动物繁殖学实训教材 郑州牧专畜牧工程系动物繁殖学课程组 张长兴 遗传与繁殖是动物生命的基本特征，遗传和育种技术是从遗传角度提高家畜生产力的手段，而繁殖管理则是畜牧生产的核心工作，是育种和动物再生产的必须途径。因此家畜繁育技术是畜牧专业的基本技术，为从事畜牧生产奠定繁育方面的基础。 实训一 母畜的发情鉴定技术 一、目的要求 掌握母畜发情的基本规律，母畜发情鉴定的基本方法和各种家畜发情的特点及配种时间的掌握。 二、实训内容 母畜发情鉴定的基本方法；牛、羊、猪的发情鉴定技术 三、主要用品 六柱保定架、开膣器、试情栏、试情布、肥皂或石蜡油、酒精棉球、镊子、毛巾、指甲钳、长臂手套、发情记录本等 四、技术要求 （一）外部观察法 1．适用动物：适用于各种家畜，尤其适用于外部表现明显，发情期短的家畜及小家畜。尤其适用于猪、牛的发情鉴定 2．母畜发情基本表现： 2．1精神行为：精神兴奋不安，鸣叫，离群，追逐人或家畜，爬跨其它家畜或物体。 2．2食欲及产奶：发情母畜表现为采食量下降，甚至绝食，但限饲的母猪可能发情时仍采食。泌乳母牛发情时产奶量会明显下降。 2．3外部变化：大多数母畜发情时，外阴红肿，从潮红到红肿发亮到皱缩；发情盛期或被其它母畜或公畜爬跨时，外阴会流出大量的粘液，粘液的粘稠度、色泽、多少都因畜种不同而不同。 （二）试情法 1．适用动物：适用于各种家畜及野生动物，尤其适用于全群性强、服从于领头家畜、发情征状不明显的家畜。如绵羊、马等。 2．试情的方法： 2．1隔栏试情法：用栅栏将公畜和母畜隔开，让公母畜头对头，观察公畜对母畜的反应和母畜对公畜的反应。尤其是观察母畜在公畜面前反应最能体现母畜的发情状态。可将有发情表现的母畜与公畜隔栏，观察母畜的反应，确定母畜是否达到发情盛期。猪的发情鉴定可用有经验的试情公猪每天上下午各一次，从净道（喂料道）上与母猪头对头试情。此法适用于马、猪。 2．2分栏试情法：将结扎输精管（手术后2个月）的公畜放入母畜群中，观察公畜追逐母畜和母畜接受公畜交配的情况，判断母畜的发情情况。凡接受公畜交配的母畜应立即隔离，以免试情公畜一直与一头发情母畜交配，而影响整个母畜群的试情。每天两次，上下午各一次。此法适用于羊、牛。 2．3试情布标记法：将试情系试情布的公畜（公畜的胸部有涂颜料的染料）放入母畜群中，每天上下午各一次，每次30～60min。接受试情公畜爬跨的母畜会在臀部留有标记。把留下标记的母畜隔离，以防公畜反复爬跨一头母畜而影响试情效果。此法适用于山羊和绵羊的试情，也可用于鹿的试情。 （三）直肠检查法 适用动物：用于牛、水牛、马、驴、骆驼等大型动物的发情鉴定。 用品：长臂手套、植物油或石蜡油或肥皂水、肥皂、毛巾、指甲钳、 基本操作步骤： 3．1母畜的保定：母畜应保定在六柱保定架内或采精架内，也可在牛的畜床上，用颈夹保定。对放牧或散养动物及野生动物可将其从前胸和后腹用扁绳吊起，以便于操作。尾部由畜主拉向一侧或用绳将其垂直吊起。 3．2人员的准备：术者将指甲剪短并锉圆，在手臂上涂肥皂或石蜡油滑润。 3．3操作： 术者将衣袖挽至肩关节处，立于牛的正后方，给 母牛的肛门周围涂以较多润滑剂，并抚摸肛门。手指并拢成楔状，以缓缓地旋转动作伸入肛门。 手臂伸入肛门后，直肠内如有宿粪，可用手指扩张肛门，使空气由手指缝进入直肠内，促使宿粪排出，否则要以手指掏出。掏出粪便时，手掌须展平，少量而多次地取出，切勿抓粪一把向个硬拉。最好设法促使母畜自动排便。其方法是将手掌在直肠内向前轻推，以阻止粪便排出，待粪便蓄积较多时，逐渐撤出手臂，即可促使排尽宿粪。 手臂尽量向前伸，将直肠向后扒，然后将手掌展平，向骨盆腔底部前后左右按压，当手掌按压到一条软骨样棒状物时，说明找到了子宫颈，中指和拇指跨在子宫颈上，手指向前滑动，食指可摸到一较硬的沟槽（角间沟），食指和中指跨在左侧子宫角向前向下滑动，即可找到左侧的卵巢；同样方法可找到另一侧卵巢。 摸到卵巢后，可将卵巢拿在手里，并触摸卵巢的质地、大小、有无卵泡及卵泡的大小，有无黄体及黄体形状及质地、大小。 操作结束后，应用肥皂及清水清洗手臂，并用毛巾擦干，用酒精棉球消毒。 （四）各种家畜的发情鉴定 1．牛的发情鉴定 1．1牛的发情特点： 牛是全年性多次发情动物，发情周期21d左右，发情期18h左右。牛的发情表现明显，发情期短，容易判断排卵时间。自发性排卵。牛的排卵时间在发情停止后10～18h。 1．2牛发情征状：母牛进入发情期以后，精神变得敏感不安，采食一下降，反刍时间缩短，常常鸣叫，主动追寻公牛；互相爬跨频繁，发情初期多爬跨其他母牛，到发情的后期，则喜欢接受其他母牛爬跨。被爬跨时，站立不动，并常张长后腿和弯腰弓背，表现愿意接受交配的姿势，这种姿势称为“静立反应”；发情母牛外阴部明显充血变大，皱纹消失，阴道粘膜潮红有光泽；发情初期有大量稀薄透明分泌物从外阴部排出，粘性大而能拉成长丝，到发情后期，分泌物量少且粘性小，不能成丝，再后转为乳白色，似浓乳状，拒绝公牛接近和爬跨，这是发情停止的片状；发情前期由于雌激素的作用，子宫及阴疲乏粘膜充血，进入排卵期以后，雌激素的作用逐渐衰减，微血管破裂而出血，这种现象多数出现在发期以后1～3d，青年母牛较老年母牛更为多见。 1．3母牛直肠检查卵巢的变化： 母牛卵泡发育可分为以下四个阶段： 第一期（卵泡出现期）：卵巢体积稍为增大，卵泡的体积为0.5～0.75cm，触之能感觉到卵巢上有一个软化点。这一期持续约10h。母牛开始出现发情的外表征状。 第二期（卵泡发育期）：卵泡直径1～1.5cm，呈小球状波动明显。这一期持续10～12h。 第三期（卵泡成熟期）：卵泡体积不再增大，但卵泡壁变薄，紧张性增强，有一触即破的感觉。这一期持续6～8h。此期母牛的发情征状明显。 第四期（排卵期）：母牛性兴奋消失后10～15h卵泡开始破裂，泡液流失，泡壁变为松软，呈一凹陷。排卵后6～8h红体形成，触感柔软，凹陷不明显。直径0.5～0.8cm，这时母牛即进入休情期。 2．1猪的发情鉴定 2．2母猪的发情特点： 猪为全年性多次发情动物，发情周期为21d左右。发情期2～3d。为自发性排卵。排卵时间为发情开始后24～26h，排卵时间6～8h。母猪的发情表现明显。排卵时间易于掌握。母猪的发情鉴定多采用外部观察法，大型猪场也可结合试情法。 2．3母猪发情外部表现：母猪在发情初期表现不安，时常鸣叫，外阴稍充血肿胀，食欲减退乃至绝食，约经半天后外阴充血明显，微湿润，喜欢爬跨其他母猪，也接受其他母猪的爬跨。以后母猪的交配欲达到高峰，这时阴门粘膜充血更为明显，呈潮红湿润，慕雄性很强烈，用手按压其背部或其他母猪爬跨，则出现静立反应。可母猪交配欲渐渐降低，外阴粘膜充血肿胀开始消退，阴门开始变干，淡红微皱，分泌物减少，喜欢静伏，表现迟滞，翻开阴门可见阴道粘膜略呈暗红色，则为配种最佳时机。 2．4母猪的试情：每天1到2次，将经过调教的老公猪赶到待配母猪舍，让试情公猪与待配母猪头对头试情，观察公猪和母猪的反应，当母猪对公猪求偶叫声有明显反应，并出现静立反应时，配种员可用力按压或骑在母猪背上，如果母猪不动，耳竖起，背弓起，尾巴上翘说明已达发情盛期。12h后为配种时间。 3．羊的发情鉴定 3．1羊的发情特点： 绵羊和山羊均为季节性多次性发情动物，绵羊发情季节为秋季；山羊为发情季节为春秋两季。绵羊的发情周期为16～17d，山羊的发情周期为21d左右。绵羊和山羊均为自发性排卵动物。绵羊排卵时间在发情开始后24～30h；山羊为发情后40h。 3．2羊的发情外部表现：母羊发情时常表现不安，时常鸣叫，一些发情母羊会爬跨其他母羊。外阴红肿，山羊发情时，外阴部会排出大量粘液，开始较稀薄清亮，继而粘稠出豆腐渣样。发情母羊会追随公羊，并接受公羊的爬跨。发现发情母羊应将其挑出，并用试情公羊进一步判断母羊的发情阶段。 3．3母羊的试情：将结扎输精管两个月以上的公羊放入母羊群，公母比例为1:40，观察母羊追随公羊和接受公羊爬跨的情况。每天两次，每次约1h。发现母羊接受公羊交配，应立即将发情母羊挑出另外组群。避免试情公羊一直与一只发情母羊交配而影响对其他母羊的试情。也可用试情布将种公羊的腹部兜住，并在兜布下垫一浸有油性颜料的海绵，当试情公羊爬跨发情母羊时，接受爬跨的发情母羊的臀部会留下明显的印记。及时将有明显标记的母羊另外组群。母羊接受试情公羊爬跨后6～12h为配种最佳时机。～ 实训二 发情控制技术 一、目的要求 掌握家畜的诱导发情、同期发情及超数排卵技术，以便能够更好的控制母畜的繁殖过程，方便家畜的成批生产，提高母畜的繁殖力，减少季节和疾病因素对母畜繁殖的影响。 二、实训内容 诱导发情技术、同期发情技术、超数排卵技术，不同畜种的发情控制。 三、主要用品 一次性注射器1ml 、5ml、20ml，各种型号的针头、针头盒、LRH-3（促排3号）、FSH-P、LH、PMSG、PG-600、CIDR（孕酮阴道栓）、氯前列烯醇、缩宫素、高锰酸钾、环丙沙星或长效治菌磺、冲宫器或输精器。 四、技术要求 发情控制技术包括乏情家畜的诱导发情，胚胎移植和集中 人为地控制母畜的发情时间和卵泡发育状态的技术叫做发情控制技术。包括处理处于病理、生理、季节性乏情状态的母畜，使其表现正常发情，并能配种受孕；调整正常繁殖母畜的发情规律，使其按照预计的时间发情，或达到母畜群同一时间段内同时发情的目的；使母畜一个发情期排出更多的卵子。母畜发情控制技术包括：诱导发情、同期发情、超数排卵。 （一）诱导发情 1．概述 1．1诱导发情的处理对象：处于哺乳期、乏情季节、病理乏情（持久黄体、卵巢黄体囊肿、卵巢静止）的母畜。 1．2常用药物：孕酮及其类似物、前列腺素及其类似物、促性腺激素类（孕马血清促性腺激素、促卵泡素、绒毛膜促性腺激素、促黄体素）、促性腺释放激素类（促排2号、促排3号）、雌激素类（雌二醇、己烯雌酚、三合激素）。 1．3常用品：孕酮类海绵栓、硅胶栓、自制棉栓，孕酮类埋植剂、注射器、激素埋植枪、输精枪、0.2%高锰酸钾溶液、酒精棉球、生理盐水等。 2．各种家畜的诱导发情技术 2．1猪的诱导发情 2．1．1母猪不发情的原因 哺乳性乏情：泌乳期母猪不会表现发情，但带仔数、泌乳量低的母猪在哺乳期可能会表现发情，母猪在哺乳期每天用试情公猪调情，部分母猪会在哺乳期表现发情，并能正常排卵。 卵巢静止：原因不详，限位饲养、过肥、环境和饲料过于单调、早配可能是卵巢静止的原因。 持久黄体和卵巢黄体囊肿：由于内分泌失调，妊娠中止等原因，导致黄体长时间不退化（假孕）或囊肿。 2．1．2母猪病理性乏情的诊断：后备母猪体重达110kg以上，年龄超过7.5个月龄仍未出现发情的；哺乳母猪断奶后超过21d未表现发情的可认为是病理性乏情。配种后75d未表现发情，但也未见腹部两侧明显隆起；或配种后35d未表现发情，但用B型超声波未能检测到胎儿的母猪可认为是假孕。 2．1．3母猪的诱导发情方法 促进母猪发情的管理： 空怀、后备母猪群养法：将断奶母猪或后备母猪4～5头一圈，放在一个圈内饲养，其中发情母猪爬跨其它母猪的行为、以及发情母猪的气味及外激素能刺激不发情的母猪表现正常发情。 紧迫法：使母猪处于不舒适的紧迫状态，如不同圈舍的内母猪调圈饲养、停料（夏季以外的时间也可以同时停水）一天等。 拌料法：用发情旺盛母猪的尿或种公猪的包皮液或尿液拌料，喂给不发情的母猪。 公猪调情法：每天两次（间隔8h）将公猪赶到不发情母猪圈内，让其与母猪调情，每次调情时间20min。 激素法： 雌激素法：给不发情的母猪肌肉注射雌二醇、己烯雌酚或三合激素，母猪表现发情征状后，不配种，下一次正常发情时配种。 促性腺激素法：给不发情母猪或夏秋季节哺乳母猪断奶当天，采用任一种方法：肌肉注射PG-600一头份、孕马血清促性腺激素1000单位、或绒毛膜促性腺素500单位，或促排2号或促排3号。母猪发情后配种。 前列腺素法：给不发情母猪肌肉注射4ml(0.4mg)氯前列烯醇。母猪发情后配种。 前列腺素+促性腺激素法：同一天分点注射氯前列烯醇0.4mg，PG-600一头份，发情后配种。 2．1．4子宫炎不育母猪的治疗：用大剂量（正常剂量的2倍）肌肉注射雌二醇或己烯雌酚，母猪进入发情盛期后（子宫颈口已经开张），输入高锰酸钾（0.2%）生理盐水液50ml，0.5h后注射缩宫素30～40单位（排出积脓），2h后，清洗母猪外阴，用50ml生理盐水加甲硝唑或青链霉素，或用长效治菌磺或环丙沙星注射液子宫内灌注50～70ml（采用输精器或冲宫器）（抗菌消炎）。下一个正常发情期配种。 2．