第七章 发酵过程的代谢控制
发酵过程控制是发酵的重要部分
控制难点：过程的不确定性和参数的非线性
同样的菌种，同样的培养基在不同工厂，不
同批次会得到不同的结果，可见发酵过程的
影响因素是复杂的，比如设备的差别、水的
差别、培养基灭菌的差别，菌种保藏时间的
长短，发酵过程的细微差别都会引起微生物
代谢的不同。了解和掌握分析发酵过程的一
般方法对于控制代谢是十分必要的
第一节 发酵过程工艺控制的
目的、研究的方法和层次
一 发酵过程的种类
分批培养
补料分批培养
半连续培养
连续培养
1,分批发酵
简单的过程，培养基中接入菌种以后，
没有物料的加入和取出，除了空气的
通入和排气。整个过程中菌的浓度、
营养成分的浓度和产物浓度等参数都
随时间变化。
分批培养中微生物的生长
迟滞期 对数生长期 稳 定 期 死亡期
微生物生长分为：迟滞期、对数生长期、
稳定期和死亡期
在迟滞期，菌体没有分裂只有生长，因
为当菌种接种入一个新的环境，细胞内
的核酸、酶等稀释，这时细胞不能分裂。
当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达到
一定程度，细胞开始分裂，这时细胞生长很
快，比生长速率几近常数。这个时期称为对
数生长期
随着细胞生长，培养液中的营养物
减少，废物积累，导致细胞生长速
率下降，进入减速期和稳定期。最
后当细胞死亡速率大于生成速率，
进入死亡期
对于初级代谢产物，在对数生长期初
期就开始合成并积累，而次级代谢产
物则在对数生长期后期和稳定期大量
合成。
分批培养的优缺点
优点 操作简单，周期短，染菌机会少，
生产过程和产品质量容易掌握
缺点 产率低，不适于测定动力学数据
2、补料分批培养
在分批培养过程中补入新鲜的料液，
以克服营养不足而导致的发酵过早结
束的缺点。
在此过程中只有料液的加入没有料液
的取出，所以发酵结束时发酵液体积
比发酵开始时有所增加。在工厂的实
际生产中采用这种方法很多。
补料分批培养的优缺点
优点 在这样一种系统中可以维持低的
基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；
可以通过补料控制达到最佳的生长和产物
合成条件；还可以利用计算机控制合理的
补料速率，稳定最佳生产工艺。
缺点 由于没有物料取出，产物的积累最
终导致比生产速率的下降。由于有物料的
加入增加了染菌机会
3、半连续培养
在补料分批培养的基础上间歇放掉
部分发酵液（带放）称为半连续培
养。某些品种采取这种方式，如四
环素发酵
优点 放掉部分发酵液，再补入部分
料液，使代谢有害物得以稀释有利于
产物合成，提高了总产量。
缺点 代谢产生的前体物被稀释，提
取的总体积增大
4、连续培养
发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出
等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持
恒定。
达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产
物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。
连续培养的优缺点
优点 控制稀释速率可以使发酵过程最优
化。发酵周期长，得到高的产量。由于 μ
＝ D，通过改变稀释速率可以比较容易的
研究菌生长的动力学
缺点 菌种不稳定的话，长期连续培养会
引起菌种退化，降低产量。长时间补料染
菌机会大大增加。
二 发酵过程工艺控制的目的
有一个好的菌种以后要有一个配合菌
种生长的最佳条件，使菌种的潜能发
挥出来
目标是得到最大的比生产速率和最大
的生产率
发挥菌种的最大生产潜力考虑之点
?菌种本身的代谢特点 生长速率、呼吸
强度、营养要求（酶系统）、代谢速率
?菌代谢与环境的相关性 温度,pH、
渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力
等
微生物代谢是一个复杂的系统，它的
代谢呈网络形式，比如糖代谢产生的
中间物可能用作合成菌体的前体，可
能用作合成产物的前体，也可能合成
副产物，而这些前体有可能流向不同
的反应方向，环境条件的差异会引发
代谢朝不同的方向进行。
微生物的生长与产物合成有密切相
关性，不仅表现在菌体量的大小影
响产物量的多少，而且菌体生长正
常与否，即前期的代谢直接影响中
后期代谢的正常与否。特别是对于
次级代谢产物的合成更具有复杂性
因此对发酵过程的了解不能机械的，
割裂的去认识，而要从细胞代谢水平
和反应工程水平全面的认识
发酵过程受到多因素又相互交叉的影响
如菌本身的遗传特性、物质运输、能量
平衡、工程因素、环境因素等等。因此
发酵过程的控制具有不确定性和复杂性。
为了全面的认识发酵过程，本章首
