第二章 酶的发酵生产
? 所有的生物体在一定的条件下都能产生
多种多样的酶。酶在生物体内产生的过
程,称为酶的生物合成。
? 经过预先设计,通过人工操作控制,利
用细胞(包括微生物、植物细胞和动物
细胞)的生命活动,产生人们所需要的
酶的过程,称为酶的发酵生产。
? 酶的发酵生产是现在酶生产的主要方法。
第一节 酶生物合成的基本理论
? 酶是生命活动的产物,又是生命活动必不
可缺的条件之一。酶的生物合成主要是
RNA和蛋白质的生物合成过程。
一,RNA 的生物合成 ———转录
? 根据分子结构和功能的不同,核糖核酸
( RNA)可以分为转移核糖核酸( tRNA)、
信使核糖核酸( mRNA)和核糖体核糖核
酸( rRNA) 3类。
? RNA 的生物学功能主要有 3个方面:
– ( 1)在某些 RNA 病毒中,双链 RNA 作为
遗传信息的载体。
– ( 2)在蛋白质的生物合成中,各种 RNA 起
着重要作用。其中,tRNA 作为氨基酸载体
并由其上的反密码子识别 mRNA 上的遗传
密码; mRNA 作为蛋白质合成的模板,由其
上的三联体密码控制蛋白质分子中的氨基酸
排列顺序; rRNA 与蛋白质组成核糖核蛋白
体(核糖体),作为蛋白质生物合成的场所。
– ( 3)作为核酸类酶,催化有关生化反应。
? 以 DNA 为模板,以核苷三磷酸为底物,
在依赖 DNA 的 RNA 聚合酶(转录酶)
的作用下,生成 RNA 的过程称为转录。
? RNA 的转录过程主要包括 3 个步骤,即
转录的起始,RNA 链的延伸和 RNA 链
合成的终止。
第二节 蛋白质的生物合成 ———翻译
? 以 mRNA 为模板,以各种氨基酸为底物,
在核糖核蛋白体上通过各种 tRNA、酶和
辅助因子的作用,合成多肽链的过程,称
为翻译。翻译是将 mRNA 分子上的碱基
排列次序转变为多肽链上氨基酸排列次序
的过程。
? 不同的生物,其蛋白质的生物合成过程虽
然有些差别,但是基本过程均包括氨基酸
活化、肽链合成的起始、肽链的延伸、肽
链合成的终止及新生肽链的加工等。
1.氨基酸活化生成氨酰 -tRNA
– 氨基酸在氨酰 -tRNA 合成酶的催化作用下,
由 ATP 提供能量,与特定的 tRNA 结合生
成氨酰 -tRNA。其反应式如下:
? 对于真核生物,肽链合成时的第 1 个氨
基酸是甲硫氨酸,起始 tRNA 是 Met-
tRNAMet。而对于大肠杆菌等原核生物,
肽链合成时的第 1 个氨基酸是甲酰甲硫
氨酸,起始 tRNA 是 fMet-tRNAF。它是
在甲硫氨酸与 tRNAF结合后,再在甲酰
转移酶的作用下,经甲酰化而生成甲酰
甲硫氨酰 -tRNAF。
2.肽链合成的起始
? 原核生物肽链合成的起始阶段是在 GTP
和起始因子( initiation factor)的参与下,
核糖体 30 S亚基,fMet-tRNAF,mRNA
和 50 S 亚基结合,组成起始复合物的过
程。
? 主要包括 5个步骤:
① 30 S亚基与起始因子 IF3结合。
② 30 S亚基与 mRNA 结合,形成 30 S-IF3-mRNA 复合
物。
③ fMet-tRNAF与起始因子 IF2以及 GTP 结合,生成
fMet-tRNAF-IF2-GTP。
④ (在起始因子 IF1的参与下,fMet-tRNAF-IF2-GTP 与
30 S-IF3-mRNA 结合生成 30 S起始复合物。在此 30
S起始复合物中,fMet-tRNAF上的反密码子正好与
mRNA 上的起始密码子 AUG 结合。
⑤ 50 S亚基与上述 30 S起始复合物结合,形成完整的
70 S核糖体。同时放出 IF1,IF2,IF3,并使 GTP 水
解生成 GDP 和 Pi。在此 70 S核糖体形成时,fMet-
tRNAF位于 70 S核糖体的,P”位(肽酰基位),而
它的,A”位(氨酰基位)是空位。
? 真核生物和原核生物的核糖体亚基组成、肽链合成的
