第二十章 细胞生长调节因子与组织制剂
第一节 细胞生长调节因子的概述
一、细胞生长调节因子的概念
细胞生长调节因子 系在 体内和体外 对 效应细胞 的
生长, 增殖和分化 起调控作用的一类物质 。
细胞生长因子 常称为 生长因子, 实际上应包括 负
性细胞生长因子, 即 细胞生长抑制因子, 因此以细胞
生长调节因子来表达 广义 的细胞生长因子 。
在很多情况下, 多种免疫细胞间的相互作用是通
过 细胞因子介导 的 。 在 固有性免疫应答 及 适应性免疫
应答 过程中, 细胞因子表现出重要的功能 。
二, 细胞因子的共同特性
共同的特征,
1,绝大多数细胞因子是 低分子量 （ 15～ 30kD）的 蛋
白或糖蛋白 。天然的细胞因子由 抗原、丝裂原 或其他
刺激物 活化的细胞 分泌。
细胞因子 通常以非特异方式发挥作用,即细胞因子
对靶细胞作用 无抗原特异性,也不受 MHC限制 。大
多数细胞因子都以 较高的亲和力 和其受体结合，因此，
很 微量（ pM） 的细胞因子就可对靶细胞产生显著的
生物学作用。细胞因子的分泌是一个 短时自限 的过程。
这是因为,细胞因子的基因 多在细胞受到刺激后 开始
转录, 转录出的 mRNA在短时工作后即被降解 。
2、细胞因子可以旁分泌、自分泌或内分泌的方式发
挥作用。
若某种细胞因子的 靶细胞 也是其产生细胞，则该
因子对靶细胞表现出的生物学作用称为 自分泌效应 ；
若某种细胞因子的产生细胞和靶细胞非同一细胞，表
现出的生物学作用称为 旁分泌效应,在高剂量时也
作用于远处的靶细胞，表现为 内分泌效应 。
3、一种细胞可产生多种细胞因子，不同类型的细胞
也可产生一种或几种相同的细胞因子。一种 细胞因
子可对 多种 靶细胞发生作用，产生多种 不同 的生物学
效应，这种性质称为 多效性 ； 几种 不同的细胞因子也
可对 同一种 靶细胞发生作用，产生 相同或相似 的生物
学效应，这种性质称为 重叠性 。
一种细胞因子可以 抑制 另外一种细胞因子的某种生物
学作用, 表现为 拮抗效应 ；可以 增强 另一种细胞因子
的某种生物学作用, 表现为 协同效应 。 众多细胞因子
在机体内存在, 相互促进或相互抑制, 形成十分复杂
的 细胞因子网络 。
三 细胞因子的分类和生物学活性
（一）细胞因子的种类
细胞因子可被分为 白细胞介素, 干扰素, 肿瘤坏
死因子, 集落刺激因子, 生长因子和趋化性细胞因子
六类 。
白细胞介素 （ IL） 最初是指由白细胞产生又在 白细
胞间 发挥作用的细胞因子, 后来发现白细胞介素可由
其他细胞产生, 也可作用于其他细胞 。
干扰素 （ IFN） 是 最先发现的细胞因子, 因其具
有干扰病毒 感染和复制 的能力 故称干扰素 。 根据来源
和理化性质, 可将干扰素分为 α,β和 γ三种类型 。
IFN-α／ β主要由 白细胞, 成纤维细胞和病毒感染的组
织细胞产生, 也称为 Ⅰ 型干扰素 。 IFN-γ主要由活化
T细胞和 NK细胞产生, 也称为 Ⅱ 型干扰素 。
肿瘤坏死因子 （ TNF） 一种能使肿瘤发生出血
坏死的物质 。 肿瘤坏死因子分为 TNF-α和 TNF-β两种,
前者主要由 活化的单核 -巨噬细胞 产生, 抗原刺激的 T
细胞, 活化的 NK细胞和肥大细胞也分泌 TNF-α。
TNF- β主要由活化的 T细胞 产生, 又称 淋巴毒素 。
集落刺激因子（ CSF）是指能够刺激多能造血
干细胞和不同发育分化阶段的造血干细胞进行增殖
分化,并在 半固体培养基 中形成相应 细胞集落 的细
胞因子。
生长因子 （ GF） 是具有 刺激细胞生长作用 的细
胞因子 。 多种未以生长因子命名的细胞因子也具有
刺激细胞生长的作用, 从这个意义上讲, 它们也是