先要告诉大家分析发酵过程的基本方面，
在此基础上再举一些例子，说明如何综
合分析发酵过程及进行优化放大。
三 发酵过程研究的方法和层次
1、研究方法
单因子实验,对实验中要考察的因子逐个
进行试验，寻找每个因子的最佳条件。一
般用摇瓶做实验
优点 一次可以进行多种条件的实验，可
以在较快时间内得到的结果。
缺点 如果考察的条件多，实验时间会
比较长
各因子之间可能会产生交互作用，影响的
结果准确性
数理统计学方法,运用统计学方法设计实验
和分析实验结果，得到最佳的实验条件。如
正交设计、均匀设计、响应面设计。
优点 同时进行多因子试验。用少量的实
验，经过数理分析得到单因子实验同样的结
果，甚至更准确，大大提高了实验效率。
但对于生物学实验要求准确性高，因为
实验的最佳条件是经过统计学方法算出来的，
如果实验中存在较大的误差就会得出错误的
结果。
2、研究的层次
初级层次的研究,
一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目
的菌株生长和代谢的一般条件，如培养
基的组成、最适温度、最适 pH等要求。
摇瓶研究的优点是工作量大，可以一次
试验几十种甚至几百种条件，对于菌种
培养条件的优化有较高的效率。
代谢及工程参数层次研究,
一般在小型反应器规模进行试验。在摇瓶
试验的基础上，考察溶氧、搅拌等摇瓶上
无法考察的参数，以及在反应器中微生物
对各种营养成分的利用速率、生长速率、
产物合成速率及其它一些发酵过程参数的
变化，找出过程控制的最佳条件和方式。
由于罐发酵中全程参数的是连续的，所以
得到的代谢情况比较可信。
我们学院的国家生物工程中心创制的全参
数发酵罐除了装备有常规发酵罐的温度、
溶氧,pH电极，得到发酵全过程的这些参
数外，还有罐体称重，补料计量装置和尾
气采集分析系统，更重要的是，有一套独
特的数据处理软件，软件的开发是长期科
研成果的结晶，可以得到 14个发酵过程参
数，并且可以输入和绘制人工测定的参数，
对发酵过程的分析起到了重要的作用
鸟苷发酵过程曲线
生产规模放大,
在大型发酵罐规模进行试验。将小型发
酵罐的优化条件在大型反应器上得以实
现,达到产业化的实现。
一般来说微生物在不同体积的反应器中
的生长速率是不同的，原因可能是，罐
的深度造成氧的溶解度、空气停留时间
和分布不同，剪切力不同，灭菌时营养
成分破坏程度不同所致。
第二节 发酵过程的中间分析
发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，
它显示了发酵过程中微生物的主要代谢
变化。因为微生物个体极微小，肉眼无
法看见，要了解它的代谢状况，只能从
分析一些参数来判断，所以说中间分析
是生产控制的眼睛。
这些代谢参数又称为状态参数，因为它
们反映发酵过程中菌的生理代谢状况，
如 pH，溶氧，尾气氧，尾气二氧化碳，
粘度，菌浓度等
代谢参数按性质分可分三类：
物理参数,温度、搅拌转速、空气压力、
空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧
（二氧化碳）浓度等
化学参数,基质浓度（包括糖、氮、
磷）,pH、产物浓度、、核酸量等
生物参数,菌丝形态、菌浓度、菌体比
生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、
关键酶活力等
从检测手段分可分为：直接参数、间接
参数
直接参数,通过仪器或其它分析手段可
以测得的参数，如温度,pH、残糖等
间接参数,将直接参数经过计算得到的
参数，如摄氧率,KLa等
直接参数又可分为在线检测参数和离线
检测参数
在线检测参数 指不经取样直接从发酵罐
上安装的仪表上得到的参数，如温度、
pH、搅拌转速；
离线检测参数 指取出样后测定得到的参
数，如残糖,NH2-N、菌体浓度。
一 发酵过程主要分析的项目
目前发酵过程主要分析项目如下
1,pH
pH与微生物的生命活动密切相关 —
— 酶催化活性
pH的变化又是微生物代谢状况的综
合反映 ——基质代谢、产物合成、细
胞状态、营养状况、供氧状况
2、排气氧、排气 CO2和呼吸熵
排气氧的浓度表征了进气的氧被微生物利用
以后还剩余的氧，因此排气氧的大小反映了
菌生长的活性，通过计算可以求得摄氧率
（ OUR）。
排气二氧化碳反映了微生物代谢的情况，因
为微生物摄入的氧并不是全部变成二氧化碳
的，有的进入代谢中间物分子，进入细胞或
产物，因此消耗的氧并不等于排出的二氧化
碳，此外，含氧的有机物降解后会产生二氧
化碳，使排气二氧化碳大于消耗的氧。
RQ值随微生物菌种的不同，培养基成分的
不同，生长阶段的不同而不同。测定 RQ值
一方面可以了解微生物代谢的状况，另一
方面也可以指导补料
CER表示单位体积发酵液单位时间内释
放的二氧化碳的量
呼吸熵＝
OUR
CE RRQ ?
