第三节 微生物培养过程的参数检测
在线检测必须用专门的传感器（也叫电极或探头）
放入发酵系统，将发酵的一些信息传递出来，为发酵控
制提供依据。
黑箱 灰箱?? ?? 参数检测
检测仪器：气相色谱、高效液相、离子色谱、
双向电泳、毛细管电泳、红外光谱、基因测序仪等
检测代谢中间物，分析代谢流向,RNA检测
一 参数在线检测
由于微生物培养过程是纯培养过程，无菌
要求高，因此对传感器有特殊要求：
?插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽
灭菌（材料、数据）
?传感器结构不能存在灭菌不透的死角，
以防染菌（密封性好）
?传感器对测量参数要敏感，且能转换成
电信号。（响应快、灵敏）
?传感器性能要稳定，受气泡影响小。
带计算机数据采集与控制的生物反应系统
P188
原理：化学或物理信号 电信号
放大 记录显示仪
控制器（与设定参数比较）
发出调节信号 控制器动作
介绍几种常用的在线检测的传感器及其工
作原理
?pH电极
?溶氧电极
它们是基础电极，以它们为基础可以
制作各种离子电极和酶电极
（一） pH测量
pH值的测量在生物反应中普遍进行，对于
生物过程控制是一个非常重要的参数。
1,pH的定义
影响化学平衡的往往是活度，而不是浓度，
但对于稀溶液为了避免在氢离子活度很小
时表达方式上的麻烦
引进 pH=-lg[H+]
[H+]=0.00001时 用 pH5表示
2,pH测量方法
pH试纸曾经是一种广泛采用的方法
优点：方便，易操作
缺点：它主观性较强
质量差异，不同厂家不同批号的 pH试纸测出的
pH值会有较大的差别，有时甚至达 0.5~1。
对于一些要求较高的场合就适用
pH试纸
pH电极
（ 1） pH电极测量原理
pH电极实际上是由参比电极
与指示电极组成的一个自发电
池，该电池的表达式可写为：
参比电极 溶液 X 指示电极
该电池的参比电极的输出电位
恒定，指示电极的输出电位随
被测体系中氢离子活度而变化。
因此整个自发电池的电动势就
是被测体系中氢离子活度的函
数。
E[α]=E0- ln1/ =E0-2.303 pH
F
RT aH?
F
RT
式中 E0对某一给定电极为常数，是温度的函数，因此从
电位差计的 E值可测出 pH值。
甘汞电极（ a） 232型（ b） 217型
1－导线； 2－加液口； 3-KCl溶液； 4－素烧瓷芯； 5－铂丝； 6－
Hg； 7－ Hg2Cl2
一般的参比电极是甘汞电极。电极的外壳是玻璃管，里面套一根小
玻璃管，其顶部伸出电极引线，引线的下端浸没在汞中，汞的下端
有糊状甘汞，汞和甘汞用棉花堵住，只有离子才能通过，而汞和甘
汞不会漏失，小管和大管之间充满 KCl溶液，末端用多孔陶瓷渗入
到溶液中，实现电极引线与溶液间的电导通。
?
参
比
电
极
由此可见，甘汞电极是由金属汞及其难溶盐 ——
氯化亚汞以及含氯离子的电解质溶液组成。这种半
电池可表示为 Hg(L) Hg2Cl2(S) Cl-(L) 电极电位产
生于汞和甘汞的界面，其电极反应为：
2Cl-+2Hg Hg2Cl2+2e-
其电极电位为
εCl/HgCl,Hg=ε + ln1/α0,/ HgHgClCl
F
RT ?Cl
由此可见甘汞电极的电极电位只与氯化钾的活
度有关而不受被测溶液的酸碱度影响
（ 2）指示电极
对指示电极的电位值随被测溶液氢离子活度的变
化而变化。原则上讲，任何与氢离子可逆反应的
电极都可用来测定溶液的 pH。
?离子选择性电极的结构
离子选择性电极的结构
其中敏感性膜部分随组成
材料的不同而各有特色。
测定 pH值的玻璃电极的
敏感膜是厚度为 10－ 1～
10－ 3mm的玻璃薄膜，其
电阻为 50～ 500mΩ。
指示电极的关键是敏感膜
H+ H+
H+ H+ H+ H+
KCl溶液
待测溶液
浓度差引起电位差 —— 浓差电极
玻璃敏感膜
（ 3）膜电位
膜电位是由于膜两侧离子活度的差异而产生，故可
看作是一种浓差电位。玻璃电极在使用前必须先在
水中浸泡一段时间，玻璃膜表面吸收水分溶解，并
且其中的一价阳离子（如 Na+离子）与水中 H+离子
发生离子交换反应。
SiO-Na++H+ SiO-H++Na+
使膜表面形成以 SiO-H+为主要成分的水合硅胶层，
厚度约为 10-4~10-5mm
液
试
水
合
硅
胶
层
干
玻
璃
层
水
合
硅
胶
层
内
参
比
溶
液
α1 α1’ α2 ’ α2
ε1— --△ ε--— ε2
以 α1,α2分别表示试液
内与内参比溶液中 H+离
子活度,α1’,α2’分别表
示外侧与内侧硅胶层表
面 H+离子活度，
由于水合硅胶层表面与
内（内参比溶液）、外
（试液）溶液中的 H+离
子从活度大的一方向小
的一方迁移，使玻璃膜
的外、内侧分别产生相
界电位 ε1和 ε2。
经水浸泡后的玻璃膜截面成为三层结构，如图。
则有：
外侧, ε1=K1+ '
1
1??LnFRT
内侧,ε2=K2+
'22?
?Ln
F
RT
可以认为，玻璃膜两侧表面性状基本相同，
故 K1=K2，水合硅胶层表面一价阳离子点已
基本被质子占据，故 α1’=α2’，于是玻璃膜
内、外侧之间的电位差
△ ε膜 =ε1-ε2=
2
1
?
?Ln
F
RT
由于内参比溶液的 H+活度 α2一定，故玻璃
膜电位与待测溶液的 H+离子活度（ pH值）
成线性关系。
△ ε膜 =常数 +
?HLnF
RT ?
