形两类；
? 按硬度可分成硬质色谱填料、半硬质疑胶色
谱填料及一些如琼脂糖的生物软胶；
? 按结构可分成表面多孔薄壳色谱填料和全多
孔色谱填料两类。
? 装置
? 一般由进样、流动相供给、色谱柱、检测及流
分收集器等部分构成 。
? 流动相供给部分
? 一般包括贮液罐、高压泵、液体混合室及梯
度洗脱系统。
? 检测器
? 根据组分的物理化学特性, 例如紫外吸收,
荧光性, 电导率, 旋光性以及可见光光密度
等, 进行在线检测 。
? 流分收集器
? 是将柱后流出的液体, 定时定量分别收集的
仪器 。 有滴数式, 容量式, 质量式等若干种 。
4.5.2 羟基磷灰石色谱
? 羟基磷灰石（ hydroxyapatite,HAP）是一种
磷酸钙晶体，基本分子结构为
Ca10(PO4)6(OH)2。
? HAP的吸附主要基于钙离子和磷酸根离子的静
电引力，即在 HAP晶体表面存在两种不同的吸
附晶面，分别起阴、阳离子交换作用。
? A W K Tiselius et al于 1956年提出。
? 1956年 Tiselius型羟基磷灰石用于蛋白质分
离
? 1986年后出现了高效化的商品球形 HAP吸
附剂，如 Bio-Rad,Sigma,高研
（ Koken）、旭光学（ Asashi Optical ）,
东压燃料工业（ Toatsu） 等公司均有产品
出售。
? 由于 HAP晶体表面结构特别，吸附机理特殊，
可用于识别 DNA及 RNA的单链和双链。
? 可分离 IEC和 HIC难于分离的蛋白质体系。
? HAP色谱通常以磷酸盐缓冲液为流动相，采用
提高盐浓度的线性梯度脱法。
? 在中性 pH环境下酸性蛋白质（ pI＜ 7 ）主要吸
附于 C点，碱性蛋白质（ pI＞ 7）主要吸附于 P
点。利用磷酸盐缓冲液（ K2HPO4＋ KH2PO4）
为流动相洗脱展开时，磷酸根离子在 C点竞争
性吸附，交换出酸性蛋白质，而 K＋ 在 P点竞争
性吸附，交换出碱性蛋白质。
? HAP吸附剂价格便宜，远低于离子交换剂，适
用于大规模分离纯化过程，已成为单克隆抗体
的主要纯化手段。
? 如人肿瘤坏死因子
（ human tumour
necrosis factor，
hTNF） 利用 HAP层
析可分离得到 4个
洗脱峰。
4.5.3 疏水作用色谱
? 疏水作用色谱 （ hydrophobic interaction
chromatography,HIC）是利用表面偶联弱
疏水性基团（疏水性配基）的疏水性吸附剂
为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间
的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生
物大分子分离纯化的一种色谱法。
? 在离子强度较高的盐溶液中，蛋白质表面疏
水部位的水化层被破坏，裸露出疏水部位，
疏水性相互作用增大。所以，蛋白质在疏水
性吸附剂上的分配系数随流动相离子强度的
提高而增大。
? 常用的疏水性配基主要有：
①苯基
② 短链烷基（ C3～ C8）
③烷氨基
④醚基
⑤聚乙二醇
? 疏水性吸附作用与配基的疏水性（疏水链长度）
和配基密度成正比，一般配基修饰密度在 10～
40 μmol/cm3之间。
? 影响疏水性吸附的因素
①离子强度及种类
? 除离子强度外，离子的种类亦影响蛋白质的
疏水性吸附。在高价阴离子的存在下，疏水
性吸附作用力较高。
? HIC分离过程中主要利用硫酸铵、硫酸钠和氯
化钠等盐溶液为流动相，在略低于盐析点的
盐浓度下进料，然后逐渐降低流动相离子强
度进行洗脱分离。
②破坏水化作用的物质
? SCN－, CIO4－ 和 I－ 等半径较大、电荷密度低
的阴离子具有减弱水分子之间相互作用。因此，
这类阴离子称为 离液离子 （ chaotropic ion）；
相反盐析作用强的高价阴离子（如 SO42－,
HPO42－ 等）的作用正好相反，称为 反离液离
子 （ antichaotropic ion）。在离液离子存在下
疏水性吸附减弱，蛋白质易于洗脱。
? 除离液离子外，乙二醇和丙三醇等含羟基的物
质也具有影响水化的作用，降低蛋白质的疏水
性吸附作用，经常用做洗脱促进剂。
③表面活性剂
? 表面活性剂可与吸附剂及蛋白质的疏水部位
结合，从而减弱蛋白质的疏水性吸附。根据
这一原理，难溶于水的膜蛋白质可添加一定
量的表面活性剂使其溶解，利用 HIC法进行洗
脱分离。
④温度
? 疏水性吸附与一般吸附相反。蛋白质疏水部
位的失水有利于疏水性吸附，而失水是吸热
过程，即疏水性吸附为吸热过程。
? HIC分离蛋白质
? HIC的特点
? HIC可作为 IEC的补充工具。
①可直接分离盐析后的蛋白质
②疏水性吸附剂种类多，选择余地大
③疏水性相互作用机理比较复杂
例如，鼠肝 细胞色素 C氧化酶可被 Octyl
Sepharose完全吸附，而用 Decyl Sepharose为
吸附剂时，吸附作用降低；在 Butyl Sepharose
上部分吸附，而在 Phenyl Sepharose上则完全
吸附。据推测，发生这种现象的原因是该酶与
苯环之间可产生 π-π健。
4.5.4 金属螯合色谱
Metal chelate chromatography
? 首先要制备金属螯合介质：琼脂糖环氧活化后
与亚氨二乙酸盐,HN:(CH2COO)2Me偶合，
形成带有双羧甲基氨基的琼脂糖。
? Cu2+,Ni2+,Zn2+和 Co2+等过渡金属离子可与 N,S
和 O等供电原子（ electron donor atom）产生配位
键，因此可与蛋白质表面的组氨酸（ His）的咪唑基、
半胱氨酸（ Cys）的巯基和色氨酸（ Trp）的吲哚基
发生亲和结合作用，其中以 His的咪唑基的结合作用
最强。
? 除了双羧甲基氨基外，可以作为螯合形成基团的还
有：水杨酸基,8-羟基喹啉基，氨基琥珀酸基等。
? 在中性条件下，金属螯合色谱填料能与蛋白质外露
的组氨酸上的咪唑基及半胱氨酸上的巯基结合，交
换配基。
? MCC分离时，必须使金属离子对色谱填料凝
胶的亲和力大于对欲分离物质的配位亲和力。
? 金属螯合色谱主要用于要依赖金属或直接与
金属作用的蛋白质、肽类、核苷酸、核酸及
酶的分离与纯化。
? 常在 pH值为 6～ 8时蛋白质可被吸附，洗脱一
般降低 pH值、增加离子强度或在缓冲液中加
入螯合剂如 EDTA等方法进行。
4.5.5 共价作用色谱
? 共价作用色层分离法是根据巯基化合物
与色谱填料上二硫键之间的共价化学反
应面进行的色谱分离的方法。 － SH基与
－ S－ S－ 能组成一组氧化 -还原体系。
? 首先要制备色谱填料。葡聚糖凝胶通过 CNBr
方法活化后，先后用谷胱甘肽及 2,2’-吡啶基二
硫化合物处理，得到谷胱甘肽型二硫键色谱填
料。
? 凝胶也可通过环氧氯丙烷活化后，再用硫代硫
酸盐处理，得到还原型的巯基丙基型凝胶，最
后用 2,2’-吡啶基二硫化合物活化便得到巯基丙
基型的二硫健色谱填料。
? 也可用交链聚丙烯酰胺作材料制得带巯芳基的
活性色谱填料。
? 共价作用色谱分离法的操作过程：
①吸附
? 蛋白质中的半胱氨酸基，与色谱填料上的二硫
键发生共价交换反应，蛋白质被结合到色谱填
料上。
? 如果吸附后，柱上有剩余的未反应的巯基吡啶
基基团，可用 pH值 4.0低浓度（ 4 mmol/L）的
二硫苏糖醇,0.1mol/L醋酸钠缓冲液洗涤除去。
②洗脱
? 洗脱可以用 L-半胱氨酸，巯基乙醇，谷胱甘肽，