起始因子、起始 tRNA 以及亚基的结合次序等均有所
不同。
1,原核生物为 70 S核糖体,由 30 S 亚基和 50 S 亚基组成;而
真核生物的核糖体为 80 S核糖体,由 40 S亚基和 60 S亚基
组成。
2,原核生物中有 3种起始因子 IF1,IF2,IF3;而真核生物中有
10种左右的起始因子,主要功能与原核生物的起始因子相似,
相对分子质量均比原核生物的起始因子大。
3,原核生物的起始 tRNA 是 fMet-tRNAF;而真核生物的起始
tRNA 是 Met-tRNAMet。
4,原核生物的 30 S亚基先与 mRNA 结合,再与 fMet-tRNAF结
合,最后与 50 S 亚基结合,生成 70 S核糖体;而真核生物
的 40 S 亚基先与 Met-tRNAMet结合,再与 mRNA 结合,最
后与 60 S亚基结合生成 80 S核糖体。
3.肽链的延伸
– 在延伸因子( elongation factor)的参与下,与
mRNA 上的密码子对应的氨酰 -tRNA 进入核糖体的
,A 位”;通过肽基转移酶( 23 S rRNA)的作用,
P 位上 fMet-tRNAF的甲酰甲硫氨酰基转移到 A 位
氨酰 -tRNA 的氨基上以肽键结合,形成肽酰 -tRNA;
接着,mRNA 与核糖体相对移动一个密码子( 3个
碱基)的距离,A 位上的肽酰 -tRNA 转移至 P 位,
而原来在 P 位的 tRNAF游离出去;然后根据 mRNA
上的密码编排,下一个氨酰 -tRNA 进入 A 位,再重
复上述的转肽和移位过程,使肽链不断延伸,直至
终止密码子为止。
? 肽链的延伸过程主要包括如下 4个步骤:
① 延伸因子 EF-T 与氨酰 -tRNA( AA1-tRNA1)以
及 GTP 结合生成复合物;
② AA1-tRNA1进入核糖体的 A 位,同时放出 EF-T,
GTP 水解生成 GDP 和 Pi;
③ 肽基转移酶将 P 位 fMet-tRNAF的 fMet转至 A
位 AA1-tRNA1的氨基上,以肽键结合生成肽酰 -
tRNA( fMet-AA1-tRNA1);
④ 在延伸因子 EF-G 和 GTP 的参与下,mRNA
与核糖体相对移动一个密码子距离,使原来在
A 位上的肽酰 -tRNA( fMet-AA1-tRNA1)移位至
P 位,A 位又成为空位,同时放出 EF-G,GDP、
Pi和 tRNAF。
然后,下一个氨酰 -tRNA( AA2-tRNA2)进入 A
位,重复上述步骤,使肽链不断延伸,直至终
止因子为止。
4.,肽链合成的终止
– 随着肽链的延伸,mRNA 与核糖体不断地在
相对移动。当 mRNA 分子中的终止密码子
( UAA,UAG,UGA)移动到核糖体的 A
位时,没有相应的氨酰 -tRNA 进入,此时释
放因子( release factor)进入 A 位与终止
密码子结合。
– 据研究表明,释放因子有两种。其中,RF-1
可与 UAA 或 UAG 结合,而 RF-2 可与 UAA
或 UGA 结合。在释放因子进入核糖体的 A
位后,已经合成的肽链从 P 位移至 A 位时,
就被释放出来。随之核糖体解离成两个亚基,
可以用于下一次肽链的合成。
三,酶生物合成的调节
– 生物体为了适应环境的变化,使代谢过程有
条不紊地进行,需要根据各种条件的变化,
对适应型酶的生物合成进行调节控制。这些
调节控制主要包括转录水平的调节,转录产
物的加工调节,翻译水平的调节,翻译产物
的加工调节和酶降解的调节等,其中,转录
水平的调节对酶的生物合成是最重要的调节。
– 根据基因调节理论,在 DNA 分子中,与
酶的生物合成有密切关系的基因有 4 种。
它们是调节基因( regulatorgene)、启动
基因( promotergene)、操纵基因
( operatorgene)和结构基因
( structuralgene)。
1,结构基因与多肽链有各自的对应关系。结构基
因上的遗传信息可以转录成为 mRNA上的遗传
