第三章 酶的分离提纯
? 酶的分离纯化是酶工程的主要内容，
也是酶学研究过程中必不可少的环节。
? 酶的分离纯化是指将酶从细胞或其他
含酶原料中提取出来，再与杂质分开，
以获得符合研究或使用要求的酶的过
程。其主要内容包括细胞破碎、酶的
提取、离心分离、过滤与膜分离、沉
淀分离、层析分离、电泳分离、萃取
分离、结晶等。
第一节 细胞破碎
? 酶的种类繁多，已知的约 4000种，它
们存在于不同生物体的不同部位。
? 除了动物和植物体液中的酶和微生物
胞外酶之外，大多数酶都存在于细胞
之中。为了获得细胞内的酶，就得收
集细胞并进行细胞或组织破碎。
? 对于不同的生物体，或同一生物体的
不同组织的细胞，由于结构不同，所
采用的细胞破碎方法和条件亦有所不
同，必须根据具体情况进行适当的选
择，以达到预期的效果。
? 细胞破碎的方法很多，可以分为机械
破碎法、微量破碎法、化学破碎法和
酶促破碎法等。
? 1.机械破碎法通过机械运动所产生的剪
切力的作用使细胞破碎的方法，称为
机械破碎法。常用的破碎机械有组织
捣碎机、细胞研磨器、匀浆器等。
? 2.物理破碎法通过温度、压力、声波等
各种物理因素的作用使组织细胞破碎
的方法，称为物理破碎法。物理破碎
法多用于微生物细胞的破碎。
? 常用的物理破碎法方法有：
（ 1）温度差破碎法：利用温度的突然变化，细胞
由于热胀冷缩的作用而破碎。
（ 2）压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细
胞破碎。常用的有高压冲击、突然降压及渗透压
变化等方法。
（ 3）超声波破碎法：利用超声波发生器所发出的
10~20kHz的声波或超声波的作用，使细胞膜产
生空穴作用（ cavitation）而使细胞破碎。
? 3.化学破碎法通过各种化学试剂对细胞膜的
作用使细胞破碎的方法，称为化学破碎法。
– 常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有
机溶剂和特里顿（ Triton）、吐温（ Tween）等
表面活性剂。
4.酶促破碎法通过细胞本身的酶系或外加酶制
剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，
而达到细胞破碎的目的。
– 利用细胞本身的酶系的作用，在一定的 pH 值和
温度条件下保温一段时间，使细胞破坏，而使细
胞内物质释出的方法，称为自溶法。自溶法效果
的好坏取决于温度,pH 值、离子强度等自溶条
件的选择与控制。
– 根据细胞外层结构的特点，还可以外加适当的酶
作用于细胞，使细胞壁受到破坏，并在低渗透压
的溶液中使细胞破裂。例如，革兰氏阳性菌主要
依靠肽多糖维持细胞壁的结构和形状，外加溶菌
酶，作用于肽多糖的 β-1,4-糖苷键，而使其细
胞壁破坏；酵母细胞的破碎是外加 !-葡聚糖酶，
使其细胞壁的 β -1,3-葡聚糖水解；霉菌可用几
丁质酶机械细胞破碎；纤维素酶、半纤维素酶和
果胶酶的混合使用，对植物细胞壁有良好的破碎
效果。
第二节 酶的提取
? 酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶
剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的
过程，也称作酶的抽提。
? 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，
选择适当的溶剂。酶都能溶解于水，可用水
或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取。有些
酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则
可用有机溶剂提取。为了提高酶的提取率并
防止酶的变性失活，在提取过程中要注意控
制好温度,pH 值等提取条件。
? 根据酶提取时所采用的溶剂或溶液的不同，
酶的提取方法主要有盐溶液提取、酸溶液提
取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。
1.盐溶液提取
– 大多数蛋白类酶（ P-酶）都溶于水，而且
在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度
增加，这称为盐溶现象，所以一般采用稀
盐溶液进行酶的提取。例如，固体发酵生
产的麸曲中的淀粉酶、蛋白酶等胞外酶，
用 0.14mol/L 的氯化钠溶液或
0.02~0.05mol/L 的磷酸缓冲液提取；枯草
杆菌碱性磷酸酶用 0.1mol/L 氯化镁溶液
提取等。有少数酶，如霉菌脂肪酶，用清
水提取的效果较好。
– 核酸类酶（ R-酶）的提取，一般是在细胞
破碎后，用 0.14mol/L 的氯化钠溶液提取，
得到核糖核蛋白提取液，再进一步与蛋白
质等杂质分离，而得到酶 RNA。
2.酸溶液提取
– 有些酶在酸性条件下溶解度较大，且稳定
性较好，宜用酸溶液提取。例如，胰蛋白
酶可用 0.12mol/L 的硫酸溶液提取。
3.碱溶液提取
– 有些在碱性条件下溶解度较大且稳定性较
好的酶，应采用碱溶液提取。例如，细菌
L-天冬酰胺酶可用 pH11~12的碱溶液碱
性提取。
4.有机溶剂提取
– 有些与脂质结合牢固或含有较多非极性基
团的 P-酶，可以采用与水可混溶的丁醇
等有机溶剂提取。
– 例如，琥珀酸脱氢酶、胆碱酯酶等的提取。
– 在 R-酶的提取中，经常采用苯酚水溶液。
一般是在细胞破碎、制成匀浆后，加入等
体积的 90% 苯酚水溶液，振荡一段时间，
结果 DNA 和蛋白质沉淀于苯酚层，而
RNA 溶解于水中。
? 在酶提取过程中，为了防止酶变性失
活，温度不宜高，尤其是采用有机溶
剂提取时，温度应该控制在 0~10℃ 。
有些酶对温度的耐受性较高，可在室
温或更高一些的温度条件下提取。为
了提高酶的溶解度，提取时 pH 值应该
避开酶的等电点。此外，还可加入某