以及二硫苏糖醇等巯基化合物，在中性条件下
进行。洗脱时，若使用还原力逐次增加的巯基
化合物或者逐渐增加巯基化合物的浓度，都可
以增加蛋白质的洗脱分辨率，提高选择性。
? 洗脱时，释出的吡啶 -2-硫酮是一个发色化合物，
在 343 nm处检出。
③再生过程
? 洗脱后的色谱填料，需用 2,2’－吡啶基二硫化
合物处理再生。对于还原型的巯基丙基琼脂
糖还必须在 80℃ 下回流 3小时。
? 二硫键色谱填料价格较贵，再生操作麻烦，
目前尚未大规模的应用。但是共价结合具有
特异性，牢固并且在适当的操作条件下还可
获得较高的收率和纯度，故这种方法在某些
领域中，特别是在蛋白质序列分析过程及其
结构研究中，有着特殊的作用，甚至还可能
成为最方便快速、简单的方法而受到欢迎。
4.6 离子交换色谱
? 离子交换色谱 （ ion exchange
chromatography,IEC）利用离子交换剂为固
定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相
互作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法。
荷电溶质在离子交换剂上的分配系数可用下式
表示：
m（ I）＝ A／ IB＋ m∞
? 其中 I为流动相的离子强度,A和 B为常数,m∞
为离子强度无限大时溶质的分配系数，是静电
相互作用以外的非特异性吸附引起的溶质在离
子交换剂上的分配。
? 对于蛋白质等两性电解质，常数 A和 B为 pH的
函数。
? B为溶质的静电荷数与离子交换基的离子价数
之比。蛋白质为多价电解质，在 pH偏离等电
点的溶液中净电荷数常为两位数以上，故 B值
比较大。
? 一方面蛋白质的分配系数对离子强度非常敏感，
即离子强度的微小改变，就会引起分配系数的
很大变化；另一方面，不同蛋白质的 B值可能
相差很大。因此，如果采用离子强度不变的流
动相进行恒定洗脱，两种蛋白质的洗脱体积相
差很大，甚至分配系数大的蛋白质很难洗脱。
? 用于蛋白质等生物分子离子交换的阴离子交
换基有 DEAE（二乙胺乙基，适用范围,pH
＜ 8.6 ）, QAE（季铵乙基）。
? 阳离子交换基为 CM（羧甲基，适用范围 pH
＞ 4）,P（膦酸基）和 SP（磺丙基）。
? 常用于制备离子交换剂的介质有纤维素类、
葡聚糖系（ Sephadex）、琼脂糖系
（ Sepharose,Bio-Gel A ）、聚乙烯醇系
（ Toyopearl）和苯乙烯系（ TSK gel PW）
等。
? IEC操作很少采用恒定洗脱法，而多采用线性
梯度洗脱法（ linear gradient elution）、逐次
洗脱法（ stepwise elution）。
? IEC的应用
? 特点
? 归纳而言,IEC具有如下的特点；
①料液处理量大，具有浓缩作用，可在较高流
速下操作；
②应用范围广泛，优化操作条件可大幅度提高
分离的选择性，所需柱长较短；
③产品回收率高；
④商品化的离子交换剂种类多，选择余地大，
价格也远低于亲和吸附剂。
? 但是,IEC的操作变量远多于 GFC,影响分离
特性的因素非常复杂。
4.7 分配色谱
? 分配色谱法是靠溶质在固定相和流动相之间
的分配系数不同而分离的方法。
? 载体
? 载体是惰性、没有吸附能力，能吸留较大量
的固定相液体。分配柱色谱法中所用的载体
主要有三类：
①硅胶
②硅藻土
③纤维素
? RPC主要用于分子量低于 5000，特别是 1000
以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也
可用于蛋白质等生物大分子的分析和纯化。
但由于反相介质表面为强烈疏水性，并且流
动相为低极性有机溶剂，生物活性大分子在
RPC分离过程中容易变性失活。
? 溶质在反相介质上的分配系数取决于溶质的
疏水性，一般疏水性越大，分配系数越大。
当固定相一定时，可通过调节流动相的组成
调整溶质的分配系数。流动相的极性越大，
溶质的分配系数越大。因此 RPC多采用降低
流动相极性（水含量）的线性梯度洗脱法。
? 反相介质的商品种类繁多，其中最具代表性
的是以硅胶为载体，通过硅烷化反应在硅胶
表面键合非极性分子层制备。其中利用 C18
硅烷化试剂制备的反相介质最多，通称 ODS
（ Octadecyl silica），其次是 C8和 C4。
? 除硅胶外，高分子聚合物也可作为反相介质
的载体，如 TSK gel Octadecyl-4PW和 TSK
gel Octadecyl-NPR（聚丙烯酸酯 -C18）等。
? 反相介质性能稳定，分离效率高，可分离肽、
氨基酸、核酸、甾类、脂类、脂肪酸、糖类、
植物碱等含有非极性基团的各种物质。
4.8 凝胶过滤色谱
? 原理与操作
? GFC利用凝胶为固定相，根据中溶质相对分子
质量的差别进行分离的液相色谱法。
? 凝胶过滤介质
1,对凝胶过滤介质的要求
① 亲水性高, 表面惰性, 即介质与溶质之间不
发生任何化学或物理相互作用；
② 稳定性强, 在较宽的 pH和离子强度范围以及
化学试剂中保持稳定, 使用寿命长,
③ 具有一定的孔径分布范围；
④ 机械强度高，允许较高的操作压力 （ 流速 ） 。
2,商品化的凝胶过滤介质种类
① 葡聚糖系
? 其中 Sephadex G是最传统的软凝胶过滤介质
之一，目前仍被广泛使用。 Sephadex G是利
用葡聚糖 （ 右旋糖酐 ） 交联制备的，交联剂
一般采用环氧氯丙烷 。 Sephadex凝胶按交联
度大小，分 G 10～ G 200共八种型号。
② 琼脂糖系（ Sepharose,Bio-Gel A ）
? 琼脂糖凝胶 Sepharose是另一种较常使用的凝
胶过滤介质，机械强度较低。 Sepharose CL
是利用环氧氯丙烷交联制备的琼脂糖凝胶，
机械强度较普通 Sepharose高。
? Bio-Gel A为 Bio Rad产品。
③ 聚丙烯酰胺系（ Bio-Gel P）
④ Sephacryl
? 为丙烯基葡聚糖与 N,N’’-亚甲基双丙烯酰胺的
共聚物。
⑤ Superdex
⑥ Superose
⑦ TSK gel Toyopearl HW
? 聚乙烯醇系
⑧ Bio-beads
? 为苯乙烯与二乙烯苯的共聚物、用于非水体系。
⑨ TSK gel PW
? 为亲水性聚乙烯。 PW系列机械强度更高，适
用于高压液相色谱。
⑩ TSK gel SW
? 硅胶。
? 凝胶特性参数
① 排阻极限 （ exclusion limit）
? 凝胶过滤介质的排阻极限是指不能扩散到凝
胶网络内部的最小分子的相对分子质量。例
如 Sephadex G50的排阻极限是 30 kD,即相
对分子质量大于该数值的分子不能进入到凝
胶网络中，其洗脱体积为 V0。
② 分级范围 （ fractionation range）
? 即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离
的溶质的相对分子质量范围。 Sephadex G50
的分级范围为 1.5～ 30 kD。
③ 溶胀率
? 溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分数，
Sephadex G50的溶胀率为 500％土 30％。
④ 凝胶粒径
? 凝胶一般为球形，其粒径大小对分离度有重要
影响。粒径越小,HETP越小，分离效率越高。
凝胶粒径多用筛目或微米表示。软凝胶粒径较