密码,再经翻译成为酶蛋白的多肽链,每一个
结构基因对应一条多肽链。
2.操纵基因可以与调节基因产生的变构蛋白(阻遏
蛋白)中的一种结构结合,从而操纵酶生物合
成的时机和合成速度。
3.启动基因决定酶的合成能否开始,启动基因由两
个位点组成:一个是 RNA 聚合酶的结合位点,
另一个是环腺苷酸( cyclic AM P,cAM P)与
CAP 组成的复合物( cAM P-CAP)的结合位
点。 CAP 是指环腺苷酸受体蛋白( cAM P
acceptor protein)或分解代谢物活化剂蛋白
( cataboliteactivatorprotein)。只有到达启动
基因的位点时,RNA 聚合酶才能结合到其在启
动基因上的相应位点上,转录才有可能开始,
否则酶就无法开始合成。
? 调节基因可以产生一种阻遏蛋白。阻遏蛋白是
一种由多个亚基组成的变构蛋白,它可以通过
与某些小分子效应物(诱导物或阻遏物)的特
异结合而改变其结构,从而改变它与操纵基因
的结合力。当阻遏蛋白与操纵基因结合时,由
于空间排挤作用,RNA 聚合酶就无法结合到启
动基因的位点上,也无法进入到结构基因的位
置进行转录,因而无法将 DNA 上的遗传信息
转录到 mRNA 分子上,酶的生物合成也就无
法进行。只有当阻遏蛋白通过与效应物结合,
改变结构而不与操纵基因结合时,RNA 聚合酶
才能结合到启动基因的位点上,进行转录,使
结构基因所对应的酶进行生物合成。
? 结构基因与操纵基因、启动基因一起组
成操纵子( operon)。
– 研究表明,乳糖操纵子等诱导型操纵子同时
具有分解代谢物阻遏作用和诱导作用;而色
氨酸操纵子等阻遏型操纵子等同时具有操纵
基因的调节和衰减子的调节两种反馈阻遏作
用。
? (一)分解代谢物的阻遏作用
– 分解代谢物阻遏作用是指某些物质(主要是指容易
利用的碳源)经过分解代谢产生的分解代谢物阻遏
某些酶(主要是诱导酶)生物合成的现象。例如,
葡萄糖阻遏 β-半乳糖苷酶的生物合成,果糖阻遏 α-
淀粉酶的生物合成等。
– 分解代谢物阻遏作用之所以产生,是由于某些物质
(如葡萄糖等)经过分解代谢放出能量,有一部分
能量储存在 ATP 中。 ATP 是由 AMP 和 ADP 通过
磷酸化作用生成的。这样细胞内 ATP 的浓度增加,
使 AMP 的浓度降低,存在于细胞内的 cAMP 就通
过磷酸二酯酶的作用水解生成 AMP。
(二)酶生物合成的诱导作用
? 加进某些物质,使酶的生物合成开始或加速进行的现
象,称为酶生物合成的诱导作用,简称为诱导作用。
? 能够引起诱导作用的物质称为诱导物( inducer)。
? 诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物。例
如,β-半乳糖苷酶的作用底物乳糖及其底物类似物异
丙基 - β -D-硫代半乳糖苷( IPTG)诱导 β -半乳糖苷酶
的生物合成;蔗糖及蔗糖甘油单棕榈酸酯诱导蔗糖酶
的生物合成等。有些酶也可由其催化反应产物诱导产
生。例如,半乳糖醛酸是果胶酶催化果胶水解的产物,
它也可以作为诱导剂,诱导果胶酶的产生;纤维二糖
作为纤维素酶的催化反应产物可诱导纤维素酶的生物
合成等。
? 乳糖操纵子中酶生物合成的诱导作用过
程如图 5-10所示。
(三)酶生物合成的反馈阻遏作用
– 酶生物合成的反馈阻遏作用又称为产物阻遏作用,
是指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该
酶的生物合成受到阻遏的现象。
– 引起反馈阻遏作用的物质称为共阻遏物
( corepressor)。共阻遏物一般是酶催化反应的产
物或是代谢途径的末端产物。例如,无机磷酸是碱
性磷酸酶催化磷酸单酯水解的产物,它的过量存在,
却会阻遏碱性磷酸酶的生物合成;色氨酸作为色氨
酸合成途径的终产物,它的过量积累却反过来对其
合成途径中的 4种酶(邻氨基苯甲酸合成酶、磷酸