2羊的诱导发情 母羊注射孕马血清1000单位，40～48h后注射氯前列烯醇0.15mg，母羊发情后注射促排3号，并配种或人工授精。对价格较昂贵的品种羊，可用孕酮栓放入母羊阴道内，到达子宫穹隆，10d后注射孕马血清1000单位，48h后注射氯前列烯醇0.15mg，并取出阴道栓。其它方法同上。 2．3牛的诱导发情 牛的诱导发情处理方法同羊，孕马血清的注射剂量为1500～2000单位，氯前列烯醇的注射剂量为0.6～0.8mg。其它方法同羊。 （二）超数排卵 用于提高每胎次胎儿数，提高排卵数，以用于胚胎移植。 各种家畜超数排卵处理方法如下： 1．牛的超数排卵处理 1．1促卵泡素(FSH)减量注射法 供体牛在发情后的9～13d肌注FSH，早晚各一次，间隔12h，分4d减量注射。在第3d时，宫注氯前列烯醇0.2mg。使用国产FSH总剂量为325单位时，处理方法如图1所示。超排剂量根据不同厂家激素确定适宜剂量，国产激素320～360单位，进口激素28～36mg。  1．2孕马血清促性腺激素(PMSG)处理法 在情期的11～12d，一次肌注PMSG2500～30001U，48h后宫注氯前列烯醇0.2mg。发情后约18h肌注等量的抗PMSG。 发情观察和人工授精 氯前列烯醇处理后40～48h，大部分处理牛发情。通常要求从宫注氯前列烯醇第2d傍晚开始观察发情，至少早晚各观察一次。在观察到接受爬跨后4～6h进行第一次输精，间隔12h后第二次输精。每次有效精子数不得少于5000万个，输入两侧子宫角或子宫体。注意输精时不得触摸卵巢。 2．羊的超数排卵 2．1促卵泡素(FSH)减量处理法 供体羊在发情后的12～13d开始肌肉注射FSH，早晚各一次，间隔12h分3d减量注射。使用国产FSH总剂量为200～300单位。第2d注射氯前列烯醇0.1mg，供体羊一般在FSH开始注射后的第4d表现发情，发情后立即静脉注射(或肌注)促黄体素(LH)75～100u，或促性腺激素释放激素的类似物50～75微克，LH的剂量一般为FSH的1/3。超排剂量及激素比例可根据不同厂家和批号稍作调整。 2．2孕马血清促性腺激素(PMSG)处理法 在发情周期的第12～13d，一次肌注PMSGl500～25001U(国际单位)，发情后18～24h肌注等量的抗PMSG。  （三）同期发情技术 目的：使正常发情的母畜群在一定时间段内同时发情。用于胚胎移植，集中供精、母畜同期分娩。 各种家畜的同期发情方法： 1．猪的同期发情 1．1后备母猪的同期发情：体重超过105kg的后备母猪每头肌肉注射孕马血清500单位，母猪群发情后注射促排3号，18d后统一注射氯前列烯醇0.4mg。或每头后备母猪注射孕马血清400单位，HCG200单位，或一次性注射PG-600，注射后第18d统一注射氯前列烯醇0.4mg。 1．2经产母猪的同期发情：可选择分娩时间接近（10d内）的分娩母猪同时断奶，以达到同期发情目的。如果要进一步提高同期发情率，可在断奶当天，被处理的母猪统一注射PG-600或PMSG400单位HCG200单位。 2．牛的同期发情 2．1二次PG法：在被处理母牛注射氯前列烯醇0.8mg后12～14d，统一第二次注射同样剂量的氯前列烯醇。 2．2孕酮栓+PG法：母牛群放孕酮栓后第13d注射氯前列烯醇0.8mg。 注：可在第二次注射PG前40～48h注射PMSG2000单位，注射氯前列烯醇后，母牛表现发情后立即注射促排2号（或3 号）。 3．羊的同期发情 3．1二次PG法：方法同牛，注射剂量为0.1～0.2mg。 3．2孕酮栓+PG法：主要用于胚胎移植的同期发情，方法同牛。 注：如果对母牛、羊进行发情登记，处于发情期的第7～18d的牛羊注射氯前列烯醇，同期发情率更高。 实训三 人工授精技术 一、目的要求 熟练掌握各种家畜人工授精操作的步骤（流程），熟练掌握牛的冷冻精液的解冻与直肠把握法输精操作；掌握羊的采精、精液品质检查、精液的稀释与保存、羊的输精操作；猪的人工授精的全套技术。 二、实训内容 采精技术、精液品质检查技术、稀释液配制技术、精液保存技术、输精技术，牛的人工授精技术、羊的人工授精、猪的人工授精 三、设备用品 见详述。 三、技术要求 （一）采精器械准备 1．假阴道的准备 目的要求：假阴道是大部分动物采精的必须工具，人工授精人员应熟练掌握假阴道的各部件的清洗、消毒、安装和调试。 用品：牛羊假阴道外壳、内胎、集精杯、固定皮圈、气阀、75%和95%的酒精棉球、长臂钳、镊子、大瓷盘、厨柜、肥皂、毛刷、玻璃棒、1000ml烧杯、500ml烧杯、酒精温度计、玻璃漏斗、精液稀释液、医用凡士林或红霉素软膏、双连球（充气）、保温套等。 1．1假阴道各部件选择与要求 1．1．1外壳 牛的假阴道外壳用硬橡胶制成，长度约40～50cm，羊的假阴道外壳用硬兼制成。外壳的内壁与外壁应光滑，无毛刺，无裂缝。最好两端边缘隆起，以便用固定皮圈固定外翻的内胎。外壳的中间有一注水孔。 1．1．2内胎 一般用弹性好的橡胶或乳胶制成，内胎应具有耐拉，弹力适当，容易安装特点。安装前应先将内胎的两端部分拉伸，以便检查内胎是否有“针眼”和裂缝。 1．1．3集精杯 苏式集精杯用于直接安装在装好内胎的假阴道的一端。一般用棕色玻璃制成的双层集精杯， 集精杯上部有向内凹陷的集精管，集精管与外壁之间形成夹壁，集精杯的下部有注水孔，用于注入35℃的温水。用软木塞或棉球可将此孔堵上，以防水外溢。集精杯均有玻璃盖。美式牛用假阴道的集精杯为一刻度试管，用一乳胶漏斗将假阴道的一端与精集杯相连。羊的集精杯与牛集精杯相似，将塑料瓶中装入半瓶35℃的温水，再将集精管装在塑料瓶中，然后旋上无盖顶的瓶盖。 1．1．4气阀 安装在假阴道外壳的注水孔上，用于向内胎与外壳之间的夹壁内充气，并调节气压，并防止夹壁之间注入的水外溢。气阀应能密封，不漏气，阀门转动应灵活。也可用医用血压计上的气阀代替效果更好。牛的假阴道外壳注水孔可将气阀直接装上，羊的假阴道外壳的注水孔较大，应将气阀装在橡皮塞上，再塞在注水孔上。 1．1．5固定皮圈 用橡胶制成，用于使内胎固定在外壳上。 1．1．6保护套 在安装好集精杯后，将保护套安装在外壳上，以防止集精杯在采精或搬动时脱落。 1．1．7保温套 考虑到冬季不易保持夹壁内的水温，可使用保温材料（如真空棉）制作一个假阴道的外套。 1．2用品拆卸及清洗 采精的用品在使用之后，应立即拆卸开，以防弹性材料因“疲劳”而失去弹性以及防止润滑剂干在内胎表面不易清洗。 1．2．1内胎 可用家用洗涤剂、软毛刷、温水或清水洗涤正反两面，洗去内胎表面的润滑剂后，应用清水将洗涤剂及污垢冲洗干净。再用“去离子”水或蒸馏水冲洗三至五遍，用两个吊在厨柜顶部的夹子对称夹住内胎一端，光滑面向内，使内胎垂直悬挂在厨内晾干。不得在阳光下曝晒或在干燥箱中加热干燥，以防其受热、发黏，影响其弹性及使用寿命。不宜将内胎平放在盒内或袋内。内胎可存放在厨内，直到下次使用时取出。 1．2．2外壳 外壳清洗没有严格要求，但应在清洗后，放入厨内晾干。 1．2．3集精杯 集精杯清洗应更为严格，用试管刷、洗涤剂、清水将集精杯的集精管内和外壁的表面清洗干净，用蒸馏水或去离子水冲洗3～5遍。放入干燥箱内用120℃温度干燥。 1．3 安装假阴道的其它用品 1．3．1 75%乙醇棉球 用于消毒内胎内壁、集精杯的集精管。 1．3．2 95%乙醇棉球 用于二次擦拭，提高酒精的蒸发速度，防止酒精残留（也可不进行二次擦拭，并等待酒精完全挥发）。 1．3．3灭菌的11～12%蔗糖溶液或6%的葡萄糖溶液用于冲洗内胎和集精杯内管。 1．3．4医用灭菌凡士林 最好将其分装在灭菌的塑料管内，一次用一管，以减少污染。这里推荐用医用红霉素软膏，其来源方便，符合卫生标准，包装小，不易污染，润滑度好，并有一定的消炎作用。 1．3．5大瓷盘两个 用于放置安装假阴道的用品，在安装时，在另一个瓷盘上操作。 1．3．6长柄钳或镊子 用于夹取酒精棉球，进行牛的假阴道内胎的消毒；镊子（20cm） 用于夹取酒精棉球消毒集精杯内管和假阴道内胎向外的翻边。羊的假阴道内道消毒再用镊子夹取酒精棉球。 1．3．7 100℃酒精温度计 用于测量水温、假阴道内的温度。 1．3．8 1000ml烧杯两个 用于盛冷水、调节水温。 1．3．9玻璃或塑料漏斗 用于向集精杯夹壁间和内胎与外壳的夹壁间注入温水或热水。 1．4假阴道的安装 1．4．1清点与检查：确认部件齐全，完整，无裂缝及针眼；将经过干燥消毒的各部件放在大瓷盘中消毒过的大瓷盘中。 1．4．2安装内胎与调试： 将内胎的光滑面向里，放入外壳内，使两端露出部分长度相当。将一端折叠后放内外壳内，将另一端内胎的一部分翻贴在外壳上，调整周正后，双手向上推卷，使内胎卷起，使其脱离外壳，并使卷起的长度与原来露出的长度相当或略长，再将内胎套在外壳上，并调整周正。 另一端用同样方法，将其翻贴在外壳上。 注意：1、在将内胎调整周正时，应尽量避免用指甲撕扯，以防造成撕裂或造成“针眼”，应反复向上卷起，再向下卷贴；2、安装另一端时，应防止内胎在外壳内扭转。3、适当使内胎在拉伸状态下安装在外壳上，这样更容易达到要求。 调试：将气阀安上，充气，检查内胎是否安装周正。安装周正的内胎充气后两端均呈内陷的“Y”型。如果符合要求，可将气放掉。如果有丰富的操作经验，可确保安装周正，可省掉充气检查。 用固定皮圈将内胎固定在外壳上。 1．4．3消毒： 用长柄钳（羊假阴道消毒用20cm镊子）夹取75%的酒精棉球，从内向外消毒内胎内壁，然后用镊子夹取75%酒精棉球消毒集精杯集精管。再用另一棉球消毒外壳上的内胎翻边。 用95%酒精棉球，用同样方法进行第二次擦拭，以促进酒精迅速挥发。此步骤也可不做。 1．4．4注入温水：用1000ml大烧杯中，将水温调至50℃（夏）或55℃（冬），用漏斗将温水注入内胎与外壳的夹壁内，注满后，来回摇动几次，将水再倒出一半。在集精杯夹壁内注入35℃的温水，并用软木塞将注水孔塞紧。 1．4．5冲洗：用稀释液基础液将内胎和集精杯冲洗一遍。 1．4．6涂润滑剂：用玻璃棒醮取少量凡士林或红霉素软膏，均匀涂布于假阴道外口到深1/2处。 1．4．7充气：用双连球向假阴道夹壁内充气至压力合适（用玻璃棒插入略有阻力）。 1．4．8测温：用酒精温度计测量假阴道内的温度。至酒精柱稳定后（需2～3min），温度应为38～41℃。如果温度不合适，应重新调温注水，倒出部分水后，再加入少量温度更高或更低的水。 1．4．9保温：将假阴道用毛巾包好备用。 2.公猪采精用品的准备 将洗净干燥的保温杯打开盖子，放在37℃或40℃的干燥箱中约5min。取出，将两层食品袋装入保温杯内，并用洁净的玻璃棒使其贴靠在保温杯壁上，袋口翻向保温杯外，上盖一层专用过滤网，用橡皮筋固定，并使过滤网中部下陷，以避免公猪射精过快或精液过滤慢时，精液外溢。最后用一张纸巾盖在网上，再轻轻将保温杯盖盖上。取两张纸巾装入工作服口袋中；采精员一手（右手）带双层无毒的聚乙烯塑料手套，另一手（左手）拿保温杯或将集精杯放于工作服的口袋中。 3．采精室（大厅） 3．1牛羊采精室或大厅 牛的采精室 必须有安静的环境，最好有专用的房间，一般要求50平方米以上，舍内有采精架或假台牛，为防止闲人围观，采精室应在僻静的位置。 羊采精室 羊的采精室与牛的基本相似，但面积可以小些。 猪采精室 采精场必须在室内，确保不受气温、日光、风、灰尘、雨雪影响。采精场地应能防止公猪逃跑。采精室总面积约10平方米，采精区(安全区外)面积为2.5×2.5m2。采精室应保持整洁，采精区内不能放置除假母猪、放滑垫以外的其它物品。假母猪尺寸为台面宽26cm，长100cm，高度一般为55cm，如果可能最好高度可以调整。假母猪后端至后支架应有30cm的距离，以方便公猪阴茎伸出和采精操作。假母猪应牢固地固定在地面上。防护栏10-16cm直径、高出地面70cm的钢管作防护栏。 4．操作室 应有两间并与采精大厅相连，一间用于安装假阴道及有关器械消毒及其它采精用品准备。另一间用于检查精液品质和分装精液处理、冷冻等。操作室的两间位于采精室的一端，并有向采精室传递采精用品和将采到的精液送入精液处理室的窗口。 （二）采精操作 目的要求：采精是人工授精的第一个步骤，采到不受任何污染的、全份的精液，并保证人、畜安全是对采精人员操作的基本要求。采精人员必须动作敏捷，技术熟练、准确。 1．牛的采精操作规程 1．1采精用品及条件 采精室、假台畜或台牛、牛假阴道、一次性手套、采精架。台牛可用小公牛、母牛、阉牛，如果不是用发情母牛作台畜，应对台牛和采精的公牛进行调教。 2的操作 1．2．