在 25℃ 下：
△ ε膜 =常数 -0.0591pH（试液）
但实际上玻璃膜内外侧表面性状总有微小差
别，即使 α1=α2时，△ ε膜 ≠0，这差别所产生
的电位叫不对称电位（ ε不对称 ），这样整个玻
璃电极（指示电极）的电位应是内参比电位、
膜电位与不对称电位之和。
ε玻璃 =ε0 +△ ε膜 +ε不对称
其中,ε0 与 ε不对称 对于特定的电极是恒
定的，故玻璃电极的电极电位与试液 pH
值呈线性关系。
（ 4）玻璃电极的性能
?存在不对称电势
不对称电势产生于电极敏感玻璃膜部分，由于
膜内外表面状态不完全一样引起的，它与温度、
玻璃组成、敏感膜厚度及加工状况等因素有关。
不对称电势可以用已知 pH值的标准缓冲液来校
正
?零电势或等电势点
电极电位为零时的溶液 pH值称为零电势
pH值，该值取决于内参比溶液的 pH值。
含有 0.025mol/l的 KCl和等摩尔浓度的磷
酸混合缓冲液的等电势点为 pH=7，在
pH<7和 pH>7时，玻璃电极的极性发生改
变。
?玻璃电极的测量范围
玻璃电极的实际转换系数并不是在整个 pH
范围都是常数，因而响应曲线会偏离直线，
实际的 pH响应曲线如图
测量值
pH
在碱性范围内 pH>10 k降低，测量值偏高
在酸性范围内 pH<1 k升高，测量值偏低 …
（ 5）玻璃电极的使用限制
?对于蛋白质等粘度较大的测量体系，容
易在玻璃电极敏感膜上产生沉积，应设法
缩短电极的沉浸时间或设法对电极表面进
行清洗，工业测试中常用特制毛刷或超声
波清洗电极表面。
?强碱或其它对膜材料有腐蚀性的溶液，
如氢氟酸溶液会破坏电极
?脱水性介质，如无水乙醇、浓硫酸会破
坏水合硅胶层
（ 6）复合电极
将两支电极都装在
一根玻璃管中，这
种电极叫复合电极，
工业上在线检测大
都使用这种电极。
它结构紧凑，便于
安装。
pH复合电极的结构
屏蔽引线用于减少噪声（电磁波、感应）。
当电极插入被测溶液中后，参比电极
隔膜 被测体系 玻璃敏感膜 内参
比电极之间达到电导通，组成原电池，其
原理与双电极 pH计的工作原理完全相同，
只是结构更紧凑，使用更方便。
（二） 敏化离子选择性电极
以离子选择性电极为基础电极，通过化学
反应或生化反应使离子选择性电极的响应
得到敏化，叫作敏化离子选择性电极。包
括有气敏电极和酶电极等。
气敏电极是基于界面化学反应的敏化电极
在某种离子选择性电极的表面覆盖一层憎
水的透气膜，在透气膜和这种离子选择性电
极之间充以中间溶液，透气膜不允许溶液中
的离子通过，而只允许被测定的气体通过，
直到透气膜内外两边该气体的分压相等。
进入透气膜的气体与中间溶液起反应，
从而使中间溶液中的某一被离子选择性电极
响应的物质的量发生变化，并通过选择性电
极电位反映出来，达到间接表征被测气体含
量的目的。
能用气敏电极测定气体有 CO2,NH3、
SO2,NO2,H2S,HCN,HF,Cl2、
Br2,I2的蒸气等，其中以氨电极比较成
熟，应用较广。
1,NH4＋ 的测量
氨是酶反应中最常见的产物和反应物，
氨离子可用氨气敏电极来测定。常用
的氨电极为：
1－电极管； 2－透气膜； 3－
0.1mol/LNH4Cl溶液； 4－ pH玻
璃电极； 5－ Ag/AgCl参比电极；
6,7－玻璃膜； 8－可卸电极头；
9－内参比溶液,10－内参比电
极
在电极管内装有玻璃
电极 —— Ag-AgCl电
极，底部装有一微孔
透气膜，玻璃电极的
敏感膜紧贴于透气膜
上，中间有一极薄的
液层，当氨通过透气
膜渗入内充液薄层，
即发生如下反应
NH3+H2O=NH4++OH-
内充液中 NH4+远大于生成的 NH4+，故
其变化可以忽略不计，而薄层的 pH则
由于 OH-的生成而升高，因此由玻璃电
极检出 OH-的浓度，即可检出 NH3的浓
度，电极电位与氨的浓度是对数响应。
透气膜一般是 0.1mm厚的微孔聚四氟
乙烯，内充液为 0,1mol/L的 NH4Cl溶
液。氨电极使用的上限为 1mol/L,下限
为 10-6mol/L。
2,CO2的测量
（ 1） CO2电极（测溶液中的 CO2）
结构与氨电极类似。测量 CO2时，气体透
过电极膜,CO2和水反应，达到以下平衡：
CO2+H2O HCO3-+H+
产生的氢离子引起 pH的变化，就可以测
出溶解 CO2的浓度。如果 CO2扩散在水或
NaHCO3的水溶液中，它们的 pH值会依
据下列的式子而变化：
在纯水中 pH=常数＋ lg
2COp
在 NaHCO3溶液中 pH=常数 -lgpCO2
在 NaHCO3溶液中测量能方便地确定 pH
和 pCO2之间的对应关系。使用特殊的气
体渗透膜，它能够使 CO2扩散到
NaHCO3溶液中去，溶液中 pH变化就是
CO2实际分压的测量值
(2)尾气 CO2的测量
常用的尾气测定仪是 不分光红外线二氧化碳测定
仪（简称 IR）,其精度高，可达 ± 0.5%，量程
的线性范围大，虽然仪器价格高，但在生物细胞
培养时常被采用。
不分光红外线 CO2气体分析原理是：除了单原子
气体（如氖、氩等）和无极性的双原子气体（如
氧、氢、氮等）外，几乎所有气体都在红外波段
（即微米级）具有不同的红外吸收光谱,CO2的
红外吸收峰在 2.6~2.9μm和 4.1~4.5μm之间有两
个吸收峰，根据吸收峰值可以求出 CO2的所含浓
度。
（ 3）尾气氧的仪器分析
采用热磁氧分析仪测定
原理是氧具有高顺磁性。在磁场中，氧气
的磁化率比其它气体高几百倍，故混合气
体的磁化率几乎完全取决于含氧气的多少。
将排气通入热磁氧分析仪，就可测出排气
氧的含量。
通过 RQ值的测定，可以分析微生物可能
利用的基质 —— 氧化型的或还原型的，分
析微生物生长阶段，分析补料的速率是否
合理
例如，储炬等发现 RQ的变化与菌体生长、营养状况
以及产生抗生素密切相关。如 20h菌丝开始发生膨大，
而此时 RQ达到峰值开始下降； 40h左右 RQ降至谷底
开始回升，正是在这段时间产生抗生素启动。由于
RQ具有以上的关联特性，他们尝试在 avemectin发
酵过程中利用 RQ作为补料控制的参考之一。
3、排气氧、排气 CO2和呼吸熵
酶电极与气敏电极相似，是在离子选择性电极的表
面覆盖一个涂层，把酶固定在涂层内，通过酶反应
产生的物质的测定，可以推算出反应物的量。
例如脲酶电极，把脲酶固定在 NH3气敏电极或 CO2
气敏电极的表面，在脲酶的催化下，尿素可以发生
如下的分解反应：
CO(NH2)2+H2O 2NH3+CO2
通过 NH3或 CO2气敏电极测定 NH3或 CO2
的分压即可达到间接测定尿素的目的。
4、酶电极
（三） 溶氧的测定
对于好氧微生物来说氧的供应十分重要，
了解发酵过程中溶氧情况是发酵控制的关键
方面。现在发酵中溶氧测定大多用溶氧电极
来测定。溶氧电极可分为极谱型和原电池型。
极谱型 需极化电压及放大器，耗氧少，
受气流影响小
原电池型 简单便宜，适于中小罐。耗氧较
大，受气流和气泡影响大。
现在国内外测定溶液中的溶解氧基本
上用 极谱型的复膜氧电极 。
复膜氧电极可分为
敞口式
封闭式
敞口式 在电极的玻璃管上有一个小
孔，使玻璃管与环境相通，这样在蒸
汽灭菌时电极玻璃管内外压力相等，
有利于保护电极
封闭式的电极玻璃管上没有小孔，蒸
汽灭菌时玻璃管受压大
现在使用的大多数是敞口式电极
1、复膜氧电极的工作原理
阴极由铂、银、金等贵金属组成，阳极由
铅、锡、铝等组成 。当给电极施加极谱电
压（ 0.6~0.8V负电压）时，溶液中的氧就
在阴极被还原。当产生的电流与溶液中氧
含量成正比时，此时的电极电流为饱和电
流，此时的电压为极谱电压。氧浓度与饱
和电流成正比关系。
在阴极表面发生的电极反应：
1/2O2+H2O+e- 2OH-
阴极上失去电子后，阳极反应产生的电子
流向阴极，于是在二电极之间形成电流，
将氧的信号转变成电信号。氧浓度越高，
电流越大。
阳极上的反应是：
Pb+2ACO- Pb(ACO)2+2e-
化学信号转变成电信号
2、电极的构造
在阴极银（铂）
片的前面包一张
半透膜，氧可以
透过半透膜达到
阴极上进行电极
反应。该半透膜
固定在阴极表面。
小孔用于压力补
偿。
3、溶氧电极的影响因素
（ 1）电极的灵敏度
电极的阴极表面覆盖了半透膜之后，在一定