呼吸熵反映了氧的利用状况
一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产
物，有意使菌体处于半饥饿状态，在营养限
制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率
在较高水平。对于这种工艺，后期的补料控
制是关键。过程中发现，在补糖开始时，不
但 CER,OUR大幅度提高，连 RQ也提高约
10％，表明通过补糖不但提供了更多的碳
源，而且随着体系内葡萄糖浓度提高，糖代
谢相关酶活力也提高，产能增加。
3、糖含量
微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。
糖的消耗 反映产生菌的生长繁殖情况
反映产物合成的活力
菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通
过糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控
制补糖来调节 pH，促进产物合成，不致于盲目
补糖，造成发酵不正常。
糖含量测定包括总糖和还原糖。
总糖 指发酵液中残留的各种糖的总量。如发
酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖。
还原糖 指含有自由醛基的单糖，通常指的是
葡萄糖。
4、氨基氮和氨氮
氨基氮 指有机氮中的氮（ NH2-N），单位是
mg/100ml。如氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼
粉中都有有机氮。
氨氮 指无机氨中的氮（ NH3-N）。
氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成
情况。
但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成
受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。
通过氨基氮和氨氮的分析可控制发酵过程，适时采
取补氨措施。
发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提
取过程。
5、磷含量
微生物体内磷含量较高，培养基中以
磷酸盐为主，发酵中用来计算磷含量
的是磷酸根。
磷是核酸的组成部分，是高能化合物
ATP的组成部分，磷还能促进糖代谢。
因此磷在培养基中具有非常重要的作
用，如果磷缺乏就要采取补磷措施。
6、菌浓度和菌形态
菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。
菌形态 显微镜观察
菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过
程中菌体量的变化，一般前期菌浓增长很
快，中期菌浓基本恒定。补料会引起菌浓
的波动，这也是衡量补料量适合与否的一
个参数。
菌浓测定方法
测粘度
压缩体积法（离心）
静置沉降体积法
光密度测定法 OD600~660 适合于细
菌、酵母
7、产物浓度
在培养过程中，产生菌的合成能力和产
物积累情况都要通过产物量的测定来了
解，产物浓度直接反映了生产的状况,
是发酵控制的重要参数。而且通过计算
还可以得到生产速率和比生产速率，从
而分析发酵条件如补料,pH对产物形
成的影响。
二 产物量的测定
（一） 产物量的特殊表示法
1、抗生素效价的表示
抗生素效价表示抗生素的有效成分的
多少，效价大小用单位（ U）来表示
效价表示方法：重量折算法
重量单位
类似重量单位
特殊单位
重量折算单位：以最低抑菌浓度为
一个单位，如青霉素 0.6微克＝ 1U
重量单位：规定某些抗生素活性部
分 1μg=1u 如链霉素、卡那霉素、
红霉素等定义活性部分 1μg＝ 1u
类似重量单位：规定抗生素的某种盐
1mg=1000u如金霉素、四环素的盐酸
盐定一为 1μg＝ 1u
特殊单位：药检所制定某些抗生素的单
位
制霉菌素 1mg=3700u
多粘菌素 B 1mg=10000u
2、酶活力的表示法
酶活力用单位来表示。由于酶通常不
是很纯，不能用重量来表示酶的量。
同一种酶用不同的方法测定会有不同
的酶活单位，容易造成混乱，为此国
际上作了统一规定，规定在 250C下，
以最适的底物浓度，最适的缓冲液离
子强度，以及最适的 pH诸条件下，每
分钟能转化一微克分子底物的酶定量
为一个活性单位。
（二） 产物量的测定
1、化学法
（ 1）滴定法
产物能使一定指示剂变色来指示反应终点的可
用滴定法
如青霉素在碱性条件下加入过量的 I2，反应生
成青霉噻唑酸碘，用 Na2S2O3滴定多余的碘，
可计算出青霉素的单位
计算青霉素效价青霉噻唑酸碘青霉素 滴定多余过量 ????? ?????? ?? ? 23222,IOSNAIOH
柠檬酸可以用 NaOH滴定来计算柠檬酸产量
（ 2）比色法
产物经一定化学反应产生颜色，且颜色深浅与
产物浓度成正比，可以用比色法测定。
