第四节 基因工程
微生物育种的发展史：
? 初级阶段：生产选种和初级的定向选育
? 物理因素诱变育种
? 化学诱变育种
? 杂交育种
? 基因工程
一、基因工程的定义
? 基因工程（ genetic engineering）, 在基因水平上的遗传工
程。利用分子生物学的理论和技术，自觉设计、操纵、改造
和重建细胞的遗传核心 — 基因组，使生物体的遗传性状发
生定向变异，以满足于人类的需要。
? 基因工程是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质
－ DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进
行切割后，把它与作为载体的 DNA分子连接起来，然后与
载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源
遗传物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从
而获得新物种的一种崭新的育种技术。
? 基因工程育种的特点,体外重组性；远缘杂交性；定向性。
二、基因工程的基本操作
? 目的基因的取得；
? 载体的选择；
? 目的基因与载体 DNA的体外重；
? 重组载体引入受体细胞；
? 重组受体细胞的筛选和鉴定；
?,工程菌,或, 工程细胞, 的大规模培养
1,目的基因的取得
一般有三条途径：①从适当
的供体细胞（各种动物、植
物及微生物均可）的 DNA中
分离； ②利用反转录酶的作
用由 mRNA合成 cDNA；③ 由
化学方法合成特定功能的基
因。
2、载体的选择
有了目的基因后，还必
须有符合要求的运送目
的基因的载体，以便把
它运载到受体细胞中进
行增殖和表达。
3、目的基因与载体
DNA的体外重组
用同一种限制性内切酶
处理目的基因和基因载体，
可以形成相同的粘性末端，
然后，将外源目的基因和载
体 DNA混合，在添加 DNA
连接酶，在一定条件下作用，
便可以使目的基因与载体经
过“退火”和连接的步骤形
成重组 DNA。
4、重组载体引入受
体细胞
目前使用最广泛的
受体微生物有大肠杆菌、
枯草杆菌和酿酒酵母。
把重组载体 DNA分子
引入受体细胞的方法很
多，若以重组质粒作载
体时，可以用转化的手
段；如以病毒 DNA作为
重组载体时，则要用感
染的方法。
三、基因工程的应用和发展前景
1、基因工程在工业上的应用
2,基因工程在农业上的应用
3、遗传工程在医疗上的应用
4、基因工程在环境保护中的应用
5、基因工程与基本理论研究
第五节 菌种的衰退、复壮和保藏
一、菌种的衰退与复壮
1,菌种衰退（ degeneration of strains）：由于自发突变导致
某物种原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。
衰退的具体表现
（ 1）原有的形态性状不典型了
（ 2）生长速度变慢，产生的孢子变少
（ 3）代谢产物的生产能力下降
（ 4）致病菌对宿主的侵染能力下降
（ 5）对外界不良条件抵抗力下降
菌种衰退的原因
（ 1）有关基因的自发突变
（ 2）育种后未经很好的分离纯化
（ 3）培养条件的改变
（ 4）污染杂菌
衰退的防止
（ 1）控制传代次数：尽量避免不必要的移种和传代，并将
必要的传代降低到最低限度，以减少自发突变的几率。
（ 2）创造良好的培养条件
（ 3）利用不同类型的细胞进行接种传代
（ 4）采用有效的菌种保藏方法
2.菌种的复壮
? 狭义复壮
在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能
等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，以达
到恢复该菌原有典型性状的一种措施。
? 广义复壮
在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离
和生产性能的测定工作，以期菌种的生产性能逐步有所提
高。
菌种复壮的方法
1）纯种分离法
2）通过宿主体内生长进行复壮
3）淘汰已衰退的个体
二、菌种的保藏
1.菌种保藏的目的：
妥善保藏菌种，达到菌不死、不衰、不乱以及便于研究、交换
和使用的目的。
2.菌种保藏原理：
? 优良纯种的选择（最好休眠体）；
? 良好休眠环境的创造条件（干燥、低温、缺氧、避光、缺乏
营养、加保护剂等）不生长，少死亡，以保持遗传性，减少
变异性。菌种保藏中最主要的因素是干燥和低温（液氮 -
196℃,干冰 -70℃ ）。