条件下当膜成为氧扩散的控制因素时，氧分
压的变化与电流输出的稳态有以下对应式：
IS=NFA(pm/dm)pO2
式中 IS—— 电极电流
N—— 电子数
F—— 法拉第常数
A—— 阴极表面积
Pm—— 氧在复膜中的穿透系数
PO2—— 被测溶液中的氧分压
dm—— 膜的厚度
增加灵敏度因素：
?增加膜穿透系数 pm
?减小膜厚度 dm
?增加阴极表面积 A
扩散速度 因为电极表面的氧浓度
与液体主流中的氧浓度存在浓度梯度
搅拌速度、通气量和培养液粘度
（ 2）温度的影响
电极还会受温度的影响
?氧在溶液中的溶解度随温度上升而下降
?温度上升使膜穿透系数增加，且氧的内相
扩散增加，增加了电化学反应速率。
由于后者影响比较显著，因此随着温度的
上升，电极输出电流呈指数上升。所以电
极须有温度补偿功能，才能真正反映出氧
溶解度变化的情况。
4、电极的标定
一般测定中应进行以下二点标定
（ 1）零点标定
用饱和 Na2SO3作无氧状态的溶液，将氧电极放入
该溶液中，显示仪表上可见溶氧浓度下降，待下降
稳定后，调节零点旋钮显示零值。
（ 2）饱和校正（满刻度）
进行简便测定时，可以采取空气饱和方式。将电
极放入培养液中，通气搅拌一段时间，显示仪上
可见溶氧上升，待上升稳定，调节满刻度旋钮至
100%即为饱和值。
5.摄氧率 r的测定
(1)用溶氧电极测定 r
要求电极响应时间短，能跟上摄氧率的
变化。测定前先用纯水标定电极，得到
单位电流代表的溶氧浓度：
残饱 － ii
C *
I饱 —— 在饱和氧浓度 C*时的电流值
I残 —— 氧浓度为零时电极所具有的电流
若测定某培养时间的摄氧率，则关闭通气阀，
保持搅拌，在罐顶通氮气，赶走上面的空气。
此时，由于耗氧,CL下降，仪表上电流值
也不断下降。
R= (-△ i/△ t)
残饱 － ii
C*
△ t—— 停止供气后 CL下降到最低点
时所需时间
△ i—— 在△ t时间内的电流变化
(2)用热磁氧分析仪测定
原理是氧具有高顺磁性，氧气的磁化率
比其它气体高几百倍，故混合气体的磁
化率几乎完全取决于含氧气的多少，根
据排气中的氧含量，可以算出摄氧率
设进口氧含量为 21%
r=每小时通气量 × （ 0.21-出口氧 %）
*22.4× 1000*V
6、氧传递系数 kLa的测定
设备的 KLa可以用亚硫酸钠法来测定，
但它是在非发酵过程中测定的，不能完
全代表发酵过程中的 KLa值。其它测定
方法有
(1)用溶氧电极和热磁氧分析仪共同测定
在发酵过程中如果溶氧浓度恒定在一定
值表示此时供氧和需氧达到平衡，即
r=KLa(C*-CL)
式中 C*可以查得,CL可以用溶氧电极测
得,r也可算出，因此可求得 KLa值
例：一装料为 7L的发酵罐，通气量
1l/L.m，操作压力为 0.3Kg/cm2，在某发
酵时间内发酵液的溶氧浓度为饱和氧浓
度的 25%，空气进入时的氧含量为 21%，
废气排出时的氧含量为 19.8%（ 1atm时
氧饱和浓度 C*=0.2mmol/L）求此时菌的
摄氧率
r=1*7*60/22.4*103*(0.21-0.198)/7
KLa＝ r/0.26(0.21.0.198)
(2)单用溶氧仪测定
用溶氧仪测定发酵过程的溶氧，开始时
供氧和需氧达到平衡，溶氧是一条水平
线。这是停止通气，保持搅拌，在罐顶
通入氮气，赶掉氧气。由于微生物对氧
的利用，溶氧迅速下降，过一段时间溶
氧下降缓慢，待溶氧到最低点后在恢复
通气。这样可以得到溶氧随时间变化的
曲线
△ CL/△ t=KLa(C*-CL)-r
CL=-1/KLa(△ CL/△ t+r)+C*
将 CL对△ CL/△ t+r作图，得到一条直线，斜率
为 -1/KLa因此可求得 KLa,延长直线与纵坐标相
交点为 C*
溶解氧浓度随通气变化的情况 KLa的求取
二 参数的离线检测进展
（一） 利用高效液相（ HPLC）分析代谢
中间产物
通过中间代谢产物的测定可以深入了
解微生物代谢的流向，依此来分析代谢的
情况。从而有的放矢的控制发酵过程
例：鸟苷生产
在鸟苷发酵中，发
现发酵到 40小时后
鸟苷合成速率下降，
但糖耗速率并未下
降，而且由于耗糖,
使发酵过程 pH下降，
补入氨水增多。那
么糖耗到哪里去了
呢？
于是进行以下一些
测定与分析
什么因素导致 pH下降？
1、有机酸的积累
有机酸积累 pH下降 补加
氨水
在正常代谢情况下，细胞通过 EMP途径和
TCA循环的过程是为细胞合成提供前体和能
量的，按照细胞经济学的原则不会供过于求，
即不会出现有机酸的积累
若发酵后期有机酸积累会引起加入的 [NH4+]
积累，相应出现产苷速率下降。 —— 代谢不
正常
测定以下中间物
发酵后期丙酮酸积累
2、氨基酸的积累
在有机酸分析的基础上进一步通过 HPLC
测定发酵过程中不同时间发酵液中氨基酸，
结果发现总氨基酸积累并且其积累晚于有
机酸和 [NH4+]积累。
氨基酸成分分析表明，初始发酵液中谷氨
酸浓度比较高，其它氨基酸浓度都较低，
随着发酵过程的进行谷氨酸很快被用于菌
体合成，在 8小时之前已经降到很低水平，
并始终维持在低水平，而在 48小时左右丙
氨酸开始出现明显的积累，发酵液中积累
量达到初始量的 12.6倍之多，其它十余种
氨基酸浓度则变化不大，并且在整个发酵
过程中都维持在较低水平。因此，丙氨酸
浓度变化可能是导致代谢流迁移所致。
3、分析原因
发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，
而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸转化而
来，因此可以推断由于 EMP途径代谢流的
增加造成了丙酮酸的积累，丙酮酸随后转
化为丙氨酸
丙氨酸本身又会对谷氨酸合成酶（ GS）造
成反馈抑制和阻遏，使产苷速率降低。
丙酮酸积累 氨水补加增加
[NH4+]积累 抑制 GS
抑制 TCA循环 丙酮酸积累
激活磷酸果糖激酶 EMP流量增加
恶性循环
丙氨酸
积累
（二） 代谢流迁移的酶学证明
糖代谢途径关键酶
糖酵解途径（ EMP）
在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶：
磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶
磷酸果糖激酶的时序分析
12小时时由于生长处于对数生长初期，代谢活力较低，
所以 PFK的活力相对较低。 24小时后随着发酵过程进
入平稳产物形成期和细胞生长期，磷酸果糖激酶的活
力也基本保持平稳。但是到 40小时以后，鸟苷形成速
率减慢甚至停止，同时观察到氨基酸和有机酸积累，
PFK相对酶活增加，这表明此时通过 EMP途径的糖代
谢通量已有了明显的增加。
丙酮酸激酶时序分析
丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增加，
而是在 24小时就基本上达到其最大值，随
后维持在恒定的水平，这表明在糖代谢时
EMP途径代谢流增加中丙酮酸激酶所起的
作用不大，不是造成代谢流迁移的主要因
素
磷酸戊糖途径（ HMP）关键酶
磷酸戊糖途径中主要的限速酶是 6－磷酸葡
萄糖脱氢酶，该酶催化 6－磷酸葡萄糖脱氢
生成 6－磷酸葡萄糖酸内酯 。
6－磷酸葡萄糖脱氢酶时序分析
由图可以看到，早期 6－磷酸葡萄糖脱氢酶活力很高，
这可能是前期菌体合成代谢比较活跃，通过 HMP途径
合成用于细胞成分的核酸等组成物质；随后基本不变，
从而保持 EMP和 HMP途径通量的平衡，此时稳定持续
的形成产物；但是到 40小时后,6－磷酸葡萄糖脱氢
酶已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵过
程的进行而持续下降。根据物料平衡原则，有可能糖
代谢在 HMP途径通量下降而 EMP途径通量增加。
三羧酸 (TCA)循环的关键酶
三羧酸循环是“消耗”丙酮酸的途径，
三羧酸流量大丙酮酸不会积累。三羧
酸循环中的关键酶为 柠檬酸合成酶,
其催化乙酰辅酶 A与草酰乙酸缩合形
成柠檬酸，是三羧酸循环的启动步骤，
也是三羧酸循环中的主要控制点，由
柠檬酸合成酶所催化的反应是三羧酸