大，一般为 50～ 150 μm（ 100～ 200目 ）,硬
凝胶粒径较小，一般为 5～ 50 μm 。 例如，
Sepharose和 Sephadex凝胶粒径分布为 45～
165 μm, 而 Superose和 TSK Toyopearl HW系
列可小到 20～ 40 μm, 甚至 6～ 10 μm 。
⑤ 床体积 （ bed volume）
? 即 1 g干燥凝胶溶胀后所占有的体积。
Sephadex G50的床体积为 9～ 11 cm3/g干胶。
⑥ 空隙体积 （ void volume）
? 指色谱柱中凝胶之间空隙的体积，即 V0值。空
隙体积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质
测定，一般使用平均相对分子质量为 2000 kD
的水溶性蓝色葡聚糖 （ blue dextran） 。
? 对于商品化的凝胶过滤介质，厂商的产品目录
中一般均给出其凝胶的各种性质，如分级范围、
粒径、流速与压力的关系等，可参考使用。
? 分配系数
Kd＝ （ Ve－ Vo） /Vi
0≤ Kd≤1
? MW与 Kd的关系
Kd ＝ a－ blogMW
? GFC的应用及特点
① 分离纯化
? GFC可用于相对分子
质量从几百到,106
数量级的物质的分离
纯化。右图是一例利
用高效 GFC分离骨髓
血清蛋白质的结果。
色谱柱,10× 300,Superose 6
洗脱液,0.05mol／ L磷酸盐
＋ 0.15mol／ L NaCl（ pH7.0）
流量,0.2ml／ min
1.IgA高聚体 2,IgA二聚体
3.IgA单体 4.IgG 5.白蛋白
②脱盐
? GFC在生物分离领域的另一主要用途是生物大
分子溶液的脱盐，以及除去其中的低相对分
子质量物质。
③相对分子质量的测定
? 在凝胶过滤介质的分级范围内蛋白质的分配
系数（或洗脱体积）与相对分子质量的对数
成正比，所以 GFC可用于未知物质相对分子质
量的测定。
? 不过,GFC仅对球形分子的测量精度较高，对
分子形状为棒状的物质，测量值将小于实际
值。
? GFC的具体优点如下：
① 溶质与介质不发生任何形式的相互作用，因此
可采用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，
产品收率可接近 100％；
② 每批分离操作结束后不需要进行介质的清洗或
再生，故容易实施循环操作，提高产品纯度；
③ 作为脱盐手段,GFC比透析法速度快，精度高；
与超滤法相比，剪切应力小，蛋白质活性收率
高；
④ 分离机理简单，操作参数少，容易规模放大。
? 与其他色谱法相比,GFC的不足之处在于：
① 仅根据溶质之间分子量的差别进行分离，选
择性低，料液处理量小；
② 经 GFC洗脱展开后产品被稀释。因此需要在
具有浓缩作用的单元操作 （ 如超滤、离子交
换和亲和色谱等 ） 后使用。
4.9 高速逆流色谱
? 高速逆流色谱（ High speed counter
current chromatography,HSCCC）是一
种无固相载体的连续液液分配色谱技术，
在重力与离心力场的作用下，其固定相被
保留于分离柱内，从而避免了固相载体与
样品发生化学反应变性或不可逆吸附。
? 该技术的样品回收率高，分辨率高，既适
用于微量分析也可用于大规模制备。
TBE 300V型高速逆流色谱示意图
4.10 径向色谱分离法
? 径向色谱柱的结构及原理如图所示。
? 当保持制备色谱柱直径不变，只增加柱长时，
可以线性增大样品处理量，样品的规模可在
保持相似的色谱条件下直接放大。
? 由于径向色谱柱反压降较低, 样品出峰较快,
对设备的要求较低, 通常的低压色谱系统就
可满足要求 。
? 径向色谱柱在生物制剂、血液制品及基因工
程产品等方面已广泛使用，其结果优于传统
的轴向色谱柱。
? 当色谱柱体积相差不大时 （ 径向柱大 25％ ）,
径向柱的流速为轴向柱的 3～ 3.8倍，处理量
为轴向柱的 3倍。
4.11 连续环状色谱分离法
? 连续环状色谱分离 （ continuous annular
chromatography,简写 CAC） 技术就是 80年代
以来迅速发展起来的一种连续色层分离过程。
它能够分离多组分混合物并且设备结构简单、
操作方便，故很有工业应用前景。
? CAC过程的关键是一个连续加料柱，由 Fox等
开发而成。连续加料柱由两个同心圆筒紧夹在
底板上而组成，两同心圆筒间的间距为 1cm，
空间内用适当的树脂或凝胶胶充填，在圆柱间
隙下的底盘四周有一系列小孔通向接收器。
? 环状床层绕中心轴以每分钟
0.4～ 2.0转慢速旋转的过程
中，洗脱液和料液被连续地
从床层的顶端输入。洗脱液
沿圆周方向，连续向下冲洗，
而待分离的化合物只在床层
顶端区域输入。
? 随着时间的延长，各组分从
进料位置开始在环状床层内
形成螺旋形谱带。
Chromatographic resolution
也称色谱法 （ chromatography）
色谱分离是分离科学的一次革命。
主要内容
4.1 概述
4.2 色谱分离的分类
4.3 生物工程中的色谱分离
4.4 色谱分离的基本理论
4.5 吸附色谱
4.6 离子交换色谱
4.7 分配色谱
4.8 凝胶色谱
4.9 高速逆流色谱
4.10 径向色谱分离法
4.11 连续环状色谱分离法
4.1 概述
4.1.1 色谱法的定义
4.1.2 色谱法的发展简史
4.1.3 色谱法的特点
4.1.1 色谱法的定义
? 色谱法 chromatography
? 是利用混合物中各组分在两相中分配系数不
同，当流动相推动样品中的组分通过固定相
时，在两相中进行连续反复多次分配，从而
形成差速移动，达到分离的方法。
①凡是色谱分离都具有 stationary phase和
mobile phase 。
②固定相是不动的，流动相对固定相作相对的
运动。
③被分离的组分与流动相和固定相有不同的作
用力。这种作用力有吸附力，溶解力,离子
交换能力等。在色谱分析中常用分配系数来描
述组分对流动相和固定相的作用力的差别：
K= Cs/Cm
分配系数的差异是色谱分离的根本原因 。
4.1.2 色谱法的发展史
? 色谱法的诞生
? 常见的分离方式如过滤、蒸馏、沉淀、结晶、离
心、萃取、膜分离等在分离复杂的混合物时就显
得力不从心了。
? 1903年,M,C,Tswett
进行了分离植物叶中各
种色素的实验。创立了
色谱法。
It is very instructive to observe the adsorption
phenomena during filtration through a powder.
First a colourless,then a yellow （ carotene） liquid
flows out from the bottom of the funnel,while a
bright green ring forms at the top of the inulin
column,below which a yellow ring soon appears.
On subsequent washing of the inulin column with
pure ligroin,both rings,the green and the yellow,
are considerably widened and move down the
column.