生长因子, 如 IL-2是 T细胞的生长因子, TNF是成纤
维细胞的生长因子 。 有些生长因子在一定条件下也
可表现对免疫应答的 抑制活性, 如 TGFβ可抑制细胞
毒性 T淋巴细胞 （ CTL） 的成熟 及 巨噬细胞的激活 。
趋化性细胞因子 是一个蛋白质家族，由十余种结
构有较大同源性、分子量多为 8～ 10kD的蛋白组成。
趋化性细胞因子主要由 白细胞与造血微环境中的
基质细胞分泌,可结合 在内皮细胞 的表面，具有对中
性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜
碱性粒细胞的 趋化和激活 活性。
淋巴细胞趋化蛋白,对淋巴细胞有趋化作用 。
二、细胞生长调节因子的一般制备方法与活性测定
（ － ） 一般制备方法
细胞生长调节因子以提取方法制备得量很低, 主
要是通过 组织培养 获得 。
动物细胞培养
1,基本概念
体外培养 就是将活的 生物体结构成分 或者活的 微
小个体 放到体外环境中让共 生存和生长 的技术 。
部分培养 所培养的生物成分无外乎有两种结构形
式, 其一是小块组织或称为 组织块, 其二是将生物组
织分散后制成的 单个细胞 。
体外培养分为 原代培养 和 继代培养 两大类 。
从生物体内取出而用于培养的小块组织一般称为 外植
块 （对于 动物组织 的称谓）,外植体 （对于 植物材料
的称谓）或者简称 植块 。由组织块分散后制成的单个
细胞一般称为 分离的细胞 或者 分散的细胞。
无论是外植块还是分散的单个细胞都可以 直接用
于培养。
体外培养 可分为 植块培养法 和 分离 （ 散 ） 细胞
培养法两大类方法 。 前者就是将植块直接进行培养,
使之在体外条件下存活和生长；而后者就是将细胞悬
液用于培养, 使分散的细胞在体外条件下存活和生长 。
体外培养的结果无外乎有 两种,一是维持生存，一是
发生显著增长。
2,动物细胞的形态和生理特点
（ 1） 形态
动物细胞的结构较原核细胞复杂得多, 而且已不
是靠一个细胞包办一切生理活动, 各种细胞都有明确
的分工 。 为了适应其功能的需要, 细胞的形态也有了
相应的变化, 我们称这种变化为 分化 （ 或称 特化 ） 。
我们通常将离体培养的细胞分为两类,贴壁依赖型 和
贴壁非依赖型, 前者可简称为 贴壁细胞, 后者可简称
为 悬浮细胞 。
在实践中我们还可以看到有些细胞并不 严格地依赖
支持物, 它们既可以贴附于支持物表面生长, 但在一
定条件下, 它们还可以在培养基中呈悬浮状态良好地
生长, 我们把这类细胞称之为 兼性贴壁细胞 。
（ 2）生理特点
① 细胞的分裂周期长
DNA合成期（ S期）
间期 DNA 合成前期（ G1期）
细胞分裂周期 DNA合成后期（ G2期）
分裂期（ M期）
G1期,DNA聚合酶和 RNA的合成。
S期,DNA合成期
G2期,DNA量加倍,RNA合成和染色体螺旋化。
M期：主要是染色体的变化、分裂，并形成子细胞
② 细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象
除少数悬浮培养细胞外,大多数正常二倍体细
胞的生长都需在一定的基质上贴附, 伸展后 才能 生长
增殖 。但在 无血清培养基 内即使加人了这些因子，有
些细胞仍不能贴附生长。 当前很少有适用于贴壁细胞
使用的无血清培养基。
当细胞在基质上分裂增殖，每个细胞与其周围的细
胞相互接触时，细胞就停止增殖。此时若能保持充足
的营养，细胞仍可存活 相当一段时间,但细胞 密度不
再增加,该现象又称之谓 接触抑制或密度依赖抑制现
象 。
一旦细胞转化为 异倍体 后, 该现象随之消失, 细胞
可 多层生长 。 细胞密度 也就可大大增加 。
③ 正常二倍体细胞的生长寿命是有限的