核糖邻氨基苯甲酸转移酶、磷酸核糖邻氨基苯甲酸
异构酶和色氨酸合成酶)的生物合成均起反馈阻遏
作用。
? 在没有共阻遏物存在时,调节基因( R)
产生的阻遏蛋白与操纵基因( O)的亲和
力弱,不能与操纵基因结合。所以,
RNA 聚合酶可以结合到其在启动基因的
位点上,进行转录,而合成结构基因( S)
所对应的酶(图 5-12a)。
第二节 酶发酵生产常用的微生物
一般来说,能用于酶发酵生产的细胞必需
具备以下几个条件:
1,酶的产量高
2,容易培养和管理
3,产酶稳定性好
4,利于酶的分离纯化
5,安全可靠
? 现在大多数酶都采用微生物细胞进行发
酵生产。微生物具有种类多,繁殖快,
容易培养代谢能力强等特点,有不少性
能优良的产酶菌株已在菌的发酵生产中
广泛应用。现把常用的产酶微生物简介
如下:
一、枯草芽抱杆菌 (Bacillus subtilis)
– 枯单芽抱杆菌是应用最广泛的产酶微生物
之一。枯草杆菌是芽胞杆菌属细菌。细胞成
杆状,大小为 0.7~0.8 x2~3μm,单个,无荚
膜,周生鞭毛,运动,革兰氏染色阳性。曲
落粗糙,不透明,污白色或微带黄色。
? 此菌用途很广,可用于生产 α—淀粉酶、
蛋白酶,β—葡聚糖酶、碱性磷酸酶等。
例如,枯草杆菌 BF7658是国内用于生产
α—淀粉酶的主要菌株;枯草杆菌 AS1.398
可用于生产中性蛋白酶和碱性磷酸酶。
枯草杆菌生产的 α—淀粉酶和蛋白酶都是
胞外酶。而碱性磷酸酶存在于细胞间质
之中。
? 二、大肠杆菌 (Escherichia coli)
– 大肠杆菌细胞呈杆状,大小为 0.5× 1.0~3.0μm,
革兰氏染色阴性,无芽胞,菌落从白色到黄白色,
光滑闲光,扩展。
– 大肠杆菌可生产多种多样的酶,一般都属于胞内酶,
需经过细脑破碎才能分离得到。例如,谷氨酸脱羧
酶,用于测定谷氨酸含量或生产 γ—氨基丁酸;天
门冬氨酸酶,催化廷胡素酸加氨生成 L—天门冬氨
酸;苄青霉素酰化酶,生产新的半合成青霉素或头
孢霉素; β—半乳糖苷酶,用于分解乳糖;限制性
核酸内切酶,DNA聚合酶,DNA连接酶、核酸外切
酶,在基因工程方面应用。
? 三、黑曲霉 (Aspergillus niger)
– 黑曲霉是曲霉属黑曲霉群霉菌。菌丝体由
具横隔的分枝菌丝构成,菌丛黑褐色,顶囊
球形,小梗双层,分生胞子球形,平滑或粗
糙。
– 黑曲霉可用于生产多种酶,有胞外酶也有
胞内酶。如,糖化酶,α—淀粉酶、酸性蛋
白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、
核搪核酸酶、脂肪酶、纤维素酶、橙皮苷酶、
柚苷酶等。
? 四、米曲霉 (Aspergillus oryzae)
– 米曲霉是曲霉属黄曲霉群霉菌。菌丛一般
为黄绿色,后变为黄褐色,分生袍子头呈放
射形,顶裹囊球形或瓶形,小梗一般为单层,
分生孢子球形,平滑少数有刺,分生孢子梗
长 2mm左右,粗糙。
– 米曲霉可用于生产糖化酶和蛋白酶,这在
我国传统的酒曲和酱油曲中得到广泛应用。
此外,米曲霉还用于生产氨基酰化酶、磷酸
二酯酶、核酸酶 P1、果胶酶等。
? 五、青霉 (Penicillium)
– 青霉属半知菌纲。营养菌丝无色,淡色,
有横隔,分生孢子枝亦有横隔,顶端形成扫
帚状的分枝,小梗顶端串生分生孢子,分生
孢子球形,椭圆形或短柱形,光滑或粗糙,
大部分在生长时呈蓝绿色。
– 青霉菌分布广泛,种类很多。其中产黄青
霉 (Penicillium chrysogenum)用于生产葡萄
糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶 (主要作
用于青霉素 V)、果胶酶、纤维素酶 Cx等;桔
青霉 (Penicillium citrinum)用于生产 5’—磷酸
二酯酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白
酶、核竣曲 Sl、核酸酶 P1等.