蓝色麦芽酚链霉素 加热，－ ? ?????? ?? ?? 22,FeOHOH
淀粉酶活力测定：在 1%可溶性淀粉溶液中加
入淀粉酶，所释放出的麦芽糖与生色试剂（ 3，
5-二硝基水杨酸与酒石酸钾钠的碱溶液）产生
颜色，它在 540nm处所得吸光度跟淀粉酶活
力成正比。
（ 3）测压法
产物特定反应放出或摄入气体，使系统
有压力变化，可以通过测定压力变化得知产
物量。
2、物理法
许多酶、抗生素都有不对称碳原子，
具有旋光性，因此可以通过测定旋光度
来测定酶或抗生素的含量。
谷氨酸 ?????? ?? 谷氨酸脱氢酶 ?????? ?? 谷氨酸脱氢酶 γ－氨基丁酸＋ CO
2
化学和物理方法优点：快速、方便，经常用
于过程分析
缺点产品中存在的杂质会干扰测定结果，因
此抗生素成品的测定用生物法测定。
适用于抗生素效价的测定
生物法以抗生素的杀菌能力为衡量效价的
标准,其原理恰好与临床应用的要求相一致，
而且此法灵敏度高，需用的检品量较小，这
是其它方法不能比的。但此法得到结果比较
慢，需经过 16~18小时培养。生物法常用于
发酵终了产品效价的测定。
3、生物法
常用的生物法测定抗生素，采用杯碟法
“杯”是放被测抗生素的不锈钢小管，小
管内径为 6mm，高 10mm的圆筒形管子，
管子的重量尽可能相等。碟是摊布培养基
的玻璃培养皿。
操作方法是：将已灭菌的琼脂培养基加热
到完全融化，倒在培养皿内，每碟 15ml
（下层），待其凝固。此外，将融化的培
养基冷却到 500C左右混入试验菌，将混有
菌的培养基 5 ml加到已凝固的培养基上待
凝固（上层）。
在培养基表面垂直放上小杯，在杯中加入
待检样品，加满后在 370C培养 16~18小时。
在培养中,一方面试验菌开始生长另一方
面抗生素呈球面扩散，离杯越近，抗生素
浓度越大，离杯越远抗生素浓度越小。随
着抗生素浓度减小，有一条最低抑菌浓度
带，在带范围内，菌不能生长，而呈透明
的圆圈，这就叫“抑菌圈”。抗生素浓度
越高，抑菌圈越大，
r,抑菌圈的半径 (毫米）
M：抗生素在管中的量
（单位）
C：最低抑菌浓度（单
位 /毫升）
H：培养基的厚度（毫
米）
L：管子的高度（毫米）
D：抗生素的扩散系数
（毫米 /小时）
T：细菌生长到肉眼所
用的时间
（小时）
抗生素浓度与抑菌圈的半径成一定数
学关系
logM=(1/9.21DT)r2+log(C.4πDTH)
抗生素的总量的对数值与抑菌圈半径
的平方呈正比。此外还受 C,H,D、
T的影响
但是 C,H,D,T是无法测量的，在
实际计算中要设法消去
一般的消去方法有
?二剂量法
?标准曲线法
KmMmM ??''
两剂量法：
标准品低单位
总量,m
抑菌圈半径 SL
标准品高单
位
总量,M
抑菌圈半径：
SH
样品高单位
总量,M’
抑菌圈半径 UH
样品低单位
总量,m’
抑菌圈半径,UL
)4l o g ()21.9 1(l o g 2 D T HCSDTM H ????
)4l o g ()21.9 1('l o g 2 D T HCUDTM H ????
)4l o g ()21.9 1('l o g 2 D T HCSDTm L ????
)4lo g ()21.9 1(lo g 2 D T HCUDTm L ????
??MM '
? ?? ? K
USUS
SUSU
LLHH
LLHH lo glo g
2222
2222
???
?????
已知：
令：
得出,? ?
? ? KUSUS SUSU LLHH LLHH lo glo g ??? ?????→
KWV lo glo g ??→
logM’—logM＝ D T HCDT U H ?4.lo g)21.9 1( 2 ?
_
D T HCDT S H ?4.lo g)21.9 1( 2 ?
logM’/M=
同理 logm’—logm=logm’/m=
)(21.9 1 22 SU HHDT ?=logθ
=logθ)(
21.9
1 22
LL SUDT ?
2logθ= )(
21.9
1 2222
LLHH SUSUDT ???
)( )(lo glo g 2222
2222
LHLH
LLHH SSUU SUSUK ??? ?????
logM’—logm’=logM’/m’= )(
21.9
1 22 UU
LHDT ?
=logK
logM—logm=logM/m= )(
21.9
1 22
LH SSDT ?
=logK
2logK= )(
21.9
1 2222
LHLH SSUUDT ???
)(
)(
l o g
l o g
2222
2222
LHLH
LLHH
SSUU
SUSU
K ???
?????
标准曲线法
优点：在一个碟子上
可以同时做两个样品
的效价，当要做的样
品量大时，采取标准
曲线法可以提高效率。
假设选用的浓度为,3U,4U，
5U,6U,7U
中心点是 5U
1
1
2
2
每个浓度做三个碟
子。
5U为中心点，每个
碟子中有 3个杯中加
中心点浓度，其余 3
个加其它浓度。测
得抑菌圈后，将浓
度和抑菌圈平均直
径做标准曲线。
logM
r
管碟法影响因素的讨论：
)4l o g ()21.9 1(l o g 2 D T HCrDTM ????