1将发情旺盛的母牛牵入采精架内，将其颈部固定在采精架上。 1．2．2母牛的外阴及后躯用0.3%的高锰酸钾水冲洗并擦干。 1．2．3将种公牛牵到采精房内，可根据种公牛的性行为特点，让种公牛在采精室停留片刻，以使公牛进行性准备，这样有利于提高采到的精液品质。但采精员必须注意公牛的行为，以防公牛在未采精时就已经射精。 1．2．4将种公牛牵到台牛旁，采精员手持假阴道面向台牛侧后方站于台牛的右侧。 1．2．5当公牛阴茎伸出，并有跃上母牛后的瞬间，采精员手持假阴道，迅速向前一步，将假阴道筒口向下倾斜与公牛阴茎伸出方向成一直线，紧靠在台畜尻部右侧。用左手在包皮开口的后方，掌心向上托住包皮（切不可用手抓握阴茎，否则会使阴茎缩回）。将阴茎拨向右侧导入假阴道内。当公牛用力向前一冲后，即表示射精完毕。公牛射精后，采精员同时使假阴道的集精杯一端略向下倾斜，以便精液流入集精杯中。 1．2．6当公牛跳下时，假阴道应随着阴茎后移，不要抽出。当阴茎由假阴道自行脱出后，立即将假阴道直立，筒口向上，并立即送至精液处理室内，放气后，取下精液杯，盖上盖子。 1．2．7如果采精室与精液处理室相距较远，可将精液移至15ml刻度试管中，加塞后，并放入盛有35℃水的保温杯中。然后将其送到精液处理室。 1．2．8公牛第一次射精后，可休息15min后进行第二次采精。采精前应更换新的集精杯，并重新调温、调压。最好准备两个假阴道，供一头公牛采精。这种一次采精两个射精量的采精方法可减少工作量，并且第二次采集的精液比第一次采到精液污染要小得多。可将两次采集的精液放在一起处理。 1．2．9每周每头公牛采精2～3次。 1．2．10采精后，让公牛略作休息，然后将公牛赶回牛舍。 1．3注意事项：牛的交配时间十分短促，只有数秒钟，因此，采精人员应动作敏捷，准确。另外，应注意假阴道与公牛的阴茎保持方向一致，尤其是在公牛射精时，更应如此。否则就有可能损伤公牛的阴茎。另外，采精人员还要密切注意公牛的行为、动作，防止被公牛踩伤或被公牛进攻。采精人员应善待牲畜，不恐吓、不打骂种公畜，这样有利于工作的顺利进行。 2．羊的采精 羊的采精方法与牛基本相同，羊从阴茎勃起到射精只有很短的时间，所以要求操作人员更要动作敏捷、准确。另外，由于羊的体格较小，所以采精时，采精员应蹲在台羊的右后侧，手持假阴道，随时准备将假阴道固定在台羊的尻部。 3．公猪的采精 3．1公猪的调教 3.1.1开始调教的年龄 小公猪从7.5～8月龄开始进行采精调教； 3.1.2调教持续时间 每次调教时间不超过15min；如果公猪不爬跨假母猪，就应将公猪赶回圈内，第二天再进行调教； 3.1.3基本调教方法 将发情旺盛的母猪的尿液或分泌物涂在假母猪后部，公猪进入采精室后，让其先熟悉环境。公猪很快会去嗅闻、啃咬假母猪或在假母猪上蹭痒，然后就会爬跨假母猪。如果公猪比较胆小，可将发情旺盛母猪的分泌物或尿液涂在麻布上，使公猪嗅闻，并逐步引导其靠近和爬跨假母猪。同时可轻轻敲击假母猪以引起公猪的注意； 3.1.4不易调教的公猪的调教 如果以上方法都不能使公猪爬跨假母猪，可用一头二至三胎的发情旺盛的母猪赶至采精室，然后将待调教的种公猪赶到采精室，当公猪爬跨发情母猪时，在公猪阴茎伸出之前，两人分别抓住其左右耳拉下，当公猪第二次爬跨发情母猪时，用同样的方法将其拉下。 这时公猪的性欲已经达到高潮，立即将发情母猪赶走，然后诱导公猪爬跨假母猪，一般都能调教成功； 3.1.5调教时的采精 当公猪爬跨上假母猪后，采精员应立即从公猪左后部接近，并按摩其包皮，排出包皮液，当公猪阴茎伸出时，应立即用右手握成空头拳，使阴茎进入空拳中，立即将阴茎的龟头锁定不让其转动，并将其牵出，开始采精。具体采精操作参看第五节采精操作规程。 3.1.6注意事项 将待调教的公猪赶至采精室后，采精员必须始终在场。因为一旦公猪爬跨上假母猪时，采精人员不在现场，不能立即进行采精，这对公猪的调教非常不利。调教公猪要有耐心，不准打骂公猪；记住，如果在调教中使公猪感到不适，这头公猪调教成功的希望就会很小。一旦采精获得成功，分别在第2、3d各采精1次，以利公猪巩固记忆。 3.2公猪的采精操作 3.2.1公猪的准备 采精员将待采精的公猪赶至采精栏，如果时间允许，可用0.1%的高锰酸钾溶液清洗其腹部和包皮（可用喷水瓶喷消毒液），再用温水（夏天用自来水）清洗干净并擦干，避免药物残留对精子造成伤害；必要时，可将公猪的阴毛剪短。 3.2.2按摩公猪的包皮腔，排出尿液 采精员蹲在（或坐在）公猪左侧，用右手尽可能地按摩公猪的包皮，使其排出包皮液（尿液），并诱导公猪爬跨假母猪。 3.2.3锁定公猪阴茎的龟头 当公猪爬跨假母猪并逐渐伸出阴茎（个别公猪需要按摩包皮，使其阴茎伸出），脱去外层手套，使公猪阴茎龟头伸入空拳（拳心向前上，小指侧向前下）；用中指、无名指和小指紧握伸出的公猪阴茎螺旋状龟头，顺其向前冲力将阴茎的“S”状弯曲拉直，握紧阴茎龟头防止其旋转，公猪即可安静下来并开始射精；小心地取下保温杯盖和盖在滤网上的纸巾。 3.2.4精液的分段收集 最初射出的少量精液含精子很少，而且含菌量大，所以不能接取，等公猪射出部分清亮的液体后，可用纸巾将清液和胶状物擦除。开始接取精液，有些公猪分2～3个阶段将浓份精液射出，直到公猪射精完毕，射精过程历时5～7min；如果可能应尽可能只收集含精多的精液，清亮的精液尽可能不收集。 3.2.5采精结束 公猪射精结束时，会射出一些胶状物，同时环顾左右，采精人员要注意观察公猪的头部动作。如果公猪阴茎软缩或有下假母猪动作，就应停止采精，使其阴茎缩回。注意：不要过早中止采精，要让公猪射精过程完整，否则会造成公猪不适。 3.2.6将精液送至实验室 除去过滤网及其网上的胶状物，将食品袋口束在一起，放在保温杯口边缘处，盖上盖子。将公猪赶回猪舍。将精液送实验室。 （三）人工授精实验室设备及操作规范 1．人工授精实验室 1．1人工授精实验室的要求 人工授精实验室是种公畜站处理精液的地方，必须保证产品的生物安全性，防止危害精子和污染精液的情况发生。 1．2人工授精实验室的基本设施 因种畜站或配种站规模及所执行的功能不同，人工授精实验室的设备条件也不相同： 1．2．1建筑要求 实验室应有足够的面积，并要求有利于维持卫生条件。如工作台面要求是陶瓷的，地面应铺设地板砖，墙面应容易冲洗、不落尘。窗户、门应有很好的防尘功能。人工授精实验室应设有外间，以便更换工作服、拖鞋等。为了防止建设材料及油漆对精子的影响，建筑材料应进行放射、有害物质检测。应使用对人无害的油漆或涂料。 1．2．2人工授精实验室的设备 释液液配制设备 纯水机、蒸馏水机、各种玻璃用品、加热搅拌器、水浴锅等。 精液品质检查用品 一台相差显微镜、恒温载物台、比色仪等。 冷冻精液用品 液氮罐、液氮机、细管灌装机、细管印字机、低温柜、冷冻槽或冷冻仪、氟板等。 2．精液品质检查 目的要求：掌握精液品质检查的项目、每个项目的操作方法、各个环节检查的项目及品质评价要点。 用品清单：保温箱、显微镜、载玻片、盖玻片、移液器、红细胞吸管、3%氯化钠、计数板、0.5%龙胆紫、低温基础液或0.9%的氯化钠 2．1直观检查 2．1．1射精量：牛的射精量应在2～10ml左右，羊的精射精量应在0.5～2ml，猪的射精量应在100-400ml。如果过多或过少均为可能存在问题：如假阴道漏水，精液中有尿液、生殖机能下降或副性腺有炎症。 2．1．2色泽：牛羊的精液应为乳白色或乳黄色，猪的精液为灰白色到白色。其它颜色均为不正常颜色 2．1．3云雾状：在33～35℃的水浴中，牛羊精液应有明显的云雾状（云团样翻卷），说明精子的密度和活力都较好。 2．2活力检查： 2．2．1将显微镜的载物台温度调至37～38℃，并使载玻片和盖玻片与载物台等温。 2．2．2用微量移液器取5ul精液注入试管中，再取50ul30℃的低温保存基础液或0.9%的氯化钠溶液注入试管中，吸吐若干次。吸取10ul滴在预温的载玻片中间，盖上盖玻片，猪的精液不需要稀释可直接取样检查活力。 2．2．3在100和400倍下判断活力。活力为十级制，前进运动的精子占总精子数的比例不低于70%，即活力不低于0.7方可作进一步处理。 如果时间允许可采用计数板计数法进行活力测定，准确度更高：先将精液用生理盐水稀释（牛100倍、羊200倍、猪20倍），再放入计数室中，在100倍下计数5个中方格的不活动精子数，再将计数板放入200度干燥箱中加温2min，杀死全部精子，再计数同样5个中方格内的总精子数。  2．3密度测定： 2．3．1稀释和杀死精子：取5ul原精液加入试管中，用移液管吸取3%氯化钠溶液1000ul，混合均匀。也可将取10ul原精液于载玻片上，用红细胞吸管吸至刻度0.5，再吸取3%氯化钠溶液至刻度101，用食指和拇指压住吸管两端，摇动若干次，弃去数滴。这两种稀释的方法稀释倍数均为200倍。 2．3．2放置计数板：将干净的计数板放在载物台上，将干净的盖玻片放在上面。 2．3．3制作精液计数样片：将稀释好的精液取少量从盖玻片与计数板的接缝处注入，使精液依靠毛细作用将精液吸入计数室中。 2．3．4找到计数室和第一个中方格：将计数板固定在显微镜的推进器内，用100倍放大找到计数室，再用400倍找到计数室的第一个中方格。 2．3．5计数精子：计数左上角至右下角五个中方格的总精子数，以精子的头部为准，依数上不数下，数左右不数右的原则进行计数位于格线上的精子，计数顺序从中方格第一排小格向右，至第二排向左，第三排向右，第四排向左。 2．3．6计算精子密度：精子密度=5个中方格总精子数×5×10000×稀释倍数 如5个中方格的总精子数是95，则精子密度=95×5×10000×200=9.5亿/ml 2．3．7牛羊精子密度范围：牛的精液精子密度为8～12亿/ml，羊的精子密度为15～30亿/ml。 2．4畸形率测定 2．4．1染色剂的制作：0.5克龙胆紫用20ml酒精助溶，加水至100ml，过滤至试剂瓶中备用。也可用纯红或纯兰墨水代替0.5%的龙胆紫溶液。2．4．2牛羊精液的稀释：用微量移液器取5ul原精液至试管中，并吸取100ul（羊可用200ul）0.9%的氯化钠溶液混合数次。 2．4．3抹片：左手食指和拇指向上捏住载玻片两端，使载玻片处于水平状态，取10ul稀释后的精液滴至载玻片右侧。右手拿一载玻片或盖玻片，使其与左手拿的载玻片呈向右的45度角，并使其接触面在精液滴的左侧。将载玻片向右拉至精液刚好进入两载玻片形成的角缝中，然后平稳地向左推至左边（不得再向回拉）。抹片后，使其自然风干。 2．4．4固定：在抹片上滴95%的酒精数滴，固定4min后，甩去多余的酒精。 2．4．5染色：将载玻片放在用玻璃棒制成的片架上，滴上0.5%的龙胆紫或纯兰或红墨水5～10滴，5min后，用洗瓶或自来水轻轻冲去染色剂，甩去水分晾干。 2．4．6载玻片放在400或640倍的显微镜下进行观察，共记录若干个视野200个左右的精子。 下列精子可被视为畸形精子： 头部膨大、头部小于正常大小、双头、头部不完整 尾部折回、尾部卷曲、尾部套索、双尾、断尾 有近端原生质小滴 牛羊的精畸形精子比例不应超过15%。 猪的精液品质检查：方法与牛羊基本相同，但由于猪的精液量较大50～500ml，精子密度较低1.5～5亿/ml。所以在精液品质检查时，密度测定（或计数板活力测定）时稀释的倍数应为10～20倍，活力检查可直接进行，不必进行稀释，畸形率测定时也可用鲜精直接抹片。 3．稀释液配制 目的要求：掌握稀释配制的基本程序和操作方法。 主要用品：250ml三角瓶、250ml烧杯、100ml量筒、感量为0.1克的天平、玻璃漏斗、电炉、石棉网、玻璃棒、定性滤纸、消毒纸巾、硫酸纸、灭菌牛皮纸、橡皮筋、10ml一次性注射器、1ml注射器、5ml注射器、鸡蛋、75%酒精棉球、葡萄糖、柠檬酸钠、青霉素、链霉素 操作： 3．1玻璃用品的清洗与消毒：将所有玻璃用品用洗涤剂洗净，用稀盐酸浸泡并用自来水冲洗干净后，用蒸馏水冲洗四遍，空干水分，用纸将瓶口包好，放入120℃干燥箱中干燥1h，放凉备用。 3．2天平的标准：用两张圆形硫酸纸放在天平的左右托盘上，校准天平。 3．3称量药品：称取配方需要量的药品，并放入大烧杯中 3．4溶液配制：用量筒量取双蒸水100ml，加入烧杯中，用磁力搅拌器或玻璃棒搅拌使其溶解。 3．5用一层定性滤纸过滤溶液至三角瓶中 3．6在三角瓶上加牛皮纸盖并橡皮筋固定，放在盖有石棉网的电炉上加热至沸腾，迅速将其取下，放凉。制成基础液。基础液如果不马上使用可放入在2～5℃冰箱中备用，保存时间不超过12h。 