? 六、木霉 (Trichoderma)
– 木霉属于半知菌纲。生长时菌落呈棉絮状
或致密丛束状,菌落表面呈不同程度的绿色。
菌丝透明,有分隔,分枝繁复,分枝末端为
小梗,瓶状,束生、对生、互生或单生,分
生孢子由小梗相继生出,靠粘液把它们聚集
成球形或近球形的孢子头。分生孢子近球形
或椭圆形,透明或亮黄绿色。
– 木霉是生产纤维素酶的重要菌株。木霉产
生的纤维素酶中包含有 Cl酶,Cx酶和纤维二
糖酶等。此外,木霉中含有较强的 l 7α羟化
酶,常用于甾体转化。
? 七、根霉 (Rhizopus)
– 根霉生长时,由营养菌丝产生匍匐枝,匍
匐枝的末端生出假根,在有假根的匍匐枝上
生出成群的孢子囊梗,梗的顶端膨大形成孢
子囊,囊内生孢子囊孢子,孢子呈球形、卵
形或不规则形状。
– 根霉用于生产糖化酶,α—淀粉酶、转化酶、
酸性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果胶酶、
纤维素酶、半纤维素酶等。根霉有强的 ll—α
羟化酶,是用于甾体转化的重要菌株。
? 八、毛霉 (Mucor)
– 毛霉的菌丝体在基质上或基质内广泛蔓延,
苗丝体上直接生山孢子囊梗,分枝较小或单
生,孢子囊梗顶端有膨大成球形的孢子囊,
囊壁上常带有针状的草酸钙结晶。
– 毛霉用于生产蛋白酶、糖化酶,α—淀粉
酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。
? 九、链霉菌 (Streptomyces)
– 链霉菌是一种放线菌。形成分校的菌丝体。
有气生菌丝和基
– 内菌丝之分,基内菌丝体不断裂,只有气生
茵丝体形成孢子链。
– 链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要菌株,
还可以用于生产青霉素酰化酶、纤维素酶、
碱性蛋白面、中性蛋白酶、几丁质酶等。此
外,链霉菌还含有丰富的 16α羟化酶,可用
于甾体转化。
? 十、啤酒酵母 (Saccharomyces
cerevisiae)
– 啤洒酵母是在工业上广泛应用的酵母,细
胞由圆形、卵形、椭圆形到腊肠形。在麦芽
汁琼脂培养基上菌落为白色,有光泽,平滑,
边缘整齐。营养细胞可以直接变为子囊,每
个子囊含有 l~4个圆形光亮的子囊孢子。
– 啤酒酵母主要用于酿造啤酒、酒精、饮料
酒和面包制造。在酶的生产方面,用于转化
酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等的生产。
? 十一、假丝酵母 (Candida)
– 假丝酵母的细胞圆形、卵形或长形。无性
繁殖为多边芽殖,形成假菌丝,可生成厚垣
孢子、无节孢子、子囊孢子。不产生色素。
在麦芽汁琼脂培养基上菌落呈乳白色或奶油
色。
– 假丝酵母是单细胞蛋白的主要生产菌。在
酶工程方面可用于生产脂肪酶、尿酸酶、尿
囊素酶、转化酶、醇脱氢酶。假丝酵母具有
烷类代谢的酶系,可用于石油发酵;具有较
强的 17羟基化酶,可用于甾体转化制造睾丸
素等
第三节 发酵工艺条件及控制
? 酶的发酵生产是以获得大量所需的酶
为目的。为此,除了选择性能优良的产
酶细胞以外,还必须满足细胞生长、繁
殖和发酵产酶的各种工艺条件,并要根
据发酵过程的变化进行优化控制。
? 酶发酵生产的一般工艺流程如图 2—8所
示,
? 一、细胞活化与扩大培养
– 性能优良的产酶细胞选育出来以后,必须
尽可能保持其生长和产酶特性不变异,不死
亡,不被杂菌污染等。
– 保藏细胞在使用之前必须接种于新鲜的斜
面培养基上,在一定的条件下进行培养,以
恢复细胞的生命活动能力,这就叫做细胞活
化。
? 二、培养基的配制
– 培养基是指人工配制的用于细胞培养和发
酵的各种营养物质的混合物。
– 培养基有多种多样,千差万别。但培养基的
组分一般包括碳源、氮源、无机盐和生长因
素等几方面。
? 1.碳源
– 碳源是指能够向细胞提供碳素化合物物的
营养物质。通常碳源同时也是提供能量的能
源。
– 在选择碳源时,必须考虑原科的供求和价
格问题。
– 目前,在酶发酵生产中最常用的碳源是淀
粉及其水解物,如:糊精、麦芽糖、葡萄糖
等。
? 2.氮源
– 氮是组成细胞蛋白质和核酸的重要元素之一,也
