5,亲和纯化
?生物亲和作用
?亲和色谱
?膜亲和过滤法
?亲和双水相萃取
?亲和反胶团萃取
?亲和沉淀
?磁性亲和分离
5.1 生物亲和作用
?生物亲和作用的本质
?影响亲和作用的因素
?亲和作用体系
5.1.1 生物亲和作用的本质
?生物分子间的这种特异性相互作用称为生物亲
和 作 用 （ bioaffinity ） 或 简 称 亲 和 作 用
（ affinity） 。
?利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理
进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化
（ affinity purification） 。
?亲和作用的分子 （ 物质 ） 对可以是：大分子 -
小分子, 大分子 -大分子, 大分子 -细胞, 细胞 -
细胞 。
?具有亲和作用的分子对之间具有, 钥匙, 和
,锁孔, 的空间结构关系 。
?亲和结合作用, 至少存在 3个对应官能团相结合：
?静电作用
?氢键
?疏水相互作用
?配位键
?弱共价键
图 5-1 蛋白质的结合部位及各种结合作用力
5.1.2 影响亲和作用的因素
1,离子强度
?离子强度影响静电引力、氢键作用、疏水相互
作用等。
2,pH
??-羧基的 pKa＝ 3.4～ 3.8
??-羧基的 pKa＝ 3.9～ 4.0
??-氨基的 pKb＝ 7.4～ 7.5
??-氨基的 pKb＝ 10.0～ 10.4
3,抑制氢键形成的物质
?脲和盐酸胍（ guanidinohydrochloric acid）
的存在可抑制氢键的形成。
4,温度
?温度升高，静电作用、氢键及金属配位键减
弱；疏水性相互作用增强 。
5,离液离子
?在 SCN－, I－ 和 ClO4－ 等离液阴离子存在下,
疏水相互作用降低 。
6,螯合剂
5.1.3 亲和作用体系
?将亲和体系中的一种分子与固体粒子共价偶联，
可特异性结合另一种分子（目标产物）,使其
从混合物中高选择性地分离纯化。
?一般将被固定的分子称为其亲和结合对象的 配
基（ ligand）,用 L表示。
?Keq越大，亲和结合作用越强。 Keq一般为 104～
108 L/mol,最高可达到 1015 L/mol 。
表 5-1 常用的亲和作用体系
特异性 亲和作用体系
高特异性 抗原 ----单克隆抗体
荷尔蒙 ----受体蛋白
核酸 ----互补碱基链段、核酸结合蛋白
酶 ----底物、产物、抑制剂
群特异性 免疫球蛋白 ----A蛋白,G蛋白
酶 ----辅酶
凝集素 ----糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体
酶、蛋白质 ----肝素
酶、蛋白质 ----活性色素（染料）
酶、蛋白质 ----过度金属离子
酶、蛋白质 ----氨基酸（组氨酸等）
5.2 亲和色谱
?亲和色谱的特点
①选择性高、特异性极强
②操作条件温和
③回收率高
?亲和色谱的局限性
①普遍性、通用性不够
②费用高
5.2.1 亲和色谱填料
?亲和吸附作用是在特定配基的存在下实现的，
需根据目标产物选择适当的亲和配基修饰固定
相粒子，制备所需的亲和吸附介质。
?少数特殊情况如 Sephadex凝胶可亲和吸附伴
刀豆球蛋白 A（一种植物凝集素）。
?在利用亲和色谱技术纯化目标产物时，商品化
的亲和吸附介质往往不能满足特殊目标产物的
需要，有必要自制亲和吸附介质。
?亲和配基
1,酶的抑制剂
?小分子抑制剂有苄脒（ benzamidine）、精氨酸
和赖氨酸等。
2,抗体
?利用抗体为配基的亲和色谱又称 免疫亲和色谱
（ immunoaffinity chromatography） 。抗体与
抗原之间的 Keq一般为 107～ 1012 L/mol。
?因此，利用免疫亲和色谱法是高度纯化蛋白质
类生物大分子的有效手段。
3,A蛋白
?protein A为分子量约 42 kD的蛋白质, 与 IgG具
有很强的亲和作用, 结合部位为 IgG分子的 Fc
片段 。 A蛋白分子上含有 5个 Fc片段可结合部
位 。
?不同 IgG的 Fc片段的结构非常相似, 因此 A蛋
白可作为各种抗体的亲和配基, 但不同抗体的
结合常数有所不同 。
?A蛋白与抗体结合并不影响抗体与抗原的结合
能力, 因此 A蛋白也可用于分离抗原 -抗体的免
疫复合体 。
4,凝集素
?凝集素 （ lectin） 是与糖特异性结合的蛋白质
（ 酶和抗体除外 ） 的总称 。
?伴刀豆球蛋白 A（ concanavalin A,con A）
可用做糖蛋白, 多糖, 糖脂等含糖生物大分子
的分析, 纯化 。 pH＜ 5.6时 con A为二聚体,
分子量为 52 kD； pH＞ 5.6时为四聚体, 分子
量为 102 kD,两个亚基 （ subunit） 之间通过