当细胞离体培养开始, 我们称为 原代培养 。 以
后经传代后, 即成为 有限细胞系 。 这时即使培养条
件都很理想, 大多数细胞也只能生长有限的时间 。
细胞经若干代传代培养后将逐渐死亡 。 该时间的长
短决定于细胞来源的种族和年龄 。 当细胞经自然的
或人为的因素转化为异倍体后, 该细胞即可转变成
无限细胞系, 或称 连续细胞系 。 此时细胞的 寿命将
是无限的, 因此更适合工业化生产的需要 。
④ 动物细胞对周围环境十分敏感
动物细胞对周围环境非常敏感, 包括对各种 物理
化学因素, 如渗透压, pH,离子浓度, 剪切力, 微
量元素等的变化耐受力很弱 。 在细胞膜外没有细胞壁
保护, 仅仅有一层很薄的粘多糖蛋白 。 细胞膜是由双
层脂质分子镶嵌着某些蛋白分子构成的膜, 因此一切
能 影响脂质和蛋白分子变性的因素 都会影响动物细
胞的存活 。
⑤ 动物细胞对培养基的要求高
动物细胞对营养的要求很高, 它不仅需要 12种必
需的氨基酸, 8种以上的维生素, 多种无机盐和微量
元素, 以及作为主要碳原的葡萄糖等外, 还需要多种
细胞生长因子和贴壁因子 等才能生长 。
水
水是细胞生命的化学基础,水具有显著的惰性，许多
物质溶在水中后不发生化学变化，这也是水的重要性
质。
1、水的溶剂作用
2、水的热稿定性和导热性
3、水的其它作用
二, 无机盐类
在所布细胞中, 无机盐都是以离子状态存在的 。
1,钠离子与氯离子
钠离子与氯离子都是与细胞活动密切相关的离子成
分 。 钠离子与氯离子在动物体内的主要作用是参与 生
物电活动, 维持水的平衡, 保持渗透压和酸碱平衡 。
2,钾离子
钾在细胞内外的分布也极不平衡, 主要 分布在细胞
内液, 在可兴奋细胞, 钾离子是形成静息电位的离子
基础 。 细胞内的钾离子对于激活某些酶是必需的 。 另
外, 钾离子在调节细胞内环境的酸碱平衡方面也有极
重要的意义 。
3、钙离子
虽然细胞内钙离子的含量还不到人体总含量的 0.l％，
但它的生物功能却非常复杂和异常重要。在 细胞外液
中，钙离子的重要作用之一是以钙盐的形式构成组织
的成分 。因而钙离子对于组织内部细胞之间 相互粘着
起着十分重要的作用。在 进行体外分离（散）细胞培
养时，若要将组织分散成单细胞悬液，可以通过螯合
细胞间钙离子以使之脱离细胞间质细构，从而达到分
散细胞的目的 。在细胞内，钙离子参与许多重要的细
胞生理活动。钙离子是一种 第二信使,钙离子本身或
与 胞浆中钙调节蛋白结合,可调节许多重要的细胞生
命活动。
4,镁离子
镁离子也是构成 细胞间质 的重要成分，对于细胞间
相互稳定结合 有很重要的意义 。
与 ATP的 β及 γ磷酸根螯合，可以降低 ATP的阴离子
浓度，使 ATP能反复地与蛋白质的特定部位结合。这
使得镁离子在蛋白质、核酸、核苷酸、脂类及糖类的
合成中以及肌肉收缩中都不可缺少。
此外，有多种其它的酶都以镁离子作为其 辅助因子 。
神经肌肉的传导也需要镁离子的参加。
5,磷
人体内的磷大部分是以 磷酸钙化合物 的形式存在于
骨质 内。
磷的化合物对细胞物质代谢和生理功能调控的功用
是十分广泛而不可缺少的。
6,碳酸盐
在 维持酸碱平衡 方面非常重要 。 碳酸盐缓冲对是体
内最重要的缓冲体系 。
葡萄糖
葡萄糖是细胞的主要营养物质 。 在葡萄糖分解代
谢过程中, 释放的能量用以合成 ATP,进而为生命活
动提供能量 。 葡萄糖分解可在有氧条件下进行, 其反
应在 线粒体内 发生；亦可在无氧条件下进行, 其反应
在 细胞胞浆内 发生 。
维生素
维生素在细胞代谢中起调节及控制作用, 虽然所
需甚微, 但为代谢正常进行的, 不可缺少 。
血液里有 4个缓冲体系, 分别为 碳酸盐缓冲对, 磷