羊精液稀释液推荐配方： 低温（2～5℃）保存液 冷冻保存液  基础液 葡萄糖（一水） 3.3g 8.8   柠檬酸钠（二水） 1.4g -   双蒸馏水 100ml 100ml  低温保存或第一液 基础液 80 ml 80ml   卵黄 20ml 20ml  第二液 第一液  47ml   甘油  3ml  牛精液冷冻精液稀释液推荐配方举例： 细管冷冻精液稀释液配方  11%乳糖或12%蔗糖73ml  卵黄20ml  甘油7ml  青霉素10万单位  链霉素10万单位  3．7取卵黄液：新鲜鸡蛋用75%的酒精棉球消毒外壳，待其完全挥发后，将鸡蛋磕开，分离蛋清、蛋黄和系带，将蛋黄盛于鸡蛋壳小头的半个蛋壳内，并小心地将蛋黄倒在用四层对折（8层）的消毒纸巾上。小心地使蛋黄在纸巾上滚动，使其表面的稀蛋清被纸巾吸附。先用针头小心将卵黄膜挑一个小口，再用去掉针头的10ml的一次性注射器，从小口慢慢吸取卵黄，尽量避免将气泡吸入，同时应避免吸入卵黄膜。吸入10ml后。再用同样的方法吸取另一个鸡蛋的卵黄。也可将卵黄移至纸巾的边缘，用针头挑一个小口，将卵黄液缓缓倒入量筒中，注意避免将卵黄膜倒入量筒中。 3．8卵黄液与基础液的混合：取80ml放凉的基础液，加入三角瓶中，然后将卵黄液注入或将卵黄液从量筒中倒入三角瓶中，将量取的80ml基础液反复冲洗量筒中的卵黄，使其全部溶解入基础液中，然后将全部的基础液倒入三角瓶中。摇匀。 3．9加入抗生素：分别用1ml注射器吸取基础液1ml，分别注入80万单位和100万单位的青霉素和链霉素瓶中，使其彻底溶解。分别从青霉素瓶中吸取0.1～0.12ml和链霉素瓶中吸取0.1ml，将其注入三角瓶中，并摇匀。另一种方法是，是称取0.1克的青霉素和0.1克的链霉素加入三角瓶中，摇匀。用基础液、卵黄液和抗生素混合制成第一液。 3．10第二液的制作：用量筒量取第一液47ml，加入另一只三角瓶中，用注射器吸取3ml消毒甘油，注入三角瓶中，摇匀。制成羊冷冻精液的第二液。 4．精液的稀释与保存 目的要求：掌握精液稀释的基本方法，稀释倍数的计算。 用品清单：纱布、冰瓶、塑料膜、吸管、冰箱、刻度试管、橡皮塞、橡皮筋、500ml烧杯、温度计（50℃）。 操作： 4．1精液与稀释液的等温：将烧杯中的水温调至33℃，将两支刻度试管放入水中，将采到的精液用吸管移至一个刻度试管中，将与精液等量的第一液移至另一个刻度试管中，在水浴中停留5min。 4．2第一次稀释：5min后，根据精液品质检查结果计算出稀释倍数对鲜精液进行第一次稀释。稀释时，应将稀释液用吸管移至放精液的试管中，并用吸管混合若干次。 4．3逐步降温：将稀释后精液继续放在500ml烧杯中，降温至室温后，再放入3℃恒温冰箱中。也可将装精液的刻度试管用纱布包4～8层用塑料膜包一层，放入加有碎冰的冰瓶中或直接放入3℃冰箱中。 4．4第二次稀释：如果作冷冻精液，可将第二液和稀释后的精液一起放在500ml烧杯中，放入3℃恒温冰箱中降温40min后，进行第二次稀释。并放在烧杯中2h进行平衡。 （四）精液冷冻与保存 目的：掌握各种剂型的牛羊精液冷冻的方法及解冻方法。 用品清单：液氮槽、带孔的铝盒、氟板、1cm直径塑料管、纱布袋、镊子、漏勺、试管、250ml烧杯、温度计、匙子、液氮罐、液氮、平衡后的精液、冰瓶（250ml）。 操作： 1.采精：用假阴道法采集精液 2.精液品质检查：采集到的精液应立即进行品质检查，射精量牛为2～15ml，羊为0.5～2ml，精子密度每ml牛不低于7亿，羊精子密度不低于15亿。为了不因为检查密度花费时间而造成精子活力下降，可在活力测定后，先进行1:0.5的稀释，并在水浴中降温。等测定出结果后再进行一次稀释。 3.精液的稀释：将按稀释需要的第一液量，放于干净的试管中，和装精液的试管一起放于33℃的水浴中等温5min，进行第一次稀释，将稀释液缓慢加入精液中。牛、羊颗粒冻精，按1:0.5稀释，细管冻精1:2稀释。用4～8层纱布包裹好，装于塑料袋中，和第二液一起放于2～5℃恒温冰箱中降温；或将装精液的试管直接放在500ml水浴中，和第二液一起放于2～5℃冰箱内降温。如果冰箱温度不可靠，也可用第一种方法包裹后，和第二液一起放于装有冰块的冰瓶中降温。降温30～60min后，用第二液进行第二次稀释。稀释比按1:1稀释。（稀释时应确保稀释液和精液等温）。 4.平衡：在2～5℃的温度下进行平衡，时间是0.5～3h。使甘油渗透到精子内部，起到对精子的防冻作用。 5.精液的冷冻： 5．1颗粒冻精制作 5．1．1冻前精液质量检查：将准备冷冻的平衡好的精液取样升温，确认精子的活力不低于0.7，保持精液在冷水浴中或有冰块的冰瓶中。将用于滴冻的滴管放在消毒干燥的试管中，并将试管放在与平衡后精液同一个水浴中。在冷冻操作中，如果不使用滴管就将滴管放于这个试管中。 5．1．2冷冻板温度控制：在液氮槽内加入液氮至冷冻板高度，将放冷冻板的铝盒及冷冻板浸入液氮中，至液氮不再大量蒸发，将冷冻板高度调整到与液氮面1cm高处。 5．1．2滴冻：用滴管吸取平衡后的精液，分别滴在铝板或氟板上的凹陷处，直径如黄豆大小，体积约0.1ml（每1ml精液可制作10个颗粒），每一个颗粒约滴入两滴精液。滴精液的过程应平稳，速度一致，轻快。 5．1．3熏蒸：滴满一板后，待所有颗粒变色后，应加盖，使液氮蒸汽熏蒸颗粒，必要时，可将加热器放在液氮中加热，加速液氮的蒸发。熏蒸5min后，将氟板浸入液氮。翻转氟板，用预冷过的勺子轻敲氟板使颗粒冻精脱离氟板。 注意事项：应先试冻一部分，解冻后确定复苏率正常，再将全部精液进行滴冻；滴冻中应保持颗粒大小的一致性，形状呈圆形或大半圆形，防止有气泡；滴冻中液氮面距冷冻板不应超过2cm。 颗粒冻精的收集：颗粒冻精可每冻一板，就在放在氟板的铝盒中收集，也可每冻完一板，先把颗粒冻精放入液氮中，待全部冻完后再集中收集。将颗粒冻精用漏勺收集，用塑料漏斗装在浸在液氮的纱布袋中，在袋口的线上作上标记，注明牛羊号、品种、生产日期。迅速将装袋的冻精放入液氮罐内的提漏内，将标记留在提漏的外边。然后将提漏放入液氮罐内。并在提漏的手柄上用一小纸牌作上标记。 5．2细管冻精制作 细管冻精在冷冻上与颗粒冻精有些不同：在稀释方法上有一次稀释法，也有二次稀释的方法；细管冻精制作量较大时，要使用细管冻精灌装机灌装后，再进行平衡，之后再进行冷冻。冷冻时，先将细管表面的水分擦干，摊放在冷冻架上，单层摆放，之后放入广口液氮罐离液氮10cm高处冷冻7～10min，然后浸入液氮，再收集分装于塑料管中，封口端向上。如果在冷冻槽中冷冻，可将细管排放在细铜网上，然后放在离液氮面3～4cm高处，冷冻7～10min，浸入液氮中。大量制作细管冻精，可使用程序冷冻仪。 6.冻精的保存与运输 冷冻精液保存的关键是确保液氮罐中的液氮量，并防止冻精受到污染。 6．1液氮罐的选择：保存用的液氮罐应有足够的容量，大型配种站的液氮罐容量应在30～50L，配种站的下属分站可采用10L的容量。 6．2液氮罐使用的注意事项 1地购买冻精或到各养殖场配种可采用3L、10L或保温瓶装冻精。 6．2．2在液氮罐运输中，应避免液氮罐受到外力撞击损坏。必要时可在运输车上放一个专用的液氮罐固定架。 6．2．3罐口应保持与外界相通的孔隙，避免将液氮罐口密封。 6．2．4液氮罐应放在通风凉爽的室内，避免放在封闭性强的空间内，以避免液氮的挥发，排走室内的空气，造成进入室内的人员窒息。在存放和运输中液氮罐应避免在阳光下曝晒。 2.5保在提漏上口露出前，补充液氮。 6．2．6在倒出液氮等可能造成液氮飞溅、翻倒等情况下，应小心操作，必要时可穿着防护衣（如用帆布制作的工作服和手套。 2.7液氮罐颈部结霜或液氮挥发速度过快，应更换可靠的液氮罐。 7.冷冻精液的解冻 7．1颗粒冻精的解冻 颗粒冻精的解冻方法有干解冻和湿解冻之分。 7．1．1解冻液：牛的解冻液一般用2.9%的柠檬酸钠液，羊的解冻液可用2.9%柠檬酸钠液，也可采用1.4%柠檬酸钠3%葡萄糖液。用VB12注射液作解冻液输精效果也非常好。 7．1．2颗粒冻精的取法：将液氮倒入泡沫塑料盒或广口保温瓶内，将液氮罐的提漏提至罐口下2～5cm处，根据标记，将盛装颗粒冻精的容器（纱布袋或塑料管）取出，并放入泡沫塑料盒内的液氮中。将纱布袋口撑开。尽可能用多少取多少颗粒冻精。取完冻精后，应将剩下的冻精放回液氮罐中。将容器中的液氮回收到液氮罐中。 7．1．3湿解冻：先将解冻液1～1.5ml，注入无菌平底试管中，放入38～40℃水浴中预温片刻（30秒左右），用在液氮中预冷过的镊子夹取1～2粒颗粒冻精，投入试管中。轻轻摇动，至溶解一半时取出。可取样检查活力。 7．1．4干解冻：将无菌平底试管放入38～40℃的浴中预温，将冻精颗粒投入到试管中，至溶解一半时，注入解冻液。 7．1．5牛的颗粒冻精多采用湿解冻，而羊颗粒冻精多采用干解冻。 7.1.6解冻后的温度：精液解冻后温度不宜太高，一般5～8℃较好，所以冻精解冻后，不能在水浴中继续加温，而是在解冻一半时就脱离水浴。 7.1.7解冻后的保存：不管是细管冻精还是颗粒冻精，解冻后保存时间都不宜过长，最好在3h用完，最多不超过12h。如果解冻后，精液不能立即使用，应保证保存条件。方法是，当冻精解冻一半时，将试管放入5℃的冷水中，并放入5℃的冰箱中保存，使用时直接在冰箱中取。 7.2细管冻精解冻：将水浴锅或保温杯水温调至40℃，将液氮罐的提漏提至罐口下便于取出细管的高度，确认细管的品种、牛号后，用镊子夹取细管封口端，迅速将细管放入保温杯中，至细管变色后，取出用手搓至全部溶化。一时不能用完的解冻后的细管精液，可将解冻变色的后的细管投入5℃的水中在保温瓶或冰箱中保存。 （五）输精 1．牛的输精 目的要求：重点掌握细管和颗粒冻精的解冻和母牛的输精操作。 用品：0.3%高锰酸钾溶液、改良型输精器套管、改良型输精器、液氮罐、细管冻精、纸巾、大保温杯、温度计、镊子。 目的要求：掌握直肠把握输精的操作方法。 输精前的准备： 1．1配种时机的掌握：根据母牛的发情阶段，确定配种时机：母牛发情开始约18h后接近发情结束或结束时配种为最佳时机。 2牛的保定：将待配母牛保定在六柱保定架内或在奶牛的畜床上输精。 1．3精液的准备：冷冻精液要先进行解冻，颗粒冻精解冻后，吸入输精器中。颗粒冻精解冻后或直接用鲜精输精时，可在钢质输精器末端接一个1或2.5ml的一次性注射器，然后吸取精液，以保证精液输入的数量。细管输精器应将细管冻精解冻后，用专用剪刀剪去封口端约0.5cm（用聚乙烯醇粉或热封端，另一端为中间夹有聚乙烯醇粉的棉塞），把细管专用输精枪捅针向后拉10～15cm，将剪口端向前装入输精枪的前端。将输精枪外套管的后端从塑料膜中推出塑料膜外，然后将外套管与输精枪套在一起旋紧。 1．4外阴部消毒：将母牛的尾巴拉到一侧，操作员站在牛的后方。用0.3%高锰酸钾冲洗母牛的外阴、肛门，并用消毒纸巾将水分吸干，将外阴部及唇裂擦拭干净。 1．5输精枪的插入：左手压开阴门裂，右手将输精枪连同外套塑料膜呈向角度插入阴门内，进入约15cm左右后，左手拉住外套塑料膜向后拉，右手固定住输精枪，使输精枪从塑料膜中穿出，并使输精枪的外套管推出塑料膜7～10cm。 1．6直肠内的操作：术者（指甲剪短锉光）左手上涂以润滑剂，先以手抚摸肛门周围，再将手呈锥形伸入母牛的直肠中，使牛排出宿粪。然后将手向前伸，并将直肠向后扒，在骨盆腔内寻找子宫颈（手掌展平，向骨盆腔底部下压，可找到一个棒状物，质硬而且有弹性），找到后，手握子宫颈的外口处，并使子宫颈呈水平，向前推送。 1．7输精枪进入子宫颈管内及输精：右手将输精枪向前推送，使输精枪前端到达子宫颈阴道部。双手配合，使输精枪插入子宫颈口，当输精枪进入子宫颈内时，能感觉到其通过子宫颈皱褶时“咔嘣、咔嘣”的“声音”，输精枪应随着子宫颈管内的皱褶变化上下调整方向，直到向前推送时，没有被皱褶阻挡的感觉时，说明输精枪已经到达子宫体。这时应避免继续向前推送。将输精枪捅针缓缓向前推，将精液送入子宫体内。 注意事项：输精枪向前推送时，应避免用蛮力，应不断调整方向，使输精枪轻松通过子宫颈管。如果在输精枪未插入子宫颈管口时，母牛努责，应将子宫颈向前推送，使阴道壁伸直。如果不能确认输精枪是否到达子宫体，为了避免输精枪戳伤子宫粘膜，可在输精枪在子宫颈管内通过4～5个皱褶时，就将精液输入。将精液输入时，应缓慢，以防倒流。 1．8输精次数：一般情况下，发情母牛只需输精一次即可，但如果输精后8h内母牛仍有明显的发情征状，应在第一次输精后8～10h进行第二次输精。 