二硫键结合 。 因此, 在利用 con A为配基的亲
和色谱操作中, 操作条件应当适宜 。
5,辅酶和磷酸腺苷
?脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用 。
辅酶主要有 NAD （ nicotinamide adenine
dinucleotide）, NADP（ NAD phosphate） 和
ATP（ adenosine triphosphate） 等 。 这些辅酶
可用做脱氢酶和激酶的亲和配基 。
?AMP （ adenosine 5'-monophosphate ）,
ADP（ adenosine 2',5'-diphosphate） 的腺苷
部分与上述辅酶的结构类似, 可用做这些酶的
亲和配基 。
6,三嗪类色素
?利用色素为配基的亲和色谱法又称 色素亲和色
谱 （ Dye-ligand affinity chromatography） 。
?Triazine dyes是一类分子内含有三嗪环的合成
染料, 与 NAD的结合部位相同, 又称为 生体模
拟色素 （ biomimetic dye） 。 除脱氢酶和激酶
外, 三嗪类色素还与血清白蛋白,
干扰素, 核酸酶和糖解酶
等具有很高的亲和力 。
?Cibacron Blue F3GA,
7,过渡金属离子
?Cu2+,Ni2+,Zn2+和 Co2+等过渡金属离子可通
过与亚胺二乙酸（ IDA）或三羧甲基乙二胺
（ TED）形成螯合金属盐固定在固定相粒子表
面，用做亲和吸附蛋白质的配基。
?这种利用金属离子为配基的亲和色谱一般称为
金属螯合色谱（ metal chelate
chromatography） 或 固定化金属离子亲和色谱
（ immobilized metal affinity chromatography，
IMAC） 。
8,组氨酸
?组氨酸可与蛋白质发生亲和结合作用：静电和
疏水性相互作用均有可能参与亲和结合。
?在盐浓度较低和 pH约等于目标蛋白质 pI的溶液
中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着
盐浓度增大，亲和吸附作用降低。
5,肝素
?肝素 （ heparin） 是存在于哺乳动物的肝, 肺,
肠等脏器中的酸性多糖类物质, 分子量一般为 5
至 30 kD,具有抗凝血作用 。
?肝素与脂蛋白, 脂肪酶, 甾体受体, 限制性核
酸内切酶, 抗凝血酶, 凝血蛋白质等具有亲和
作用, 可用作这些物质的亲和配基 。
?肝素的亲和结合作用在中性 pH和低浓度盐溶液
中较强, 随着盐浓度的增大结合作用降低 。
?亲和色谱填料载体
?亲和色谱的理想载体应具有下列特性：
①不溶性；
②渗透性；
③高硬度及适当的颗粒形式；
④最低的吸附力；
⑤较好的化学稳定性；
⑥抗微生物和酶的侵蚀；
⑦亲水性；
⑧具有大量的供反应的化学基团。
?常规的亲和色谱填料都是以软质凝胶，诸如 葡
聚糖, 琼脂糖, 聚丙烯酰胺 等作为载体材料的。
?近年来，为了满足快速高效分离的需要，以 多
孔硅胶 和 合成高分子化合物 为载体的高效 AFC
色谱填料，得以迅速发展。
?亲和色谱填料的制备过程一般包括：载体
（ carrier,support）的选择、载体的活化和配
基的连接。
?部分商品化的色谱填料见表 5-2。
表 5-2 部分商品化的色谱填料
?载体的活化和配基的连接
1,溴化腈活化法
?用于多糖凝胶的活化，固定活性基团为氨基的
配基（ R-NH2）。溴化腈（ CNBr）对多糖类载
体的活化在碱性（ pH＞ 10）条件下数分钟即可
完成，之后的配基修饰亦需在碱性条件进行，
一般使用碳酸盐缓冲液。反应过程为：
2,环氧基活化法
?可用于固定分子结构为 R-NH2,R-OH和 R-SH
的配基。常用的活化试剂为 1,4-丁二醇 -二缩水
甘油醚（ BGE）和环氧氯丙烷。
?以活化羟基为例：
?或引入活性基团环氧基后，可采用下述直接法
或间接法（氧化法、碳二亚胺法、戊二醛法）
固定配基。
3,硅胶的活化
?活化硅胶常采用硅烷化试剂，如 γ-氨丙基三甲
（乙）氧硅烷和环氧丙基三甲基硅烷等，反应为：
?引入活性氨基或环氧基后，在酸性溶液中环氧基
可发生二醇化反应：
4,间隔臂
?当配基较小时，将其直接固定在载体上，会由
于载体的空间位阻，配基大分子不能发生有效
的亲和吸附作用。
这时，需要在配基
与载体之间连接一
个“间隔臂（ spacer）”，
使其发生有效的亲
和结合。
图 5-2 间隔臂的作用
?在上述配基固定化方法中，环氧基活化法中的
双环氧化合物起间隔臂的作用。
?事实上，除 CNBr活化法外，其他活化法都引入
了不同的活性基因，这些活性基团如果有适当
的长度，都可起到间隔臂的作用。
?利用 CNBr活化法固定小分子配基时，一般需先
引入 ω-氨基已酸或 1,6-二氨基已烷后再用相应