循环中的第一个限速步骤。
柠檬酸合成酶时序分析
从图可以看到,TCA循环的关键酶柠檬
酸合成酶在整个发酵过程中，尤其是在
后期产苷速率下降的过程中都维持比较
平稳的水平，这表明在发酵过程后期所
发生的代谢流迁移时,TCA循环的通量
并没有发生明显的增加。即 代谢流迁移
发生在 EMP和 HMP之间，主要是由于
EMP和 HMP途径之间的分配平衡被打破
所造成的。 EMP途径代谢流的增加造成
了一种代谢流的溢流现象。
丙氨酸脱氢酶的时序分析
在发酵中后期，丙氨酸脱氢酶活力出现了明
显的增加。丙氨酸脱氢酶催化由丙酮酸生成
丙氨酸，该酶活性增加与丙酮酸和丙氨酸的
时序增加相吻合，这些数据表明代谢流的溢
流现象发生在柠檬酸合成酶之前的丙酮酸节
点，通过丙氨酸脱氢酶生成丙氨酸，从而缓
解了 EMP途径代谢流增加造成的代谢不平衡。
结果加入 EMP途径的抑制剂，克服了
代谢流迁移的问题，提高了鸟苷的产
量
（三）与产物合成相关的酶和中间物
测定
例：螺旋霉素生物合成的代谢研究
图 3 螺旋霉素生物合成代谢网络途径
0
50
100
150
200
250
300
350
0 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96
发酵时间 ( h )
峰面积
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
峰面积
F O - Ⅰ
F O - Ⅱ
N S P - Ⅰ
N S P - Ⅱ
SP- Ⅰ
SP- Ⅱ
SP- Ⅲ
图 1 螺旋霉素生物合成中间物动态流量分布图
哪
个
代
谢
中
间
物
过
多
积
累
在发酵后期有 FO-Ⅱ 积累, 要减少 FO-Ⅰ 转化为
FO-Ⅱ 必须降低 C3酰化酶的活力, 但这与 SPⅡ,
SPⅢ 合成有矛盾
在发酵结束时,SP-Ⅰ 还有一定的积累，如能最大
限度的转化为 SP-Ⅱ, SP-Ⅲ,即加强步骤 3对发酵
效率和发酵效价是有积极意义的。而 FO-Ⅱ, NSP-
Ⅱ 的最终积累则导致流量浪费，因为这两种物质最
终不能转化为目的产物。因此必须减小步骤 4的通
量。但由于这几个步骤的转化都是由 C3酰化酶催化
反应，这给改变通量带来一定的困难。
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96
发酵时间（h）
质量浓度（g/L）
乙酸
丁酸
图 2 有机酸前体的动态流量分布图
在图 2中，乙酸和丁酸在从 40小时开始积累
并在 64小时达到最高值，对照图 3螺旋霉素
生物合成代谢网络途径 [9]，我们可以推测在
发酵中前期在图 3中的步骤 1也即大环成环步
骤有一定程度的, 瓶颈, 影响，从而导致乙
酸、丁酸有一定的积累。若能加强这一步骤
的通量，应能提高代谢网络的通量，提高螺
旋霉素的效价。
我们测定了内酯环合成相关的酶活 —— 前体
的活化
酰基激酶和酰基 CoA合成酶活性趋势
测定酶活并建立酶活趋势曲线 。
分析：两种酶在发酵过程中都有两个活性
高峰期,但 出现的时间相差很大 。
酰基激酶的活性高峰期主要集中在发酵中
前期
酰基 CoA合成酶的活性高峰期主要集中在发
酵中后期 。 此外, 酰基 CoA合成酶的活性远
小于酰基激酶的活性 。
图 1 酰基激酶和酰基 CoA合成酶活性趋势
酰基激酶 酰基 CoA
合成酶
酰基激酶在发酵初期出现一个活性高峰，
推测其参与了初级代谢；后一个活力峰出
现在发酵中期，且与酰基 CoA合成酶的第
一个活力峰出现时间相一致，意味着酰基
激酶对次级代谢同样有着重要作用。在螺
旋霉素的生物合成中，酰基 CoA合成酶的
活性主要集中在发酵中后期，推测合成酶
主要参与次级代谢。由于合成酶的活性较
小，推测其可能是大环合成的, 瓶颈,,
如果提高其活性，就有可能大幅度提高发
酵效价。
采取措施：寻找酶的激活剂
添加 ZnSO4,MnCl2,CoCl2,CuSO4等无
机盐, 研究了 Zn2+,Mn2+,Co2+,Cu2+等
二价阳离子对两种酶的影响 。
体外各阳离子对酶活性影响, 确定了各
阳离子对两种酶的最佳添加浓度 （ 表
1） 。
0
200
400
600
800
1000
1200
Divaledt metal ion
Enzyme activity(u/g)
Control
Co2+
Zn2+
Mn2+
Cu2+
图 2 二价阳离子对酰基激酶活性的影响
0
20
40
60
80
100
Divaledt metal ion
Enzyme activity(u/g)
Control
Co2+
Zn2+
Mn2+
Cu2+
图 3 二价阳离子对酰基 CoA合成酶活性的影响
在最佳浓度下, 各离子对两种酶的影
响程度如图 2,3所示 。 对于酰基激酶,
Co2+,Mn2+,Zn2+离子都有明显的激活
作用；而 Cu2+则几乎完全抑制了激酶 。
对于酰基 CoA合成酶, Cu2+却有很强的
激活作用； Co2+,Mn2+有较高的激活作
用；而 Zn2+的作用不明显 。
摇瓶发酵
根据酰基激酶和酰基 CoA合成酶活性趋势曲线,
分别在发酵 0h和 48h添加上述最佳浓度的离子,
测定螺旋霉素的平均发酵效价 （ 表 2） 。
表 2 不同时间添加二价阳离子对螺旋霉素效价的影响
0h 48h
Control Mn2+ Co2+ Mn2+ Co2+ Cu2+
1# 2571 2612 2806 2498 3024 2956
2# 2606 3350 3224 2814 3498 3822
Average 2589 2981 3015 2656 3261 3389
代谢过程检测的新进展 —— 转录谱
基因芯片 —— 微阵列检测 RNA含量
思考题
1、用于在线检测的传感器必须符合哪些要求？
2,pH电极的指示电极能测定 pH值的原理是什么？
3,pH电极的测量范围有没有限制？使用时应注
意哪些问题？
4、溶氧电极能够测定液体中溶氧浓度的原理是什
么？
5、影响溶氧电极测定的灵敏度和准确性的因素有
哪些？
6、哪些仪器可以测定尾气氧和尾气二氧化碳？测
定原理是什么？
在线检测必须用专门的传感器（也叫电极或探头）
放入发酵系统，将发酵的一些信息传递出来，为发酵控
制提供依据。
黑箱 灰箱?? ?? 参数检测
检测仪器：气相色谱、高效液相、离子色谱、
双向电泳、毛细管电泳、红外光谱、基因测序仪等
检测代谢中间物，分析代谢流向,RNA检测
一 参数在线检测
由于微生物培养过程是纯培养过程，无菌
要求高，因此对传感器有特殊要求：
?插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽
灭菌（材料、数据）
?传感器结构不能存在灭菌不透的死角，
以防染菌（密封性好）
?传感器对测量参数要敏感，且能转换成
电信号。（响应快、灵敏）
?传感器性能要稳定，受气泡影响小。
带计算机数据采集与控制的生物反应系统
P188
原理：化学或物理信号 电信号
放大 记录显示仪
控制器（与设定参数比较）
发出调节信号 控制器动作
介绍几种常用的在线检测的传感器及其工
作原理
?pH电极
?溶氧电极
它们是基础电极，以它们为基础可以
制作各种离子电极和酶电极
（一） pH测量
pH值的测量在生物反应中普遍进行，对于
生物过程控制是一个非常重要的参数。
1,pH的定义
影响化学平衡的往往是活度，而不是浓度，
但对于稀溶液为了避免在氢离子活度很小
时表达方式上的麻烦
引进 pH=-lg[H+]
[H+]=0.00001时 用 pH5表示
2,pH测量方法
pH试纸曾经是一种广泛采用的方法
优点：方便，易操作
缺点：它主观性较强
质量差异，不同厂家不同批号的 pH试纸测出的
pH值会有较大的差别，有时甚至达 0.5~1。
对于一些要求较高的场合就适用
pH试纸
pH电极
（ 1） pH电极测量原理
pH电极实际上是由参比电极
与指示电极组成的一个自发电
池，该电池的表达式可写为：
参比电极 溶液 X 指示电极
该电池的参比电极的输出电位
恒定，指示电极的输出电位随
被测体系中氢离子活度而变化。
因此整个自发电池的电动势就
是被测体系中氢离子活度的函
数。
E[α]=E0- ln1/ =E0-2.303 pH
F
RT aH?