酸盐缓冲对, 血红蛋白缓冲对 （ KHb／ HHb） 以及
血浆蛋白质缓冲对 。 其中以碳酸盐缓冲体系为多 。
体液渗透压
体液渗透压 主要来自体液中不能自由透过细胞膜的
颗粒 。 溶于血浆中的晶体物质构成血浆晶体渗透压,
而血浆中的蛋白质则构成血浆胶体渗透压 。 主要靠水
的转移来维持细胞内, 外渗透压的相对平衡 。
在生物学实验使用的各种溶液中, 其 渗透压在正常
血浆渗透压范围内的称为等渗溶液 （ 如 0,85％ NaCl
溶液 ） 。
动物细胞培养基大致可以分成 3类：
天然培养基
在细胞培养的早期阶段人们多采用该类材料做培
养基, 如 血浆凝块, 血清, 淋巴液, 胚胎浸液以及
羊水, 腹水等 。
合成培养基
成分明确的化学试剂配制而成 。 单纯采用这种合
成培养基，细胞常常仍不能很好地增殖，甚至细胞都
不能贴壁。因此在使用时常常需要加人一定量的 动物
血清，最常用的是添加 5％～ 10%的小牛血清。在杂
交瘤细胞的培养中，血清的要求更高，常需用 10%
～ 20％的胎牛血清。
无血清培养基
⑥ 动物细胞蛋白修饰功能与细菌不同
动物细胞的蛋白质合成除了在 游离的核糖体 上进
行外, 还在与 糙面内质网上结合的核糖体 上进行 。 在
游离核糖体上合成的蛋白质都用于 细胞质基质内, 而
在与膜结合的核糖体上合成的蛋白质是 分泌性 的和 膜
中的整合蛋白, 它们多数为 糖蛋白 。 这些寡糖链, 有
的在内质网中加接, 有的在高尔基体内加接 。 在内质
网中加接的是 N-链寡糖, 在高尔基体内加接的是 O-
链寡糖, 蛋白质的 糖基化 与细胞的许多生理功能密切
相关, 如 细胞识别, 表面受体, 胞内消化 和 外排分
泌 物等 。 原核生物由于缺少糙面内质网结构, 因此
无法对蛋白质迸行糖基化和其他一系列 翻译后修饰 。
综观动物细胞的上述 6点生理特点, 不难想象,
与采用原核细胞相比, 采用动物细胞作为宿主细胞
生产药品, 有它不足的一面, 如培养条件要求高,
成本贵, 产量低等；但也有它优越的一面, 即它们
多半是 分泌在胞外 的, 收集纯化方便；得到了较完
善的翻译后修饰, 特别是 糖基化, 因此更与天然的
产品一致, 更适于临床使用 。
今后随着动物细胞培养和表达水平的提高, 培养
基成本的下降, 以及动物细胞使用范围的扩大, 如
人造器官, 基因治疗 等, 由动物细胞带来的产值可
能会 超过原核细胞 。
3,生产用动物细胞的要求
（ 1）、什么样的细胞允许用以生产人用的药品 。
正常组织分离的原代细胞
只要是二倍体细胞,二倍体细胞的寿命一般都不会
超过 50代 。
取消了对传代细胞使用的限制
（ 2）、用于生产的动物细胞不外乎 3类
① 原代细胞
原代细胞 是直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消
化而获得的细胞悬液。
② 二倍体细胞系
原代细胞 经过传代、筛选、克隆，从而从多种细
胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细
胞株。
③ 转化细胞系
这类细胞是通过某个转化过程形成的，它常常由于
染色体的断裂变成了 异倍体,从而失去了 正常细胞的
特点,而获得了 无限增殖 的能力。
这种转化过程可以是 自发的,即正常细胞在传代
培养过程中，大部分细胞随着传代次数的增加，寿命
逐渐终结,但其中有个别细胞可自发地转化而形成
有无限生命力的细胞系。
此外,直接从动物的肿瘤组织中建立的细胞系也
是转化的细胞 。由于转化的细胞 具有无限生命力,
而且常常 倍增时间较短, 对培养条件和生长因子等
要求较低,故更适于大规模工业化生产的需要。
为了获取上述所需细胞, 除 原代细胞 需靠自己临