的方法固定配基。
?引入间隔臂的长度是有一定限制的，当间隔臂
超过一定长度时，配基与目标分子的亲和力又
会减弱。
5.2.2 亲和色谱洗脱方法
?特异性洗脱法
?利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合
作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲
和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产
物。
?例如,Lys和 Arg均为 t-PA的抑制剂，利用固定
化 Lys为配基亲和分离 t-PA时，可用 Arg溶液进
行洗脱 。
?利用 con A为配基的目标产物可用葡萄糖溶液洗
脱。
?特异性洗脱法的洗脱条件温和，有利于保护目
标产物的生物活性，另外，由于仅特异性洗脱
目标产物，对于特异性较低的亲和体系（例如，
用三嗪类色素为配基时）或非特异性吸附较严
重的物系，特异性洗脱法有利于提高目标产物
的纯度。
?非特异性洗脱法
?非特异性洗脱通过调节洗脱液的 pH值、离子强
度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物
的亲和吸附作用，是使用较多的洗脱方法。
8.2.3 应用举例
1,t-PA的纯化
?组织纤溶酶原激活剂（ t-PA）是一种糖蛋白，
具有激活纤溶酶原、促进血纤维蛋白溶解的作
用，是治疗血栓等心脑血管疾病的蛋白药物。
?赖氨酸、精氨酸、氨基苄脒和纤维蛋白与 t-PA
具有亲和结合作用，常用做亲和色谱纯化 t-PA
的配基。
?图 5-3是利用精氨酸 -Sepharose 4B亲和色谱法
纯化猪心组织 t-PA的结果。原料为猪心丙酮粉
经醋酸钾抽提、硫酸铵沉淀。
图 5-3 精氨酸 -
Sepharose 4B
亲和色谱
2,干扰素的纯化
?干扰素（ interferon,IFN） 对癌症、肝炎等疾
病具有特殊疗效。
?IFN主要分 α,β和 γ三种类型, 可通过动物细胞
培养或重组 DNA大肠杆菌发酵大量生产 。
?色素亲和色谱, 固定化金属离子亲和色谱和免
疫亲和色谱可用于 IFN的纯化 。
?如图 5-3是利用单抗免疫亲和色谱法纯化源于大
肠杆菌的重组人白细胞干扰素 （ rhIFN- α） 的
操作条件和结果 。 rhIFN- α的比活提高了 1150
倍, 收率达 95％ 。
图 5-4 单抗免
疫亲和色谱法
纯化 rhIFN-α
5.3 膜亲和过滤法
?自 20世纪 80年代中期以来，把亲和色谱技术和
膜分离技术两种技术有机地结合，出现了膜亲
和过滤方法 。
?膜亲和过滤方法包括两个分支：
?亲和膜分离技术
?亲和错流过滤
5.3.1 亲和膜分离
?原理和特点
?亲和膜 （ affinity membrane） 是利用亲和配
基修饰的膜 。
?亲和膜分离是以亲和膜为亲和吸附介质纯
化目标产物的分离方法, 是亲和色谱的变
型 。 又称 膜亲和色谱 （ membrane-based
affinity chromatography） 。
?亲和色谱操作速度有限。一般采用径向放大的
方式，才能保证色谱柱的处理量。
?如果色谱柱的体积一定，降低柱高而增大柱径
可即, 短粗”型亲和色谱柱有利于提高分离速
度。
?亲和配基固定
在膜孔表面，
流体在对流透
过膜的过程中
目标蛋白质与
配基接触而被
吸附。
图 5-5 亲和膜吸附原理示意图
?应用举例
?色素亲和膜纯
化 G6PDH,在
9 min内即完成
了 0.6 L料液的
纯化处理，
G6PDH收率达
82％，比活提
高 27倍。
图 5-6 色素亲和膜纯化 G6PDH
5.3.2 亲和错流过滤
?原理和特点
?亲和错流过滤（ affinity cross-flow filtration，
ACFF）又称亲和过滤（ affinity filtration）或亲
和超滤（ affinity ultrafiltration），是生物亲和
相互作用与膜分离相结合的生物大分子的分离
纯化技术。
?亲和过滤操作
图 5-7 亲和过滤操作
?亲和过滤的优点
① 以压差为传质推动力, 速度快, 易于放大；
② 纯化水平可接近或达到亲和色谱；
③ 制备亲和过滤介质所用的载体一般为水溶性聚
合物或无孔微粒, 无内扩散传质阻力, 目标分
子的亲和结合速度快；
?与固定床型亲和色谱相比, 亲和过滤操作中目
标分子与亲和过滤介质的接触在全混槽中进行,
最多只能达到一级吸附平衡, 相当于色谱过程
的一个理论塔板 。 采用多级串联亲和过滤操作
可弥补这一缺点 。
?应用举例
?利用高温杀死的酵母细胞为亲和过滤介质进行
亲和过滤纯化 con A的研究 。
?酵母细胞 （ 直径约 5 μm） 表面含有多糖残基,
因此可亲和吸附 con A。 利用中空纤维膜组件
的间歇亲和过滤流程示于图 5-8.