F
RT
式中 E0对某一给定电极为常数，是温度的函数，因此从
电位差计的 E值可测出 pH值。
甘汞电极（ a） 232型（ b） 217型
1－导线； 2－加液口； 3-KCl溶液； 4－素烧瓷芯； 5－铂丝； 6－
Hg； 7－ Hg2Cl2
一般的参比电极是甘汞电极。电极的外壳是玻璃管，里面套一根小
玻璃管，其顶部伸出电极引线，引线的下端浸没在汞中，汞的下端
有糊状甘汞，汞和甘汞用棉花堵住，只有离子才能通过，而汞和甘
汞不会漏失，小管和大管之间充满 KCl溶液，末端用多孔陶瓷渗入
到溶液中，实现电极引线与溶液间的电导通。
?
参
比
电
极
由此可见，甘汞电极是由金属汞及其难溶盐 ——
氯化亚汞以及含氯离子的电解质溶液组成。这种半
电池可表示为 Hg(L) Hg2Cl2(S) Cl-(L) 电极电位产
生于汞和甘汞的界面，其电极反应为：
2Cl-+2Hg Hg2Cl2+2e-
其电极电位为
εCl/HgCl,Hg=ε + ln1/α0,/ HgHgClCl
F
RT ?Cl
由此可见甘汞电极的电极电位只与氯化钾的活
度有关而不受被测溶液的酸碱度影响
（ 2）指示电极
对指示电极的电位值随被测溶液氢离子活度的变
化而变化。原则上讲，任何与氢离子可逆反应的
电极都可用来测定溶液的 pH。
?离子选择性电极的结构
离子选择性电极的结构
其中敏感性膜部分随组成
材料的不同而各有特色。
测定 pH值的玻璃电极的
敏感膜是厚度为 10－ 1～
10－ 3mm的玻璃薄膜，其
电阻为 50～ 500mΩ。
指示电极的关键是敏感膜
H+ H+
H+ H+ H+ H+
KCl溶液
待测溶液
浓度差引起电位差 —— 浓差电极
玻璃敏感膜
（ 3）膜电位
膜电位是由于膜两侧离子活度的差异而产生，故可
看作是一种浓差电位。玻璃电极在使用前必须先在
水中浸泡一段时间，玻璃膜表面吸收水分溶解，并
且其中的一价阳离子（如 Na+离子）与水中 H+离子
发生离子交换反应。
SiO-Na++H+ SiO-H++Na+
使膜表面形成以 SiO-H+为主要成分的水合硅胶层，
厚度约为 10-4~10-5mm
液
试
水
合
硅
胶
层
干
玻
璃
层
水
合
硅
胶
层
内
参
比
溶
液
α1 α1’ α2 ’ α2
ε1— --△ ε--— ε2
以 α1,α2分别表示试液
内与内参比溶液中 H+离
子活度,α1’,α2’分别表
示外侧与内侧硅胶层表
面 H+离子活度，
由于水合硅胶层表面与
内（内参比溶液）、外
（试液）溶液中的 H+离
子从活度大的一方向小
的一方迁移，使玻璃膜
的外、内侧分别产生相
界电位 ε1和 ε2。
经水浸泡后的玻璃膜截面成为三层结构，如图。
则有：
外侧, ε1=K1+ '
1
1??LnFRT
内侧,ε2=K2+
'22?
?Ln
F
RT
可以认为，玻璃膜两侧表面性状基本相同，
故 K1=K2，水合硅胶层表面一价阳离子点已
基本被质子占据，故 α1’=α2’，于是玻璃膜
内、外侧之间的电位差
△ ε膜 =ε1-ε2=
2
1
?
?Ln
F
RT
由于内参比溶液的 H+活度 α2一定，故玻璃
膜电位与待测溶液的 H+离子活度（ pH值）
成线性关系。
△ ε膜 =常数 +
?HLnF
RT ?