M.S,Tswett
Tr,Varshav,Obshch,Estestvoispyt.,Otd,Biol.,
14 （ 1903） 20
? 然而，在 20多年时间里，他的新分离方法并没有受
到科学界的重视。其中一个重要原因是德国著名化
学家 R,Willst?tter对色谱法的排斥和不信任。
? Willst?tter（ 1915年获诺贝尔化学奖获得者） 1913年
在其名著“叶绿素的研究”中，称色谱法是一种
“离奇的方法”，认为它不适用于制备工作，在吸
附过程中，试样组分可能发生化学变化。他写道：
,色谱法只能在试样很少的情况下使用，似乎不适
合于制备目的 ……,
? Willst?tter的观点，即过分强调制备工作，也反映出
当时有机化学家的一种普遍态度。因此，茨维特的
技术是超越其时代的。
? 1930年 12月，奥地利 22岁研究生 E,Lederer
到海得堡 R,Kuhn领导的化学研究所研究类
胡萝卜素。他对文献进行了仔细考察，从文
献中了解到茨维特的色谱技术。在 Kuhn的
指导下，他用碳酸钙作吸附剂，在一小色柱
中，成功地 分离了 ?-,?-,?-胡萝卜素,并
发表了三篇论文，公布了他们的研究成果。
这标志着色谱法的复兴。
? Karrer在 1937年,Kuhn在 1938年,Ruzicka在
1939年相继获诺贝尔化学奖。从此以后，色
谱法得到普遍的公认，成为最有效的分离提
纯手段。
? 色谱法的发展
? 1931年,Kuhn,Lederer用氧化铝和碳酸钙分
离了 ?-,?-,?-胡萝卜素后才引起重视。
Tswett的方法是借助于各组分在固定相中吸附
能力的强弱不同而进行分离的，称为 吸咐色谱
adsorption chromatography。
? 1935年,Adams和 Holmes 合成了离子交换树
脂，并用于色谱分离，从而诞生了离子交换色
谱法。
? 1941年 A,J,P,Martin和 R,L,M,Synge发明了
分配色谱法（ partition chromatography） 。
1952年获诺贝尔化学奖。
Archer John Porter Martin Richard Laurence Millington Synge
? 1941年 Martin和 Synge提出用气体代替液体作流
动相的可能性。
? 1952年 James和 Martin发表了从理论到实践比较
完整的 气液色谱法 gas-liquid chromatography。
? 1957年 Golay开创了开管柱气相色谱法 open-
tubular column chromatography,即 毛细管柱
气相色谱法 capillary column chromatography。
? 1956年 Van Deemter等在前人研究的基础上发
展了描述色谱过程的速率理论。
? 1965年 Giddings总结和发展了前人的色谱理论 。
? 1944年 R,Consden,A,H,Gorden和 Martin等发
展了 纸色谱 。
? 1949年 Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合剂
制作薄层板使 薄层色谱法（ thin layer
chromatography） 得以实际应用,1956年 E,
Stahl对 TLC的标准化、规范化及应用面做了大
量工作并 开发出薄层色谱板涂布器之后，才使
TLC得到广泛地应用。
? 1959年 Porath和 Flodin提出了 凝胶色谱法 （ gel
chromatography ） 。
? 1967年 Porath,Axen和 Ernback成功地创立了 亲
和色谱法 （ affinity chromatography ） 。
? 20世纪 60年代初,Giddings将气 -液色谱理论用
于液 -液色谱，同时 把高压泵和化学键合固定相
用于液相色谱,于 60年代末出现了 高效液相色
谱 （ HPLC） 。
? 20世纪 80年代初毛细管 超临界流体色谱 （ SFC）
得到发展,90年代未得到较广泛的应用。
? 20世纪 80年代初由 Jorgenson等集前人经验而
发展起来的 毛细管电泳 （ Capillary
electrophoresis,CE）,在 90年代得到广泛的
发展和应用。
? 同时集 HPLC和 CE优点的 毛细管电色谱 在 20世纪
90年代后期受到重视。
4.1.3 色谱法的特点
? 分离效率高
? 可选操作参数多
? 应用范围广
? 高灵敏度的在线检测快速
? 分离与过程自动化操作
4.2 色谱分离的分类
? 按分离机理不同分类
? 按固定相及流动相的状态分类
? 按固定相形状分类
? 其他分类方法
4.2.1 按分离机理不同分类
? 吸附色谱
? Adsorption chromatography,AC是指混合物随
流动相通过固定相 （ 吸附剂 ） 时，由于固定相
对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方
法。
? 吸附作用力可以是 物理吸附作用,也可以是 化
学吸附作用 。物理吸附的特点是选择性低，吸
附速度较快，吸附过程可逆；化学吸附的特点
是有一定选择性，吸附速度较慢，不易解吸。
物理吸附和化学吸附可以同时发生，在一定条
件下也可以互相转化。
? 吸附色谱是各种色谱分离技术中应用最早的
一类，传统的吸附色谱以各种无机材料为吸
附剂。
? 在此基础上发展起来的新的吸附色谱技术，
如 疏水作用色谱 （ hydrophobic interaction
chromatography,HIC）, 金属螯合作用色谱
（ metal chelation chromatography,MCC）
和 共价作用色谱 （ covalent interaction
chromatography,CIC） 等，所用吸附剂一般
为有机基质并通过化学修饰后制成，它们都
有比较明确的作用机理，即 疏水作用, 螯合
作用 和 共价作用 。
? 离子交换色谱
? 离子交换色谱 （ ion exchange
chromatography,IEC） 是基于离子交换原理
进行的色谱分离。广泛用于生物大分子的分离
纯化中。
? 亲和色谱
? 亲和色谱 （ affinity chromatography,AFC）
是将与目的产物具有特异亲和力的生物分子固
定化后作为固定相从混合物中分离目的产物的
过程。
? 亲和作用是特殊的吸附作用。
? 分配色谱
? Distribution chromatography,DC又称为液液
色谱，其原理是利用混合物中各物质在两液相
中的分配系数不同而分离。
? 分配色谱可分为 正相色谱 （ normal phase
chromatography,NPC） 和 反相色谱
（ reversed phase chromatography,RPC） 。
? 离子对色谱 ion-pair chromatography。
? 凝胶色谱
? 凝胶色谱 （ gel chromatography,GC）以凝胶
为固定相，是一种根据各物质分子大小不同而
进行分离的色谱技术，因而又称为分子筛色谱
（ molecular sieve chromatography,MSC）；
空间排阻色谱 （ size exclusion
chromatography,SEC）。
? 凝胶色谱分为两大类,凝胶过滤色谱 （ gel
filtration chromatography,GFC）和 凝胶渗透
色谱 （ gel permeation chromatography，
GPC） 。
? 电色谱
? 电色谱 （ electrochromatography） 是电泳和
液相色谱的融合技术 。 所谓电色谱是采用电渗
流来推动流动相, 使得峰扩展只与溶质扩散系
数有关, 因而使电色谱的理论塔板数远远高于
液相色谱 。 同时由于引入了高效液相色谱的固