?0
图 5-8 中空纤维膜组件的亲和过滤流程
5.4 亲和双水相萃取
? 亲和双水相萃取 即在 PEG或 Dextran上接上
一定的亲和配基，这样使体系具有双水相处
理量大和亲和色谱专一性高的优点。
? 随着亲和双水相萃取体系的完善，更显示出
其在生物物质分离中的独特优点。
?近几年来，仅在 PEG上可接的配基就有十多种，
分离纯化的物质达几十种，产物的分配系数成
百上千倍的提高，如用磷酸酯 PEG／ 磷酸盐双
水相体系萃取 -β干扰素，分配系数由原来的 1左
右提高到 630。
5.5 亲和反胶团萃取
?亲和反胶团萃取 （ affinity-based reversed
micellar extraction）是指在反胶团相中除通常
的表面活性剂（如 AOT）以外，添加另一种亲
水头部为目标分子的亲和配基的助表面活性剂
（ cosurfactant），通过亲和配基与目标分子的
亲和结合作用，促进目标产物在反胶团相的分
配，提高目标产物的分配系数和反胶团萃取分
离的选择性的分离方法。
图 5-9 亲和反
胶团萃取 con A
利用正辛基 -β-D-吡喃葡萄糖苷
（ octyl-β-D-glucopyranoside，
OGP）提高 con A的萃取率
5.6 亲和沉淀
?亲和沉淀（ affinity precipitation）是生物亲和相
互作用与沉淀分离相结合的蛋白质类生物大分
子的分离纯化技术。
?亲和沉淀又分
?一次作用亲和沉淀
?二次作用亲和沉淀
5.6.1 一次作用亲和沉淀
?水溶性化合物分子上偶联双配基（ bis-ligand）
或多配基（ polyligand）与多价蛋白质
（ multivalentprotein）产生亲和交联而沉淀的
分离方法称为 一次作用亲和沉淀（ primary-
effect affinity precipitation） 。
?一次作用亲和沉淀机理与抗原 -抗体的沉淀作用
相似，当配基与蛋白质的亲和结合部位的摩尔
比为 1时沉淀率最高。
?1979年 Larsson和 Mosbach发表了利用双辅酶
Ⅰ （ bis-NAD）亲和沉淀乳酸脱氢酶（ LDH）
的研究。
?1983年，利用三嗪色素（ Procion Blue H-B）
为配基的一次作用亲和沉淀法纯化免肌 LDH，
收率达 97％，纯度达电泳纯。
?一次作用亲和沉淀仅适用于多价蛋白质，要求
配基与目标分子的亲和结合常数较高，沉淀条
件难于掌握，并且沉淀的目标分子与双配基的
分离困难，实用上存在较大难度。
5.6.2 二次作用亲和沉淀
?利用在物理场（如 pH,离子强度、温度和添加
金属金子等）改变时溶解度下降、发生可逆性
沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配基，制
备亲和沉淀介质。
?亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场使
介质与目标分子共同沉淀的方法称为 二次作用
亲和沉淀（ secondary-effect affinity
precipitation）。
?早期开发的可逆沉淀性亲和载体分子结构如下 。
其中的苄脒基为胰蛋白酶的亲和配基, 而苯甲
酸基为 pH敏感基团 。
?该聚合物可溶解于 pH＞ 6的水溶液, 但当 pH＜
5时即可发生完全的沉淀 。
?例 牛胰蛋白酶的纯化
① 将该聚合物加入到 pH 8.0的牛胰抽提液中, 充
分混合 。
② 加酸使 pH值降至 4.0,则聚合物与胰蛋白酶结
合沉淀 。
③ 离心回收沉淀, 并用 pH 4.0的水溶液清洗 。
④ 再加酸使 pH降至 2.0,洗脱回收胰蛋白酶 。
?利用该方法纯化牛胰蛋白酶的收率为 76％, 纯
度提 5.4倍, 达 92％ 。
?二十五 -10,12-二炔 -1-醇磷脂乙醇胺
[CH3（ CH2） 11C≡C-C≡C（ CH2） 9OPO3HCH2 CH2NH2]
水悬浮液在超声波处理下形成 0.1～ 0.2 μm的
脂质体（ liposome），表面为亲水性乙醇胺
基团。
该脂质体溶液在紫外线照射
下可发生聚合反应，形成聚
合脂质体（ polymerized
liposome,PLS）。 PLS具有
在盐的作用下发生可逆性沉
淀的性质。
?利用这一性质，将粗制大豆胰蛋白酶抑制剂
（ STI）共价偶联在 PLS表面，制成亲和沉淀介
质 STI-PLS。 利用 STI-PLS亲和沉淀纯化胰蛋白
酶收率保持在 80%以上，纯化倍数达 5.6以上。
5.7 磁性亲和分离
?磁性亲和分离的载体为磁性高分子微球。
?磁性高分子微球是指含有磁性金属或金属氧化
物（如 Fe,Co,Ni及其氧化物）的超细粉末而
具有磁响应性的高分子微球。
?磁性高分子微球的制备
?表面化学修饰
?磁性分离装置
?磁性高分子微球的应用
磁性高分子微球的制备
?磁性高分子微球一般为核／壳式结构。
?包埋法
?包埋法是将磁性粒子分散于高分子溶液中，通
过雾化、絮凝、沉积、蒸发等手段得到磁性高
分子微球。
?单体聚合法