在 25℃ 下：
△ ε膜 =常数 -0.0591pH（试液）
但实际上玻璃膜内外侧表面性状总有微小差
别，即使 α1=α2时，△ ε膜 ≠0，这差别所产生
的电位叫不对称电位（ ε不对称 ），这样整个玻
璃电极（指示电极）的电位应是内参比电位、
膜电位与不对称电位之和。
ε玻璃 =ε0 +△ ε膜 +ε不对称
其中,ε0 与 ε不对称 对于特定的电极是恒
定的，故玻璃电极的电极电位与试液 pH
值呈线性关系。
（ 4）玻璃电极的性能
?存在不对称电势
不对称电势产生于电极敏感玻璃膜部分，由于
膜内外表面状态不完全一样引起的，它与温度、
玻璃组成、敏感膜厚度及加工状况等因素有关。
不对称电势可以用已知 pH值的标准缓冲液来校
正
?零电势或等电势点
电极电位为零时的溶液 pH值称为零电势
pH值，该值取决于内参比溶液的 pH值。
含有 0.025mol/l的 KCl和等摩尔浓度的磷
酸混合缓冲液的等电势点为 pH=7，在
pH<7和 pH>7时，玻璃电极的极性发生改
变。
?玻璃电极的测量范围
玻璃电极的实际转换系数并不是在整个 pH
范围都是常数，因而响应曲线会偏离直线，
实际的 pH响应曲线如图
测量值
pH
在碱性范围内 pH>10 k降低，测量值偏高
在酸性范围内 pH<1 k升高，测量值偏低 …
（ 5）玻璃电极的使用限制
?对于蛋白质等粘度较大的测量体系，容
易在玻璃电极敏感膜上产生沉积，应设法
缩短电极的沉浸时间或设法对电极表面进
行清洗，工业测试中常用特制毛刷或超声
波清洗电极表面。
?强碱或其它对膜材料有腐蚀性的溶液，
如氢氟酸溶液会破坏电极
?脱水性介质，如无水乙醇、浓硫酸会破
坏水合硅胶层
（ 6）复合电极
将两支电极都装在
一根玻璃管中，这
种电极叫复合电极，
工业上在线检测大
都使用这种电极。
它结构紧凑，便于
安装。
pH复合电极的结构
屏蔽引线用于减少噪声（电磁波、感应）。
当电极插入被测溶液中后，参比电极
隔膜 被测体系 玻璃敏感膜 内参
比电极之间达到电导通，组成原电池，其
原理与双电极 pH计的工作原理完全相同，
只是结构更紧凑，使用更方便。
（二） 敏化离子选择性电极
以离子选择性电极为基础电极，通过化学
反应或生化反应使离子选择性电极的响应
得到敏化，叫作敏化离子选择性电极。包
括有气敏电极和酶电极等。
气敏电极是基于界面化学反应的敏化电极
在某种离子选择性电极的表面覆盖一层憎
水的透气膜，在透气膜和这种离子选择性电
极之间充以中间溶液，透气膜不允许溶液中
的离子通过，而只允许被测定的气体通过，
直到透气膜内外两边该气体的分压相等。
进入透气膜的气体与中间溶液起反应，
从而使中间溶液中的某一被离子选择性电极
响应的物质的量发生变化，并通过选择性电
极电位反映出来，达到间接表征被测气体含
量的目的。
能用气敏电极测定气体有 CO2,NH3、
SO2,NO2,H2S,HCN,HF,Cl2、
Br2,I2的蒸气等，其中以氨电极比较成
熟，应用较广。
1,NH4＋ 的测量
氨是酶反应中最常见的产物和反应物，
氨离子可用氨气敏电极来测定。常用
的氨电极为：
1－电极管； 2－透气膜； 3－
0.1mol/LNH4Cl溶液； 4－ pH玻
璃电极； 5－ Ag/AgCl参比电极；
6,7－玻璃膜； 8－可卸电极头；
9－内参比溶液,10－内参比电
极
在电极管内装有玻璃
电极 —— Ag-AgCl电
极，底部装有一微孔
透气膜，玻璃电极的
敏感膜紧贴于透气膜
上，中间有一极薄的
液层，当氨通过透气
膜渗入内充液薄层，
即发生如下反应
NH3+H2O=NH4++OH-
内充液中 NH4+远大于生成的 NH4+，故
其变化可以忽略不计，而薄层的 pH则
由于 OH-的生成而升高，因此由玻璃电
极检出 OH-的浓度，即可检出 NH3的浓
度，电极电位与氨的浓度是对数响应。
透气膜一般是 0.1mm厚的微孔聚四氟
乙烯，内充液为 0,1mol/L的 NH4Cl溶
液。氨电极使用的上限为 1mol/L,下限
为 10-6mol/L。
2,CO2的测量
（ 1） CO2电极（测溶液中的 CO2）
结构与氨电极类似。测量 CO2时，气体透
过电极膜,CO2和水反应，达到以下平衡：
CO2+H2O HCO3-+H+
产生的氢离子引起 pH的变化，就可以测
出溶解 CO2的浓度。如果 CO2扩散在水或
NaHCO3的水溶液中，它们的 pH值会依
据下列的式子而变化：
在纯水中 pH=常数＋ lg
2COp
在 NaHCO3溶液中 pH=常数 -lgpCO2
在 NaHCO3溶液中测量能方便地确定 pH
和 pCO2之间的对应关系。使用特殊的气
体渗透膜，它能够使 CO2扩散到
NaHCO3溶液中去，溶液中 pH变化就是
CO2实际分压的测量值
(2)尾气 CO2的测量
常用的尾气测定仪是 不分光红外线二氧化碳测定
仪（简称 IR）,其精度高，可达 ± 0.5%，量程
的线性范围大，虽然仪器价格高，但在生物细胞
培养时常被采用。
不分光红外线 CO2气体分析原理是：除了单原子
气体（如氖、氩等）和无极性的双原子气体（如
氧、氢、氮等）外，几乎所有气体都在红外波段
（即微米级）具有不同的红外吸收光谱,CO2的
红外吸收峰在 2.6~2.9μm和 4.1~4.5μm之间有两
个吸收峰，根据吸收峰值可以求出 CO2的所含浓
度。
（ 3）尾气氧的仪器分析
采用热磁氧分析仪测定
原理是氧具有高顺磁性。在磁场中，氧气
的磁化率比其它气体高几百倍，故混合气
体的磁化率几乎完全取决于含氧气的多少。
将排气通入热磁氧分析仪，就可测出排气
氧的含量。
通过 RQ值的测定，可以分析微生物可能
利用的基质 —— 氧化型的或还原型的，分
析微生物生长阶段，分析补料的速率是否
合理
例如，储炬等发现 RQ的变化与菌体生长、营养状况
以及产生抗生素密切相关。如 20h菌丝开始发生膨大，
而此时 RQ达到峰值开始下降； 40h左右 RQ降至谷底
开始回升，正是在这段时间产生抗生素启动。由于
RQ具有以上的关联特性，他们尝试在 avemectin发
酵过程中利用 RQ作为补料控制的参考之一。
3、排气氧、排气 CO2和呼吸熵
酶电极与气敏电极相似，是在离子选择性电极的表
面覆盖一个涂层，把酶固定在涂层内，通过酶反应
产生的物质的测定，可以推算出反应物的量。
例如脲酶电极，把脲酶固定在 NH3气敏电极或 CO2
气敏电极的表面，在脲酶的催化下，尿素可以发生
如下的分解反应：
CO(NH2)2+H2O 2NH3+CO2
通过 NH3或 CO2气敏电极测定 NH3或 CO2
的分压即可达到间接测定尿素的目的。
4、酶电极
（三） 溶氧的测定
对于好氧微生物来说氧的供应十分重要，
了解发酵过程中溶氧情况是发酵控制的关键
方面。现在发酵中溶氧测定大多用溶氧电极
来测定。溶氧电极可分为极谱型和原电池型。
极谱型 需极化电压及放大器，耗氧少，
受气流影响小
原电池型 简单便宜，适于中小罐。耗氧较
大，受气流和气泡影响大。
现在国内外测定溶液中的溶解氧基本
上用 极谱型的复膜氧电极 。
复膜氧电极可分为
敞口式
封闭式
敞口式 在电极的玻璃管上有一个小
孔，使玻璃管与环境相通，这样在蒸
汽灭菌时电极玻璃管内外压力相等，
有利于保护电极
封闭式的电极玻璃管上没有小孔，蒸
汽灭菌时玻璃管受压大
现在使用的大多数是敞口式电极
1、复膜氧电极的工作原理
阴极由铂、银、金等贵金属组成，阳极由
铅、锡、铝等组成 。当给电极施加极谱电
压（ 0.6~0.8V负电压）时，溶液中的氧就
在阴极被还原。当产生的电流与溶液中氧