斜率小 D,T大,误差小
截距小 C,D,T,H小，误差
小
logM
r
logM1
r1r1r1
?培养基厚度
H越小，其它条件相同时 r越大。
影响 H的因素：培养基的厚度
?细菌生长到肉眼所需的时间 T越大在其
它条件相同时,r越大
影响 T的因素：菌体本身，及影响菌体生
长的条件如：接种量，培养温度、及营养
环境
其它影响因素：上层铺得平整、菌液加
入时的温度、钢圈的放置、滴液
发酵过程控制是发酵的重要部分
控制难点：过程的不确定性和参数的非线性
同样的菌种，同样的培养基在不同工厂，不
同批次会得到不同的结果，可见发酵过程的
影响因素是复杂的，比如设备的差别、水的
差别、培养基灭菌的差别，菌种保藏时间的
长短，发酵过程的细微差别都会引起微生物
代谢的不同。了解和掌握分析发酵过程的一
般方法对于控制代谢是十分必要的
第一节 发酵过程工艺控制的
目的、研究的方法和层次
一 发酵过程的种类
分批培养
补料分批培养
半连续培养
连续培养
1,分批发酵
简单的过程，培养基中接入菌种以后，
没有物料的加入和取出，除了空气的
通入和排气。整个过程中菌的浓度、
营养成分的浓度和产物浓度等参数都
随时间变化。
分批培养中微生物的生长
迟滞期 对数生长期 稳 定 期 死亡期
微生物生长分为：迟滞期、对数生长期、
稳定期和死亡期
在迟滞期，菌体没有分裂只有生长，因
为当菌种接种入一个新的环境，细胞内
的核酸、酶等稀释，这时细胞不能分裂。
当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达到
一定程度，细胞开始分裂，这时细胞生长很
快，比生长速率几近常数。这个时期称为对
数生长期
随着细胞生长，培养液中的营养物
减少，废物积累，导致细胞生长速
率下降，进入减速期和稳定期。最
后当细胞死亡速率大于生成速率，
进入死亡期
对于初级代谢产物，在对数生长期初
期就开始合成并积累，而次级代谢产
物则在对数生长期后期和稳定期大量
合成。
分批培养的优缺点
优点 操作简单，周期短，染菌机会少，
生产过程和产品质量容易掌握
缺点 产率低，不适于测定动力学数据
2、补料分批培养
在分批培养过程中补入新鲜的料液，
以克服营养不足而导致的发酵过早结
束的缺点。
在此过程中只有料液的加入没有料液
的取出，所以发酵结束时发酵液体积
比发酵开始时有所增加。在工厂的实
际生产中采用这种方法很多。
补料分批培养的优缺点
优点 在这样一种系统中可以维持低的
基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；
可以通过补料控制达到最佳的生长和产物
合成条件；还可以利用计算机控制合理的
补料速率，稳定最佳生产工艺。
缺点 由于没有物料取出，产物的积累最
终导致比生产速率的下降。由于有物料的
加入增加了染菌机会
3、半连续培养
在补料分批培养的基础上间歇放掉
部分发酵液（带放）称为半连续培
养。某些品种采取这种方式，如四
环素发酵
优点 放掉部分发酵液，再补入部分
料液，使代谢有害物得以稀释有利于
产物合成，提高了总产量。
缺点 代谢产生的前体物被稀释，提
取的总体积增大
4、连续培养
发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出
等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持
恒定。
达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产
物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。
连续培养的优缺点
优点 控制稀释速率可以使发酵过程最优
化。发酵周期长，得到高的产量。由于 μ
＝ D，通过改变稀释速率可以比较容易的
研究菌生长的动力学
缺点 菌种不稳定的话，长期连续培养会
引起菌种退化，降低产量。长时间补料染
菌机会大大增加。
二 发酵过程工艺控制的目的
有一个好的菌种以后要有一个配合菌
种生长的最佳条件，使菌种的潜能发
挥出来
目标是得到最大的比生产速率和最大
的生产率
发挥菌种的最大生产潜力考虑之点
?菌种本身的代谢特点 生长速率、呼吸
强度、营养要求（酶系统）、代谢速率
?菌代谢与环境的相关性 温度,pH、
渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力
等
微生物代谢是一个复杂的系统，它的
代谢呈网络形式，比如糖代谢产生的
中间物可能用作合成菌体的前体，可
能用作合成产物的前体，也可能合成
副产物，而这些前体有可能流向不同
的反应方向，环境条件的差异会引发
代谢朝不同的方向进行。
微生物的生长与产物合成有密切相
关性，不仅表现在菌体量的大小影
响产物量的多少，而且菌体生长正
常与否，即前期的代谢直接影响中
后期代谢的正常与否。特别是对于
次级代谢产物的合成更具有复杂性
因此对发酵过程的了解不能机械的，
割裂的去认识，而要从细胞代谢水平
和反应工程水平全面的认识