2．羊的输精 目的要求：掌握羊的输精的基本操作方法。 用品：羊用输精器、0.3%高锰酸钾、纸巾、开膣器、75%酒精棉球、石蜡油、无菌平底试管、2.9%柠檬酸钠、保温水杯、温度计。 2．1母羊的保定：可将母羊保定在专用的输精架内，输精架应高于地面或在输精架后挖一个坑以便于工作人员操作。也可将母羊的后肢放在一个横杆上保定，也可由两名助手将母羊的两后肢提起，使前肢着地，使母羊呈倒立状态。 2．2精液及输精器的准备：每次用过的输精器，应先用蒸馏水冲洗管壁内外，然后用酒精进行管内和管壁外的消毒，再用蒸馏水将酒精冲洗掉，将输精器金属部分放在干燥箱中120～150度消毒30min。放凉后使用。如果是颗粒冻精应在平底试管中解冻。末端接一支1ml一次性注射器，吸取鲜精或解冻后的冷冻精液。 2．3外阴部消毒：用0.3%的高锰酸钾喷在母羊的后躯，湿润后，用纸巾擦干。 2．4插入开膣器：压开阴唇裂，用消毒过的开膣器，涂上润滑剂，使侧扁的鸭嘴部呈上下方向插入母羊阴道内，然后使手柄向下转动，并张开开膣器，保持撑开状态。 2．5找到子宫颈口：子宫颈口可能因大量的粘液存在而不易寻找，可用输精器轻轻拨开粘液，如果仍不易确定，应注意子宫颈口周围的粘膜色泽呈暗红色。 2．6输精：借助光源或自然光，找到子宫颈口后，将输精器插入子宫颈管内1cm左右，缓缓将精液输入。然后抽出输精器和开膣器。 2．7注意：开膣器张开后，直到完全抽出前，要始终保持开张状态，避免因松手使开膣器夹伤粘膜。如果最终不能找到子宫颈口，可将精液输入到粘膜颜色较深的地方。处女羊无法插入开膣器，可将输精器直接插入到母羊的阴道内进行输精，输精量（总有效精子数）应加倍。 3.猪的输精 3.1用品：输精管、洗瓶、红霉素软膏、精液运输箱、纸巾、高锰酸钾溶液、抹布、输精记录簿等。 3.2输精时间、配种方法和输精次数 （1）断奶后3～6d发情的经产母猪，发情出现静立反射后6～12h进行第1次输精配种；（2）断奶后7d以上发情经产母猪，发情出现静立反应，就进行配种（输精）；分以下几种（1）第1次自然交配、第2、3次人工授精；（2）2次人工授精；（3）3次人工授精； 3.3精液检查 袋装精液可先将其放在恒温载物台上，用一张载玻片（边缘磨光）压在精液袋上，使这部分精液加热片刻，在100倍下观察活力，输精前精液的活力不应低于0.5。没有恒温载物台的实验室，可将精液袋封口线内刺破，用微量移液器吸取精液在显微镜下检查，如果精液合格，再用封口机将精液袋封好。 3.4输精前再次进行发情鉴定 将试情公猪赶至待配母猪栏之前，使母猪在输精时与公猪口鼻部接触； 3.5外阴部消毒 输精前清洁双手或带上一次性手套；用0.1～0.2%高锰酸钾溶液清洁母猪外阴、尾根及臀部周围，再用消毒纸巾擦干； 3.6在输精管前端涂上润滑剂 从密封袋中取出没有受任何污染的一次性输精管（手不应接触输精管的前2/3部分），在其前端上涂上精液作润滑剂； 3.7将输精管插入母猪的生殖道内 双手分开母猪外阴部，然后左手使外阴口保持张开状态，将输精管45度角向上插入母猪生殖道内，当感到有阻力时，继续缓慢向左旋转并用力将输精管向前送入，直到感觉输精管前端被锁定（轻轻回拉拉不动）； 3.8输精 从精液贮存箱中取出品质合格的精液，确认公猪品种、耳号；缓慢颠倒摇匀精液，瓣开精液袋封口将塑料管暴露出来，接到输精管上，将精液袋后端提起，开始进行输精（也可将精液袋先套在输精管上后再将输精管插入母猪生殖道内）；在输精过程中，应不断抚摸母猪的乳房或外阴、压背、抚摸母猪的腹侧以刺激母猪，使其子宫收缩产生负压，将精液吸纳。输精时除非输精开始时精液不下，勿将精液挤入母猪的生殖道内，以防精液倒流；如果在专用的输精栏内进行输精，可隔栏放一头公猪，这样输精会更容易些；如果输精场地宽敞，输精员可站在母猪的左侧，面向后，左臂挎在母猪的后躯，将重力压在母猪的后背部，并用左手抚摸母猪侧腹及乳房，右手将精液袋提起，这样输精更接近本交，精液进入母猪生殖道的速度更快些。 3.9防止精液倒流 用控制精液袋高低的方法来调节精液流出的速度，输精时间一般在3～7min，输完后，应在防止空气进入母猪生殖道的情况下，把输精管后端一小段折起，用精液袋上的圆孔固定，使输精器滞留在生殖道内3～5min，让输精管慢慢滑落；或较快地将输精管向下抽出，以促进子宫颈口收缩，防止精液倒流； 3.10从17℃冰箱中中取出的精液，无需升温至37℃，摇匀后可直接输精，但检查精子活力需将载玻片升温至37℃； 3.11每头母猪每次输精都应使用一条新的输精管； 3.12输精时的问题处理 （1）如果在插入输精管时，母猪排尿，就应将这支输精管丢弃；（2）如果在输精时，精液倒流，应将精液袋放低，使生殖道内的精液流回精液袋中，再略微提高精液袋，使精液缓慢流入生殖道，同时注意压迫母猪的背部或对母猪的侧腹部及乳房进行按摩，以促进子宫收缩；（3）如果以上方法仍然不能解决问题，继续倒流或不下，可前后移动输精管，或抽出输精管，重新插入锁定后，继续输精； 3.13输精次数及间隔时间 每头母猪在一个发情期内要求至少输精两次，最好三次，两次输精时间间隔时间8～12h。 实训四 牛羊的妊娠诊断 一、目的要求 掌握母畜早期妊娠诊断的基本方法。 二、实训内容 外部观察法、阴道检查法、直肠检查法妊娠诊断，超声波法妊娠诊断 三、用品 0.3%高锰酸钾、纸巾、开膣器、石蜡油、手灯、B型超声波诊断仪等。 四、技术要求 （一）牛的妊娠诊断 牛的妊娠诊断方法有三种：外部观察法、阴道检查法和直肠检查法。 外部观察法：母牛妊娠后不出现发情周期（在配种后17～22d和37～44d未见发情），食欲增加，被毛变得光亮，性情温驯，行动谨慎，到5个月后腹围明显增大，向右侧突出，乳房开始发育。 阴道检查法：用开膣器进行妊娠诊断。向阴道内插入开膣器时感到有阻力；打开开膣器后，可看到粘膜苍白、干燥，宫颈口关闭，向一侧倾斜。妊娠达1.5～5个月时，子宫塞的颜色变黄、稠浓；6个月后，粘液变得稀薄、透明，有些排出体外在阴门下方结成痂块。子宫颈位置前移，阴道变得深长。 直肠检查法： 母牛配种后19～22d子宫变化不明显，如果卵巢上有发育良好的黄体，可怀疑已受孕。 妊娠30d后两侧子宫大小开始不一，孕角略为变粗质地松软，有波动感，孕角的子宫壁变薄；空角较坚实，有弹性。用手握住孕角，轻轻滑动时可感到有胎囊，用拇指与食指捏起子宫角，然后放松，可感到子宫腔内有胎囊滑过。胎囊在40d时才有球形感，直径达3.5～4cm。但经产牛也常易错判。 妊娠60d后，孕角大小为空角的2倍左右，波动感明显，角间沟变得宽平，子宫向腹腔下垂，但依然能摸到整个子宫。 妊娠90d，孕角的直径长到10～12cm，波动极明显；空角也增大1倍，角间沟消失，子宫开始沉向腹腔，初产牛下沉要晚些。子宫颈前移，有时能摸到胎儿。孕侧的子宫动脉出现微弱的妊娠脉搏。 妊娠120d，子宫全部沉入腹腔，子宫颈越过耻骨前缘，一般只能摸到两侧的子宫角。子叶明显，可摸到胎儿，孕侧子宫动脉的妊娠脉搏已向下延伸，可能显感到脉动。 妊娠150d，子宫膨大，沉入前腹腔区，子叶增长到胡桃核到鸡蛋大小，子宫动脉增粗，达手指粗细。空角子宫也增粗，出现妊娠脉搏。子宫动脉沿荐骨前行，在荐骨与腰椎交界的岬部前方，可摸到主动脉的最后一个分支，称髂内动脉。在左右两根髂内动脉的根部，顺子宫阔韧带下行，可摸到子宫动脉。它是游离状的，仔细触摸不难找到。 4.乳汁孕酮测定法 配种后第35～83d，每ml乳汁孕酮含量达到35ng以上可确定为怀孕。 （二）羊的妊娠诊断 1.直肠腹外触诊法 母山羊绝食过夜后，口服每kg体重0.11mg甲苯塞嗪以作镇定作用。然后取背卧位保定，取肥皂水30ml灌入直肠；再将一根圆头的直径为1.5cm、长度50cm的空心硬塑料棒（管）涂上润滑油后，沿脊背方向前后左右移动着插入直肠30～35cm深，将棒压向胎儿所处的腹腔后部。若子宫内有胎儿，则有实体的感觉或塑料棒左右移动时有障碍物；否则，从腹壁外可清晰地摸到塑料棒。此法能准确判断配种后55d以上的妊娠母羊，但易于造成损伤和流产，使用此法应特别小心。 多普勒仪诊断法 根据多谱勒仪的原理，将探头插入母羊直肠内，可以听到母体心率（90～110次/分）和胎儿的脉搏，以此来判断母羊是否妊娠，在绵羊上有很高的准确性。 娠诊断仪法 提起母羊右后肢，用少量润滑剂滴在A型超声波诊断仪探头处，按压开关键，对准母羊的后腹侧毛少的区域，使探头向前、向左、向上扫描，如听到声音，缩小扫描范围，当听到持续的声音，说明母羊已经怀孕。如果母羊正在发情或有子宫炎，用A型超声波可能会因此时母羊子宫内有大量粘液而造成误诊。 实训五 牛的胚胎移植技术规程 目的要求 基本掌握牛的非手术冲胚及非手术移胚胚胎移植的基本操作技术。 内容 供受体的驱虫及营养调控、供受体的同期发情、供体的超数排卵、供体的配种、供受体的发情登记、冲胚液的配制、供体的采胚、检胚与胚胎鉴定、胚胎的冷冻、胚胎移植 用品清单：（见附件） 技术操作 （一）主题内容与适用范围 本规程规定了牛胚胎移植技术操作的基本原则、要求和方法。 本规程适用于胚胎移植技术推广应用的规范化操作。 （二）超数排卵 1．供体牛的选择 1．1供体牛应符合本品种标准，具有较高的生产性能。 1．2供体牛的年龄一般为3~8岁，青年牛在18月龄左右，体格健壮，无遗传性疾病，繁殖机能正常。 1．3产犊记录清楚，没有流产病史，产后60d以上，有两次正常发情记录。 1．4生殖器官正常，不得患有子宫内膜炎、卵巢囊肿和子宫过度弛缓、下垂等疾病，长期空怀的母牛不得作供体。 1．5重复超数排卵的供体牛每次处理需间隔60d左右。在连续超数排卵处理4～5次后需进行配种，以使之妊娠，待产犊后再使用。凡2次超数排卵反应差的母牛不再用作供体。 1．6供体牛的超数排卵处理应在自然发情或诱导发情的情期第9～13d进行。凡黄体发育不良，卵巢静止的母牛不宜用。 1．7应选择性情温顺的母牛作供体，以便于操作。 2. 供体牛的饲养管理 2．1良好的营养状况是牛保持正常繁殖机能的必要条件，要保证给供体牛足够的优质干草、青贮或多汁饲料、精料以及维生素和矿物质，并供给清洁的饮水和盐，做到合理饲养，精心管理。 2．2供体牛在采卵前后要特别注意保持良好的饲管环境，不得任意变换饲草；饲料和管理程序，避免因过强的应激所造成的神经紧张状态。 3．超数排卵处理 3．1促卵泡素(FSH)减量注射法 供体牛在发情后的9～13d肌注FSH，早晚各一次，间隔12h，分4d减量注射。在第3d时同时宫注PGF2α2.0～2.4mg。如使用国产FSH总剂量为325单位时，处理方法如附图所示。超排剂量根据不同厂家激素确定适宜剂量，国产激素320～360单位，进口激素28～36mg。  3．2 孕马血清促性腺激素(PMSG)处理法 在情期的11～12d，一次肌注PMSG2500～30001U，48h后宫注PGF2α2.4mg。发情后约18h肌注等量的抗PMSG。 3．3 发情观察和人工授精 PGF2α处理后40～48h，大部分处理牛发情。通常要求从宫注PGF2α第2d傍晚开始观察发情，至少早晚各观察一次。在观察到接受爬跨后4～6h进行第一次输精，间隔12h后第二次输精。每次有效精子数不得少于50×106，输入两侧子宫角或子宫体。注意输精时不得触摸卵巢。 （三）采卵 1．采卵时间 以发情日为第0d，在第5～6d检查卵巢确定黄体数，以便于安排受体头数。第7d(或第6～8d)非手术回收卵。 2．器械和冲卵液的准备 灭菌处理过的冲卵管用PBS液冲洗2～3次，插入钢芯，检查气球。在无菌间用导管连接吊瓶和集卵杯灌流装置。装入PBS液的吊瓶在37℃水浴中预温待用。准备好必要的麻醉剂、注射器、酒精棉球和冲洗消毒剂等。 3．供体牛的保定和麻醉 供体牛保定完毕后，在第一、二尾椎骨间酒精消毒，用2%普鲁卡因3～5ml作硬膜外麻醉，或肌注2%静松灵l ml。 4．外阴清洗、消毒 麻醉后将牛尾竖直绑在保定架上，清除粪便，用清水冲洗会阴部及外阴，再用高锰酸钾液冲洗消毒，用灭菌卫生纸擦干，最后用酒精棉球消毒外阴部。 5．冲卵管的插入和冲卵部位 助手将准备好的冲卵管交给术者的右手，术者左手食指和拇指压开阴门插入冲卵管，再将左手伸入直肠，仔细小心地诱导冲卵管经子宫颈进入一侧子宫角至大弯处，抽出少许钢芯，再将冲卵管向前推，使其尖端靠近子宫角深部。由助手持30ml注射器一次推入10ml空气，然后按术者要求，以1ml计数充气。根据子宫大小及冲卵管在子宫的位置确定充气量，一般青年牛充气14～16ml，经产牛为18～25ml。