是酶分子的主要功组成元素。
– 凡能够向细胞提供氮元素的营养物质称为氮源。
– 氮源可分为有机氮源和无机氮源两种。有机氮源
主要是各种蛋白质及其水解产物。无机氮源是含氮
的各种无机化合构。
– 此外,碳和氮两者的比例对酶的产量有显著的影
响。所谓碳氮比 (C/ N)一般是指培养基中碳元素 (C)
的总量与氮元素 (N)总量之比。可通过测定或计算培
养基中碳和氮的含量而求出。有时也采用培养基中
碳源总量和氮源总量之比来表示碳氮比。
– 使用时要注意两种比值是不同的。
? 3.无机盐
– 无机盐的主要作用是提供细胞生命活动不
可缺少的无机元素,并对培养基的 pH值、
氧化还原电位和渗透压起调节作用。
– 根据细胞对无机元素需要量的大小,可分
为主要元素 (大量元素 )和微量元素两大类。
? 主要元素有:磷、硫、钾、钠、镁、钙等。微量
元素有:铜、锰、锌、钼、钴、碘等。
? 微量元素是细胞生命活动不可缺少的,但需要量
很少,过量反而会引起不良效果,必须严加控制。
? 4.生长因素
– 生长因素是指细胞生长繁殖所必不可缺的
微量有机化合物,
– 主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素,
以及动植物生长激素等。
三,pH值的调节
? 培养基的 pH值与细胞的生长繁殖以及
发酵产酶都有密切关系,故必须进行必
要的调节控制。
? 不同细胞生长繁殖的最适 pH值有所不同。一般
细菌和放线菌的生长最适 pH值为中性或微碱性
( pH 6.5~8.0);霉菌和酵母的生长最适 pH值
为偏酸性 (pH 4.0~6.0);植物细胞生长的最适
pH值为 5~6。
? 细胞发酵产酶的最适 pH值通常接近于该酶反
应的最适 pH值。
? 所以在细胞培养和发酵过程中,必须对培养
基的 pH值进行适当的控制和调节。 pH值的调
节可以通过改变培养基的组分或其比例来实现。
必要时可使用缓冲溶液,或添加适宜的酸、碱
溶液,以调节控制培养基中 pH值的变化。
? 四、温度的调节控制
– 温度是影响细胞生长繁殖和发酵产酶的重要因素
之一。
– 不同的细胞有各自不同的最适生长温度。
– 细胞发酵产酶的最适温度与最适生长温度有所不
同,而月往往低于最适生长温度,这是由于在较低
的温度条件下,可提高酶的稳定性,延长细胞产酶
时间。
– 在细胞生长和发酵产酶过得中,由于细胞的新陈
代谢作用,不断放出热量,会使培养基的温度升高,
同时,热量不断扩散和散失,又会使培养基温度降
低,两者综合,决定了培养基的温度.
– 温度控制的方法一般采用热水升温,冷水降温,故
此在发酵罐中,均设计有足够传热面积的热交换装
置,如排管、蛇管、夹套、喷淋管等。
? 五、溶解氧的调节控制
– 细胞的生长繁殖以及酶的生物合成过程需要大量
的能量。为了满足细胞生长和发酵产酶的需要,培
养基中的能源物质 (一般是碳源提供 )必须经有氧降
解才能产生大量的 ATP。为此,必须供给充足的氧
气。
– 在培养基中生长和发酵产酶的细胞,一般只能利
用溶解在培养基中的氧气 ——溶解氧。
– 由于氧是难溶于水的气体,培养基中含有的溶解氧
并不多,很快就会被细胞利用完。为此,必须在发
酵过程中连续不断地供给无菌空气,使培养基中的
溶解氧保持在一定水平,以满足细胞生长和产酶的
需要。
? 调节溶氧速率的方法,主要有下列几种:
(1)调节通气量
(2)调节氧的分压:
(3)调节气液接触时间:
(4)调节气液接触面积
(5) 调节培养液粘度
六,提高酶产量的措施
– 在酶的发酵生产过程中,为了提高酶产量,
除了选育优良的产酶细胞,保证发酵工艺条
件并根据需要和变化情况及时加以调节控制
以外,还可以来取某些行之有效的措施,诸
如添加诱导物,控制阻遏物浓度,添加表面
活性剂或其他产酶促进剂等。
? 1、添加诱导物
– 对于诱导酶的发酵生产,在发酵培养基中
添加适当的诱导物,可使产酶量显著提高。
– 诱导物一般可分为 3类:
? (1)酶的作用底物
? (2)酶的反应产物
? (3)酶的底物类似物
? 2.控制阻遏物浓度
– 如前所述,有些酶的生物合成受到阻遏物
的阻遏作用。为了提高酶产量,必须设法解
除阻遏作用。
– 阻遏作用有产物阻退和分解代谢物阻遏两