定相, 使电色谱具备了高效液相色谱固定相所
具有的选择性, 使它不仅能分离带电物质 。 也
能分离中性化合物 。
4.2.2 按固定相及流动相的状态分类
? 气相色谱 GC
? 气相色谱 （ gas chromatography,GC） 仅限于
能够气化的物质，且主要用于分析。气相色谱
包括 气液色谱 GLC,气固色谱 GSC。
? 液相色谱 LC
? 液相色谱 （ liquid phase chromatography，
LPC） 可分为液液色谱 LLC,液固色谱 LSC。
? 超临界流体色谱
? 超 临 界 流 体 色 谱 （ supercritical fluid
chromatography,SFC） 是 20世纪 80年代中期
发展起来的一种新的色谱分离技术, 其流动相
为超临界流体 。
4.2.3 按固定相形状分类
? 柱色谱 （ column chromatography）
? 平面色谱 （ planar chromatography）
? 纸上层析 （ paper chromatography ）
? 薄层色谱 （ thin layer chromatography）
4.2.4 其他分类方法
? 按使用领域不同对色谱仪的分类
1,分析用色谱仪
? 又可分为实验室用色谱仪、在工业生产流程中
为在线连续使用的色谱仪和便携式色谱仪。
2,制备用色谱仪
? 又可分为实验室用制备型色谱仪和工业用大型
制造纯物质的制备色谱仪。制备型色谱仪可以
完成一般分离方法难以完成的纯物质制备任务，
如纯化学试剂的制备，蛋白质的纯化。
? 根据操作压力不同进行分类
? 可分为 低压色谱分离 （ ＜ 0.5 MPa）, 中压色
谱分离 （ 0.5～ 5 MPa） 和 高压色谱分离 （ 5～
50 MPa） 。
? 低压色谱分离的装置比较简单，操作费用低，
但流动相流动速率慢，分离时间长，常常使生
物活性物质活性降低。
? 高压色谱分离技术的特点是，流动相流动速率
高，分离时间短，分辨率高。缺点是设备费昂
贵，此外在高压作用下有些生物物质有变性的
可能。
? 根据展开方式进行分类
? 根据洗脱操作时展开方式的不同可分为为 洗
脱展开 （ elution development）, 迎头分析
（ frontal analysis） 和 顶替展开
（ displacement development） 三种。
? 洗脱展开 （ elution chromatography） 。
? 迎头分析法与一般的固定床吸附操作相同，大
量料液连续输入到色谱柱中，直到在出口处发
生溶质穿透 （ breakthrough） 。
? 迎头分析中各个溶质按其在固定相和流动相间
分配系数的大小次序穿透，只有最先穿透的
（ 分配系数最小 ） 的组分能以纯粹的状态得到
部分回收，之后的流出液均为双组分或双组分
以上的混合物。
? 顶替展开与洗脱展开相似，唯一不同之处是：
顶替展开所采用的洗脱液 （ 流动相 ） 中含有
与固定相的亲和力比料液中各个组分都大的
物质，这种物质称为顶替剂 （ displacer） 。
顶替剂将料液中所含溶质按其与固定相亲和
力的大小不同从柱中次序顶替 （ 洗脱 ） 出来。
顶替展开法可使溶质区带得到浓缩，适于大
量处理稀溶液。
? 根据流动方式进行分类
? 一般色谱操作中流动相从固定床的一端输入，
沿轴向流向另一端，属于 轴向流色谱 （ axis
flow chromatography） 。
? 径向流色谱 （ radial flow chromatography） 是
在柱心设一通透性细管，料液及流动相从柱的
圆周引入，从外表面沿径向流向柱心，透过中
心管流出。
? 连续环状色谱 （ continuous annular
chromatography） 。
? 拟移动床色谱 （ simulated moving bed
chromatography） 。
4.3 生物工程中的色谱分离
? 色谱和电泳是目前所知最好的两种分离方法，
其塔板数可达百万数量级。在基因工程产品
中，色谱分离占有核心地位。
? 色谱分离的规模
? 色谱分离方法的选择
? 分析色谱与工业色谱的比较
4.3.1 色谱分离的规模
? 与一般分离技术相比，色谱分离的规模是相
当小的。根据分离时一次进样量的多少，色
谱分离的规模可分为如下 4类：
? 色谱分析：＜ 10 mg
? 半制备 （ 或称中等规模制备 ）, 10～ 50 mg
? 制备 （ 或称样品制备 ）, 0.1～ 10 g
? 工业生产：＞ 20 g
4.3.2 色谱分离方法的选择
? 应用色谱分离方法制备和生产生物体组成成分，
包括各种初级代谢产物、次级代谢产物以及各
种生物大分子，使用色谱技术来分离纯化这些
物质时常根据如下几个方面来选择不同的色谱
分离方法。
① 目的产物的分子结构、物理化学特性、及分子
量的大小；
② 主要杂质，特别是分子结构、大小和理化特性
与目的产物相近的杂质的成分与含量；
③ 目的产物在色谱分离过程中生理活性的稳定性。
4.3.3 分析色谱与工业色谱的比较
? 应用色谱技术范围的不同
? 分析色谱的流动相包括气相和液相，固定相形
状包括柱、纸和薄板，而制备和工业色谱主要
是采用以液相为流动相的柱色谱。
? 操作上的不同
? 在分析色谱中, 进样量愈小愈好, 因此出现了
当今的微型毛细管柱色谱；在制备和工业色谱
中, 则要求进样量越多越好, 色谱柱也应适当
大些, 从而出现了大直径的径向色谱柱 （ radial
flow chromatographic column,RFCC） 。
? 色谱分离理论上的不同
1,理论塔板数的不同
? 对于生物大分子而言，分离的好坏往往与理
论塔板数没有明显的关系。
2,分配系数的不同
? 线性色谱与非线性色谱
3,样品保留值与峰高的不同
? 制备色谱和工业色谱中，不能根据保留值定
性，色谱的峰高也不能作为制备色谱和工业
色谱定量分析的指标。
4.4 色谱分离的基本理论
4.4.1 塔板理论
4.4.2 速率理论
4.4.1 塔板理论
? 塔板理论 Plate Theory就是把分配色谱柱比作一
个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组
分在两相间的分配行为，挥发度大的组分最先
从, 塔顶, （即柱出口）逸出，由于流动相连
续地进入柱内，为了便于研究组分在两相间的
分配行为。
? 塔板理论的基本假设,
①柱由完全相同的不连续的体积单元组成，每
一个体积单元犹如精馏塔中的一块塔板，而它
在柱内又是不存在的，故称理论塔板。
②每一块塔板的一部分空间为固定相所占据，
另一部分空间为流动相所占据。这后一部分空
间称为塔板体积（ ?Vm）。流动相从柱入口以
一个个 ?Vm 体积,脉冲式 地加入。
③组分在每块塔板上的两相间瞬时达到平衡。
④分配系数在所有塔板上都为常数，与组分浓
度无关即相当于线性等温线的情况。
⑤忽略塔板间的纵向分子扩散。
? 流出曲线
经 N次平衡后，流动相中的组分分数 q与在固定
相组分分数 p符合二项式分布：
（ p+q） N
上例中 K=1,p=q=1/2,展开为：
（ p+q） 4=p4+4qp3+6q2p2+4q3p+q4
=1/16+1/4+3/8+1/4+1/16
若 K=2,p=0.667,q=0.333,则
（ p+q）
4=0.198+0.395+0.296+0.099+0.012
当 N≥50时，流出曲线对称呈正态分布。
进流动相 平衡 K=1
1/4 2/4 1/4
1/8 3/8 3/8 1/8
1/2
1/16 ? 3/8 ? 1/16
? 柱效
n =5.54（ tR/W1/2） 2 =16（ tR/W） 2
neff=5.54（ tR’/W1/2） 2=16（ tR’/W） 2
Heff=L/Neff
? 分配色谱与精馏的差别
4.4.2 速率理论 Rate Theory
? 塔板理论满意地解释了色谱流出曲线呈高斯分
布；论证了组分的保留值与分配系数间的关系；