冲卵管固定后抽出钢芯，开始灌流。 6．灌流方法 将吊瓶挂在距外阴部1.0m高处，接通三通管(Y型)和冲卵管。术者用右手控制进流和出流开关，每次灌注30～50ml，由少到多，每侧总量为300～500ml。左手通过直肠辅助按摩子宫角。每侧子宫角冲8～10次。或者用50ml注射器，每次注入30～50ml的PBS冲卵液，分次冲洗子宫角，回收后注入加盖量筒。另一侧子宫角的冲洗是由术者右手拉直冲卵管，助手小心插入钢芯。术者的左手在直肠内诱导钢芯插稳后，给气球放气。术者再将冲卵管插入另一侧子宫角，用同样的方法冲洗。全过程需在室温(20℃左右)操作。 7．术后处理 两侧子宫角冲卵完成后，从气球放出一部分空气，将冲卵管抽至子宫体灌注土霉素溶液(3g土霉素粉溶于100ml灭菌双蒸水或生理盐水)或10ml青霉素(80万u)和链霉素(100万u)，拔出冲卵管。 （四）检卵 1．过滤集卵杯(日本产)法 回收结束后，用带4G针头的注射器冲洗滤网2～3次，吸去杯中的泡沫，置实体显微镜下检查。 2．过滤杯(美国产)法 滤去冲卵液，将过滤杯中留下的30～50ml倒入平皿，用冲卵液冲洗过滤杯2～3次，一并倒入平皿，置镜下检查。 3．沉淀法(或滤网吸液法) 将回收的冲卵液注入1000ml量筒，在20～25℃下静置20～30min(min)，用导管吸去上层液体。或者按好滤网，用导管在滤网上吸去上部冲卵液，将残留的80～100ml倒入平皿内检卵。 4．检卵前的准备 在酒精灯上拉好内径为200～300um的玻璃吸管和玻璃棒，在吸管上连接乳胶管(也可用1ml一次性注射器与一支采血管接一起)。在小培养皿内做好含10%或20%牛血清的PBS保存液液滴3～5个，覆盖上液体石蜡油，作好编号，放入培养箱待用。 5．检卵 用玻璃棒清除卵外围的粘液、杂质。用吸管将卵移至培养皿的液滴内，同一供体牛的卵放于同一液滴内。然后用吸管先吸入少量第二液滴的PBS保存液至第一液滴，吸入全部卵，防止吸入黏液、杂质，移至第二液滴，依次冲洗卵3～5次。室温20～25℃，需2人进行检卵及胚胎鉴定。 （五）胚胎的鉴定和分级 1．胚胎的鉴定 1．1在100～200倍实体解剖镜下观察受精卵的形态、色调、分裂球的大小、均匀度、细胞的密度、与透明带的间隙以及变性情况等。 1．2凡卵子的卵黄未形成分裂球及细胞团的，均列为未受精卵。 1．3胚胎的发育阶段：通常受精后6～8d非手术回收的正常受精卵发育情况如下： 1．3．1桑椹胚一发情后第5～6d回收的卵，只能观察到球状的细胞团，分不清分裂球，占据透明带内腔的大部分。 1．3．2致密桑椹胚一发情后第6～7d回收的卵，细胞团变小，占透明带内腔60%～70%。 1．3．3早期囊胚一发情后第7～8d回收的卵，细胞的一部分出现发亮的胚泡腔。细胞团占透明带内腔70%～80%，难以分清内细胞团和滋养层。 1．3．4囊胚一发情后第7～8d回收，内细胞团和滋养层界线清晰，胚泡腔明显，细胞充满透明带内腔。 1．3．5扩大囊胚一发情后第8～9d回收，胚泡腔明显扩大，体积增大到原来的1.2～1.5倍，与透明带之间无空隙，透明带变薄，相当于正常厚度的1/3。 1．3．6孵育胚一一般在发情后9～11d，由于胚泡腔继续扩张，致使透明带破裂，卵细胞脱出。 1．3．7凡在发情后第6～8d回收的16细胞以下的受精卵均应列为非正常发育卵，不能用于移植或冷冻保存。 2．胚胎的分级：分为A、B、C三个等级。 2．1 A级一胚胎形态完整，轮廓清晰，呈球形，分裂球大小均匀，结构紧凑，色调和透明度适中，无附着的细胞和液泡。 2．2 B级一轮廓清晰，色调及细胞密度良好，可见到一些附着的细胞和液泡，变性细胞约占10%～30%。 2．3C级一轮廓不清晰，色调发暗，结构较松散，游离的细胞或液泡较多，变性细胞达30%～50%。 2．4胚胎的等级划分还应考虑到受精卵的发育程度。发情后第7d回收的受精卵在正常发育时应处于致密桑椹胚至囊胚阶段。凡在16细胞以下的受精卵及变性细胞超过一半的胚胎均属等外。 （六）胚胎的冷冻保存 1．三步平衡法 1．1 10%甘油保存液的配制：取9ml含20%牛血清的PBS，加入lml甘油，用吸管反复混合15～20次，经0.22um滤器过滤到灭菌容器内待用。 1．2 取含20%牛血清的PBS2ml和3.5ml，分别加入10%甘油3ml和1.5ml，配成含6%和3%甘油的保存液。将3%、6%和10%三种甘油浓度的保存液分别装入小培养皿。 1．3 胚胎分别在3%、6%和10%甘油的保存液中浸5min。 1．4 胚胎装管：用0.25ml塑料细管按以下顺序吸入，少量的10%甘油的PBS液、气泡、10%甘油的PBS液(含有胚胎)、气泡、少量的10%甘油的PBS液(如附图所示)，加热封口两道。  2．一步细管法 2．1 保存液的配制：10%甘油的PBS液配法同上。12.5%蔗糖液的配制为称出12.5g蔗糖，加入80ml的PBS溶解。每ml加入青霉素100单位、链霉素100ug。用0.22um滤器过滤灭菌后，分装成4ml瓶，在-20℃保存。使用时，将每瓶(4m1)蔗糖液解冻，加入lml灭活牛血清，混合后用0.22um滤器灭菌。 2．2 胚胎从PBS液中直接吸入到10%甘油的PBS中冲洗3～5次，停留5min后移入第二个10%甘油的保存液中10min。 2．3 胚胎装管：用0.25ml塑料细管按附图装管。  2．4 塑料细管的编号：剪一段(2cm)0.5ml的塑料细管作为标记外套，内装色纸，写上供体品种、牛号、胚胎发育阶段及等级、制作日期(年、月、日)，并在外套管上写明序号备查。 3．冷冻程序：将细管直接浸入冷冻仪的酒精浴内，以1℃/min的速度从室温降至-6℃，植冰5min后，停留10min，再以0.3℃/min的速度降至-30℃，停留10min后，直接投入液氮，长期保存。 （七）冷冻胚胎的解冻 1．三步平衡法冻胚的解冻 1．1 解冻液的配制：配制出10%、6%和3%甘油的PBS保存液，用0.22um滤器灭菌，分装在小培养皿内，第一杯为含10%甘油的PBS保存液，第二杯为6%甘油的PBS保存液，第三杯为3%甘油的PBS保存液，第四杯为0%甘油的PBS保存液。 1．2 胚胎的解冻：胚胎从液氮中取出在3s内投入38℃水浴浸10s。 1．3 三步脱甘油：用70%酒精棉球消毒解冻后塑料细管和剪刀刀刃，剪去棉塞端，与带有空气的l ml注射器连接上。再剪去细管的另一端，在室温下将胚胎推广入10%甘油和0.3mol／L蔗糖的PBS保存液中，放置5min，以后陆续移入6%和3%甘油蔗糖的PBS保存液中，各放置5min，最后移至不含甘油的PBS保存液中镜检待用。 2．一步细管法的解冻 2．1 解冻方法 从液氮中取出装有胚胎的塑料细管，投入37～38℃温水水浴10s。 2．2 脱甘油 手提塑料细管，棉塞向下甩2、3次，将气泡甩向棉塞端，使蔗糖液和保存液混合。或者用手指轻弹气泡，使两种液体混合。将棉塞向下直立10min。 2．3 观察胚胎 用特制塑料细管观察镜或显微镜的目镜，通过塑料管壁从上到下转动观察胚胎的形态和位置，确认后用70%的酒精棉球消毒并切除细管上层l cm，切口要平整，可直接用于移植。 （八）胚胎分割 1．准备工作 1．1 检查和调整好显微操作装置。 1．2 微细玻璃针和固定细管的制作：玻璃针细度要求为3um，用专用拉针仪制作。固定管要求拉制成内径为100um的细管，切口要齐，切口用煅炼仪烧圆。上述针、细管均用70%酒精灭菌，使用前用PBS液反复冲洗。 1．3 安装好特制的分割胚胎的刀具。 1．4 将含有20%牛血清的PBS液经0.22um滤器过滤，在灭菌的塑料培养皿内作成液滴，覆盖上液体石蜡，放入培养箱30min后使用。 2．分割操作 2．1 将第6～8d回收的发育良好的胚胎移入已作好的液滴，移至倒置显微镜或实体解剖镜下，调整焦距，找到胚胎。用已作好的细管固定胚胎，用玻璃针或刀片从内细胞团正中切开。 2．2 使用刀具分割时可不用固定管。先用刀刃在培养皿上划一刀印，再用刀尖将胚胎拨至刀印上，调整好内细胞团的位置，用刀片从上到下切成两团。 2．3 分割好的胚胎移至含20%牛血清的PBS，清洗后装管移植。 2．4 冷冻胚胎解冻后分割操作同上。 （九）胚胎移植 1．受体牛的选择标准 1．1年龄在3～8岁，健康，无疾病，体格较大，膘度好。 1．2繁殖性能正常，产后60d以上，并有两次以上的正常自然发情记录。 1．3泌乳性能好，无难产史。不使用两次人工授精未孕的牛。 2．受体牛的饲养管理 2．1 做到精心管理，合理饲养，环境清洁，饲草、饲料、饮水要新鲜，补充食盐和必要的添加剂。 2．2 组成一定数量的牛群。圈舍内防止过挤，以便于发情观察。 2．3 农户长期舍饲的母牛要注意加强运动。 2．4 防止在移植前后因饲料及环境改变造成的应激反应。 3．供体牛、受体牛的同期发情 3．1 自然发情 根据受体牛的发情观察，与供体牛发情前后相差一天的牛，可作为受体。 3．2 使用PGF2α。(一次宫注)诱发发情 一般在供体牛注射PGF2α前一天，给处于情期8～15d且直检黄体好的受体牛一次宫注PGF2α2mg诱发发情。 3．3两次PGF2α处理 在不考虑发情周期的情况下，可间隔11d，前后两次宫注PGF2α受体牛的处理日程安排应与供体牛超排处理相吻合。 3．4发情观察 原则上根据母牛接受爬跨确认发情，早、晚各观察30min发情情况。对发情牛需做直检以确认卵泡，次日上午或晚上确定是否排卵。 若在发情后36h以后排卵的牛不能用作受体。 3．5供体牛、受体牛的发情日差 移植胚胎时，如果供体和受体牛的发情周期不一致，则难以受胎。要求两者的子宫环境相一致。受体牛的发情日比供体牛早一天为+1，晚一天为-1，同日发情为0。超过2d不能用于移植。 3．6按胚胎发育情况选受体牛的发情日差 可将致密桑椹胚移植给发情6d的受体牛，将早期囊胚移植给发情7d的受体牛，将囊胚和扩大囊胚移植给发情8d的受体牛。 4．移植 4．1待移植受体牛的检查 要求受体牛发情时直检的卵泡直径在10～20mm左右，发情后36h内出现排卵。移植前一天直检黄体，其直径在11～15mm以上，黄体的手感弹性好，质地软而充实。 4．2器械准备 仿西德式金属移植器，先将移植枪、枪头及金属保护外套分别用纸包扎好，高压消毒。塑料卡苏式移植枪需经气体灭菌。移植时，先用70%酒精棉球消毒装有胚胎的塑料细管，然后剪掉封口一端，装入移植枪内，套上保护外套。 4．3移植前胚胎装管 胚胎移植时可用0.25ml细管分三段吸入PBS保存液，中间由两个气泡隔开，中段含有胚胎。也可用小气泡分成多段装管，胚胎在中段。一步细管法解冻脱甘油后，用酒精棉球多次消毒细管，剪去封口即可用于移植。 4．4受体牛的准备 将受体牛保定，清除粪便，肌注2%静松灵l ml或用2%的普鲁卡因3ml在1、2尾椎间硬膜外麻醉。清洗外阴，用高锰酸钾水冲洗消毒，用灭菌纸擦干，最后经酒精棉球消毒。 4．5移植 术者用左手压开外阴，右手持移植器插入阴道。然后左手伸进直肠，移植器到达子宫颈口时，右手用力将移植枪捅破外套填片，插入子宫颈。左手在直肠内诱导使枪头轻轻稳妥地插入黄体侧子宫角至大弯处，持移植器的右手推出胚胎，缓慢旋转地抽出移植枪。 （十）妊娠诊断 1．直肠检查法 通常在移植后三个月开始检查。妊娠90d时，子宫继续增大，落入腹腔，可感觉到胎儿的浮动，孕角出现孕脉，子宫壁可触到子叶。 2．超声波诊断(B超) 2．1对妊娠25d以上的受体牛可用B超检查。利用探头通过直肠轻轻地在子宫角滑动，在荧光屏上便可观察到周围黑色中间有一个长1～2cm灰白色图像，即是胎儿。胎儿60日龄时为6～7cm长，90日龄时为14～17cm长。 2．2使用B超探头检查时要特别注意，防止动作过重，检查过度，以免引起流产。 实训六 羊胚胎移植技术操作规程 目的要求 掌握羊胚胎移植的手术采卵、检胚、手术移植的基本操作规程。 实训内容 供受体的驱虫及营养调控、供受体的同期发情、供体的超数排卵、供体的配种、供受体的发情登记、冲胚液的配制、供体的采胚、检胚与胚胎鉴定、胚胎的冷冻、胚胎移植 用品清单（见附件） 技术要求 本规程规定了绵羊胚胎移植技术操作的基本原则、要求和方法。 本规程适用于绵羊胚胎移植技术推广应用的规范化操作。山羊胚胎移植操作也可参照本规程。 （一）超数排卵 1．供体羊的选择 1．1供体羊应符合品种标准，具有较高生产性能和遗传育种价值。 1．2供体羊的年龄一般为2.5～7岁，青年羊为18月龄。体格健壮，无遗传及传染性疾病。 