些保护剂，以提高酶的稳定性。
第三节 离心分离
? 离心分离是借助于离心机旋转所产生
的离心力，使不同大小、不同密度的
物质分离的技术过程。
? 离心机多种多样，按照离心机的最大
转速的不同可以分为常速（低速）、
高速和超速等 3种。
– 常速离心机的最大转速在 8000r/min以内，相对
离心力（ RCF）在 1× 104g 以内，在酶的分离
纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基
残渣等固形物的分离。
– 高速离心机的最大转速为 1× 104~ 2.5× 104r/min，
相对离心力达到 1× 104g ~ 1× 105g，在酶的分
离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。
超速离心机的最大转速达 2.5× 104 ~ 8×
104r/min，相对离心力可以高达 5× 105g。
– 超速离心可以采用差速离心、密度梯度离心或等
密梯度离心等方法。超速离心可用于酶分子的分
离纯化。在离心过程中，应该根据需要，选择好
离心力（或离心速度）和离心时间，并且控制好
温度和 pH 值等条件。
第四节 过滤与膜分离
（一）过滤
– 过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同
形状的物质分离的技术。
– 过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、
纤维、多孔陶瓷和各种高分子膜等，其中
以各种高分子膜为过滤介质的过滤技术称
为膜分离技术。微滤、超滤、反渗透、透
析及电渗析等都属于膜过滤技术。
– 根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同，
过滤可以分为粗滤、微滤、超滤和反渗透
等 4大类。
（二）膜分离技术
– 借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大
小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分
子进行分离的技术称为膜分离技术。
– 膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋
酸纤维素、赛璐珞以及尼龙等高分子聚合
物制成的高分子膜。有时也可以采用动物
膜或羊皮纸等。在膜分离过程中，薄膜的
作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒
或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。
膜的孔径有多种规格可供使用时选择。
– 根据物质颗粒或分子通过薄膜的原理和推
动力的不同，膜分离技术可以分为 3大类。
2.电场膜分离
– 电场膜分离是在半透膜的两侧分别装上正、负电
极。在电场作用下，小分子的带电物质或离子向
着与其本身所带电荷相反的电极移动，透过半透
膜而达到分离的目的。电渗析和离子交换膜电渗
析即属于此类。
– （ 1）电渗析。用两块半透膜将透析槽分隔成 3 个室，
在中心室通入待分离的混合溶液，在两侧室中装入水或
缓冲液并分别装上正、负电极。接通直流电源后，中心
室溶液中的阳离子向负极移动，透过半透膜到达阴极槽，
而阴离子则向正极移动，透过半透膜移向阳极槽，从而
达到分离。实际应用时，可由上述相同的多个透析槽联
在一起组成一个透析系统。
– （ 2）离子交换膜电渗析。离子交换膜电渗析的装置与一
般电渗析相同。只是以离子交换膜代替一般的半透膜。
离子交换膜的选择透过性比一般半透膜强。一方面它具
有一般半透膜截留大于孔径颗粒的作用；另一方面，由
于离子交换膜上带有某种基团，根据同性电荷相斥、异
性电荷相吸的原理，只让带异性电荷的颗粒透过，而把
带同性电荷的物质截留。
3.扩散膜分离扩散膜分离是利用小分子
物质的扩散作用，不断透过半透膜扩
散到膜外，而大分子被截留。常见的
透析就是属于扩散膜分离。
– 透析时，一般将半透膜制成透析袋，将欲
分离的混合液装在袋内，袋外是水或缓冲
液。在一定的温度下，透析一段时间，使
小分子物质从袋内透出到膜外。必要时，
袋外的水或缓冲液可以多次或连续更换。
第五节 沉淀分离
? 沉淀分离是通过改变某些条件，使溶
液中某种溶质的溶解度降低，从溶液
中沉淀析出，而与其他溶质分离的方
法。
? 沉淀分离是酶的分离纯化过程中经常
采用的方法。
? 沉淀分离的方法有多种，诸如盐析沉
淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀
法、复合沉淀法、选择性变性沉淀法
等。
1.盐析沉淀法盐析沉淀法简称盐析法，是在
酶的分离纯化中应用最早且至今仍在广泛
使用的方法，主要用于蛋白类酶的分离纯
化。
– 蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度
的影响。一般在低盐浓度的情况下，蛋白
质的溶解度随盐浓度的升高而增加，而在
盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质的溶解
度又随盐浓度的升高而降低，结果使蛋白
质沉淀析出。在某一浓度的盐溶液中，不
同蛋白质的溶解度各不相同，由此可达到
彼此分离的目的。
– 经过盐析得到的酶沉淀，含有大量盐分，
一般可以采用透析、超滤或层析等方法进
行脱盐。
2.等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时
溶解度最低，以及不同的两性电解质有不
同的等电点这一特性，对蛋白质,RNA、
氨基酸等两性电解质进行分离纯化的方法
称为等电点沉淀法。
3.有机溶剂沉淀法利用酶与其他杂质在有机
溶剂中的溶解度不同，而使酶与杂质分离
的方法称为有机溶剂沉淀法。