并能成功地用于塔板数的计算。
? 塔板理论的局限性
? 塔板理论作了五个不符合实际的假设。它还排
除了一个极其重要的参数 —— 流动相速度，并
忽略了两相体积的大小。由于排除了流动相速
度这一参数，因而不能解释在不同流动相速度
时的柱效不同的原因。
从本质上说，塔板理论的缺点在于忽视了组分
分子在两相中扩散和传质的动力学过程。
? 色谱过程中的扩散和传质
? 对速率理论作出全面解释的是荷兰化学家 Van
Deemter等，以后又由美国化学家 J,Calvin
Giddings作了进一步的改进。
? 当组分的谱带向柱出口迁移时，在非理想线性
色谱状态下必然要展宽。
? 在柱内有四种受动力学控制的过程，使谱带偏
离理想状态而展宽。
? 这四种过程是涡流扩散、纵向分子扩散、流动
相中传质和固定相中传质。
? 涡流扩散 eddy diffusion
? 当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于
受到固定相颗粒的障碍，不断改变方向，使组
分分子在前进中形成紊乱的类似, 涡流, 的流
动，导致谱带展宽，故称涡流扩散。
? 由 涡流 扩散引起的展宽程度可表示为：
?2e=2?dpL
?为填充不规则因子，它决定于固定相颗粒的直
径 dp、粒度范围和填充情况； L为柱长。
? 纵向分子扩散 longitudinal diffusion
纵向分子扩散指沿 x轴方向的扩散，它是由浓度
梯度造成的。由纵向分子扩散引起的展宽程度可
表示为：
?2l=2?DmL/u
?为弯曲因子，亦称阻碍因子，它反映固定相颗
粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况，一般
小于 1； u为流动相线速； Dm为组分在流动相中
的扩散系数。 Dm?1/√M。 同一组分在氢气中的
扩散系数要大于在氮气中的扩散系数，因此用氢
气作流动相对，纵向分子扩散更严重。
? 流动相中传质阻力
组分从流动相主体扩散到流动相与固定相的界面，
以便发生相转移，妨碍这一扩散过程的阻力称为
流动相传质阻力。由流动相传质阻力所引起的展
宽程度可表示为：
?2m= ?dp2Lu/Dm
?是由柱填充性质决定的因子，与固定相性质及
构型有关。 dp为固定相颗粒的平均直径。
影响展宽的因素有,dp,u,Dm,L
? 固定相中传质阻力
组分到达两相界面后，就要扩散到固定相内部达
到分配平衡，然后又返回两相界面。妨碍这一过
程的阻力称为固定相传质阻力。由固定相中传质
阻力引起的谱带展宽程度可表示为：
?2s= qk’df2Lu/（（ 1+k’） 2Ds）
q 是与固定相性质、构型有关的因子，对均匀液
膜,q为 2/3； k’为分配比。 df为固定液的平均
厚度。 Ds为组分在固定相中扩散系数。
影响 ?2s 因素有,df,Ds,u,L,k’
对于吸附色谱，其分配平衡受吸附 -解吸动力学
速率控制,固定相中传质阻力引起的谱带展宽程
度可表示为：
?2sa= 2k’Lu/（（ 1+k’） 2Kd）
Kd为吸附速率常数。
? 速率理论方程式
H= ?2/L= ?2e+ ?2l+ ?2m+ ?2s
= 2?dp+2?Dm/u+?dp2u/Dm+qk’df2u/((1+k’)2Ds)
H=A+B/u+Cu
这里 A— 涡流扩散相
B— 纵向扩散相
C— 传质阻力相
4.5 吸附色谱
? 吸附色谱的一般操作
? 羟基磷灰石色谱
? 疏水作用色谱
? 金属螯合色谱
? 共价作用色谱
? 吸附剂（固定相）对不同物质的吸附力不同而
使混合物分离的。
? 无机基质 吸附色谱 （多种作用力）
? 疏水作用吸附色谱 （疏水作用）
? 共价作用吸附色谱 （共价键）
? 金属螯合作用吸附色谱 （螯合作用）
? 离子交换色谱和亲和色谱 也可归类于吸附色谱。
4.5.1 吸附色谱的一般操作
? 吸附剂的选择
? 按化合物的种类可分成无机基质色谱填料和
有机基质色谱填料两大类；
? 按形状可分成球形和无定形两类；
? 按硬度可分成硬质色谱填料、半硬质疑胶色
谱填料及一些如琼脂糖的生物软胶；
? 按结构可分成表面多孔薄壳色谱填料和全多
孔色谱填料两类。
? 装置
? 一般由进样、流动相供给、色谱柱、检测及流
分收集器等部分构成 。
? 流动相供给部分
? 一般包括贮液罐、高压泵、液体混合室及梯
度洗脱系统。
? 检测器
? 根据组分的物理化学特性, 例如紫外吸收,
荧光性, 电导率, 旋光性以及可见光光密度
等, 进行在线检测 。
? 流分收集器
? 是将柱后流出的液体, 定时定量分别收集的
仪器 。 有滴数式, 容量式, 质量式等若干种 。
4.5.2 羟基磷灰石色谱
? 羟基磷灰石（ hydroxyapatite,HAP）是一种
磷酸钙晶体，基本分子结构为
Ca10(PO4)6(OH)2。
? HAP的吸附主要基于钙离子和磷酸根离子的静
电引力，即在 HAP晶体表面存在两种不同的吸
附晶面，分别起阴、阳离子交换作用。
? A W K Tiselius et al于 1956年提出。
? 1956年 Tiselius型羟基磷灰石用于蛋白质分
离
? 1986年后出现了高效化的商品球形 HAP吸
附剂，如 Bio-Rad,Sigma,高研
（ Koken）、旭光学（ Asashi Optical ）,
东压燃料工业（ Toatsu） 等公司均有产品
出售。
? 由于 HAP晶体表面结构特别，吸附机理特殊，
可用于识别 DNA及 RNA的单链和双链。
? 可分离 IEC和 HIC难于分离的蛋白质体系。
? HAP色谱通常以磷酸盐缓冲液为流动相，采用
提高盐浓度的线性梯度脱法。
? 在中性 pH环境下酸性蛋白质（ pI＜ 7 ）主要吸
附于 C点，碱性蛋白质（ pI＞ 7）主要吸附于 P
点。利用磷酸盐缓冲液（ K2HPO4＋ KH2PO4）
为流动相洗脱展开时，磷酸根离子在 C点竞争
性吸附，交换出酸性蛋白质，而 K＋ 在 P点竞争
性吸附，交换出碱性蛋白质。
? HAP吸附剂价格便宜，远低于离子交换剂，适
用于大规模分离纯化过程，已成为单克隆抗体
的主要纯化手段。
? 如人肿瘤坏死因子
（ human tumour
necrosis factor，
hTNF） 利用 HAP层
析可分离得到 4个
洗脱峰。
4.5.3 疏水作用色谱
? 疏水作用色谱 （ hydrophobic interaction
chromatography,HIC）是利用表面偶联弱
疏水性基团（疏水性配基）的疏水性吸附剂
为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间
的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生
物大分子分离纯化的一种色谱法。
? 在离子强度较高的盐溶液中，蛋白质表面疏
水部位的水化层被破坏，裸露出疏水部位，
疏水性相互作用增大。所以，蛋白质在疏水
性吸附剂上的分配系数随流动相离子强度的
提高而增大。
? 常用的疏水性配基主要有：
①苯基
② 短链烷基（ C3～ C8）
③烷氨基
④醚基
⑤聚乙二醇
? 疏水性吸附作用与配基的疏水性（疏水链长度）
和配基密度成正比，一般配基修饰密度在 10～
40 μmol/cm3之间。
? 影响疏水性吸附的因素
①离子强度及种类
? 除离子强度外，离子的种类亦影响蛋白质的
疏水性吸附。在高价阴离子的存在下，疏水
性吸附作用力较高。
? HIC分离过程中主要利用硫酸铵、硫酸钠和氯
化钠等盐溶液为流动相，在略低于盐析点的
盐浓度下进料，然后逐渐降低流动相离子强
度进行洗脱分离。
②破坏水化作用的物质
? SCN－, CIO4－ 和 I－ 等半径较大、电荷密度低
的阴离子具有减弱水分子之间相互作用。因此，
这类阴离子称为 离液离子 （ chaotropic ion）；
相反盐析作用强的高价阴离子（如 SO42－,
HPO42－ 等）的作用正好相反，称为 反离液离