种。阻遏物可以是酶催化反应产物,代谢途
径的末端产物以及分解代谢物 (葡萄糖等容
易利用的碳源 )。
– 控制阻遏物浓度是解除阻遏、提高梅产量的
有效措施。
3.添加表面活性剂
– 表面活性剂可分为离子型和非离子型两大
类。离子型表面活性剂又有阳离子型.阴离
子型和两性离子型之别。
– 由于离子型表面活性剂有些对细胞有毒害
作用,特别是季胺型离子表面活性剂 (如
“新洁而灭”等 )是消毒剂。不能用于酶的
发酵生产。
4.添加产酶促进剂
– 产酶促进剂是指可以促进产酶、但作用机
理并未阐明清楚的物质。添加产酶促进剂往
往对提高酶产量有显著效果。
第四节 酶发酵动力学
? 发酵动力学主要研究在发酵过程中细
胞生长速度,产物生成速度,以及环境
因素对这些速度的影响。
? 在酶的发酵生产方面,研究细胞生长
和发酵产酶动力学,对于了解酶生物合
成模式,发酵工艺条件的优化控制,提
高酶产量均有相当重要的意义。
一、酶生物合成的模式
? 产酶细胞在一定条件下进行培养,其生长过程
一般经历调整期、对数生长期、平衡期和衰退期
4个阶段 (图 2—7)。
? 通过分析比较酶的产生与细胞生长的关系,可以
把酶生物合成的模式分为 4种类型。即:同步合
成型,延续合成型,中期合成型和滞后合成型。
mRNA的稳定性以及培养基中阻遏物的存在是影
响酶生物合成模式的主要因素。
? 二、细胞生长动力学
? 在培养过程中,细胞生长速率与细胞浓度成正比
? 当培养物中只有一种限制性基质,而不存在其
他限制生长的因素时,μ为此限制性基质浓度的
函数,这就是莫诺德生长动力学模型:
? 在连续全混流反应器的发酵过程中,不断流加
培养液并不断地排出同体积发酵液。在稳态时,
游离细胞连续发酵的生长动力学方程可表达为:
? 莫诺德方程与酶反应动力学的米氏方程相似。
最大比生长速率 μm和莫诺德系数 Ks也可由双倒数
作图法求出。
三、产酶动力学
? 产酶动力学主要研究细胞产酶速率以
及各种因素对产酶速率的影响。
? 产酶动力学的研究可以从整个发酵系
统着眼,研究群体细胞的产酶速率,这
称为宏观产酶动力学,或称为非结构动
力学。也可以从细胞内部着眼,研究细
胞中酶合成速率,这谓之微观产酶动力
学或结构动力学。
? 宏观产酶动力学与细胞比生长速率和
细胞浓度以及细胞产酶模式有关。
? 一般产酶动力学方程可表达为:
? 根据细胞的产酶模式不同,产酶速率与细胞生长
动力学的关系也有所不同。
– 同步合成型:
– 中期合成型的酶,为特殊的生长偶联型,其产酶动力
学方程与同步合成型相同,然而,在有阻遏物存在时,
α= 0,无酶产生,在解除阻遏后,才开始酶的合成。
– 滞后合成型的酶,为非生长偶联型,生长偶联型的
比产酶速率。 α= 0,其产酶动力学方程可表达为:
? 延续合成型的酶,在细胞生长期和平衡期均可
产生酶,是部分生长偶联型,其产酶动力学方程
为:
? 微观产酶动力学研究细胞内部酶的合成
速率及其影响因素。
? 根据酶生物合成及其调节理论,细胞中酶生物
合成的一般模型如下:
? 根据一般模型,酶的生物合成速率决定
于细胞中 mRNA的浓度,同时与细胞比
生长速率有关,即:
? 当酶的生物合成受分解代谢物阻遏的情
况下,其生物合成模型为,
? 根据此模型,K2和 DNA浓度假设为常数,
细胞中 mRNA,RSi,和 RA的变化速率可
分别表达为:
第五节 固定化细胞发酵产酶
? 固定化细胞又称固定化活细胞或固定化增殖
细胞,是指用各种方法固定在栽体上又能进行
生长、繁殖和新陈代谢的细胞。
一、固定化细胞生长和产酶动力学
? 固定化细胞在适宜的条件下培养时,固定在载体上的细
胞以一定的速率生长,在达到平衡期以后的相当长的一段
时间内,固定化细胞的浓度基本上保持恒定。同时,随着
固定化细胞的生长和增殖,有一些细胞泄漏到培养液中,
这些泄漏细胞如同游离细胞一样,在培养液中生长繁殖。
如图 2—15所示。
? 故此,在固定化细胞的培养系统中,细胞包括固定在载体
的细胞和游离细胞两部分。即,
? 在固定化细胞发酵过程中,固定在载体
上的细胞和培养液中的游离细胞都可产
生酶。即:
? 而固定在角叉菜胶中的枯草杆菌细胞,在生长达
到平衡期之前,培养液中 α—淀粉酶很少,这主