4.复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它
与酶形成复合物而沉淀下来，分离出沉淀
后，再用适当的方法，使酶从复合物中析
出，这种分离纯化方法称为复合沉淀法。
– 常用的复合沉淀剂有单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸等
高分子聚合物。
5.选择性变性沉淀法选择一定的条件使
酶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性
沉淀，而不影响所需的酶，这种分离
方法称为选择性变性沉淀法。
– 例如，对于热稳定性好的酶，可以通过加
热进行热处理，使大多数杂蛋白受热变性
沉淀而被除去。
– 此外，还可以根据酶的特性，通过改变
pH 值或加进某些金属离子等使杂蛋白变
性沉淀而除去。
第六节 层析分离
? 层析分离是利用混合液中各组分的物理化学
性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附
力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使
各组分以不同程度分布在两相中，其中一个
相是固定的称为固定相；另一个相是流动的，
称为流动相。当流动相流经固定相时，各组
分以不同的速度移动，从而使不同的组分分
离纯化。
? 酶可以采用不同的层析方法进行分离纯化，
常用的有吸附层析、分配层析、离子交换层
析、凝胶层析和亲和层析等。
1.吸附层析
? 吸附层析是利用吸附剂对不同物质的
吸附力不同而使混合物中各组分分离
的方法。吸附层析是各种层析技术中
应用最早且至今仍广泛使用的技术。
– 任何两个相之间都可以形成一个界面，其
中一个相的物质或溶质在两相界面上的密
集现象称为吸附。凡是能够将其他物质聚
集到自己表面上的物质称为吸附剂，能聚
集于吸附剂表面的物质称为被吸附物。
– 吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装
在吸附柱中进行柱层析。层析时，欲分离
样品液自柱顶加入，上柱完毕后，再加入
洗脱剂解吸洗脱。
2.分配层析
– 分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同
而分离的方法。
– 常见的纸上层析和一些薄层层析属于分配层析。
在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物
（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂
（称为固定相），另一种与固定相溶剂互不相溶
的溶剂可沿着固定相流动（称为流动相），当某
溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质在两
相之间进行连续的动态分配。由于不同的溶质有
不同的分配系数，移动速度不同，从而达到分离。
– 分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中
溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度比
值。在层析条件确定后，溶质的分配系数是一常
数。
3.离子交换层析
– 离子交换层析是利用离子交换剂上的可解
离基团对各种离子的亲和力不同而达到分
离目的的一种层析分离方法。
– 离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性
高分子物质。通过在不溶性高分子物质
（母体）上引入若干可解离基团（活性基
团）而制成。
– 离子交换剂进行酶的层析分离过程包括装
柱、上柱、洗脱、收集和交换剂再生等步
骤。
4.凝胶层析
– 凝胶层析又称凝胶过滤、分子筛层析或分
子排阻层析，是以各种多孔凝胶为固定相，
利用溶液中各组分的相对分子质量不同而
进行分离的层析技术。
– 凝胶的种类很多，常用于凝胶层析的有葡
聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶
等。各种凝胶均有系列产品，不同的型号
表明凝胶的孔径不同，可根据需要选择使
用。
5.亲和层析
– 亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专
一而又可逆的亲和力，使酶等生物分子分离纯化
的技术。酶与底物，酶与竞争性抑制剂，酶与辅
助因子，抗原与抗体，酶 RNA 与互补的 RNA
分子或片段,RNA 与互补的 DNA 分子或片段等
之间都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。
故此，亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用。
– 在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基
（ ligand）。配基必须偶联于不溶性母体
（ matrix）上。母体又称为载体或担体。在亲和
层析中，一般采用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚
丙烯酰胺凝胶或纤维素等作为母体。
– 当小分子物质（金属离子等无机辅助因子、有机
辅助因子等）作为配基时，由于空间位阻作用，
难以与配对的大分子亲和吻合，需要在母体与配
基之间引入适当长度的连接臂（ spacearm）。
第七节 电泳分离
? 带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相
反的电极移动的过程称为电泳。
? 不同的物质由于其带电性质及其颗粒大小和
形状不同，在一定的电场中它们的移动方向
和移动速度也不同，故此可使它们分离。物