3.选择菌种保藏方法要考虑的因素
? 菌种性状的保持；通用性；简便性；设备的普及性。
4,实验室菌种保藏的常用方法：
（ 1）斜面冰箱保藏法,将菌种接在适当的斜面上，待其生长
丰满后，可放在 4℃ 冰箱中保藏。此法一般可保藏 3个月左
右，各类菌种均可用此法进行保藏。
（ 2）半固体穿刺保藏法,将菌种接入半固体直立柱中，然后
进行培养。待长好后，放入 4℃ 冰箱中保藏。此法可保藏半
年左右，它适用于细菌、酵母的菌种保藏。
（ 3）石蜡油封存法,如果将无菌石蜡油加入到上述保藏的菌
种中，使菌种与空气隔绝，则保藏效果更佳，一般可保藏 1
年左右。根据同样的道理，用灭菌的橡皮塞代替棉花塞，
效果更好。此法可保藏 1-2年左右，此法适用于各类菌种的
保藏。
（ 4）砂土管保藏法,取过筛河砂，用 10%盐酸浸泡，用水洗净
后，烘干。再取瘦土，以 4,1量混合，装入小试管、灭菌后，
滴入几滴菌种悬液，用接种针搅匀。然后放入干燥器中，抽
气干燥，放入低温保藏。此法一般可保藏 1至数年。它适用
于产生孢子的微生物的保藏。
（ 5）冰冻干燥保藏法,将高浓度的菌液装入灭菌的安瓿瓶中，
放在低温条件下抽气干燥，其中的水分因升华而逸出，形成
完全干燥的菌块，然后将安瓿瓶在真空条件下融封。这种方
法因菌体内的水分全部被抽掉，无法进行任何代谢作用，所
以保藏期很长，一般在 5年以上。它适用于各大类微生物的
保藏。
? 详细操作方法请参考相关实验书籍
常用菌种保藏方法的比较
见教材 P244
5.菌种的保藏机构
国外：
?美国典型菌种保藏中心（ ATCC）
?美国北部地区研究室（ NRRL）
?荷兰霉菌中心保藏所（ CBS）
?英国国家典型菌种保藏所（ NCTC）
?日本大阪发酵研究所（ IFO）
中国菌种保藏机构：
?中国微生物菌种保藏委员会（ CCGMC） 中科院微生物
所（北京）
?中国典型培养物保藏中心（ CCTCC）
?工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC） 轻工部食品发
酵工业科学研究所（北京）
?抗生素菌种保藏管理中心（ CACC） 中国医学科学院抗
生素研究所（北京）
国际著名的美国 ATCC（ American Type Culture Collection）目
前已改为仅采用两种最有效的方法，即保藏期一般达 5～ 15年的
冷冻干燥保藏法 和保藏期一般达 20年以上的 液氮保藏法,以达到
最大限度地减少传代次数和避免菌种衰退的目的。
我国菌种保藏部分情况：
? 我国由于 1979年 7月成立了中国微生物菌种保藏管理委员会 (CCCCM)，
它的任务是促进我国微生物菌种保藏的合作、协调与发展，以便更好
地利用微生物资源为我国经济建设、科学研究和教学服务。该委员会
下设 7个菌种保藏管理中心。分别收集、保藏、提供各类不同的菌种。
1,中国普通微生物菌种保藏中心（ CGMCC） (中国科学院 )
2,中国农业微生物菌种保藏中心（ ACCC） (中国农业科学院 )
3,中国工业微生物菌种保藏中心（ CICC） (轻工业总会 )
4,中国医学微生物菌种保藏中心（ CMCC） (卫生部 )
5,中国抗生素微生物菌种保藏中心（ CACC） (国家医药管理局 )
6,中国兽医微生物菌种保藏中心（ CVCC） (农业部 )
7,中国林业微生物菌种保藏中心（ CFCC） (中国林业科学院 )。
中国科学院于 1996年 4月成立了中国科学院典型培养物保藏委员会，
该委员会下设 9个库，它们分别是：
? 中国普通微生物保藏管理中心 (CGMCC)；
? 中国病毒保藏中心 (CCGVCC)；
? 细胞库；
? 昆明细胞库；
? 基因库；
? 植物离体种质库 (IVPGC)；
? 稀有濒危特有植物种质库 (REPE)；
? 海洋生物种质库及淡水藻种库 (FACHB)。
我国菌种保藏有三种方法：斜面传代法；冷冻干燥保藏法；液氮保
藏法。
作业题：
1、在现代遗传学和其他许多生物基本理论研究中，为什么要选用微生物
作为研究对象？
2、什么是质粒？有哪些类型？简要说明细菌的几种质粒。
3、基因突变有哪些类型？其特点有哪些？
4、对于基因的抗性突变产生的原因讨论有哪些观点？简述论证的实验依
据。
5、概述基因突变的机制。
6、说明诱变育种的基本环节和原则并解释艾姆斯试验。
7、说明营养缺陷型突变菌株的筛选方法及有关的三种遗传型个体。
8、以革兰氏阳性菌说明转化的具体过程
9、转导有哪些类型？
10、以 F因子为根据,E,coil分成了哪 4种结合型菌株？说明 F因子的传
递过程。
11、什么是基因工程？其基本操作步骤可概括为那些？