时用动物组织制备外, 一般都可从各国的 细胞库, 如
美国细胞保存中心 和 欧洲动物细胞保存中心等, 或
有关研究机构索取 。 而各单位自己建立的细胞系除保
存在各自单位外, 多数同时也送交细胞保存中心保存 。
我国目前还未成立中心, 细胞分散保存在各研究所 。
4、基因工程细胞的构建和筛选
尽管上述的 原代细胞, 二倍体细胞 系和 转化细胞
系三者都已被用于生产中，但在生产中采用更多的、
更有前景的是 融合细胞 及采用基因工程手段构建的各
种 工程细胞 。
（ 1）, 真核细胞基因表达载体的构建
为了要将 外源基因 在动物细胞中高效表达，首
先要将其构建在一个 高效表达载体 内。目前一般使用
的载体有两类：
一类是 病毒载体,如牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒
和杆状病毒等。
另一类是 质粒载体,而且常常是 穿梭质粒载体,
即在细菌和哺乳动物细胞两者体内都能扩增 。
（ 2）, 基因载体的导人和高效表达工程细胞株的筛
选
载体构建后，如何导人动物细胞呢？目前的方法大致
可分为 4类,
融合法 化学法 物理法 病毒法
细胞融合法 DNA-磷酸钙沉淀法 电穿孔法 重组逆转录病毒介导法
脂质体介导法 DEAE一葡聚糖法 显微注射法 重组洲 A病毒介导法
原生质融合法 染色体介导法 基因枪法 多瘤病毒样颗粒介导法
微细胞介导法
鬼影红细胞介导法
外源基因导入动物细胞 的效率是很低的，依靠构
建载体内的 选择标记 采用相应的 筛选系统,从上百
万个细胞中筛选出已整合并表达外源基因的工程细
胞 。
FDA的规定, 用于生产的工程细胞必须建立两个细
胞库,原始细胞库 和 生产用细胞库 。
5,动物细胞的培养条件
（ 1） 所有的与细胞接触的设备, 器材和溶液, 都必
须保持绝对无菌, 避免细胞外微生物的污染 。
（ 2） 必须有足够的营养供应, 绝对不可有有害的物
质, 避免即使是极微量的有害离子的掺入 。
（ 3） 保证有适量的氧气供应 。
（ 4） 需随时清除细胞代谢中产生的有害产物 。
（ 5） 有良好的适于生存的外界环境, 包括 pH,渗透
压和离子浓度等 。
（ 6） 及时分种, 保持合适的细胞密度 。
6、动物细胞大规模培养的方法
动物细胞培养的方法，一般可根据培养细胞的种
类分为 原代细胞培养 和 传代细胞培养 。
又可根据培养基的不同分为 液体培养 和 固体培养 。
还可根据培养容器和方式的不同分为 静止培养,
旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、
固定床或流化床培养 等。
但从生产实际看，动物细胞的大规模培养主要可
分为 悬浮培养, 贴壁培养和贴壁 -悬浮培养 。
1、悬浮培养 所谓悬浮培养即让细胞自由地悬浮于培
养基内生长增殖。
2、贴壁培养 是必须让细胞贴附在某种基质上生长繁
殖的培养方法。它适用于一切贴附依赖性细胞（贝占
壁细胞），也适用于兼性贴壁细胞。该方法的优缺点
与悬浮培养正好相反，优点是适用的细胞种类广（因
为生产中所使用的细胞绝大多数是贴壁细胞），较容
易采用灌流培养的方式使细胞达到高密度 。
3、贴壁一悬浮培养，或称假悬浮培养
（ 1）微载体培养
（ 2） 包埋和微囊培养
动物细胞生物反应器
1、搅拌罐式生物反应器
2、气升式生物反应器
3、中空纤维式生物反应器
4、透析袋或膜式生物反应器
5、固定床或流化床生物反应器
植物组织和细胞培养 是指在无菌和人工控制的营养
（ 培养基 ） 及环境条件 （ 光照, 温度等 ） 下, 研究植
物的细胞, 组织和器官以及控制其生长发育的技术 。
植 物 细 胞 培 养
一、基本概念
1、植物组织和细胞培养