质颗粒在电场中的移动方向，决定于它们所
带电荷的种类。带正电荷的颗粒向电场的阴
极移动；带负电荷的颗粒则向阳极移动。净
电荷为零的颗粒在电场中不移动。
? 颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身
所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大
小的影响。此外，还受到电场强度、溶液
pH 值、离子强度及支持体的特性等外界条
件的影响。
– （ 1）电场强度。电场强度是指每厘米距
离的电压降，又称为电位梯度或电势梯度。
电场强度对颗粒的泳动速度起着十分重要
的作用。电场强度越高，带电颗粒的泳动
速度越快。根据电场强度的大小可将电泳
分为高压电泳和常压电泳。
– （ 2）溶液的 pH 值。溶液的 pH 值决定了
溶液中颗粒分子的解离程度，也就是决定
了颗粒分子所带净电荷的多少。溶液的
pH 值离开其等电点越远，颗粒所带净电
荷越多，泳动速度越快；反之，颗粒的泳
动速度则越慢。
– （ 3）溶液的离子强度。溶液的离子强度
越高，颗粒的泳动速度越慢。
– （ 4）电渗。在电场中，溶液对于固体支
持物的相对移动称为电渗。例如，在纸电
泳中，由于滤纸纤维素上带有一定量的负
电荷，使与滤纸相接触的水分子感应而带
有一些正电荷，水分子便会向负极移动并
带动溶液中的颗粒一起向负极移动。若颗
粒本身向负极移动，则其表观泳动速度将
比其本来的泳动速度快；若颗粒本身向正
极移动，则其表观泳动速度慢于其本来的
泳动速度。净电荷为零的颗粒，也会随水
向负极移动。
– 此外，缓冲液的粘度和温度等也对颗粒的
泳动速度有一定的影响。
? 在酶学研究中，电泳技术主要用于酶
的纯度鉴定、酶相对分子质量测定、
酶等电点测定以及少量酶的分离纯化。
其方法多种多样。按其使用的支持体
不同，可分为纸电泳、薄层电泳、薄
膜电泳、凝胶电泳和等电点聚焦电泳
等。
– 1.纸电泳纸电泳是以滤纸为支持体的电泳
技术。
– 2.薄层电泳薄层电泳是将支持体与缓冲液
调制成适当厚度的薄层而进行电泳的技术。
– 3.薄膜电泳薄膜电泳是以醋酸纤维等高分子物质
制成的薄膜为支持体的电泳技术。
– 4.凝胶电泳凝胶电泳是以各种具有网状结构的多
孔凝胶作为支持体的电泳技术。
? 凝胶电泳的支持体主要有聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝
胶等。常用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE）。
? 聚丙烯酰胺凝胶电泳按其凝胶形状和电泳装置的不同，
可以分为垂直管型盘状凝胶电泳和垂直板型片状凝胶
电泳。两者的操作原理和方式基本相同，不同的是前
者在玻璃管内制成圆柱状的凝胶，后者则在两块玻璃
板之间制成平板状凝胶。
? 聚丙烯酰胺凝胶电泳按其凝胶组成系统的不同，可以
分为连续凝胶电泳、不连续凝胶电泳、浓度梯度凝胶
电泳和 SDS凝胶电泳等 4种。
5.等电点聚焦电泳
– 等电点聚焦电泳又称为等电点聚焦或电聚
焦，是 20 世纪 60 年代后期发展起来的
电泳技术，在酶的等电点测定和酶的分离
中广泛使用。
– 在电泳系统中，加进两性电解质载体。当
接通直流电时，两性电解质载体即形成一
个由阳极到阴极连续增高的 pH 梯度。当
酶或其他两性电解质进入这个体系时，不
同的两性电解质即移动到（聚焦于）与其
等电点相当的 pH 值位置上，从而使不同
等电点的物质得以分离。这种电泳技术称
为等电点聚焦电泳。
第八节 萃取分离
? 萃取分离是利用物质在两相中的溶解
度不同而使其分离的技术。
? 萃取分离中的两相一般为互不相溶的
两个液相，有时也可采用其他流体。
? 按照两相的组成不同，萃取可以分为
有机溶剂萃取、液膜萃取、双水相萃
取和超临界萃取等。
第九节 酶的结晶
? 结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。
结晶时，溶质分子按照一定的规律排列在一
起，形成特定形状的晶体颗粒。
? 酶的结晶是酶分离纯化的一种手段，也是酶
的一种制品形式。在酶学研究中，酶结晶为
酶的结构、功能、催化机制等方面的研究提
供了适宜的样品，同时为较高纯度的酶的获
得和应用创造了条件。
? 酶结晶的方法多种多样，主要有盐析结晶、
有机溶剂结晶、透析平衡结晶、等电点结晶
等。
1.盐析结晶
– 在适宜的温度和 pH 值等条件下，慢慢增
加酶液中盐的浓度，使酶的溶解度慢慢降
低，而使酶析出结晶，此种方法称为盐析
结晶。
? 盐析结晶采用的中性盐一般是硫酸铵，也可
采用硫酸钠等其他中性盐。
2.有机溶剂结晶
– 在适宜的温度和 pH 值等条件下，慢慢加
入一定量的有机溶剂到酶液中，使酶的溶
解度慢慢降低，达到稍为过饱和状态而析
出结晶，此种方法称为有机溶剂结晶。
? 常用于酶结晶的有机溶剂主要有乙醇、丙酮、
丁醇、甲醇、异丙醇甲基戊二醇、二甲亚砜
等。
3.透析平衡结晶
– 将经过纯化的浓缩酶液装进透析袋，对一
定浓度的盐溶液或一定 pH 值的缓冲液或
有机溶剂进行透析，经过一段时间，酶液
中酶的浓度渐渐达到过饱和状态而析出结
晶，此种方法称为透析平衡结晶。透析平
衡结晶是常用的结晶方法之一，可用于大
量样品的结晶，也可用于微量样品的结晶。
4.等电点结晶
– 通过慢慢改变浓缩酶液的 pH 值，使之逐
步达到酶的等电点，使酶的溶解度降低，
达到过饱和状态而析出结晶，此种方法称
为等电点结晶。
第十节 浓缩与干燥
? 浓缩是从低浓度酶溶液中除去部分的
水或其他溶剂而成为高浓度溶液的过
程。
? 干燥是将固体、半固体或浓缩液中的
水分（或其他溶剂）除去一部分，以
获得含水较少的固体的过程。
– 干燥的方法很多。常用的有：真空干燥、
冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥和吸附干
燥等。
本章结束
祝您学习愉快！
? 酶的分离纯化是酶工程的主要内容，