?单体聚合法是在磁性粒子和单体存在下，加入
引发剂、稳定剂等进行聚合反应，得到内部包
有磁性微粒的高分子微球。
?具体方法主要有：悬浮聚合、分散聚合、乳液
聚合）和辐射聚合等。
表面化学修饰
?表面功能化
?配基固定化
磁性分离装置
?间歇式磁性分离装置
?流动式磁性分离装置
?梯度高磁性分离装置
?磁场稳定流态化床
磁性高分子微球的应用
?细胞分离
?固定化酶
?靶向药物
?两相分离
?亲和分离
?生物亲和作用
?亲和色谱
?膜亲和过滤法
?亲和双水相萃取
?亲和反胶团萃取
?亲和沉淀
?磁性亲和分离
5.1 生物亲和作用
?生物亲和作用的本质
?影响亲和作用的因素
?亲和作用体系
5.1.1 生物亲和作用的本质
?生物分子间的这种特异性相互作用称为生物亲
和 作 用 （ bioaffinity ） 或 简 称 亲 和 作 用
（ affinity） 。
?利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理
进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化
（ affinity purification） 。
?亲和作用的分子 （ 物质 ） 对可以是：大分子 -
小分子, 大分子 -大分子, 大分子 -细胞, 细胞 -
细胞 。
?具有亲和作用的分子对之间具有, 钥匙, 和
,锁孔, 的空间结构关系 。
?亲和结合作用, 至少存在 3个对应官能团相结合：
?静电作用
?氢键
?疏水相互作用
?配位键
?弱共价键
图 5-1 蛋白质的结合部位及各种结合作用力
5.1.2 影响亲和作用的因素
1,离子强度
?离子强度影响静电引力、氢键作用、疏水相互
作用等。
2,pH
??-羧基的 pKa＝ 3.4～ 3.8
??-羧基的 pKa＝ 3.9～ 4.0
??-氨基的 pKb＝ 7.4～ 7.5
??-氨基的 pKb＝ 10.0～ 10.4
3,抑制氢键形成的物质
?脲和盐酸胍（ guanidinohydrochloric acid）
的存在可抑制氢键的形成。
4,温度
?温度升高，静电作用、氢键及金属配位键减
弱；疏水性相互作用增强 。
5,离液离子
?在 SCN－, I－ 和 ClO4－ 等离液阴离子存在下,
疏水相互作用降低 。
6,螯合剂
5.1.3 亲和作用体系
?将亲和体系中的一种分子与固体粒子共价偶联，
可特异性结合另一种分子（目标产物）,使其
从混合物中高选择性地分离纯化。
?一般将被固定的分子称为其亲和结合对象的 配
基（ ligand）,用 L表示。
?Keq越大，亲和结合作用越强。 Keq一般为 104～
108 L/mol,最高可达到 1015 L/mol 。
表 5-1 常用的亲和作用体系
特异性 亲和作用体系
高特异性 抗原 ----单克隆抗体
荷尔蒙 ----受体蛋白
核酸 ----互补碱基链段、核酸结合蛋白
酶 ----底物、产物、抑制剂
群特异性 免疫球蛋白 ----A蛋白,G蛋白
酶 ----辅酶
凝集素 ----糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体
酶、蛋白质 ----肝素
酶、蛋白质 ----活性色素（染料）
酶、蛋白质 ----过度金属离子
酶、蛋白质 ----氨基酸（组氨酸等）
5.2 亲和色谱
?亲和色谱的特点
①选择性高、特异性极强
②操作条件温和
③回收率高
?亲和色谱的局限性
①普遍性、通用性不够
②费用高
5.2.1 亲和色谱填料
?亲和吸附作用是在特定配基的存在下实现的，
需根据目标产物选择适当的亲和配基修饰固定
相粒子，制备所需的亲和吸附介质。
?少数特殊情况如 Sephadex凝胶可亲和吸附伴
刀豆球蛋白 A（一种植物凝集素）。
?在利用亲和色谱技术纯化目标产物时，商品化
的亲和吸附介质往往不能满足特殊目标产物的
需要，有必要自制亲和吸附介质。
?亲和配基
1,酶的抑制剂
?小分子抑制剂有苄脒（ benzamidine）、精氨酸
和赖氨酸等。
2,抗体
?利用抗体为配基的亲和色谱又称 免疫亲和色谱
（ immunoaffinity chromatography） 。抗体与
抗原之间的 Keq一般为 107～ 1012 L/mol。
?因此，利用免疫亲和色谱法是高度纯化蛋白质
类生物大分子的有效手段。
3,A蛋白
?protein A为分子量约 42 kD的蛋白质, 与 IgG具
有很强的亲和作用, 结合部位为 IgG分子的 Fc
片段 。 A蛋白分子上含有 5个 Fc片段可结合部
位 。
?不同 IgG的 Fc片段的结构非常相似, 因此 A蛋
白可作为各种抗体的亲和配基, 但不同抗体的
结合常数有所不同 。
?A蛋白与抗体结合并不影响抗体与抗原的结合
能力, 因此 A蛋白也可用于分离抗原 -抗体的免
疫复合体 。
4,凝集素
?凝集素 （ lectin） 是与糖特异性结合的蛋白质
（ 酶和抗体除外 ） 的总称 。
?伴刀豆球蛋白 A（ concanavalin A,con A）