发酵过程受到多因素又相互交叉的影响
如菌本身的遗传特性、物质运输、能量
平衡、工程因素、环境因素等等。因此
发酵过程的控制具有不确定性和复杂性。
为了全面的认识发酵过程，本章首
先要告诉大家分析发酵过程的基本方面，
在此基础上再举一些例子，说明如何综
合分析发酵过程及进行优化放大。
三 发酵过程研究的方法和层次
1、研究方法
单因子实验,对实验中要考察的因子逐个
进行试验，寻找每个因子的最佳条件。一
般用摇瓶做实验
优点 一次可以进行多种条件的实验，可
以在较快时间内得到的结果。
缺点 如果考察的条件多，实验时间会
比较长
各因子之间可能会产生交互作用，影响的
结果准确性
数理统计学方法,运用统计学方法设计实验
和分析实验结果，得到最佳的实验条件。如
正交设计、均匀设计、响应面设计。
优点 同时进行多因子试验。用少量的实
验，经过数理分析得到单因子实验同样的结
果，甚至更准确，大大提高了实验效率。
但对于生物学实验要求准确性高，因为
实验的最佳条件是经过统计学方法算出来的，
如果实验中存在较大的误差就会得出错误的
结果。
2、研究的层次
初级层次的研究,
一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目
的菌株生长和代谢的一般条件，如培养
基的组成、最适温度、最适 pH等要求。
摇瓶研究的优点是工作量大，可以一次
试验几十种甚至几百种条件，对于菌种
培养条件的优化有较高的效率。
代谢及工程参数层次研究,
一般在小型反应器规模进行试验。在摇瓶
试验的基础上，考察溶氧、搅拌等摇瓶上
无法考察的参数，以及在反应器中微生物
对各种营养成分的利用速率、生长速率、
产物合成速率及其它一些发酵过程参数的
变化，找出过程控制的最佳条件和方式。
由于罐发酵中全程参数的是连续的，所以
得到的代谢情况比较可信。
我们学院的国家生物工程中心创制的全参
数发酵罐除了装备有常规发酵罐的温度、
溶氧,pH电极，得到发酵全过程的这些参
数外，还有罐体称重，补料计量装置和尾
气采集分析系统，更重要的是，有一套独
特的数据处理软件，软件的开发是长期科
研成果的结晶，可以得到 14个发酵过程参
数，并且可以输入和绘制人工测定的参数，
对发酵过程的分析起到了重要的作用
鸟苷发酵过程曲线
生产规模放大,
在大型发酵罐规模进行试验。将小型发
酵罐的优化条件在大型反应器上得以实
现,达到产业化的实现。
一般来说微生物在不同体积的反应器中
的生长速率是不同的，原因可能是，罐
的深度造成氧的溶解度、空气停留时间
和分布不同，剪切力不同，灭菌时营养
成分破坏程度不同所致。
第二节 发酵过程的中间分析
发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，
它显示了发酵过程中微生物的主要代谢
变化。因为微生物个体极微小，肉眼无
法看见，要了解它的代谢状况，只能从
分析一些参数来判断，所以说中间分析
是生产控制的眼睛。
这些代谢参数又称为状态参数，因为它
们反映发酵过程中菌的生理代谢状况，
如 pH，溶氧，尾气氧，尾气二氧化碳，
粘度，菌浓度等
代谢参数按性质分可分三类：
物理参数,温度、搅拌转速、空气压力、
空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧
（二氧化碳）浓度等
化学参数,基质浓度（包括糖、氮、
磷）,pH、产物浓度、、核酸量等
生物参数,菌丝形态、菌浓度、菌体比
生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、
关键酶活力等
从检测手段分可分为：直接参数、间接
参数
直接参数,通过仪器或其它分析手段可
以测得的参数，如温度,pH、残糖等
间接参数,将直接参数经过计算得到的
参数，如摄氧率,KLa等
直接参数又可分为在线检测参数和离线
检测参数
在线检测参数 指不经取样直接从发酵罐
上安装的仪表上得到的参数，如温度、
pH、搅拌转速；
离线检测参数 指取出样后测定得到的参
数，如残糖,NH2-N、菌体浓度。
一 发酵过程主要分析的项目
目前发酵过程主要分析项目如下
1,pH
pH与微生物的生命活动密切相关 —
— 酶催化活性
pH的变化又是微生物代谢状况的综
合反映 ——基质代谢、产物合成、细
胞状态、营养状况、供氧状况
2、排气氧、排气 CO2和呼吸熵
排气氧的浓度表征了进气的氧被微生物利用
以后还剩余的氧，因此排气氧的大小反映了
菌生长的活性，通过计算可以求得摄氧率
（ OUR）。
排气二氧化碳反映了微生物代谢的情况，因
为微生物摄入的氧并不是全部变成二氧化碳
的，有的进入代谢中间物分子，进入细胞或
产物，因此消耗的氧并不等于排出的二氧化
碳，此外，含氧的有机物降解后会产生二氧
化碳，使排气二氧化碳大于消耗的氧。
RQ值随微生物菌种的不同，培养基成分的
不同，生长阶段的不同而不同。测定 RQ值
一方面可以了解微生物代谢的状况，另一
方面也可以指导补料
CER表示单位体积发酵液单位时间内释
放的二氧化碳的量
呼吸熵＝
OUR
CE RRQ ?