子 （ antichaotropic ion）。在离液离子存在下
疏水性吸附减弱，蛋白质易于洗脱。
? 除离液离子外，乙二醇和丙三醇等含羟基的物
质也具有影响水化的作用，降低蛋白质的疏水
性吸附作用，经常用做洗脱促进剂。
③表面活性剂
? 表面活性剂可与吸附剂及蛋白质的疏水部位
结合，从而减弱蛋白质的疏水性吸附。根据
这一原理，难溶于水的膜蛋白质可添加一定
量的表面活性剂使其溶解，利用 HIC法进行洗
脱分离。
④温度
? 疏水性吸附与一般吸附相反。蛋白质疏水部
位的失水有利于疏水性吸附，而失水是吸热
过程，即疏水性吸附为吸热过程。
? HIC分离蛋白质
? HIC的特点
? HIC可作为 IEC的补充工具。
①可直接分离盐析后的蛋白质
②疏水性吸附剂种类多，选择余地大
③疏水性相互作用机理比较复杂
例如，鼠肝 细胞色素 C氧化酶可被 Octyl
Sepharose完全吸附，而用 Decyl Sepharose为
吸附剂时，吸附作用降低；在 Butyl Sepharose
上部分吸附，而在 Phenyl Sepharose上则完全
吸附。据推测，发生这种现象的原因是该酶与
苯环之间可产生 π-π健。
4.5.4 金属螯合色谱
Metal chelate chromatography
? 首先要制备金属螯合介质：琼脂糖环氧活化后
与亚氨二乙酸盐,HN:(CH2COO)2Me偶合，
形成带有双羧甲基氨基的琼脂糖。
? Cu2+,Ni2+,Zn2+和 Co2+等过渡金属离子可与 N,S
和 O等供电原子（ electron donor atom）产生配位
键，因此可与蛋白质表面的组氨酸（ His）的咪唑基、
半胱氨酸（ Cys）的巯基和色氨酸（ Trp）的吲哚基
发生亲和结合作用，其中以 His的咪唑基的结合作用
最强。
? 除了双羧甲基氨基外，可以作为螯合形成基团的还
有：水杨酸基,8-羟基喹啉基，氨基琥珀酸基等。
? 在中性条件下，金属螯合色谱填料能与蛋白质外露
的组氨酸上的咪唑基及半胱氨酸上的巯基结合，交
换配基。
? MCC分离时，必须使金属离子对色谱填料凝
胶的亲和力大于对欲分离物质的配位亲和力。
? 金属螯合色谱主要用于要依赖金属或直接与
金属作用的蛋白质、肽类、核苷酸、核酸及
酶的分离与纯化。
? 常在 pH值为 6～ 8时蛋白质可被吸附，洗脱一
般降低 pH值、增加离子强度或在缓冲液中加
入螯合剂如 EDTA等方法进行。
4.5.5 共价作用色谱
? 共价作用色层分离法是根据巯基化合物
与色谱填料上二硫键之间的共价化学反
应面进行的色谱分离的方法。 － SH基与
－ S－ S－ 能组成一组氧化 -还原体系。
? 首先要制备色谱填料。葡聚糖凝胶通过 CNBr
方法活化后，先后用谷胱甘肽及 2,2’-吡啶基二
硫化合物处理，得到谷胱甘肽型二硫键色谱填
料。
? 凝胶也可通过环氧氯丙烷活化后，再用硫代硫
酸盐处理，得到还原型的巯基丙基型凝胶，最
后用 2,2’-吡啶基二硫化合物活化便得到巯基丙
基型的二硫健色谱填料。
? 也可用交链聚丙烯酰胺作材料制得带巯芳基的
活性色谱填料。
? 共价作用色谱分离法的操作过程：
①吸附
? 蛋白质中的半胱氨酸基，与色谱填料上的二硫
键发生共价交换反应，蛋白质被结合到色谱填
料上。
? 如果吸附后，柱上有剩余的未反应的巯基吡啶
基基团，可用 pH值 4.0低浓度（ 4 mmol/L）的
二硫苏糖醇,0.1mol/L醋酸钠缓冲液洗涤除去。
②洗脱
? 洗脱可以用 L-半胱氨酸，巯基乙醇，谷胱甘肽，
以及二硫苏糖醇等巯基化合物，在中性条件下
进行。洗脱时，若使用还原力逐次增加的巯基
化合物或者逐渐增加巯基化合物的浓度，都可
以增加蛋白质的洗脱分辨率，提高选择性。
? 洗脱时，释出的吡啶 -2-硫酮是一个发色化合物，
在 343 nm处检出。
③再生过程
? 洗脱后的色谱填料，需用 2,2’－吡啶基二硫化
合物处理再生。对于还原型的巯基丙基琼脂
糖还必须在 80℃ 下回流 3小时。
? 二硫键色谱填料价格较贵，再生操作麻烦，
目前尚未大规模的应用。但是共价结合具有
特异性，牢固并且在适当的操作条件下还可
获得较高的收率和纯度，故这种方法在某些
领域中，特别是在蛋白质序列分析过程及其
结构研究中，有着特殊的作用，甚至还可能
成为最方便快速、简单的方法而受到欢迎。
4.6 离子交换色谱
? 离子交换色谱 （ ion exchange
chromatography,IEC）利用离子交换剂为固
定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相
互作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法。
荷电溶质在离子交换剂上的分配系数可用下式
表示：
m（ I）＝ A／ IB＋ m∞
? 其中 I为流动相的离子强度,A和 B为常数,m∞
为离子强度无限大时溶质的分配系数，是静电
相互作用以外的非特异性吸附引起的溶质在离
子交换剂上的分配。
? 对于蛋白质等两性电解质，常数 A和 B为 pH的
函数。
? B为溶质的静电荷数与离子交换基的离子价数
之比。蛋白质为多价电解质，在 pH偏离等电
点的溶液中净电荷数常为两位数以上，故 B值
比较大。
? 一方面蛋白质的分配系数对离子强度非常敏感，
即离子强度的微小改变，就会引起分配系数的
很大变化；另一方面，不同蛋白质的 B值可能
相差很大。因此，如果采用离子强度不变的流
动相进行恒定洗脱，两种蛋白质的洗脱体积相
差很大，甚至分配系数大的蛋白质很难洗脱。
? 用于蛋白质等生物分子离子交换的阴离子交
换基有 DEAE（二乙胺乙基，适用范围,pH
＜ 8.6 ）, QAE（季铵乙基）。
? 阳离子交换基为 CM（羧甲基，适用范围 pH
＞ 4）,P（膦酸基）和 SP（磺丙基）。
? 常用于制备离子交换剂的介质有纤维素类、
葡聚糖系（ Sephadex）、琼脂糖系
（ Sepharose,Bio-Gel A ）、聚乙烯醇系
（ Toyopearl）和苯乙烯系（ TSK gel PW）
等。
? IEC操作很少采用恒定洗脱法，而多采用线性
梯度洗脱法（ linear gradient elution）、逐次
洗脱法（ stepwise elution）。
? IEC的应用
? 特点
? 归纳而言,IEC具有如下的特点；
①料液处理量大，具有浓缩作用，可在较高流
速下操作；
②应用范围广泛，优化操作条件可大幅度提高
分离的选择性，所需柱长较短；
③产品回收率高；
④商品化的离子交换剂种类多，选择余地大，
价格也远低于亲和吸附剂。
? 但是,IEC的操作变量远多于 GFC,影响分离
特性的因素非常复杂。
4.7 分配色谱
? 分配色谱法是靠溶质在固定相和流动相之间
的分配系数不同而分离的方法。
? 载体
? 载体是惰性、没有吸附能力，能吸留较大量
的固定相液体。分配柱色谱法中所用的载体
主要有三类：
①硅胶
②硅藻土
③纤维素
? RPC主要用于分子量低于 5000，特别是 1000
以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也
可用于蛋白质等生物大分子的分析和纯化。
但由于反相介质表面为强烈疏水性，并且流
动相为低极性有机溶剂，生物活性大分子在
RPC分离过程中容易变性失活。
? 溶质在反相介质上的分配系数取决于溶质的
疏水性，一般疏水性越大，分配系数越大。
当固定相一定时，可通过调节流动相的组成
调整溶质的分配系数。流动相的极性越大，
溶质的分配系数越大。因此 RPC多采用降低
流动相极性（水含量）的线性梯度洗脱法。
? 反相介质的商品种类繁多，其中最具代表性
的是以硅胶为载体，通过硅烷化反应在硅胶
表面键合非极性分子层制备。其中利用 C18
硅烷化试剂制备的反相介质最多，通称 ODS
（ Octadecyl silica），其次是 C8和 C4。
? 除硅胶外，高分子聚合物也可作为反相介质