可用做糖蛋白, 多糖, 糖脂等含糖生物大分子
的分析, 纯化 。 pH＜ 5.6时 con A为二聚体,
分子量为 52 kD； pH＞ 5.6时为四聚体, 分子
量为 102 kD,两个亚基 （ subunit） 之间通过
二硫键结合 。 因此, 在利用 con A为配基的亲
和色谱操作中, 操作条件应当适宜 。
5,辅酶和磷酸腺苷
?脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用 。
辅酶主要有 NAD （ nicotinamide adenine
dinucleotide）, NADP（ NAD phosphate） 和
ATP（ adenosine triphosphate） 等 。 这些辅酶
可用做脱氢酶和激酶的亲和配基 。
?AMP （ adenosine 5'-monophosphate ）,
ADP（ adenosine 2',5'-diphosphate） 的腺苷
部分与上述辅酶的结构类似, 可用做这些酶的
亲和配基 。
6,三嗪类色素
?利用色素为配基的亲和色谱法又称 色素亲和色
谱 （ Dye-ligand affinity chromatography） 。
?Triazine dyes是一类分子内含有三嗪环的合成
染料, 与 NAD的结合部位相同, 又称为 生体模
拟色素 （ biomimetic dye） 。 除脱氢酶和激酶
外, 三嗪类色素还与血清白蛋白,
干扰素, 核酸酶和糖解酶
等具有很高的亲和力 。
?Cibacron Blue F3GA,
7,过渡金属离子
?Cu2+,Ni2+,Zn2+和 Co2+等过渡金属离子可通
过与亚胺二乙酸（ IDA）或三羧甲基乙二胺
（ TED）形成螯合金属盐固定在固定相粒子表
面，用做亲和吸附蛋白质的配基。
?这种利用金属离子为配基的亲和色谱一般称为
金属螯合色谱（ metal chelate
chromatography） 或 固定化金属离子亲和色谱
（ immobilized metal affinity chromatography，
IMAC） 。
8,组氨酸
?组氨酸可与蛋白质发生亲和结合作用：静电和
疏水性相互作用均有可能参与亲和结合。
?在盐浓度较低和 pH约等于目标蛋白质 pI的溶液
中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着
盐浓度增大，亲和吸附作用降低。
5,肝素
?肝素 （ heparin） 是存在于哺乳动物的肝, 肺,
肠等脏器中的酸性多糖类物质, 分子量一般为 5
至 30 kD,具有抗凝血作用 。
?肝素与脂蛋白, 脂肪酶, 甾体受体, 限制性核
酸内切酶, 抗凝血酶, 凝血蛋白质等具有亲和
作用, 可用作这些物质的亲和配基 。
?肝素的亲和结合作用在中性 pH和低浓度盐溶液
中较强, 随着盐浓度的增大结合作用降低 。
?亲和色谱填料载体
?亲和色谱的理想载体应具有下列特性：
①不溶性；
②渗透性；
③高硬度及适当的颗粒形式；
④最低的吸附力；
⑤较好的化学稳定性；
⑥抗微生物和酶的侵蚀；
⑦亲水性；
⑧具有大量的供反应的化学基团。
?常规的亲和色谱填料都是以软质凝胶，诸如 葡
聚糖, 琼脂糖, 聚丙烯酰胺 等作为载体材料的。
?近年来，为了满足快速高效分离的需要，以 多
孔硅胶 和 合成高分子化合物 为载体的高效 AFC
色谱填料，得以迅速发展。
?亲和色谱填料的制备过程一般包括：载体
（ carrier,support）的选择、载体的活化和配
基的连接。
?部分商品化的色谱填料见表 5-2。
表 5-2 部分商品化的色谱填料
?载体的活化和配基的连接
1,溴化腈活化法
?用于多糖凝胶的活化，固定活性基团为氨基的
配基（ R-NH2）。溴化腈（ CNBr）对多糖类载
体的活化在碱性（ pH＞ 10）条件下数分钟即可
完成，之后的配基修饰亦需在碱性条件进行，
一般使用碳酸盐缓冲液。反应过程为：
2,环氧基活化法
?可用于固定分子结构为 R-NH2,R-OH和 R-SH
的配基。常用的活化试剂为 1,4-丁二醇 -二缩水
甘油醚（ BGE）和环氧氯丙烷。
?以活化羟基为例：
?或引入活性基团环氧基后，可采用下述直接法
或间接法（氧化法、碳二亚胺法、戊二醛法）
固定配基。
3,硅胶的活化
?活化硅胶常采用硅烷化试剂，如 γ-氨丙基三甲
（乙）氧硅烷和环氧丙基三甲基硅烷等，反应为：
?引入活性氨基或环氧基后，在酸性溶液中环氧基
可发生二醇化反应：
4,间隔臂
?当配基较小时，将其直接固定在载体上，会由
于载体的空间位阻，配基大分子不能发生有效
的亲和吸附作用。
这时，需要在配基
与载体之间连接一
个“间隔臂（ spacer）”，
使其发生有效的亲
和结合。
图 5-2 间隔臂的作用
?在上述配基固定化方法中，环氧基活化法中的
双环氧化合物起间隔臂的作用。
?事实上，除 CNBr活化法外，其他活化法都引入
了不同的活性基因，这些活性基团如果有适当