呼吸熵反映了氧的利用状况
一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产
物，有意使菌体处于半饥饿状态，在营养限
制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率
在较高水平。对于这种工艺，后期的补料控
制是关键。过程中发现，在补糖开始时，不
但 CER,OUR大幅度提高，连 RQ也提高约
10％，表明通过补糖不但提供了更多的碳
源，而且随着体系内葡萄糖浓度提高，糖代
谢相关酶活力也提高，产能增加。
3、糖含量
微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。
糖的消耗 反映产生菌的生长繁殖情况
反映产物合成的活力
菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通
过糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控
制补糖来调节 pH，促进产物合成，不致于盲目
补糖，造成发酵不正常。
糖含量测定包括总糖和还原糖。
总糖 指发酵液中残留的各种糖的总量。如发
酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖。
还原糖 指含有自由醛基的单糖，通常指的是
葡萄糖。
4、氨基氮和氨氮
氨基氮 指有机氮中的氮（ NH2-N），单位是
mg/100ml。如氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼
粉中都有有机氮。
氨氮 指无机氨中的氮（ NH3-N）。
氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成
情况。
但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成
受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。
通过氨基氮和氨氮的分析可控制发酵过程，适时采
取补氨措施。
发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提
取过程。
5、磷含量
微生物体内磷含量较高，培养基中以
磷酸盐为主，发酵中用来计算磷含量
的是磷酸根。
磷是核酸的组成部分，是高能化合物
ATP的组成部分，磷还能促进糖代谢。
因此磷在培养基中具有非常重要的作
用，如果磷缺乏就要采取补磷措施。
6、菌浓度和菌形态
菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。
菌形态 显微镜观察
菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过
程中菌体量的变化，一般前期菌浓增长很
快，中期菌浓基本恒定。补料会引起菌浓
的波动，这也是衡量补料量适合与否的一
个参数。
菌浓测定方法
测粘度
压缩体积法（离心）
静置沉降体积法
光密度测定法 OD600~660 适合于细
菌、酵母
7、产物浓度
在培养过程中，产生菌的合成能力和产
物积累情况都要通过产物量的测定来了
解，产物浓度直接反映了生产的状况,
是发酵控制的重要参数。而且通过计算
还可以得到生产速率和比生产速率，从
而分析发酵条件如补料,pH对产物形
成的影响。
二 产物量的测定
（一） 产物量的特殊表示法
1、抗生素效价的表示
抗生素效价表示抗生素的有效成分的
多少，效价大小用单位（ U）来表示
效价表示方法：重量折算法
重量单位
类似重量单位
特殊单位
重量折算单位：以最低抑菌浓度为
一个单位，如青霉素 0.6微克＝ 1U
重量单位：规定某些抗生素活性部
分 1μg=1u 如链霉素、卡那霉素、
红霉素等定义活性部分 1μg＝ 1u
类似重量单位：规定抗生素的某种盐
1mg=1000u如金霉素、四环素的盐酸
盐定一为 1μg＝ 1u
特殊单位：药检所制定某些抗生素的单
位
制霉菌素 1mg=3700u
多粘菌素 B 1mg=10000u
2、酶活力的表示法
酶活力用单位来表示。由于酶通常不
是很纯，不能用重量来表示酶的量。
同一种酶用不同的方法测定会有不同
的酶活单位，容易造成混乱，为此国
际上作了统一规定，规定在 250C下，
以最适的底物浓度，最适的缓冲液离
子强度，以及最适的 pH诸条件下，每
分钟能转化一微克分子底物的酶定量
为一个活性单位。
（二） 产物量的测定
1、化学法
（ 1）滴定法
产物能使一定指示剂变色来指示反应终点的可
用滴定法
如青霉素在碱性条件下加入过量的 I2，反应生
成青霉噻唑酸碘，用 Na2S2O3滴定多余的碘，
可计算出青霉素的单位
计算青霉素效价青霉噻唑酸碘青霉素 滴定多余过量 ????? ?????? ?? ? 23222,IOSNAIOH
柠檬酸可以用 NaOH滴定来计算柠檬酸产量
（ 2）比色法
产物经一定化学反应产生颜色，且颜色深浅与
产物浓度成正比，可以用比色法测定。
蓝色麦芽酚链霉素 加热，－ ? ?????? ?? ?? 22,FeOHOH
淀粉酶活力测定：在 1%可溶性淀粉溶液中加
入淀粉酶，所释放出的麦芽糖与生色试剂（ 3，
5-二硝基水杨酸与酒石酸钾钠的碱溶液）产生