也是酶学研究过程中必不可少的环节。
? 酶的分离纯化是指将酶从细胞或其他
含酶原料中提取出来，再与杂质分开，
以获得符合研究或使用要求的酶的过
程。其主要内容包括细胞破碎、酶的
提取、离心分离、过滤与膜分离、沉
淀分离、层析分离、电泳分离、萃取
分离、结晶等。
第一节 细胞破碎
? 酶的种类繁多，已知的约 4000种，它
们存在于不同生物体的不同部位。
? 除了动物和植物体液中的酶和微生物
胞外酶之外，大多数酶都存在于细胞
之中。为了获得细胞内的酶，就得收
集细胞并进行细胞或组织破碎。
? 对于不同的生物体，或同一生物体的
不同组织的细胞，由于结构不同，所
采用的细胞破碎方法和条件亦有所不
同，必须根据具体情况进行适当的选
择，以达到预期的效果。
? 细胞破碎的方法很多，可以分为机械
破碎法、微量破碎法、化学破碎法和
酶促破碎法等。
? 1.机械破碎法通过机械运动所产生的剪
切力的作用使细胞破碎的方法，称为
机械破碎法。常用的破碎机械有组织
捣碎机、细胞研磨器、匀浆器等。
? 2.物理破碎法通过温度、压力、声波等
各种物理因素的作用使组织细胞破碎
的方法，称为物理破碎法。物理破碎
法多用于微生物细胞的破碎。
? 常用的物理破碎法方法有：
（ 1）温度差破碎法：利用温度的突然变化，细胞
由于热胀冷缩的作用而破碎。
（ 2）压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细
胞破碎。常用的有高压冲击、突然降压及渗透压
变化等方法。
（ 3）超声波破碎法：利用超声波发生器所发出的
10~20kHz的声波或超声波的作用，使细胞膜产
生空穴作用（ cavitation）而使细胞破碎。
? 3.化学破碎法通过各种化学试剂对细胞膜的
作用使细胞破碎的方法，称为化学破碎法。
– 常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有
机溶剂和特里顿（ Triton）、吐温（ Tween）等
表面活性剂。
4.酶促破碎法通过细胞本身的酶系或外加酶制
剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，
而达到细胞破碎的目的。
– 利用细胞本身的酶系的作用，在一定的 pH 值和
温度条件下保温一段时间，使细胞破坏，而使细
胞内物质释出的方法，称为自溶法。自溶法效果
的好坏取决于温度,pH 值、离子强度等自溶条
件的选择与控制。
– 根据细胞外层结构的特点，还可以外加适当的酶
作用于细胞，使细胞壁受到破坏，并在低渗透压
的溶液中使细胞破裂。例如，革兰氏阳性菌主要
依靠肽多糖维持细胞壁的结构和形状，外加溶菌
酶，作用于肽多糖的 β-1,4-糖苷键，而使其细
胞壁破坏；酵母细胞的破碎是外加 !-葡聚糖酶，
使其细胞壁的 β -1,3-葡聚糖水解；霉菌可用几
丁质酶机械细胞破碎；纤维素酶、半纤维素酶和
果胶酶的混合使用，对植物细胞壁有良好的破碎
效果。
第二节 酶的提取
? 酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶
剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的
过程，也称作酶的抽提。
? 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，
选择适当的溶剂。酶都能溶解于水，可用水
或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取。有些
酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则
可用有机溶剂提取。为了提高酶的提取率并
防止酶的变性失活，在提取过程中要注意控
制好温度,pH 值等提取条件。
? 根据酶提取时所采用的溶剂或溶液的不同，
酶的提取方法主要有盐溶液提取、酸溶液提
取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。
1.盐溶液提取
– 大多数蛋白类酶（ P-酶）都溶于水，而且
在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度
增加，这称为盐溶现象，所以一般采用稀
盐溶液进行酶的提取。例如，固体发酵生
产的麸曲中的淀粉酶、蛋白酶等胞外酶，
用 0.14mol/L 的氯化钠溶液或
0.02~0.05mol/L 的磷酸缓冲液提取；枯草
杆菌碱性磷酸酶用 0.1mol/L 氯化镁溶液
提取等。有少数酶，如霉菌脂肪酶，用清
水提取的效果较好。
– 核酸类酶（ R-酶）的提取，一般是在细胞
破碎后，用 0.14mol/L 的氯化钠溶液提取，
得到核糖核蛋白提取液，再进一步与蛋白
质等杂质分离，而得到酶 RNA。
2.酸溶液提取
– 有些酶在酸性条件下溶解度较大，且稳定
性较好，宜用酸溶液提取。例如，胰蛋白
酶可用 0.12mol/L 的硫酸溶液提取。
3.碱溶液提取
– 有些在碱性条件下溶解度较大且稳定性较
好的酶，应采用碱溶液提取。例如，细菌
L-天冬酰胺酶可用 pH11~12的碱溶液碱
性提取。
4.有机溶剂提取
– 有些与脂质结合牢固或含有较多非极性基
团的 P-酶，可以采用与水可混溶的丁醇
等有机溶剂提取。
– 例如，琥珀酸脱氢酶、胆碱酯酶等的提取。
– 在 R-酶的提取中，经常采用苯酚水溶液。
一般是在细胞破碎、制成匀浆后，加入等
体积的 90% 苯酚水溶液，振荡一段时间，
结果 DNA 和蛋白质沉淀于苯酚层，而
RNA 溶解于水中。
? 在酶提取过程中，为了防止酶变性失
活，温度不宜高，尤其是采用有机溶
剂提取时，温度应该控制在 0~10℃ 。
有些酶对温度的耐受性较高，可在室
温或更高一些的温度条件下提取。为
了提高酶的溶解度，提取时 pH 值应该
避开酶的等电点。此外，还可加入某
些保护剂，以提高酶的稳定性。
第三节 离心分离