微生物育种的发展史：
? 初级阶段：生产选种和初级的定向选育
? 物理因素诱变育种
? 化学诱变育种
? 杂交育种
? 基因工程
一、基因工程的定义
? 基因工程（ genetic engineering）, 在基因水平上的遗传工
程。利用分子生物学的理论和技术，自觉设计、操纵、改造
和重建细胞的遗传核心 — 基因组，使生物体的遗传性状发
生定向变异，以满足于人类的需要。
? 基因工程是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质
－ DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进
行切割后，把它与作为载体的 DNA分子连接起来，然后与
载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源
遗传物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从
而获得新物种的一种崭新的育种技术。
? 基因工程育种的特点,体外重组性；远缘杂交性；定向性。
二、基因工程的基本操作
? 目的基因的取得；
? 载体的选择；
? 目的基因与载体 DNA的体外重；
? 重组载体引入受体细胞；
? 重组受体细胞的筛选和鉴定；
?,工程菌,或, 工程细胞, 的大规模培养
1,目的基因的取得
一般有三条途径：①从适当
的供体细胞（各种动物、植
物及微生物均可）的 DNA中
分离； ②利用反转录酶的作
用由 mRNA合成 cDNA；③ 由
化学方法合成特定功能的基
因。
2、载体的选择
有了目的基因后，还必
须有符合要求的运送目
的基因的载体，以便把
它运载到受体细胞中进
行增殖和表达。
3、目的基因与载体
DNA的体外重组
用同一种限制性内切酶
处理目的基因和基因载体，
可以形成相同的粘性末端，
然后，将外源目的基因和载
体 DNA混合，在添加 DNA
连接酶，在一定条件下作用，
便可以使目的基因与载体经
过“退火”和连接的步骤形
成重组 DNA。
4、重组载体引入受
体细胞
目前使用最广泛的
受体微生物有大肠杆菌、
枯草杆菌和酿酒酵母。
把重组载体 DNA分子
引入受体细胞的方法很
多，若以重组质粒作载
体时，可以用转化的手
段；如以病毒 DNA作为
重组载体时，则要用感
染的方法。
三、基因工程的应用和发展前景
1、基因工程在工业上的应用
2,基因工程在农业上的应用
3、遗传工程在医疗上的应用
4、基因工程在环境保护中的应用
5、基因工程与基本理论研究
第五节 菌种的衰退、复壮和保藏
一、菌种的衰退与复壮
1,菌种衰退（ degeneration of strains）：由于自发突变导致
某物种原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。
衰退的具体表现
（ 1）原有的形态性状不典型了
（ 2）生长速度变慢，产生的孢子变少
（ 3）代谢产物的生产能力下降
（ 4）致病菌对宿主的侵染能力下降
（ 5）对外界不良条件抵抗力下降
菌种衰退的原因
（ 1）有关基因的自发突变
（ 2）育种后未经很好的分离纯化
（ 3）培养条件的改变
（ 4）污染杂菌
衰退的防止
（ 1）控制传代次数：尽量避免不必要的移种和传代，并将
必要的传代降低到最低限度，以减少自发突变的几率。
（ 2）创造良好的培养条件
（ 3）利用不同类型的细胞进行接种传代
（ 4）采用有效的菌种保藏方法
2.菌种的复壮
? 狭义复壮
在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能
等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，以达
到恢复该菌原有典型性状的一种措施。
? 广义复壮
在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离
和生产性能的测定工作，以期菌种的生产性能逐步有所提
高。
菌种复壮的方法
1）纯种分离法
2）通过宿主体内生长进行复壮
3）淘汰已衰退的个体
二、菌种的保藏
1.菌种保藏的目的：
妥善保藏菌种，达到菌不死、不衰、不乱以及便于研究、交换
和使用的目的。
2.菌种保藏原理：
? 优良纯种的选择（最好休眠体）；
? 良好休眠环境的创造条件（干燥、低温、缺氧、避光、缺乏
营养、加保护剂等）不生长，少死亡，以保持遗传性，减少
变异性。菌种保藏中最主要的因素是干燥和低温（液氮 -
196℃,干冰 -70℃ ）。