颜色，它在 540nm处所得吸光度跟淀粉酶活
力成正比。
（ 3）测压法
产物特定反应放出或摄入气体，使系统
有压力变化，可以通过测定压力变化得知产
物量。
2、物理法
许多酶、抗生素都有不对称碳原子，
具有旋光性，因此可以通过测定旋光度
来测定酶或抗生素的含量。
谷氨酸 ?????? ?? 谷氨酸脱氢酶 ?????? ?? 谷氨酸脱氢酶 γ－氨基丁酸＋ CO
2
化学和物理方法优点：快速、方便，经常用
于过程分析
缺点产品中存在的杂质会干扰测定结果，因
此抗生素成品的测定用生物法测定。
适用于抗生素效价的测定
生物法以抗生素的杀菌能力为衡量效价的
标准,其原理恰好与临床应用的要求相一致，
而且此法灵敏度高，需用的检品量较小，这
是其它方法不能比的。但此法得到结果比较
慢，需经过 16~18小时培养。生物法常用于
发酵终了产品效价的测定。
3、生物法
常用的生物法测定抗生素，采用杯碟法
“杯”是放被测抗生素的不锈钢小管，小
管内径为 6mm，高 10mm的圆筒形管子，
管子的重量尽可能相等。碟是摊布培养基
的玻璃培养皿。
操作方法是：将已灭菌的琼脂培养基加热
到完全融化，倒在培养皿内，每碟 15ml
（下层），待其凝固。此外，将融化的培
养基冷却到 500C左右混入试验菌，将混有
菌的培养基 5 ml加到已凝固的培养基上待
凝固（上层）。
在培养基表面垂直放上小杯，在杯中加入
待检样品，加满后在 370C培养 16~18小时。
在培养中,一方面试验菌开始生长另一方
面抗生素呈球面扩散，离杯越近，抗生素
浓度越大，离杯越远抗生素浓度越小。随
着抗生素浓度减小，有一条最低抑菌浓度
带，在带范围内，菌不能生长，而呈透明
的圆圈，这就叫“抑菌圈”。抗生素浓度
越高，抑菌圈越大，
r,抑菌圈的半径 (毫米）
M：抗生素在管中的量
（单位）
C：最低抑菌浓度（单
位 /毫升）
H：培养基的厚度（毫
米）
L：管子的高度（毫米）
D：抗生素的扩散系数
（毫米 /小时）
T：细菌生长到肉眼所
用的时间
（小时）
抗生素浓度与抑菌圈的半径成一定数
学关系
logM=(1/9.21DT)r2+log(C.4πDTH)
抗生素的总量的对数值与抑菌圈半径
的平方呈正比。此外还受 C,H,D、
T的影响
但是 C,H,D,T是无法测量的，在
实际计算中要设法消去
一般的消去方法有
?二剂量法
?标准曲线法
KmMmM ??''
两剂量法：
标准品低单位
总量,m
抑菌圈半径 SL
标准品高单
位
总量,M
抑菌圈半径：
SH
样品高单位
总量,M’
抑菌圈半径 UH
样品低单位
总量,m’
抑菌圈半径,UL
)4l o g ()21.9 1(l o g 2 D T HCSDTM H ????
)4l o g ()21.9 1('l o g 2 D T HCUDTM H ????
)4l o g ()21.9 1('l o g 2 D T HCSDTm L ????
)4lo g ()21.9 1(lo g 2 D T HCUDTm L ????
??MM '
? ?? ? K
USUS
SUSU
LLHH
LLHH lo glo g
2222
2222
???
?????
已知：
令：
得出,? ?
? ? KUSUS SUSU LLHH LLHH lo glo g ??? ?????→
KWV lo glo g ??→
logM’—logM＝ D T HCDT U H ?4.lo g)21.9 1( 2 ?
_
D T HCDT S H ?4.lo g)21.9 1( 2 ?
logM’/M=
同理 logm’—logm=logm’/m=
)(21.9 1 22 SU HHDT ?=logθ
=logθ)(
21.9
1 22
LL SUDT ?
2logθ= )(
21.9
1 2222
LLHH SUSUDT ???
)( )(lo glo g 2222
2222
LHLH
LLHH SSUU SUSUK ??? ?????
logM’—logm’=logM’/m’= )(
21.9
1 22 UU
LHDT ?
=logK
logM—logm=logM/m= )(
21.9
1 22
LH SSDT ?
=logK
2logK= )(
21.9
1 2222
LHLH SSUUDT ???
)(
)(
l o g
l o g
2222
2222
LHLH
LLHH
SSUU
SUSU
K ???
?????
标准曲线法
优点：在一个碟子上
可以同时做两个样品
的效价，当要做的样
品量大时，采取标准
曲线法可以提高效率。
假设选用的浓度为,3U,4U，
5U,6U,7U
中心点是 5U
1
1
2
2
每个浓度做三个碟
子。
5U为中心点，每个
碟子中有 3个杯中加
中心点浓度，其余 3
个加其它浓度。测
得抑菌圈后，将浓
度和抑菌圈平均直
径做标准曲线。
logM
r
管碟法影响因素的讨论：
)4l o g ()21.9 1(l o g 2 D T HCrDTM ????
斜率小 D,T大,误差小
截距小 C,D,T,H小，误差
小
logM
r
logM1
r1r1r1
?培养基厚度
H越小，其它条件相同时 r越大。
影响 H的因素：培养基的厚度
?细菌生长到肉眼所需的时间 T越大在其
它条件相同时,r越大
影响 T的因素：菌体本身，及影响菌体生
长的条件如：接种量，培养温度、及营养
环境
其它影响因素：上层铺得平整、菌液加
入时的温度、钢圈的放置、滴液