? 离心分离是借助于离心机旋转所产生
的离心力，使不同大小、不同密度的
物质分离的技术过程。
? 离心机多种多样，按照离心机的最大
转速的不同可以分为常速（低速）、
高速和超速等 3种。
– 常速离心机的最大转速在 8000r/min以内，相对
离心力（ RCF）在 1× 104g 以内，在酶的分离
纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基
残渣等固形物的分离。
– 高速离心机的最大转速为 1× 104~ 2.5× 104r/min，
相对离心力达到 1× 104g ~ 1× 105g，在酶的分
离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。
超速离心机的最大转速达 2.5× 104 ~ 8×
104r/min，相对离心力可以高达 5× 105g。
– 超速离心可以采用差速离心、密度梯度离心或等
密梯度离心等方法。超速离心可用于酶分子的分
离纯化。在离心过程中，应该根据需要，选择好
离心力（或离心速度）和离心时间，并且控制好
温度和 pH 值等条件。
第四节 过滤与膜分离
（一）过滤
– 过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同
形状的物质分离的技术。
– 过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、
纤维、多孔陶瓷和各种高分子膜等，其中
以各种高分子膜为过滤介质的过滤技术称
为膜分离技术。微滤、超滤、反渗透、透
析及电渗析等都属于膜过滤技术。
– 根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同，
过滤可以分为粗滤、微滤、超滤和反渗透
等 4大类。
（二）膜分离技术
– 借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大
小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分
子进行分离的技术称为膜分离技术。
– 膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋
酸纤维素、赛璐珞以及尼龙等高分子聚合
物制成的高分子膜。有时也可以采用动物
膜或羊皮纸等。在膜分离过程中，薄膜的
作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒
或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。
膜的孔径有多种规格可供使用时选择。
– 根据物质颗粒或分子通过薄膜的原理和推
动力的不同，膜分离技术可以分为 3大类。
2.电场膜分离
– 电场膜分离是在半透膜的两侧分别装上正、负电
极。在电场作用下，小分子的带电物质或离子向
着与其本身所带电荷相反的电极移动，透过半透
膜而达到分离的目的。电渗析和离子交换膜电渗
析即属于此类。
– （ 1）电渗析。用两块半透膜将透析槽分隔成 3 个室，
在中心室通入待分离的混合溶液，在两侧室中装入水或
缓冲液并分别装上正、负电极。接通直流电源后，中心
室溶液中的阳离子向负极移动，透过半透膜到达阴极槽，
而阴离子则向正极移动，透过半透膜移向阳极槽，从而
达到分离。实际应用时，可由上述相同的多个透析槽联
在一起组成一个透析系统。
– （ 2）离子交换膜电渗析。离子交换膜电渗析的装置与一
般电渗析相同。只是以离子交换膜代替一般的半透膜。
离子交换膜的选择透过性比一般半透膜强。一方面它具
有一般半透膜截留大于孔径颗粒的作用；另一方面，由
于离子交换膜上带有某种基团，根据同性电荷相斥、异
性电荷相吸的原理，只让带异性电荷的颗粒透过，而把
带同性电荷的物质截留。
3.扩散膜分离扩散膜分离是利用小分子
物质的扩散作用，不断透过半透膜扩
散到膜外，而大分子被截留。常见的
透析就是属于扩散膜分离。
– 透析时，一般将半透膜制成透析袋，将欲
分离的混合液装在袋内，袋外是水或缓冲
液。在一定的温度下，透析一段时间，使
小分子物质从袋内透出到膜外。必要时，
袋外的水或缓冲液可以多次或连续更换。
第五节 沉淀分离
? 沉淀分离是通过改变某些条件，使溶
液中某种溶质的溶解度降低，从溶液
中沉淀析出，而与其他溶质分离的方
法。
? 沉淀分离是酶的分离纯化过程中经常
采用的方法。
? 沉淀分离的方法有多种，诸如盐析沉
淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀
法、复合沉淀法、选择性变性沉淀法
等。
1.盐析沉淀法盐析沉淀法简称盐析法，是在
酶的分离纯化中应用最早且至今仍在广泛
使用的方法，主要用于蛋白类酶的分离纯
化。
– 蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度
的影响。一般在低盐浓度的情况下，蛋白
质的溶解度随盐浓度的升高而增加，而在
盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质的溶解
度又随盐浓度的升高而降低，结果使蛋白
质沉淀析出。在某一浓度的盐溶液中，不
同蛋白质的溶解度各不相同，由此可达到
彼此分离的目的。
– 经过盐析得到的酶沉淀，含有大量盐分，
一般可以采用透析、超滤或层析等方法进
行脱盐。
2.等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时
溶解度最低，以及不同的两性电解质有不
同的等电点这一特性，对蛋白质,RNA、
氨基酸等两性电解质进行分离纯化的方法
称为等电点沉淀法。
3.有机溶剂沉淀法利用酶与其他杂质在有机
溶剂中的溶解度不同，而使酶与杂质分离
的方法称为有机溶剂沉淀法。
4.复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它