的长度，都可起到间隔臂的作用。
?利用 CNBr活化法固定小分子配基时，一般需先
引入 ω-氨基已酸或 1,6-二氨基已烷后再用相应
的方法固定配基。
?引入间隔臂的长度是有一定限制的，当间隔臂
超过一定长度时，配基与目标分子的亲和力又
会减弱。
5.2.2 亲和色谱洗脱方法
?特异性洗脱法
?利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合
作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲
和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产
物。
?例如,Lys和 Arg均为 t-PA的抑制剂，利用固定
化 Lys为配基亲和分离 t-PA时，可用 Arg溶液进
行洗脱 。
?利用 con A为配基的目标产物可用葡萄糖溶液洗
脱。
?特异性洗脱法的洗脱条件温和，有利于保护目
标产物的生物活性，另外，由于仅特异性洗脱
目标产物，对于特异性较低的亲和体系（例如，
用三嗪类色素为配基时）或非特异性吸附较严
重的物系，特异性洗脱法有利于提高目标产物
的纯度。
?非特异性洗脱法
?非特异性洗脱通过调节洗脱液的 pH值、离子强
度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物
的亲和吸附作用，是使用较多的洗脱方法。
8.2.3 应用举例
1,t-PA的纯化
?组织纤溶酶原激活剂（ t-PA）是一种糖蛋白，
具有激活纤溶酶原、促进血纤维蛋白溶解的作
用，是治疗血栓等心脑血管疾病的蛋白药物。
?赖氨酸、精氨酸、氨基苄脒和纤维蛋白与 t-PA
具有亲和结合作用，常用做亲和色谱纯化 t-PA
的配基。
?图 5-3是利用精氨酸 -Sepharose 4B亲和色谱法
纯化猪心组织 t-PA的结果。原料为猪心丙酮粉
经醋酸钾抽提、硫酸铵沉淀。
图 5-3 精氨酸 -
Sepharose 4B
亲和色谱
2,干扰素的纯化
?干扰素（ interferon,IFN） 对癌症、肝炎等疾
病具有特殊疗效。
?IFN主要分 α,β和 γ三种类型, 可通过动物细胞
培养或重组 DNA大肠杆菌发酵大量生产 。
?色素亲和色谱, 固定化金属离子亲和色谱和免
疫亲和色谱可用于 IFN的纯化 。
?如图 5-3是利用单抗免疫亲和色谱法纯化源于大
肠杆菌的重组人白细胞干扰素 （ rhIFN- α） 的
操作条件和结果 。 rhIFN- α的比活提高了 1150
倍, 收率达 95％ 。
图 5-4 单抗免
疫亲和色谱法
纯化 rhIFN-α
5.3 膜亲和过滤法
?自 20世纪 80年代中期以来，把亲和色谱技术和
膜分离技术两种技术有机地结合，出现了膜亲
和过滤方法 。
?膜亲和过滤方法包括两个分支：
?亲和膜分离技术
?亲和错流过滤
5.3.1 亲和膜分离
?原理和特点
?亲和膜 （ affinity membrane） 是利用亲和配
基修饰的膜 。
?亲和膜分离是以亲和膜为亲和吸附介质纯
化目标产物的分离方法, 是亲和色谱的变
型 。 又称 膜亲和色谱 （ membrane-based
affinity chromatography） 。
?亲和色谱操作速度有限。一般采用径向放大的
方式，才能保证色谱柱的处理量。
?如果色谱柱的体积一定，降低柱高而增大柱径
可即, 短粗”型亲和色谱柱有利于提高分离速
度。
?亲和配基固定
在膜孔表面，
流体在对流透
过膜的过程中
目标蛋白质与
配基接触而被
吸附。
图 5-5 亲和膜吸附原理示意图
?应用举例
?色素亲和膜纯
化 G6PDH,在
9 min内即完成
了 0.6 L料液的
纯化处理，
G6PDH收率达
82％，比活提
高 27倍。
图 5-6 色素亲和膜纯化 G6PDH
5.3.2 亲和错流过滤
?原理和特点
?亲和错流过滤（ affinity cross-flow filtration，
ACFF）又称亲和过滤（ affinity filtration）或亲
和超滤（ affinity ultrafiltration），是生物亲和
相互作用与膜分离相结合的生物大分子的分离
纯化技术。
?亲和过滤操作
图 5-7 亲和过滤操作
?亲和过滤的优点
① 以压差为传质推动力, 速度快, 易于放大；
② 纯化水平可接近或达到亲和色谱；
③ 制备亲和过滤介质所用的载体一般为水溶性聚
合物或无孔微粒, 无内扩散传质阻力, 目标分
子的亲和结合速度快；
?与固定床型亲和色谱相比, 亲和过滤操作中目
标分子与亲和过滤介质的接触在全混槽中进行,
最多只能达到一级吸附平衡, 相当于色谱过程
的一个理论塔板 。 采用多级串联亲和过滤操作
可弥补这一缺点 。
?应用举例
?利用高温杀死的酵母细胞为亲和过滤介质进行
亲和过滤纯化 con A的研究 。
?酵母细胞 （ 直径约 5 μm） 表面含有多糖残基,
因此可亲和吸附 con A。 利用中空纤维膜组件
的间歇亲和过滤流程示于图 5-8.