的载体，如 TSK gel Octadecyl-4PW和 TSK
gel Octadecyl-NPR（聚丙烯酸酯 -C18）等。
? 反相介质性能稳定，分离效率高，可分离肽、
氨基酸、核酸、甾类、脂类、脂肪酸、糖类、
植物碱等含有非极性基团的各种物质。
4.8 凝胶过滤色谱
? 原理与操作
? GFC利用凝胶为固定相，根据中溶质相对分子
质量的差别进行分离的液相色谱法。
? 凝胶过滤介质
1,对凝胶过滤介质的要求
① 亲水性高, 表面惰性, 即介质与溶质之间不
发生任何化学或物理相互作用；
② 稳定性强, 在较宽的 pH和离子强度范围以及
化学试剂中保持稳定, 使用寿命长,
③ 具有一定的孔径分布范围；
④ 机械强度高，允许较高的操作压力 （ 流速 ） 。
2,商品化的凝胶过滤介质种类
① 葡聚糖系
? 其中 Sephadex G是最传统的软凝胶过滤介质
之一，目前仍被广泛使用。 Sephadex G是利
用葡聚糖 （ 右旋糖酐 ） 交联制备的，交联剂
一般采用环氧氯丙烷 。 Sephadex凝胶按交联
度大小，分 G 10～ G 200共八种型号。
② 琼脂糖系（ Sepharose,Bio-Gel A ）
? 琼脂糖凝胶 Sepharose是另一种较常使用的凝
胶过滤介质，机械强度较低。 Sepharose CL
是利用环氧氯丙烷交联制备的琼脂糖凝胶，
机械强度较普通 Sepharose高。
? Bio-Gel A为 Bio Rad产品。
③ 聚丙烯酰胺系（ Bio-Gel P）
④ Sephacryl
? 为丙烯基葡聚糖与 N,N’’-亚甲基双丙烯酰胺的
共聚物。
⑤ Superdex
⑥ Superose
⑦ TSK gel Toyopearl HW
? 聚乙烯醇系
⑧ Bio-beads
? 为苯乙烯与二乙烯苯的共聚物、用于非水体系。
⑨ TSK gel PW
? 为亲水性聚乙烯。 PW系列机械强度更高，适
用于高压液相色谱。
⑩ TSK gel SW
? 硅胶。
? 凝胶特性参数
① 排阻极限 （ exclusion limit）
? 凝胶过滤介质的排阻极限是指不能扩散到凝
胶网络内部的最小分子的相对分子质量。例
如 Sephadex G50的排阻极限是 30 kD,即相
对分子质量大于该数值的分子不能进入到凝
胶网络中，其洗脱体积为 V0。
② 分级范围 （ fractionation range）
? 即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离
的溶质的相对分子质量范围。 Sephadex G50
的分级范围为 1.5～ 30 kD。
③ 溶胀率
? 溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分数，
Sephadex G50的溶胀率为 500％土 30％。
④ 凝胶粒径
? 凝胶一般为球形，其粒径大小对分离度有重要
影响。粒径越小,HETP越小，分离效率越高。
凝胶粒径多用筛目或微米表示。软凝胶粒径较
大，一般为 50～ 150 μm（ 100～ 200目 ）,硬
凝胶粒径较小，一般为 5～ 50 μm 。 例如，
Sepharose和 Sephadex凝胶粒径分布为 45～
165 μm, 而 Superose和 TSK Toyopearl HW系
列可小到 20～ 40 μm, 甚至 6～ 10 μm 。
⑤ 床体积 （ bed volume）
? 即 1 g干燥凝胶溶胀后所占有的体积。
Sephadex G50的床体积为 9～ 11 cm3/g干胶。
⑥ 空隙体积 （ void volume）
? 指色谱柱中凝胶之间空隙的体积，即 V0值。空
隙体积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质
测定，一般使用平均相对分子质量为 2000 kD
的水溶性蓝色葡聚糖 （ blue dextran） 。
? 对于商品化的凝胶过滤介质，厂商的产品目录
中一般均给出其凝胶的各种性质，如分级范围、
粒径、流速与压力的关系等，可参考使用。
? 分配系数
Kd＝ （ Ve－ Vo） /Vi
0≤ Kd≤1
? MW与 Kd的关系
Kd ＝ a－ blogMW
? GFC的应用及特点
① 分离纯化
? GFC可用于相对分子
质量从几百到,106
数量级的物质的分离
纯化。右图是一例利
用高效 GFC分离骨髓
血清蛋白质的结果。
色谱柱,10× 300,Superose 6
洗脱液,0.05mol／ L磷酸盐
＋ 0.15mol／ L NaCl（ pH7.0）
流量,0.2ml／ min
1.IgA高聚体 2,IgA二聚体
3.IgA单体 4.IgG 5.白蛋白
②脱盐
? GFC在生物分离领域的另一主要用途是生物大
分子溶液的脱盐，以及除去其中的低相对分
子质量物质。
③相对分子质量的测定
? 在凝胶过滤介质的分级范围内蛋白质的分配
系数（或洗脱体积）与相对分子质量的对数
成正比，所以 GFC可用于未知物质相对分子质
量的测定。
? 不过,GFC仅对球形分子的测量精度较高，对
分子形状为棒状的物质，测量值将小于实际
值。
? GFC的具体优点如下：
① 溶质与介质不发生任何形式的相互作用，因此
可采用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，
产品收率可接近 100％；
② 每批分离操作结束后不需要进行介质的清洗或
再生，故容易实施循环操作，提高产品纯度；
③ 作为脱盐手段,GFC比透析法速度快，精度高；
与超滤法相比，剪切应力小，蛋白质活性收率
高；
④ 分离机理简单，操作参数少，容易规模放大。
? 与其他色谱法相比,GFC的不足之处在于：
① 仅根据溶质之间分子量的差别进行分离，选
择性低，料液处理量小；
② 经 GFC洗脱展开后产品被稀释。因此需要在
具有浓缩作用的单元操作 （ 如超滤、离子交
换和亲和色谱等 ） 后使用。
4.9 高速逆流色谱
? 高速逆流色谱（ High speed counter
current chromatography,HSCCC）是一
种无固相载体的连续液液分配色谱技术，
在重力与离心力场的作用下，其固定相被
保留于分离柱内，从而避免了固相载体与
样品发生化学反应变性或不可逆吸附。
? 该技术的样品回收率高，分辨率高，既适
用于微量分析也可用于大规模制备。
TBE 300V型高速逆流色谱示意图
4.10 径向色谱分离法
? 径向色谱柱的结构及原理如图所示。
? 当保持制备色谱柱直径不变，只增加柱长时，
可以线性增大样品处理量，样品的规模可在
保持相似的色谱条件下直接放大。
? 由于径向色谱柱反压降较低, 样品出峰较快,
对设备的要求较低, 通常的低压色谱系统就
可满足要求 。
? 径向色谱柱在生物制剂、血液制品及基因工
程产品等方面已广泛使用，其结果优于传统
的轴向色谱柱。
? 当色谱柱体积相差不大时 （ 径向柱大 25％ ）,
径向柱的流速为轴向柱的 3～ 3.8倍，处理量
为轴向柱的 3倍。
4.11 连续环状色谱分离法
? 连续环状色谱分离 （ continuous annular
chromatography,简写 CAC） 技术就是 80年代
以来迅速发展起来的一种连续色层分离过程。
它能够分离多组分混合物并且设备结构简单、
操作方便，故很有工业应用前景。
? CAC过程的关键是一个连续加料柱，由 Fox等
开发而成。连续加料柱由两个同心圆筒紧夹在
底板上而组成，两同心圆筒间的间距为 1cm，
空间内用适当的树脂或凝胶胶充填，在圆柱间
隙下的底盘四周有一系列小孔通向接收器。
? 环状床层绕中心轴以每分钟
0.4～ 2.0转慢速旋转的过程
中，洗脱液和料液被连续地
从床层的顶端输入。洗脱液
沿圆周方向，连续向下冲洗，
而待分离的化合物只在床层
顶端区域输入。
? 随着时间的延长，各组分从
进料位置开始在环状床层内
形成螺旋形谱带。