与酶形成复合物而沉淀下来，分离出沉淀
后，再用适当的方法，使酶从复合物中析
出，这种分离纯化方法称为复合沉淀法。
– 常用的复合沉淀剂有单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸等
高分子聚合物。
5.选择性变性沉淀法选择一定的条件使
酶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性
沉淀，而不影响所需的酶，这种分离
方法称为选择性变性沉淀法。
– 例如，对于热稳定性好的酶，可以通过加
热进行热处理，使大多数杂蛋白受热变性
沉淀而被除去。
– 此外，还可以根据酶的特性，通过改变
pH 值或加进某些金属离子等使杂蛋白变
性沉淀而除去。
第六节 层析分离
? 层析分离是利用混合液中各组分的物理化学
性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附
力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使
各组分以不同程度分布在两相中，其中一个
相是固定的称为固定相；另一个相是流动的，
称为流动相。当流动相流经固定相时，各组
分以不同的速度移动，从而使不同的组分分
离纯化。
? 酶可以采用不同的层析方法进行分离纯化，
常用的有吸附层析、分配层析、离子交换层
析、凝胶层析和亲和层析等。
1.吸附层析
? 吸附层析是利用吸附剂对不同物质的
吸附力不同而使混合物中各组分分离
的方法。吸附层析是各种层析技术中
应用最早且至今仍广泛使用的技术。
– 任何两个相之间都可以形成一个界面，其
中一个相的物质或溶质在两相界面上的密
集现象称为吸附。凡是能够将其他物质聚
集到自己表面上的物质称为吸附剂，能聚
集于吸附剂表面的物质称为被吸附物。
– 吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装
在吸附柱中进行柱层析。层析时，欲分离
样品液自柱顶加入，上柱完毕后，再加入
洗脱剂解吸洗脱。
2.分配层析
– 分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同
而分离的方法。
– 常见的纸上层析和一些薄层层析属于分配层析。
在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物
（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂
（称为固定相），另一种与固定相溶剂互不相溶
的溶剂可沿着固定相流动（称为流动相），当某
溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质在两
相之间进行连续的动态分配。由于不同的溶质有
不同的分配系数，移动速度不同，从而达到分离。
– 分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中
溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度比
值。在层析条件确定后，溶质的分配系数是一常
数。
3.离子交换层析
– 离子交换层析是利用离子交换剂上的可解
离基团对各种离子的亲和力不同而达到分
离目的的一种层析分离方法。
– 离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性
高分子物质。通过在不溶性高分子物质
（母体）上引入若干可解离基团（活性基
团）而制成。
– 离子交换剂进行酶的层析分离过程包括装
柱、上柱、洗脱、收集和交换剂再生等步
骤。
4.凝胶层析
– 凝胶层析又称凝胶过滤、分子筛层析或分
子排阻层析，是以各种多孔凝胶为固定相，
利用溶液中各组分的相对分子质量不同而
进行分离的层析技术。
– 凝胶的种类很多，常用于凝胶层析的有葡
聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶
等。各种凝胶均有系列产品，不同的型号
表明凝胶的孔径不同，可根据需要选择使
用。
5.亲和层析
– 亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专
一而又可逆的亲和力，使酶等生物分子分离纯化
的技术。酶与底物，酶与竞争性抑制剂，酶与辅
助因子，抗原与抗体，酶 RNA 与互补的 RNA
分子或片段,RNA 与互补的 DNA 分子或片段等
之间都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。
故此，亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用。
– 在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基
（ ligand）。配基必须偶联于不溶性母体
（ matrix）上。母体又称为载体或担体。在亲和
层析中，一般采用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚
丙烯酰胺凝胶或纤维素等作为母体。
– 当小分子物质（金属离子等无机辅助因子、有机
辅助因子等）作为配基时，由于空间位阻作用，
难以与配对的大分子亲和吻合，需要在母体与配
基之间引入适当长度的连接臂（ spacearm）。
第七节 电泳分离
? 带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相
反的电极移动的过程称为电泳。
? 不同的物质由于其带电性质及其颗粒大小和
形状不同，在一定的电场中它们的移动方向
和移动速度也不同，故此可使它们分离。物
质颗粒在电场中的移动方向，决定于它们所
带电荷的种类。带正电荷的颗粒向电场的阴