1．3繁殖机能正常，经产母羊没有空胎史。 2.供体羊的饲养管理 2．1良好的营养状况是保持正常繁殖机能的必要条件。应在优质牧草的草场放牧，补充高蛋白饲料、维生素和矿物质，并供给盐和清洁的饮水，做到合理饲养，精心管理。 2．2供体羊在采卵前后应保证良好的饲管条件，不得任意变换草料和管理程序，在配种季节前开始补饲，保持中等以上体膘。 3．超数排卵时间 3．1绵羊胚胎移植的超数排卵，应在每年绵羊最佳繁殖季节进行。 3．2供体羊超数排卵开始处理的时间，应在自然发情或诱导发情的情期第12～13d进行。 4．超数排卵处理 4．1促卵泡素(FSH)减量处理法 供体羊在发情后的12～13d开始肌肉注射FSH，早晚各一次，间隔12h分3d减量注射。使用国产FSH总剂量为200～300单位。供体羊一般在开始注射后的第4d表现发情，发情后立即静脉注射(或肌注)促黄体素(LH)75～100iu，或促性腺激素释放激素的类似物50～75ug，LH的剂量一般为FSH的1/3。超排剂量及激素比例可根据不同厂家和批号稍作调整。  4．2孕马血清促性腺激素(PMSG)处理法 在发情周期的第12～13d，一次肌注PMSGl500～25001U(国际单位)，发情后18～24h肌注等量的抗PMSG。 4．3发情鉴定和人工授精 FSH注射完毕，随即每天早晚用试情公羊(带试情布或结扎输精管)进行试情。发情供体羊每日上下午各配种一次，直至发情结束。应增加每次输精的有效精子数。 （二）采卵 1．采卵时间 以发情日为0d，在6～7.5d或2～3d用手术法分别从子宫或输卵管回收卵。 2．手术室设置及要求 采卵及胚胎移植需在专门的手术室内进行，手术室要求洁净明亮，光线充足、无尘，地面用水泥或砖铺成。配备照明用电。室内温度保持在20～25℃。在手术室内设专门套间，作为胚胎操作室。手术室定期用3%～5%煤酚皂(来苏尔)或石炭酸溶液喷洒消毒，手术前用紫外灯照射1～2h，在手术过程中不应随意开启门窗。 3．器械、冲卵液等物品的准备 3．1手术用的金属器械放在含0.5%亚硫酸钠(作为防诱剂)的0.1%新洁尔灭液中浸泡30min(min)或在来苏尔液中浸泡1h，使用前用灭菌盐水冲洗，以除去化学试剂的毒性、腐蚀性和气味。 3．2玻璃器皿、敷料和创巾等物品按规程要求进行消毒。 3．4麻醉药、消毒药和抗菌素等药物，酒精棉、碘酒棉等物品备齐。 4．供体羊准备 供体羊手术前应停食24～48h，可供给适量饮水（手术前12h停水）。 4．1供体羊的保定和麻醉 供体羊仰放在手术保定架上，四肢固定。肌肉注射2%静松灵0.5ml，局部用0.5%盐酸普鲁卡因麻醉。 4．2手术部位及其消毒 手术部位一般选择乳房前腹中线部(在两条乳静脉之间)或后肢股内侧鼠鼷部。用电剪或毛剪在术部剪毛，应剪净毛茬，分别用清水和消毒液清洗术部，然后涂以2%～4%的碘酒，待干后再用70%～75%的酒精棉脱碘。先盖大创巾，再将灭菌巾盖于手术部位，使预定的切口暴露在创巾开口的中部。 5．术者的准备 术者应将指甲剪短，并锉光滑，用指刷、肥皂清洗，特别注意刷洗指缝，再进行消毒。术者需穿清洁手术服，戴工作帽和口罩。 手臂消毒：在两个盆内各盛温热的洁水(已煮沸过)3000～4000ml，加入氨水5～7ml，配成0.5%的氨水，术者将手指尖到肘部先后在两盆氨水中各浸泡2min，洗后用消毒毛巾或纱布擦干，按手向肘的顺序擦。然后再将手臂置于0.1%的新洁尔灭液中浸洗约5min，或用70%～75%酒精棉球擦拭两次。双手消毒后，要保持拱手姿势，避免与未消毒过的物品接触，一旦接触，即应重新消毒。 6．手术操作的基本要求 手术操作要细心、谨慎、熟练，否则直接影响冲卵效果和创口愈合及供体羊繁殖机能的恢复。 6．1作切口注意要点 切口常用直线形，作切口时注意以下六点： 6．1．1避开较大血管和神经； 6．1．2切口边缘与切面整齐； 6．1．3切口方向与组织走向尽量一致； 6．1．4依组织层次分层切开； 6．1．5便于暴露羊的子宫和卵巢，切口长约为5cm(cm)； 6．1．6避开第一次手术瘢痕。 6．2切开皮肤 用左手的食指和拇指在预定切口的两侧将皮肤撑紧固定，右手用餐刀式执刀，由预定切口起点至终点一次切开，使切口深度一致，边缘平直。 6．3切开皮下组织 皮下组织用执笔式执刀法切开，也可先切一小口，再用外科剪刀剪开。 6．4切开肌肉，用钝性分离法。按肌肉纤维方向用刀柄或止血钳刺开一小切口。然后将刀柄末端或用手指伸入切口，沿纤维方向整齐分离开。避免损伤肌肉的血管和神经。 6．5切开腹膜 切开腹膜应避免损伤腹内脏器，先用镊子提起腹膜，在提起部位作一切口，然后用另一只手的食指深入腹膜引导刀(向外切口)或用外科剪净腹膜剪开。 术者将食指及中指由切口伸入腹腔，在与骨盆腔交界的前后位置触摸子宫角，摸到后用二指夹持，牵引至创口表面，循一侧子宫角至该侧输卵管，在输卵管末端转弯处找到该侧卵巢。不可用力牵拉卵巢，不能直接用手捏卵巢，更不能触摸排卵点和充血的卵泡。观察卵巢表面排卵点和卵泡发育，详细记录。如果排卵点少于3个，可不冲洗。 6．6止血 6．6．1毛细血管止血 手术中出血应及时、妥善地止血。对常见的毛细管出血或渗血，用纱布敷料轻压出血处即可，不可用纱布擦拭出血处。 6．6．2小血管止血 用止血钳止血，首先要看准出血所在位置，钳夹可保持足够的时间，若将止血钳沿血管纵轴扭转数周，止血效果更好。 6．6．3较大血管止血 除用止血钳夹住暂时止血外，必要时还需用缝合线结扎止血。结扎打结分为徒手打结和器械打结两种。 6．7缝合 6．7．1缝合的基本要求 a.缝合前创口必须彻底止血，用加抗菌素的灭菌生理盐水冲洗，清除手术过程中形成的血凝块等。 b.按组织层次分层缝合。 c.对合严密、创缘不内卷、外翻。 d.缝线结扎松紧适当。 e.缝合进针和出针要距创缘0.5cm左右。 f.针间距要均匀，所有结要打在同一侧。 6．7．2缝合方法 缝合方法大致分为间断缝合和连续缝合两种。 a.间断缝合，用于张力较大，渗出物较多的伤口。在创口处每隔1cm缝一针，针针打结。这种缝合常用于肌肉和皮肤的缝合。 b.连续缝合，只在缝线的头尾打结。螺旋形缝合是最简单的一种连续缝合，适于子宫、腹膜和粘膜的缝合；锁扣缝合，如同做衣服锁扣眼的方法，可用于直线形的肌肉和皮肤缝合。 7．采卵方法 7．1输卵管法 供体羊发情后2～3d采卵，用输卵管法。将冲卵管一端由输卵管伞部的喇叭口插入，约2～3cm深(打活结或用钝圆的夹子固定)，另一端接集卵皿。用注射器吸取37℃的冲卵液5～l0ml，在子宫角靠近输卵管的部位，将针头朝输卵管方向扎入，一人操作，一只手的手指在针头后方捏紧子宫角，另一只手推注射器，冲卵液由宫管结合部流入输卵管，经输卵管流至集卵皿。 输卵管法的优点是卵的回收率高，冲卵液用量少，检卵省时间。缺点是容易造成输卵管，特别是伞部的粘连。 7．2子宫法 供体羊发情后6～7.5d的采卵用这种方法。术者将子宫暴露于创口表面后，用套有胶管的肠钳夹在子宫角分叉处，注射器吸入预热的冲卵液20～30ml(一侧用液50～60m1)，冲卵针头(钝形)从子宫角尖端插入，当确认针头在管腔内，进退通畅时，将硅胶管连接于注射器上，推注冲卵液。当子宫角膨胀时，将回收卵针头从肠钳钳夹基部的上方迅速扎入，冲卵液经硅胶管收集于烧杯内，最后用两手拇指和食指将子宫角捋一遍。另一侧子宫角用同样方法冲洗。进针时避免损伤血管，推注冲卵液时力量和速度应适中。 子宫法对输卵管损伤甚微，尤其不涉及伞部，但卵回收率较输卵管法低，用液较多，捡卵较费时。 7．3冲卵管法 用手术法取出子宫，在子宫体扎孔，将冲卵管插入，使气球在子宫角分叉处，使冲卵管尖端靠近子宫角前端，用注射器注入气体8～10ml，然后进行灌流，分次冲洗子宫角，每次灌注10～20ml，一侧用液约50～60ml，冲完后气球放气，冲卵管插入另一侧，用同样方法冲卵。 7．4术后处理 采卵完毕后，用37℃灭菌生理盐水湿润母羊子宫，冲去凝血块，再涂少许灭菌液体石蜡，将器官复位。腹膜、肌肉缝合后，撒一些碘胺粉等消炎防腐药。皮肤缝合后，在伤口周围涂碘酒，再用酒精作最后消毒。供体羊肌注青霉素(80iu)和链霉素(100万u)。 （三）检卵 1．检卵操作要求 检卵者应熟悉体视镜的结构，做到熟练使用。找卵的顺序由低倍到高倍，一般在10倍左右已能发现卵子。对胚胎鉴定分级时再转向高倍(或加上大物镜)，改变放大率时，需再次调整焦距至看清物象为止。 2．找卵要点 根据卵子的比重、大小、形态和透明带折光性等特点找卵。 2．1卵子的比重比冲卵液大，因此一般位于集卵皿的底部。 2．2绵羊卵子直径为150～200／um，肉眼观察只有针尖大小。 2．3卵子是一球形体，在镜下呈圆形，其外层是透明带，它在冲卵液内的折光性比其他不规则组织碎片折光性强，色调为灰色。 2．4当疑似卵子时晃动表面皿，卵子滚动。用玻璃针拨动，针尖尚未触及卵子即已移动。 2．5镜检找到的卵子数，应和卵巢上排卵点的数量大致相当。 3．检卵前的准备 3．1待检的卵应保存在37℃条件下，尽量减少体外环境、温度、灰尘等因素的不良影响。检卵时将集卵杯倾斜，轻轻倒弃上层液，留杯底约10ml冲卵液，再用少量PBS冲洗集卵杯，倒入表面皿镜检。 3．2在酒精灯上拉制内径为300～400um的玻璃细管和玻璃针。将10%或20%羊血清PBS保存液用0.22um滤器过滤到培养皿内。每个冲卵供体羊需备3～4个培养皿，写好编号，放入培养箱待用。 4．检卵方法及要求 用玻棒清除卵外围的粘液、杂质。将胚胎吸至第一个培养皿内，细管先吸入少许PBS再吸入卵，在培养皿的不同位置冲洗卵3～5次。依次在第二个培养皿内重复冲洗，然后把全部卵移至另一个培养皿。每换一个培养皿时应换新的玻璃细管，一只供体的卵放在一个皿内。操作室温为20～25℃，检卵及胚胎鉴定需2人进行。 （四）胚胎的鉴定和分级 1．胚胎的鉴定 1．1在20～40倍体视显微镜下观察受精卵的形态、色调、分裂球的大小、均匀度、细胞的密度、与透明带的间隙以及变性情况等。 1．2凡卵子的卵黄未形成分裂球及细胞团的，均列为未受精卵。 1．3胚胎的发育阶段 发情(受精)后2～3d用输卵管法回收的卵，发育阶段为2～8细胞期，可清楚地观察到卵裂球，卵黄腔间空隙较大。6～8d回收的正常受精卵发育情况如下。 1．3．1桑椹胚：发情后第5～6d回收的卵，只能观察到球状的细胞团，分不清分裂球，细胞团占据卵黄腔的大部分。 1．3．2致密桑椹胚：发情后第6～7d回收的卵，细胞团变小占卵黄腔60%～70%。 1．3．3早期囊胚：发情后第7～8d回收的卵，细胞团的一部分出现发亮的胚胞腔。细胞团占卵黄腔70%～80%，难以分清内细胞团和滋养层。 1．3．4囊胚：发情后第7～8d回收的卵，内细胞团和滋养层界线清晰，胚胞腔明显，细胞充满卵黄腔。 1．3．5扩大囊胚：发情后第8～9d回收的卵，囊腔明显扩大，体积增大到原来的1.2～1.5倍，与透明带之间无空隙，透明带变薄，相当于正常厚度的1/3。 1．3．6孵育胚：一般在发情后9～11d，由于胚胞腔继续扩张，致使透明带破裂，卵细胞脱出。 1．3．7凡在发情后第6～8d回收的16细胞以下的受精卵均应列为非正常发育卵，不能用于移植或冷冻保存。 2．胚胎的分级 分为A、B、C三个等级。 2．1 A级：胚胎形态完整，轮廓清晰，呈球形，分裂球大小均匀，结构紧凑，色调和透明度适中，无附着的细胞和液泡。 2．2 B级：轮廓清晰，色调及细胞密度良好，可见到少量附着的细胞和液泡，变性细胞约占10%～30%。 2．3 C级：轮廓不清晰，色调发暗，结构较松散，游离的细胞或液泡较多，变性细胞达30%～50%。 2．4 胚胎的等级划分还应考虑到受精卵的发育程度。发情后第7d回收的受精卵在正常发育时应处于致密桑椹胚至囊胚阶段。凡在16细胞以下的受精卵及变性细胞超过一半的胚胎均属等外，其中部分胚胎仍有发育的能力，但受胎率很低。 （五）胚胎的冷冻保存 1．三步平衡法 1．1 10%甘油保存液的配制：取9ml含20%羊血清的PBS，加入1m1甘油，用细管反复混合15～20次，经0.22lum滤器过滤到灭菌容器内待用。 1．2 取含20%羊血清0.3mol／L蔗糖的PBS 2ml和3.5ml，分别加入10%甘油3ml和1.5ml，配成含6%和3%甘油的蔗糖冷冻液。将3%、6%和10%三种甘油浓度的冷冻液分别装入小培养皿。 1．3胚胎分别在3%、6%和10%甘油的冷冻液中浸5min。 1．