?0
图 5-8 中空纤维膜组件的亲和过滤流程
5.4 亲和双水相萃取
? 亲和双水相萃取 即在 PEG或 Dextran上接上
一定的亲和配基，这样使体系具有双水相处
理量大和亲和色谱专一性高的优点。
? 随着亲和双水相萃取体系的完善，更显示出
其在生物物质分离中的独特优点。
?近几年来，仅在 PEG上可接的配基就有十多种，
分离纯化的物质达几十种，产物的分配系数成
百上千倍的提高，如用磷酸酯 PEG／ 磷酸盐双
水相体系萃取 -β干扰素，分配系数由原来的 1左
右提高到 630。
5.5 亲和反胶团萃取
?亲和反胶团萃取 （ affinity-based reversed
micellar extraction）是指在反胶团相中除通常
的表面活性剂（如 AOT）以外，添加另一种亲
水头部为目标分子的亲和配基的助表面活性剂
（ cosurfactant），通过亲和配基与目标分子的
亲和结合作用，促进目标产物在反胶团相的分
配，提高目标产物的分配系数和反胶团萃取分
离的选择性的分离方法。
图 5-9 亲和反
胶团萃取 con A
利用正辛基 -β-D-吡喃葡萄糖苷
（ octyl-β-D-glucopyranoside，
OGP）提高 con A的萃取率
5.6 亲和沉淀
?亲和沉淀（ affinity precipitation）是生物亲和相
互作用与沉淀分离相结合的蛋白质类生物大分
子的分离纯化技术。
?亲和沉淀又分
?一次作用亲和沉淀
?二次作用亲和沉淀
5.6.1 一次作用亲和沉淀
?水溶性化合物分子上偶联双配基（ bis-ligand）
或多配基（ polyligand）与多价蛋白质
（ multivalentprotein）产生亲和交联而沉淀的
分离方法称为 一次作用亲和沉淀（ primary-
effect affinity precipitation） 。
?一次作用亲和沉淀机理与抗原 -抗体的沉淀作用
相似，当配基与蛋白质的亲和结合部位的摩尔
比为 1时沉淀率最高。
?1979年 Larsson和 Mosbach发表了利用双辅酶
Ⅰ （ bis-NAD）亲和沉淀乳酸脱氢酶（ LDH）
的研究。
?1983年，利用三嗪色素（ Procion Blue H-B）
为配基的一次作用亲和沉淀法纯化免肌 LDH，
收率达 97％，纯度达电泳纯。
?一次作用亲和沉淀仅适用于多价蛋白质，要求
配基与目标分子的亲和结合常数较高，沉淀条
件难于掌握，并且沉淀的目标分子与双配基的
分离困难，实用上存在较大难度。
5.6.2 二次作用亲和沉淀
?利用在物理场（如 pH,离子强度、温度和添加
金属金子等）改变时溶解度下降、发生可逆性
沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配基，制
备亲和沉淀介质。
?亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场使
介质与目标分子共同沉淀的方法称为 二次作用
亲和沉淀（ secondary-effect affinity
precipitation）。
?早期开发的可逆沉淀性亲和载体分子结构如下 。
其中的苄脒基为胰蛋白酶的亲和配基, 而苯甲
酸基为 pH敏感基团 。
?该聚合物可溶解于 pH＞ 6的水溶液, 但当 pH＜
5时即可发生完全的沉淀 。
?例 牛胰蛋白酶的纯化
① 将该聚合物加入到 pH 8.0的牛胰抽提液中, 充
分混合 。
② 加酸使 pH值降至 4.0,则聚合物与胰蛋白酶结
合沉淀 。
③ 离心回收沉淀, 并用 pH 4.0的水溶液清洗 。
④ 再加酸使 pH降至 2.0,洗脱回收胰蛋白酶 。
?利用该方法纯化牛胰蛋白酶的收率为 76％, 纯
度提 5.4倍, 达 92％ 。
?二十五 -10,12-二炔 -1-醇磷脂乙醇胺
[CH3（ CH2） 11C≡C-C≡C（ CH2） 9OPO3HCH2 CH2NH2]
水悬浮液在超声波处理下形成 0.1～ 0.2 μm的
脂质体（ liposome），表面为亲水性乙醇胺
基团。
该脂质体溶液在紫外线照射
下可发生聚合反应，形成聚
合脂质体（ polymerized
liposome,PLS）。 PLS具有
在盐的作用下发生可逆性沉
淀的性质。
?利用这一性质，将粗制大豆胰蛋白酶抑制剂
（ STI）共价偶联在 PLS表面，制成亲和沉淀介
质 STI-PLS。 利用 STI-PLS亲和沉淀纯化胰蛋白
酶收率保持在 80%以上，纯化倍数达 5.6以上。
5.7 磁性亲和分离
?磁性亲和分离的载体为磁性高分子微球。
?磁性高分子微球是指含有磁性金属或金属氧化
物（如 Fe,Co,Ni及其氧化物）的超细粉末而
具有磁响应性的高分子微球。
?磁性高分子微球的制备
?表面化学修饰
?磁性分离装置
?磁性高分子微球的应用
磁性高分子微球的制备
?磁性高分子微球一般为核／壳式结构。
?包埋法
?包埋法是将磁性粒子分散于高分子溶液中，通
过雾化、絮凝、沉积、蒸发等手段得到磁性高
分子微球。
?单体聚合法
?单体聚合法是在磁性粒子和单体存在下，加入
引发剂、稳定剂等进行聚合反应，得到内部包
有磁性微粒的高分子微球。
?具体方法主要有：悬浮聚合、分散聚合、乳液
聚合）和辐射聚合等。
表面化学修饰
?表面功能化
?配基固定化
磁性分离装置
?间歇式磁性分离装置
?流动式磁性分离装置
?梯度高磁性分离装置
?磁场稳定流态化床
磁性高分子微球的应用
?细胞分离
?固定化酶
?靶向药物
?两相分离
?亲和分离