① 幼苗及较大植株的培养，即为,植物培养, ；
②从植物体各种器官的外植体增殖而形成的愈伤组
织的培养叫做,愈伤组织培养, ；
植物无菌培养技术分如下几类：
③ 能够保持较好分散性的 离体细胞 或 较小细胞团 的液
体培养，称为,悬浮培养, ；
④离体器官的培养，如茎尖、根尖、叶片、花器官各
部分 原基 或 未成熟的花器官 各部分以及未成熟果实的
培养，称为,器官培养,
⑤ 未成熟或成熟的胚胎 的离体培养，则为,胚胎培
养, 。
悬浮培养 是指在液体培养基中, 能够保持良好分散性
的细胞和小的细胞聚集体的培养 。 在此培养条件下组
织化水平较低 。
2、悬浮培养
3,细胞培养
分生组织培养 又称 生长锥培养,是指在人工培养基
上培养茎端分生组织细胞。分生组织，如茎尖分生
组织的部位仅限于顶端 圆锥区,其长度不超过 0.1
mm。研究表明，通过组织培养技术进行植物的快速
繁殖试验时往往并没有利用这么小的外植体，而是
利用较大的茎尖组织，通常包括 1～ 2个叶原基。
4,分生组织培养
细胞培养是指利用单个细胞进行液体或固体培养, 诱
导其 增殖及分化 。 其目的是为了得到 单细胞无性繁殖
系 。
5,外植体
外植体 是指用于植物组织 （ 细胞 ） 培养的器官或组
织 （ 的 切段 ）, 植物的各部位如根, 茎, 叶, 花, 果,
穗, 胚珠, 胚乳, 花药和花粉等均可作为外植体进行
组织培养 。
6,器官形成
器官形成 一般是指在组织培养或悬浮培养物中芽、
根或花等器官的 分化与形成 。或者在先形成的 小根基
部迅速形成愈伤组织,然后再 形成芽 ；或者在不同部
位分别形成 芽和根 之后，再形成 维管组织 而将二者连
成一个轴，最后形成 小植株 。
如果在培养过程中小植株的发生途径与正常的受精卵
发育方式 极为近似 时, 通常称为, 胚胎形成, 。 当
在体细胞或花药培养中培养物是小孢子这样的 单倍体
细胞, 其所形成的胚胎结构叫做, 胚状体, （ 或, 不
定胚, ） 。
7,无性繁殖系
无性繁殖系 （ clone） 又叫 克隆, 是指使用母体培
养物反复进行 继代培养 时, 通过同种外植体而获得越
来越多的无性繁殖后代而言, 如 根无性系, 组织无性
系, 悬浮培养物无性系 等 。 在上述 无性系 的培养中,
有时其局部的组织无论在结构, 生长速度以及颜色方
面都表现出明显的区别, 如继续进行 选择培养, 则从
同一无性系可分离形成二个或多个不同的系列, 该系
列称为, 无性系的变异体,
8,突变体
细胞本身发生遗传变异或应用诱变处理发生的遗传
变异所得的新细胞, 即为 突变体 。 由单细胞形成的无
性系称为, 单细胞无性系, ；如果这种单细胞无性系
是从同一组织分离得到的, 并彼此不同时, 叫做, 单
细胞变异体, 。
9,继代培养
由最初的外植体上切下的新增殖的组织, 培养一代
称为, 第一代培养, 。 连续多代的培养即为, 继代培
养,, 又称, 连续培养, 。 但习惯上, 连续培养, 一
词多用于不断加人新的培养基, 并连续收集培养物以
保持平衡而进行的长期不转移的悬浮培养 。
二, 植物细胞的结构特征
植物细胞内部的细微结构只有在透射电子显微镜下
才能观察到 。 植物细胞由 细胞壁和原生质体 两部分组
成 。 原生质体包括细胞质, 细胞核和液泡 。 细胞质和
细胞核组成原生质 。 后含物常存在于细胞质和液泡中 。
与动物细胞与微生物细胞相比, 植物细胞有 3个特点,
即具有 细胞壁, 液泡和质体 （ 如叶绿体 ）
三, 细胞后含物和生理活性物质
细胞中除含有生命的原生质体外, 还有许多 非生
命的物质, 它们均为细胞代谢过程中的产物 。 一类是
后含物, 系 储藏物质或废弃物质, 分布于液泡内,