4 胚胎装管：用0.25ml塑料细管按以下顺序吸入：少量的10%甘油的PBS液、气泡、10%甘油的PBS液(含有胚胎)、气泡、少量的10%甘油的PBS液(如图所示)，加热封口两道。  1．5塑料管的编号：剪一段(2cm)0.5ml塑料细管作为标记外套，内装色纸，注明供体品种、耳号、胚胎发育阶段及等级、制作日期(年、月、日)，并在外套管上写明序号备查。 2．冷冻程序：将细管直接浸入冷冻仪的酒精浴槽内，以1℃/min的速度从室温降至-6℃，停5min后植冰，再停留10min，以0.3℃/min的速度降至-36℃，再以0.1℃/min的速度降至-38℃，直接投入液氮，长期保存。 （六）冷冻胚胎的解冻 1．解冻液的配制：配制出10%、6%和3%甘油的蔗糖解冻液，用0.22um滤器灭菌，分装在小培养皿内，第1～4杯分别为10%、6%、3%、0%甘油的蔗糖解冻液，第5杯为PBS保存液。 2．胚胎的解冻：胚胎从液氮中取出，在3s(秒钟)内投入38℃水浴，浸10s。 3．三步脱甘油：用70%酒精棉球擦拭塑料细管和剪刀刀刃，剪去棉塞端，与带有空气的lml注射器连接。再剪去细管的另一端，在室温下将胚胎推入10%甘油和0.3mol/L蔗糖的PBS解冻液中，放置5min后依次移入6%、3%和0%甘油的蔗糖PBS解冻液中，各停留5min，最后移至PBS保存液中镜检待用。 （七）胚胎分割 1．准备工作 1．1检查和调整好显微操作装置。 1．2微细玻璃针和固定管的制作：玻璃针细度要求为3um，用专用拉针仪制作。固定管要求拉制成内径为100um的细管，切口要齐，并用煅炼仪烧圆。上述针、细管均用70％酒精消毒，使用前用PBS液反复冲洗。 1．3安装好分割胚胎的用具。 1．4将含有20％犊牛血清的PBS液经0.22um滤器过滤，在灭菌的直径为90mm的塑料培养皿内做成液滴，覆盖液体石蜡备用。 2．分割操作 2．1将第6～8d回收的发育良好的胚胎移人已做好的液滴，每个液滴放人1枚胚胎，以免半胚相混。将培养皿移至倒置显微镜或实体解剖镜下，调整焦距，找到胚胎。用固定细管固定胚胎，用玻璃针或刀片从内细胞团正中切开。 2．2使用刀具分割时可不用固定管。先用刀刃在培养皿底部划一刀印，再用刀尖将胚胎拨至刀印上，调整好内细胞团的位置，再用刀片从上往下垂直切成两团。 2．3分割好的胚胎移至含20%羊血清(或犊牛血清)的PBS，清洗后装管移植。 2．4冷冻胚胎解冻后分割操作同上。 （八）胚胎移植 1．受体羊的选择 1．1健康、无传染病、营养良好。 1．2无生殖疾病、发情周期正常的经产羊。 2．供体羊、受体羊的同期发情 2．1自然发情 对受体羊群自然发情进行观察，与供体羊发情前后相差一天以内的羊，可作为受体。 2．2诱导发情 绵羊诱导发情分为孕激素类和前列腺素类控制同期发情两类方法。孕酮海棉栓法是一种常用的方法。海绵栓在灭菌生理盐水中浸湿后塞人阴道深处，第13～14d取出，在取海绵栓的前一天或当天，肌肉注射PMSG(400IU)或戊酸雌二醇或苯甲酸雌二醇(2～4mg)，48h前后受体羊可表现发情。 3．移植 3．1移植液 3．1．1 0.03g牛血清白蛋白溶于10ml PBS。 3．1．2 1ml血清+9ml PBS。 以上两种移植液均含青霉素(100u/m1)、链霉素(100u/m1)。配好后用0.22um滤器过滤，置38℃培养箱待用。 3．2受体羊准备 受体羊术前需空腹12～24h，仰卧或侧卧于手术保定架上，肌注0.3～0.5ml 2％静松灵。手术部位及手术要求与供体羊相同。 3．3简易手术法 对受体羊可用简易手术法移植胚胎。术部消毒后，拉紧皮肤，在后肢内侧鼠鼷部作1.5~2.0cm切口，用1个手指伸进腹腔，摸到子宫角引导至切口外，确认排卵侧黄体发育状况，用钝形针头在黄体侧子宫角扎孔，将移植管顺子宫角方向插入宫腔，推出胚胎，随即子宫复位。皮肤复位后即将腹壁切口覆盖，皮肤切口用碘酒、酒精消毒，一般不需缝合。若切口增大或覆盖不严密，应进行缝合。 受体羊术后在小圈内观察1～2d圈舍应干燥、清洁，防止感染。 3．4移桓胚胎注意要点 3．4．1观察受体卵巢，胚胎移至黄体侧子宫角，无黄体不移植。一般移2枚胚胎。 3．4．2在子宫角扎孔时应避开血管，防止出血。 3．4．3不可用力牵拉卵巢，不能触摸黄体。 3．4．4胚胎发育阶段与移植部位相符。 3．4．5对受体羊黄体发育按突出卵巢的直径分为优、中、差，优—0.6～1.0cm，中—0.5cm差—小于0.5cm。 3．5受体羊饲管 受体羊术后1～2d情期内要注意观察返情情况，若返情则应进行配种或移植。对没有返情的羊应加强饲养管理，妊娠前期应满足母羊对热量的摄取，防止胚胎因营养不良而引起早期死亡。在妊娠后期应保证母羊营养的全面需要，尤其是对蛋白质的需要，以满足胎儿的充分发育。 3．6产羔期护理 受体羊产羔期需精心管理，做好助产、双羔羊哺乳及保姆羊带乳，并要保证母羊哺乳期营养需要。产羔记录应详细、认真。 附件1 牛羊胚胎移植试剂配制 1 冲卵液(PBS)的配制 1.1 改进的PBS配方 NaCl 136.87mM 8.00 g/l KCl 2.68mM 0.20 g/l CaCl 20.90mM 0.10 g/l KH2PO4 1.47mM 0.20 g/l MgCl2.6H2O 0.49mM 0.10 g/l Na2HPO4 8.09mM 1.15 g/l 丙酮酸钠 0.33mM 0.036 g/l 葡萄糖 5.50mM 1.00 g/l 牛血清白蛋白(或犊牛血清) 3.00 g/l 青霉素 100 iu/ml 链霉素 l00 ug/ml 双蒸水 1000 ml 1.2 浓缩PBS液的配制：为了便于保存，可用双蒸水配制成浓缩10倍的原液。 A液 100ml 500ml 1000ml NaCl 8.0g 40.0g 80.0g KCl 0.2g 1.0g 2.0g CaCl2 100mg 500mg 1.0g MgCl.6H20 100mg 500mg 1.0g B液 Na2HPO4.7H20 2.16g 10.8g 21.6g (或无水Na2HPO4) 1.144g 5.72g 11.44g KH2P04 200mg 1.0g 2.0g 配好的A、B原液和双蒸水分别高压灭菌，低温保存待用。 1.3 冲卵液的配制：使用前A、B原液各取100ml，缓慢加入灭菌双蒸水800ml充分混合。取其中100ml，加入丙酮酸钠36mg、葡萄糖1.0g、牛血清白蛋白3.0g(或牛血清10m1)和抗生素，充分混合后用0.22um滤器过滤灭菌，与大瓶混合液混合待用。配成的冲卵液pH值为7.2～7.3，渗透压为290～300毫渗。 2 牛血清的制作 2.1 从卵巢反应好的供体牛于冲卵后采血。 2.2 血清制作程序：用灭菌过的针头、离心管从颈静脉采血，30min内，以3500r／min离心10min，取血清。再用同一转速将分离出的血清再离心l0min，弃去沉淀。 2.3 血清的灭活：将上述血清集中在瓶内，用56℃水浴(血清温度达56℃)灭活30min，或者在52℃温水中灭活40min。灭活处理后，用3500r／min离心10min，再用0.45um滤器过滤灭菌，然后小剂量分装入小瓶，于-20℃保存待用。 2.4 血清使用前要做胚胎培养试验，只有经培养后确认胚胎发育好的血清才能使用。 附件3 牛胚胎移植实验用品的准备 1 器具和洗刷 1.1器具使用后应立即浸于水中，流水冲洗。粘有污垢或斑点应立刻洗刷掉，然后再用洗涤液清洗。 1.2 新器具先用清水洗净后浸入洗液中，再用洗涤液认真刷洗，或用超声波洗涤器洗涤。洗涤剂可用市售品。 1.3 水洗：从洗涤液中取出后立刻放入流水中，冲洗3h完全冲掉洗涤液。 1.4 洗净：用去离子水冲洗5次，再用蒸馏水洗5次，最后用双蒸水冲洗2次。 1.5 干燥和包装：洗净后的器具放入干燥箱烘干，再用白纸包装待消毒。 2器具的灭菌 2.1 高压灭菌：适用于玻璃器具、金属制品、耐压耐热的塑料制品以及可用高压蒸汽灭菌的培养液、无机盐溶液、液体石蜡油等。上述器具经包装放入地高压灭菌器内，在121℃(1kg／cm2)一般处理20～30min，PBS等培养液为15min。 2.2 气体灭菌法：对于不能用高压蒸汽灭菌处理的塑料器具可用氧化乙烯等气体灭菌。灭菌方法与要求可根据不同设备说明进行操作。气体灭菌过的器具需放置一定间隔时间才能使用。 2.3 干热灭菌法：对耐高温的玻璃及金属器具，包装好以后放入干热灭菌器，160℃处理1～5h，或者使温度升至180℃以后，关闭开关，待恢复常温时取出。 2.4 紫外线灭菌：塑料制品可放置在无菌间距紫外线灯50～80cm处，容器内侧向上，塑料细管需垂直置于紫外线灯下照射30min以上。 2.5 钴60Co同位素照射灭菌：将需要灭菌的器具包装好，送有辐照中心处理。 2.6 用70%酒精浸泡消毒：聚乙烯冲卵管以及乳胶管等，可在70%酒精液中浸泡消毒。 3 培养液的灭菌 3.1 过滤灭菌法：装有滤膜的滤器经高压灭菌后使用。培养液用0.22um滤膜，血清用0.45um滤膜过滤。过滤时应弃去开始的2～3滴。 3.2 用抗生素灭菌：在配制培养液时，同时加入青霉素C钾100单位/ml，链霉素100mg/ml。 4 液体石蜡油的处理 4.1 市售液体石蜡装入分液漏斗，用双蒸水充分摇动洗涤3～5次，静止或离心分离水分。 4.2 液体石蜡装入三角烧瓶内(装入量为容量的70%～75%)，用硅塞封口，塞上通入长和短的两根玻璃管，管上端塞好棉花，一根深入油面底层，一根不接触油面。高压灭菌15min呈白色浊色，冷却后静置12h，即为透明。 4.3 将所用的培养液用滤器灭菌，按石蜡油量的1/20加入并充分混合。 4.4 由长玻璃管通入5%CO2、95%空气组成的混合气30min。 4.5 经上述处理后的石蜡油在使用前原封不动地放在二氧化碳培养箱内静置一昼夜，使液相和油相完全分离，待用。 附件2 牛胚胎移植主要器械与设备 1 回收卵器械 1.1 两通和三通冲卵管及钢芯 1.2 子宫颈扩张棒 1.3 Y字型硅胶管 1.4 1000ml吊瓶，1000ml量筒。 1.5 30ml、50ml注射器 1.6 过滤式集卵杯(日本产)或过滤杯(美国式)滤网 2 检卵与分割设备 2.1 实体解剖镜 2.2 培养皿(35mm~15mm)，(90mm×l5mm) 2.3 乳胶吸管 2.4 巴氏玻璃管 2.5 培养箱，配有CO2的培养罐 2.6 显微操作仪一台(加附件) 3 移植器械 3.1 移植枪一套，加外套 3.2 塑料细管专用剪 4 其他 4.1 蒸馏水装制一套及离子交换器一台 4.2 干热灭菌器一台 4.3 高压消毒锅一台 4.4 过滤灭菌膜若干，滤膜为0.22um和0.45um。 4.5 0.25ml和0.5ml塑料细管 4.6 托盘式扭力天平(分度值0.01g)，分析天平(分度值ug) 5 药品 5.1 配制PBS液所含中药品 5.2 FSH和LH，PMSG及抗PMSG等超数排卵药 5.3 PGF2α 5.4 2%静松灵或2%普鲁卡因 5.5 抗生素及其他消毒液 附件3  附牛4  附件5 附件6 羊胚胎移植主要器械与设备 1 回收卵器械 1.1 冲卵管一带硅胶管的7号针头(钝形)，回收管——带硅胶管的16号针头(钝形)，肠钳套乳胶管。 1.2 注射器20ml或30ml 1.3 集卵杯一50ml或lOOml烧杯 2 检卵与分割设备 2.1 体视显微镜 2.2 培养皿(35mmxl5mm)，(90mmxl5mm)，表面皿 2.3 巴氏玻璃管 2.4 培养箱，C02培养罐及C02气体 2.5 显微操作仪及附件 3 移植 3.1 微量注射器、12号针头 3.2 移植管一内径200～300tan玻璃吸管或前端细后部膨大的(套在注射器上)塑料吸管。 4 手术器械 4.1 毛剪，外科剪(圆头、尖头) 4.2 活动刀柄、刀片、外科刀 4.3 止血钳(弯头、直头)、蚊式止血钳、创巾夹、持针器、手术镊(带齿、不带齿) 4.4 缝合针(圆刃针、三棱针)、缝合线(丝线、肠线)、创巾若干 4.5 手术保定架、手术灯、活动手术器械车 5 其他 5.1 蒸馏水装置一套，离子交换器一台 5.2 干烤箱一台 5.3 高压消毒锅一台 5.4 滤器若干，0.22um、0.45um滤膜，0.25ml塑料吸1 5.5 pH计一台 6 药品及试剂 6.1 配制PBS所需试剂 6.2 FSH和LH，PMSG及抗PMSG等超排激素 6.3 2%静松灵，0.5%普鲁卡因、利多卡因。 6.4 肾上腺素及止血药品 6.5 抗生素及其他消毒液、纱布、药棉等