3.选择菌种保藏方法要考虑的因素
? 菌种性状的保持；通用性；简便性；设备的普及性。
4,实验室菌种保藏的常用方法：
（ 1）斜面冰箱保藏法,将菌种接在适当的斜面上，待其生长
丰满后，可放在 4℃ 冰箱中保藏。此法一般可保藏 3个月左
右，各类菌种均可用此法进行保藏。
（ 2）半固体穿刺保藏法,将菌种接入半固体直立柱中，然后
进行培养。待长好后，放入 4℃ 冰箱中保藏。此法可保藏半
年左右，它适用于细菌、酵母的菌种保藏。
（ 3）石蜡油封存法,如果将无菌石蜡油加入到上述保藏的菌
种中，使菌种与空气隔绝，则保藏效果更佳，一般可保藏 1
年左右。根据同样的道理，用灭菌的橡皮塞代替棉花塞，
效果更好。此法可保藏 1-2年左右，此法适用于各类菌种的
保藏。
（ 4）砂土管保藏法,取过筛河砂，用 10%盐酸浸泡，用水洗净
后，烘干。再取瘦土，以 4,1量混合，装入小试管、灭菌后，
滴入几滴菌种悬液，用接种针搅匀。然后放入干燥器中，抽
气干燥，放入低温保藏。此法一般可保藏 1至数年。它适用
于产生孢子的微生物的保藏。
（ 5）冰冻干燥保藏法,将高浓度的菌液装入灭菌的安瓿瓶中，
放在低温条件下抽气干燥，其中的水分因升华而逸出，形成
完全干燥的菌块，然后将安瓿瓶在真空条件下融封。这种方
法因菌体内的水分全部被抽掉，无法进行任何代谢作用，所
以保藏期很长，一般在 5年以上。它适用于各大类微生物的
保藏。
? 详细操作方法请参考相关实验书籍
常用菌种保藏方法的比较
见教材 P244
5.菌种的保藏机构
国外：
?美国典型菌种保藏中心（ ATCC）
?美国北部地区研究室（ NRRL）
?荷兰霉菌中心保藏所（ CBS）
?英国国家典型菌种保藏所（ NCTC）
?日本大阪发酵研究所（ IFO）
中国菌种保藏机构：
?中国微生物菌种保藏委员会（ CCGMC） 中科院微生物
所（北京）
?中国典型培养物保藏中心（ CCTCC）
?工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC） 轻工部食品发
酵工业科学研究所（北京）
?抗生素菌种保藏管理中心（ CACC） 中国医学科学院抗
生素研究所（北京）
国际著名的美国 ATCC（ American Type Culture Collection）目
前已改为仅采用两种最有效的方法，即保藏期一般达 5～ 15年的
冷冻干燥保藏法 和保藏期一般达 20年以上的 液氮保藏法,以达到
最大限度地减少传代次数和避免菌种衰退的目的。
我国菌种保藏部分情况：
? 我国由于 1979年 7月成立了中国微生物菌种保藏管理委员会 (CCCCM)，
它的任务是促进我国微生物菌种保藏的合作、协调与发展，以便更好
地利用微生物资源为我国经济建设、科学研究和教学服务。该委员会
下设 7个菌种保藏管理中心。分别收集、保藏、提供各类不同的菌种。
1,中国普通微生物菌种保藏中心（ CGMCC） (中国科学院 )
2,中国农业微生物菌种保藏中心（ ACCC） (中国农业科学院 )
3,中国工业微生物菌种保藏中心（ CICC） (轻工业总会 )
4,中国医学微生物菌种保藏中心（ CMCC） (卫生部 )
5,中国抗生素微生物菌种保藏中心（ CACC） (国家医药管理局 )
6,中国兽医微生物菌种保藏中心（ CVCC） (农业部 )
7,中国林业微生物菌种保藏中心（ CFCC） (中国林业科学院 )。
中国科学院于 1996年 4月成立了中国科学院典型培养物保藏委员会，
该委员会下设 9个库，它们分别是：
? 中国普通微生物保藏管理中心 (CGMCC)；
? 中国病毒保藏中心 (CCGVCC)；
? 细胞库；
? 昆明细胞库；
? 基因库；
? 植物离体种质库 (IVPGC)；
? 稀有濒危特有植物种质库 (REPE)；
? 海洋生物种质库及淡水藻种库 (FACHB)。
我国菌种保藏有三种方法：斜面传代法；冷冻干燥保藏法；液氮保
藏法。
作业题：
1、在现代遗传学和其他许多生物基本理论研究中，为什么要选用微生物
作为研究对象？
2、什么是质粒？有哪些类型？简要说明细菌的几种质粒。
3、基因突变有哪些类型？其特点有哪些？
4、对于基因的抗性突变产生的原因讨论有哪些观点？简述论证的实验依
据。
5、概述基因突变的机制。
6、说明诱变育种的基本环节和原则并解释艾姆斯试验。
7、说明营养缺陷型突变菌株的筛选方法及有关的三种遗传型个体。
8、以革兰氏阳性菌说明转化的具体过程
9、转导有哪些类型？
10、以 F因子为根据,E,coil分成了哪 4种结合型菌株？说明 F因子的传
递过程。
11、什么是基因工程？其基本操作步骤可概括为那些？