如糖类, 盐类, 生物碱, 苷, 有机酸, 挥发油等；另
一类为 生理活性物质, 对细胞内生化代谢和生理活动
起着调节作用, 含量虽少, 但其生理作用却非常重要,
如酶, 维生素, 植物激素和抗生素等 。
四, 植物培养细胞的生理特性
由于植物细胞自身的特性，使得植物细胞培养的操
作条件与微生物培养不尽相同。
植物培养细胞重量的增加主要是取决于 对数期,而
次级代谢产物的累积则主要在 稳定期完成 。
就植物培养细胞而言，它们很少以 单一细胞悬浮生
长,而多以 非均相集合体 的 细胞团形式存在 。根据细
胞系的来源、培养基及培养时间等的不同,细胞团 的
细胞数目在 2～ 200之间,直径为 2 mm左右。
原因有二,
①细胞分裂之后没有进行细胞分离；
②在间歇培养过程中细胞处于对数生长后期时，
开始分泌 粘多糖和蛋白质,或者以其他方式形成 粘性
表面,从而形成细胞团。
植物细胞形态上的 另一个特性,就是其 纤维素细胞
壁 使得其外骨架相当脆弱，表现为抗张力强度大，抗
剪切能力小。
所有的植物细胞都是好气性的。
与微生物细胞相反，它并不需要很高的 气液传质速
率,而是要 控制供氧量,以保持 较低的溶氧水平 。此
外，大多数植物细胞液体培养的 pH为 5～ 7，在此 pH
水平，通气速率过高会 驱除二氧化碳而抑制细胞生长,
这个问题可通过在通气过程中 加人一定浓度的二氧化
碳来解决。
应该指出的是，植物培养细胞的碳源供应仅有很少
一部分是通过光合作用实现的，这是由于入射光的穿
透性不强所导致的植物培养细胞的 光合作用效率低下 。
植物细胞液体培养过程中的 泡沫问题,气泡比微生
物培养系统中的大，而且由于其含有蛋白质或粘多糖，
粘度较大，细胞极易被包埋在泡沫中，并从循环的营
养液中带出来，这就造成了 非均相培养 。
通常要采用化学或机械的方法加以控制 。
植物细胞培养的基本技术
－, 植物材料的准备
用于植物组织培养的 外植体, 必须是无杂菌材料 。
如果不是取自 种子库, 而是来自温室或生长在大田植
物的种子, 幼苗, 器官, 组织等, 因此培养前必须对
外植体进行严格的 灭菌处理 。
原则上 应尽可能选择那些 灭菌后易于除去或容易分
解的试剂 。 灭菌剂的 选择和处理时间 的长短取决于所
用材料对试剂的敏感性 。
最常用的灭菌剂是 次氯酸钙、次氯酸钠和氯化汞 。
二, 培养基及其组成
培养基实际上是植物离体器官, 组织或细胞等的
,无菌土壤,, 其特点是营养成分的可调控性 。
植物组织和细胞培养所用培养基种类较多，但通
常都含有无机盐、碳源、有机氮源、植物生长激素、
维生素等化学成分。
1,无机盐
2,碳源
植物细胞培养物通常均为异养细胞 。 因此, 人们经
常使用碳水化合物, 肌醇作为碳源, 有时也用甘油,
乳糖和半乳糖等化合物 。
有些培养物还可通过同化二氧化碳而获得所需的能
量, 此所谓 光自养培养物 。
3,植物生长调节剂
植物激素 是指植物代谢过程中形成的生长调节物质，
在极低浓度时即能调节植物的生育过程，并 能从合成
部位转运到作用部位而发挥作用 。植物激素只限于天
然产生的调节物质，到目前为止，已发现植物组织中
可以形成 5种植物激素，即 生长素、分裂素、赤霉素、
脱落酸和乙烯。
4,有机氮源
5,维生素
三、培养方法
植物细胞培养，按培养对象来说，可分为 原生质
体培养和单倍体细胞培养 ；按培养基类型可分为 固
体培养和液体培养 ；按培养方式可分为 悬浮细胞培
养和固定化细胞培养 。
所谓 固体培养 系统实际上包括利用琼脂作为支持物
的固体培养和固定化细胞培养。
固体培养的特点是 简便易行,所占 空间小 。
但也有一些 缺点,
①外植体或其愈伤组织仅有一部分与培养基相接触，
该部位的营养物质可被迅速吸收，从而形成培养基中