含量成正比时，此时的电极电流为饱和电
流，此时的电压为极谱电压。氧浓度与饱
和电流成正比关系。
在阴极表面发生的电极反应：
1/2O2+H2O+e- 2OH-
阴极上失去电子后，阳极反应产生的电子
流向阴极，于是在二电极之间形成电流，
将氧的信号转变成电信号。氧浓度越高，
电流越大。
阳极上的反应是：
Pb+2ACO- Pb(ACO)2+2e-
化学信号转变成电信号
2、电极的构造
在阴极银（铂）
片的前面包一张
半透膜，氧可以
透过半透膜达到
阴极上进行电极
反应。该半透膜
固定在阴极表面。
小孔用于压力补
偿。
3、溶氧电极的影响因素
（ 1）电极的灵敏度
电极的阴极表面覆盖了半透膜之后，在一定
条件下当膜成为氧扩散的控制因素时，氧分
压的变化与电流输出的稳态有以下对应式：
IS=NFA(pm/dm)pO2
式中 IS—— 电极电流
N—— 电子数
F—— 法拉第常数
A—— 阴极表面积
Pm—— 氧在复膜中的穿透系数
PO2—— 被测溶液中的氧分压
dm—— 膜的厚度
增加灵敏度因素：
?增加膜穿透系数 pm
?减小膜厚度 dm
?增加阴极表面积 A
扩散速度 因为电极表面的氧浓度
与液体主流中的氧浓度存在浓度梯度
搅拌速度、通气量和培养液粘度
（ 2）温度的影响
电极还会受温度的影响
?氧在溶液中的溶解度随温度上升而下降
?温度上升使膜穿透系数增加，且氧的内相
扩散增加，增加了电化学反应速率。
由于后者影响比较显著，因此随着温度的
上升，电极输出电流呈指数上升。所以电
极须有温度补偿功能，才能真正反映出氧
溶解度变化的情况。
4、电极的标定
一般测定中应进行以下二点标定
（ 1）零点标定
用饱和 Na2SO3作无氧状态的溶液，将氧电极放入
该溶液中，显示仪表上可见溶氧浓度下降，待下降
稳定后，调节零点旋钮显示零值。
（ 2）饱和校正（满刻度）
进行简便测定时，可以采取空气饱和方式。将电
极放入培养液中，通气搅拌一段时间，显示仪上
可见溶氧上升，待上升稳定，调节满刻度旋钮至
100%即为饱和值。
5.摄氧率 r的测定
(1)用溶氧电极测定 r
要求电极响应时间短，能跟上摄氧率的
变化。测定前先用纯水标定电极，得到
单位电流代表的溶氧浓度：
残饱 － ii
C *
I饱 —— 在饱和氧浓度 C*时的电流值
I残 —— 氧浓度为零时电极所具有的电流
若测定某培养时间的摄氧率，则关闭通气阀，
保持搅拌，在罐顶通氮气，赶走上面的空气。
此时，由于耗氧,CL下降，仪表上电流值
也不断下降。
R= (-△ i/△ t)
残饱 － ii
C*
△ t—— 停止供气后 CL下降到最低点
时所需时间
△ i—— 在△ t时间内的电流变化
(2)用热磁氧分析仪测定
原理是氧具有高顺磁性，氧气的磁化率
比其它气体高几百倍，故混合气体的磁
化率几乎完全取决于含氧气的多少，根
据排气中的氧含量，可以算出摄氧率
设进口氧含量为 21%
r=每小时通气量 × （ 0.21-出口氧 %）
*22.4× 1000*V
6、氧传递系数 kLa的测定
设备的 KLa可以用亚硫酸钠法来测定，
但它是在非发酵过程中测定的，不能完
全代表发酵过程中的 KLa值。其它测定
方法有
(1)用溶氧电极和热磁氧分析仪共同测定
在发酵过程中如果溶氧浓度恒定在一定
值表示此时供氧和需氧达到平衡，即
r=KLa(C*-CL)
式中 C*可以查得,CL可以用溶氧电极测
得,r也可算出，因此可求得 KLa值
例：一装料为 7L的发酵罐，通气量
1l/L.m，操作压力为 0.3Kg/cm2，在某发
酵时间内发酵液的溶氧浓度为饱和氧浓
度的 25%，空气进入时的氧含量为 21%，
废气排出时的氧含量为 19.8%（ 1atm时
氧饱和浓度 C*=0.2mmol/L）求此时菌的
摄氧率
r=1*7*60/22.4*103*(0.21-0.198)/7
KLa＝ r/0.26(0.21.0.198)
(2)单用溶氧仪测定
用溶氧仪测定发酵过程的溶氧，开始时
供氧和需氧达到平衡，溶氧是一条水平
线。这是停止通气，保持搅拌，在罐顶
通入氮气，赶掉氧气。由于微生物对氧
的利用，溶氧迅速下降，过一段时间溶
氧下降缓慢，待溶氧到最低点后在恢复
通气。这样可以得到溶氧随时间变化的
曲线
△ CL/△ t=KLa(C*-CL)-r
CL=-1/KLa(△ CL/△ t+r)+C*
将 CL对△ CL/△ t+r作图，得到一条直线，斜率
为 -1/KLa因此可求得 KLa,延长直线与纵坐标相
交点为 C*
溶解氧浓度随通气变化的情况 KLa的求取
二 参数的离线检测进展
（一） 利用高效液相（ HPLC）分析代谢
中间产物
通过中间代谢产物的测定可以深入了
解微生物代谢的流向，依此来分析代谢的
情况。从而有的放矢的控制发酵过程
例：鸟苷生产
在鸟苷发酵中，发
现发酵到 40小时后
鸟苷合成速率下降，
但糖耗速率并未下
降，而且由于耗糖,
使发酵过程 pH下降，
补入氨水增多。那
么糖耗到哪里去了
呢？
于是进行以下一些
测定与分析
什么因素导致 pH下降？
1、有机酸的积累
有机酸积累 pH下降 补加
氨水
在正常代谢情况下，细胞通过 EMP途径和
TCA循环的过程是为细胞合成提供前体和能
量的，按照细胞经济学的原则不会供过于求，
即不会出现有机酸的积累
若发酵后期有机酸积累会引起加入的 [NH4+]
积累，相应出现产苷速率下降。 —— 代谢不
正常
测定以下中间物
发酵后期丙酮酸积累
2、氨基酸的积累
在有机酸分析的基础上进一步通过 HPLC
测定发酵过程中不同时间发酵液中氨基酸，
结果发现总氨基酸积累并且其积累晚于有
机酸和 [NH4+]积累。
氨基酸成分分析表明，初始发酵液中谷氨
酸浓度比较高，其它氨基酸浓度都较低，
随着发酵过程的进行谷氨酸很快被用于菌
体合成，在 8小时之前已经降到很低水平，
并始终维持在低水平，而在 48小时左右丙
氨酸开始出现明显的积累，发酵液中积累
量达到初始量的 12.6倍之多，其它十余种
氨基酸浓度则变化不大，并且在整个发酵
过程中都维持在较低水平。因此，丙氨酸
浓度变化可能是导致代谢流迁移所致。
3、分析原因
发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，
而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸转化而
来，因此可以推断由于 EMP途径代谢流的
增加造成了丙酮酸的积累，丙酮酸随后转
化为丙氨酸
丙氨酸本身又会对谷氨酸合成酶（ GS）造
成反馈抑制和阻遏，使产苷速率降低。
丙酮酸积累 氨水补加增加
[NH4+]积累 抑制 GS
抑制 TCA循环 丙酮酸积累
激活磷酸果糖激酶 EMP流量增加
恶性循环
丙氨酸
积累
（二） 代谢流迁移的酶学证明
糖代谢途径关键酶
糖酵解途径（ EMP）
在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶：
磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶
磷酸果糖激酶的时序分析
12小时时由于生长处于对数生长初期，代谢活力较低，
所以 PFK的活力相对较低。 24小时后随着发酵过程进
入平稳产物形成期和细胞生长期，磷酸果糖激酶的活
力也基本保持平稳。但是到 40小时以后，鸟苷形成速
率减慢甚至停止，同时观察到氨基酸和有机酸积累，
PFK相对酶活增加，这表明此时通过 EMP途径的糖代
谢通量已有了明显的增加。
丙酮酸激酶时序分析
丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增加，
而是在 24小时就基本上达到其最大值，随
后维持在恒定的水平，这表明在糖代谢时
EMP途径代谢流增加中丙酮酸激酶所起的
作用不大，不是造成代谢流迁移的主要因
素
磷酸戊糖途径（ HMP）关键酶
磷酸戊糖途径中主要的限速酶是 6－磷酸葡
萄糖脱氢酶，该酶催化 6－磷酸葡萄糖脱氢
生成 6－磷酸葡萄糖酸内酯 。
6－磷酸葡萄糖脱氢酶时序分析
由图可以看到，早期 6－磷酸葡萄糖脱氢酶活力很高，
这可能是前期菌体合成代谢比较活跃，通过 HMP途径
合成用于细胞成分的核酸等组成物质；随后基本不变，
从而保持 EMP和 HMP途径通量的平衡，此时稳定持续
的形成产物；但是到 40小时后,6－磷酸葡萄糖脱氢
酶已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵过
程的进行而持续下降。根据物料平衡原则，有可能糖
代谢在 HMP途径通量下降而 EMP途径通量增加。
三羧酸 (TCA)循环的关键酶
三羧酸循环是“消耗”丙酮酸的途径，
三羧酸流量大丙酮酸不会积累。三羧
酸循环中的关键酶为 柠檬酸合成酶,
其催化乙酰辅酶 A与草酰乙酸缩合形
成柠檬酸，是三羧酸循环的启动步骤，
也是三羧酸循环中的主要控制点，由
柠檬酸合成酶所催化的反应是三羧酸
循环中的第一个限速步骤。
柠檬酸合成酶时序分析
从图可以看到,TCA循环的关键酶柠檬
酸合成酶在整个发酵过程中，尤其是在
后期产苷速率下降的过程中都维持比较
平稳的水平，这表明在发酵过程后期所
发生的代谢流迁移时,TCA循环的通量
并没有发生明显的增加。即 代谢流迁移
发生在 EMP和 HMP之间，主要是由于
EMP和 HMP途径之间的分配平衡被打破
所造成的。 EMP途径代谢流的增加造成
了一种代谢流的溢流现象。
丙氨酸脱氢酶的时序分析
在发酵中后期，丙氨酸脱氢酶活力出现了明
显的增加。丙氨酸脱氢酶催化由丙酮酸生成
丙氨酸，该酶活性增加与丙酮酸和丙氨酸的
时序增加相吻合，这些数据表明代谢流的溢
流现象发生在柠檬酸合成酶之前的丙酮酸节
点，通过丙氨酸脱氢酶生成丙氨酸，从而缓
解了 EMP途径代谢流增加造成的代谢不平衡。
结果加入 EMP途径的抑制剂，克服了
代谢流迁移的问题，提高了鸟苷的产
量
（三）与产物合成相关的酶和中间物
测定
例：螺旋霉素生物合成的代谢研究
图 3 螺旋霉素生物合成代谢网络途径
0
50
100
150
200
250
300
350
0 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96
发酵时间 ( h )
峰面积
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
峰面积
F O - Ⅰ
F O - Ⅱ
N S P - Ⅰ
N S P - Ⅱ
SP- Ⅰ
SP- Ⅱ
SP- Ⅲ
图 1 螺旋霉素生物合成中间物动态流量分布图
哪
个
代
谢
中
间
物
过
多
积
累
在发酵后期有 FO-Ⅱ 积累, 要减少 FO-Ⅰ 转化为
FO-Ⅱ 必须降低 C3酰化酶的活力, 但这与 SPⅡ,
SPⅢ 合成有矛盾
在发酵结束时,SP-Ⅰ 还有一定的积累，如能最大
限度的转化为 SP-Ⅱ, SP-Ⅲ,即加强步骤 3对发酵
效率和发酵效价是有积极意义的。而 FO-Ⅱ, NSP-
Ⅱ 的最终积累则导致流量浪费，因为这两种物质最
终不能转化为目的产物。因此必须减小步骤 4的通
量。但由于这几个步骤的转化都是由 C3酰化酶催化
反应，这给改变通量带来一定的困难。
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96
发酵时间（h）
质量浓度（g/L）
乙酸
丁酸
图 2 有机酸前体的动态流量分布图
在图 2中，乙酸和丁酸在从 40小时开始积累
并在 64小时达到最高值，对照图 3螺旋霉素
生物合成代谢网络途径 [9]，我们可以推测在
发酵中前期在图 3中的步骤 1也即大环成环步
骤有一定程度的, 瓶颈, 影响，从而导致乙
酸、丁酸有一定的积累。若能加强这一步骤
的通量，应能提高代谢网络的通量，提高螺
旋霉素的效价。
我们测定了内酯环合成相关的酶活 —— 前体
的活化
酰基激酶和酰基 CoA合成酶活性趋势
测定酶活并建立酶活趋势曲线 。
分析：两种酶在发酵过程中都有两个活性
高峰期,但 出现的时间相差很大 。
酰基激酶的活性高峰期主要集中在发酵中
前期
酰基 CoA合成酶的活性高峰期主要集中在发
酵中后期 。 此外, 酰基 CoA合成酶的活性远
小于酰基激酶的活性 。
图 1 酰基激酶和酰基 CoA合成酶活性趋势
酰基激酶 酰基 CoA
合成酶
酰基激酶在发酵初期出现一个活性高峰，
推测其参与了初级代谢；后一个活力峰出
现在发酵中期，且与酰基 CoA合成酶的第
一个活力峰出现时间相一致，意味着酰基
激酶对次级代谢同样有着重要作用。在螺
旋霉素的生物合成中，酰基 CoA合成酶的
活性主要集中在发酵中后期，推测合成酶
主要参与次级代谢。由于合成酶的活性较
小，推测其可能是大环合成的, 瓶颈,,
如果提高其活性，就有可能大幅度提高发
酵效价。
采取措施：寻找酶的激活剂
添加 ZnSO4,MnCl2,CoCl2,CuSO4等无
机盐, 研究了 Zn2+,Mn2+,Co2+,Cu2+等
二价阳离子对两种酶的影响 。
体外各阳离子对酶活性影响, 确定了各
阳离子对两种酶的最佳添加浓度 （ 表
1） 。
0
200
400
600
800
1000
1200
Divaledt metal ion
Enzyme activity(u/g)
Control
Co2+
Zn2+
Mn2+
Cu2+
图 2 二价阳离子对酰基激酶活性的影响
0
20
40
60
80
100
Divaledt metal ion
Enzyme activity(u/g)
Control
Co2+
Zn2+
Mn2+
Cu2+
图 3 二价阳离子对酰基 CoA合成酶活性的影响
在最佳浓度下, 各离子对两种酶的影
响程度如图 2,3所示 。 对于酰基激酶,
Co2+,Mn2+,Zn2+离子都有明显的激活
作用；而 Cu2+则几乎完全抑制了激酶 。
对于酰基 CoA合成酶, Cu2+却有很强的
激活作用； Co2+,Mn2+有较高的激活作
用；而 Zn2+的作用不明显 。
摇瓶发酵
根据酰基激酶和酰基 CoA合成酶活性趋势曲线,
分别在发酵 0h和 48h添加上述最佳浓度的离子,
测定螺旋霉素的平均发酵效价 （ 表 2） 。
表 2 不同时间添加二价阳离子对螺旋霉素效价的影响
0h 48h
Control Mn2+ Co2+ Mn2+ Co2+ Cu2+
1# 2571 2612 2806 2498 3024 2956
2# 2606 3350 3224 2814 3498 3822
Average 2589 2981 3015 2656 3261 3389
代谢过程检测的新进展 —— 转录谱
基因芯片 —— 微阵列检测 RNA含量
思考题
1、用于在线检测的传感器必须符合哪些要求？
2,pH电极的指示电极能测定 pH值的原理是什么？
3,pH电极的测量范围有没有限制？使用时应注
意哪些问题？
4、溶氧电极能够测定液体中溶氧浓度的原理是什
么？
5、影响溶氧电极测定的灵敏度和准确性的因素有
哪些？
6、哪些仪器可以测定尾气氧和尾气二氧化碳？测
定原理是什么？