极移动；带负电荷的颗粒则向阳极移动。净
电荷为零的颗粒在电场中不移动。
? 颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身
所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大
小的影响。此外，还受到电场强度、溶液
pH 值、离子强度及支持体的特性等外界条
件的影响。
– （ 1）电场强度。电场强度是指每厘米距
离的电压降，又称为电位梯度或电势梯度。
电场强度对颗粒的泳动速度起着十分重要
的作用。电场强度越高，带电颗粒的泳动
速度越快。根据电场强度的大小可将电泳
分为高压电泳和常压电泳。
– （ 2）溶液的 pH 值。溶液的 pH 值决定了
溶液中颗粒分子的解离程度，也就是决定
了颗粒分子所带净电荷的多少。溶液的
pH 值离开其等电点越远，颗粒所带净电
荷越多，泳动速度越快；反之，颗粒的泳
动速度则越慢。
– （ 3）溶液的离子强度。溶液的离子强度
越高，颗粒的泳动速度越慢。
– （ 4）电渗。在电场中，溶液对于固体支
持物的相对移动称为电渗。例如，在纸电
泳中，由于滤纸纤维素上带有一定量的负
电荷，使与滤纸相接触的水分子感应而带
有一些正电荷，水分子便会向负极移动并
带动溶液中的颗粒一起向负极移动。若颗
粒本身向负极移动，则其表观泳动速度将
比其本来的泳动速度快；若颗粒本身向正
极移动，则其表观泳动速度慢于其本来的
泳动速度。净电荷为零的颗粒，也会随水
向负极移动。
– 此外，缓冲液的粘度和温度等也对颗粒的
泳动速度有一定的影响。
? 在酶学研究中，电泳技术主要用于酶
的纯度鉴定、酶相对分子质量测定、
酶等电点测定以及少量酶的分离纯化。
其方法多种多样。按其使用的支持体
不同，可分为纸电泳、薄层电泳、薄
膜电泳、凝胶电泳和等电点聚焦电泳
等。
– 1.纸电泳纸电泳是以滤纸为支持体的电泳
技术。
– 2.薄层电泳薄层电泳是将支持体与缓冲液
调制成适当厚度的薄层而进行电泳的技术。
– 3.薄膜电泳薄膜电泳是以醋酸纤维等高分子物质
制成的薄膜为支持体的电泳技术。
– 4.凝胶电泳凝胶电泳是以各种具有网状结构的多
孔凝胶作为支持体的电泳技术。
? 凝胶电泳的支持体主要有聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝
胶等。常用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE）。
? 聚丙烯酰胺凝胶电泳按其凝胶形状和电泳装置的不同，
可以分为垂直管型盘状凝胶电泳和垂直板型片状凝胶
电泳。两者的操作原理和方式基本相同，不同的是前
者在玻璃管内制成圆柱状的凝胶，后者则在两块玻璃
板之间制成平板状凝胶。
? 聚丙烯酰胺凝胶电泳按其凝胶组成系统的不同，可以
分为连续凝胶电泳、不连续凝胶电泳、浓度梯度凝胶
电泳和 SDS凝胶电泳等 4种。
5.等电点聚焦电泳
– 等电点聚焦电泳又称为等电点聚焦或电聚
焦，是 20 世纪 60 年代后期发展起来的
电泳技术，在酶的等电点测定和酶的分离
中广泛使用。
– 在电泳系统中，加进两性电解质载体。当
接通直流电时，两性电解质载体即形成一
个由阳极到阴极连续增高的 pH 梯度。当
酶或其他两性电解质进入这个体系时，不
同的两性电解质即移动到（聚焦于）与其
等电点相当的 pH 值位置上，从而使不同
等电点的物质得以分离。这种电泳技术称
为等电点聚焦电泳。
第八节 萃取分离
? 萃取分离是利用物质在两相中的溶解
度不同而使其分离的技术。
? 萃取分离中的两相一般为互不相溶的
两个液相，有时也可采用其他流体。
? 按照两相的组成不同，萃取可以分为
有机溶剂萃取、液膜萃取、双水相萃
取和超临界萃取等。
第九节 酶的结晶
? 结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。
结晶时，溶质分子按照一定的规律排列在一
起，形成特定形状的晶体颗粒。
? 酶的结晶是酶分离纯化的一种手段，也是酶
的一种制品形式。在酶学研究中，酶结晶为
酶的结构、功能、催化机制等方面的研究提
供了适宜的样品，同时为较高纯度的酶的获
得和应用创造了条件。
? 酶结晶的方法多种多样，主要有盐析结晶、
有机溶剂结晶、透析平衡结晶、等电点结晶
等。
1.盐析结晶
– 在适宜的温度和 pH 值等条件下，慢慢增
加酶液中盐的浓度，使酶的溶解度慢慢降
低，而使酶析出结晶，此种方法称为盐析
结晶。
? 盐析结晶采用的中性盐一般是硫酸铵，也可
采用硫酸钠等其他中性盐。
2.有机溶剂结晶
– 在适宜的温度和 pH 值等条件下，慢慢加
入一定量的有机溶剂到酶液中，使酶的溶
解度慢慢降低，达到稍为过饱和状态而析
出结晶，此种方法称为有机溶剂结晶。
? 常用于酶结晶的有机溶剂主要有乙醇、丙酮、
丁醇、甲醇、异丙醇甲基戊二醇、二甲亚砜
等。
3.透析平衡结晶
– 将经过纯化的浓缩酶液装进透析袋，对一
定浓度的盐溶液或一定 pH 值的缓冲液或
有机溶剂进行透析，经过一段时间，酶液
中酶的浓度渐渐达到过饱和状态而析出结
晶，此种方法称为透析平衡结晶。透析平
衡结晶是常用的结晶方法之一，可用于大
量样品的结晶，也可用于微量样品的结晶。
4.等电点结晶
– 通过慢慢改变浓缩酶液的 pH 值，使之逐
步达到酶的等电点，使酶的溶解度降低，
达到过饱和状态而析出结晶，此种方法称
为等电点结晶。
第十节 浓缩与干燥
? 浓缩是从低浓度酶溶液中除去部分的
水或其他溶剂而成为高浓度溶液的过
程。
? 干燥是将固体、半固体或浓缩液中的
水分（或其他溶剂）除去一部分，以
获得含水较少的固体的过程。
– 干燥的方法很多。常用的有：真空干燥、
冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥和吸附干
燥等。
本章结束
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