要是由于生长时间不长,加上凝胶对酶的扩散有
一定的阻碍作用。而在凝胶中细胞达到平衡期以
后,α—淀粉酶的浓度持续增加,可以认为,固
定在凝胶中的细胞的产酶模式为非处长偶联型。
其产酶速率 (dE/ dt)g与固定在凝胶中的细胞浓度
(Xg)成正比。即:
? 将 (2—21)式和 (2—22)式代入 (2—20)式,
得到固定化细胞产酶动力学方程:
? 式中 εf= (αμ十 β),为游离细胞比产酶速率
? εg= γ为固定在载体上细胞比产酶速率
? 在固定化细胞连续发酵过程中,如反应
器内系全混流态,Xf是全器均一的,与
流出反应器的游离细胞浓度相同。其细
胞生长速率为:
? 在 D= μf的条件下,发酵容器中的细胞浓
度达到动态平衡,数量上基本保持恒定,
固定化细胞连续发酵的产酶动力学方程
可以表达为:
二、固定化细胞发酵产酶的特点
– 根据 10多年来的大量试验结果,以及上述
固定化细胞生长和产酶动力学研究,可以
看到固定化细胞发酵生产胞外酶具有如下
显著特点:
1,提高产酶率
2,可在高稀释率条件下连续发酵
3,发酵稳定性好
4,缩短发酵周期,提高设备利用率
5,产品容易分离纯化
– 固定化细胞颗粒很容易与发酵液分离,发
酵液中游离细胞含量较低,就有利于产品
的分离纯化,有利于提高产品质量。
三、固定化细胞发酵产酶的工艺条件控制
1.固定化细胞的预培养
2.溶解氧的供给
3.湿度的控制
4.培养基成分的控制
– 此外,为了适应固定化细胞发酵产酶的工艺
要求,还必须在固定化细胞反应器的研制,
固定化载体和固定化技术等方面下功夫。
第六节 动、植物细胞发酵产酶
? 利用植物细胞和动物细胞发酵生产各种天然
产物,是生物工程研究和开发的新领域。
一、动植物细胞的特性
? 动物细胞和植物细胞均可以在人工控制条件
的生物反应器中,如同微生物细胞那样,发酵
生产而获得各种所需的产物。然而它们之间有
不同的特性。微生物、植物、动物细胞的主要
特性差异如表 2—2所示。
二、植物细胞发酵的特点
– 植物是各种色素、香精、药物和酶等天然
产物的主要来源。至今为止,植物来源的天
然物质的生产几乎都是采用提取法。即首先
收集植物 (栽培的或野生的 ),然后来用各种
生化技术,把有用的物质从植物组织细胞中
提取分离出来。
– 植物细胞发酵技术首先从植物组织中选育
出植物细胞,再经过筛选、诱变、原生质体
融合或 DNA重组等技术而获得高产、稳定的
植物细胞。然后,用植物细胞在人工控制条
件的植物细胞反应器中,如同微生物细胞那
样,进行发酵而获得各种所需的产物。
? 植物细胞发酵生产天然产物与从植物中
提取分离这些物质相比较,具有如下特
点:
1.提高产率
– 使用高产稳定的植物细胞进行发酵,可明显提高天然
产物的产率。
2.缩短周期
3.易于管理,减轻劳动强度
4.提高产品质量
– 然而,植物细胞与微生物相比,存在对剪
切力敏感和发酵周期长的缺点,由此引起的
一系列问题有待研究解决。
三、植物细胞发酵产酶的工艺条件控制
1.植物细胞生长和发酵所使用的培养基
2.温度和 pH值
3.通风与搅拌
4。前体的添加
5.刺激剂的应用
四、动物细胞发酵
? 动物细胞可以产生各种有较高价值的物质。
特别是激素、疫苗、单克隆抗体和酶等各种
动物功能蛋白质,通过动物细胞培养和发酵
得到的动物功能蛋白主要有如下几种:
1,疫苗:脊髓灰质炎 (小儿麻痹症 )疫苗,牲畜口蹄疫
疫苗,风疹疫苗,麻疹疫苗,腮腺炎疫苗,黄热
病疫苗,狂犬病疫苗,肝炎疫苗等。
2,激素:催乳激素,生长激素,前列腺素,促性腺
激素,淋巴细胞活素,白细胞间质素,干扰素,
胰岛素等。
3,酶:胶原酶,血纤维蛋白溶酶原活性剂等。
4,单克隆抗体:通过杂交瘤细胞等动物细胞培养生
产各种单克隆抗体。
? 动物细胞培养方法可分成两大类。
– 一类是来自血液、淋巴组织的细胞、肿癌细
胞和杂交瘤细胞等,可以采用悬浮培养。
– 另一类是存在于动物复杂的器官中的细胞,
与其周围的细胞互相依存,即有所谓“定位
依存’关系,这一类细胞不宜采用悬浮培养,
而必须依附在固体或半固体的表面才能生长
和进行正常的新陈代谢。定位依存关系的细
胞一般采用固定化细胞培养方式。
– 动物细胞的固定化宜采用吸附法或包理法。
本章结束
祝您学习愉快!