营养物质的浓度差，并进而导致愈伤组织生长的不平
衡；
②由于外植体的基部插人固体培养基中，因此该
处呈现 气体交换不畅 的状态，阻碍了组织呼吸作用的
正常进行，同时也会堆积生长过程中排出的 有害物质 ；
③在静止状态下，由于重力作用，以及光线从上部
或一侧射人，因而在愈伤组织细胞间出现了 极化现象,
结果导致细胞群体的不均匀状态。
④固体培养物有时需要测定一些生理生化指标 。
常用的 固化剂 有 琼脂、藻酸盐、角叉藻聚糖、明胶、
羟乙基纤维素、聚丙烯酰胺、淀粉和硅胶 等。
这些物质可 与水可逆性结合,而且可以保证培养基
的湿度，这一切均取决于固化剂的浓度。最常用的凝
固剂是琼脂，其最适浓度为 0.6％～ 1.0％。硅胶或明
胶也可作为凝固剂使用。明胶的使用浓度为 10%。近
年来，尚有人使用聚丙烯酰胺或泡沫塑料作为固化剂。
固体培养还是液体培养一般温度控制在 25± 1℃ 之
间。有些植物材料在诱导愈伤组织时需要在黑暗条件
下进行，但诱导愈伤组织的器官分化和其他材料的培
养都需要光照。光照以 每天 16h为宜，光照度因材料
不同而异，数百到数千勒克司（ lx）的光源，一般为
日光灯。
外植体在培养 3周左右 必须移换至新鲜培养基上，以
保持培养物的继续正常生长。移换一次培养基称一次
继代培养 。一种外植体经过 一定次数 的继代培养，其
培养物就可用于 悬浮培养 。由于外植体诱导形成的愈
伤组织开始比较紧密坚实，所以需要经过较长时间的
多次继代培养后,愈伤组织变得较为疏松 时才能进行
悬浮培养。
液体培养系统包括小规模的 悬浮培养 和大规模的
成批培养,半 连续和连续培养 。悬浮培养可分为 静止
和振荡 两类。静止液体培养具有简便易行的特点，而
且培养基还不会出现营养物质浓度差的现象。振荡液
体培养，是使悬浮细胞在液体培养基中，并不断振
（转）动下进行培养。
1、成批培养法
将培养基一次性加入反应器，接种、培养一定时间后
收获细胞的操作方式称为成批培养法 。
植物细胞培养过程中，次级代谢产物的大量累积往
往发生在细胞生长的 稳定期,人们基于此原理设计了
植物细胞的 两步培养法,即使用两个生物反应器，第
一个反应器用于细胞生物量的 累积,第二个反应器用
于次级代谢产物的 生产 。
2,半连续培养法
在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培
养液和新鲜培养液进行交换的培养方法称为 半连续培
养法。
3,连续培养法
连续培养法是利用连续培养反应器, 在投料和接种
培养一段时间后, 以一定速度连续采集细胞和培养液,
并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境长期
维持恒定的方法 。
4,固定化培养法
植物次级代谢产物的累积主要在细胞生长的稳定期,
表明细胞 成块而趋于分化 时, 细胞块中各个细胞处于
一定 理化梯度 之下, 此现象与完整植株类似, 由此人
们提出了植物细胞固定化培养技术 。
细胞位置固定, 易于获得 高密度细胞群体 及维持细
胞间的 物理化学梯度, 利于细胞组织化, 易于控制培
养条件及获得 次级代谢产物 。
四、植物细胞培养的生物反应器
（一）、机械搅拌式生物反应器
（二）、鼓泡塔生物反应器
（三）、气升式生物反应器
（四）、转鼓式生物反应器
（五）、固定化细胞生物反应器
细胞生长过程可归纳为,
① 生长细胞体积倍增, 可制备同步化的细胞 。
② 生长细胞复制 DNA,也有蛋白质的含量变化 。
制备中应特别注意以下几点,
（ 1） 生产中必须保证生产条件的一致性, 以免影响
质量 。
（ 2） 使用转化细胞系 （ 特别是肿瘤原性细胞系 ） 作
为制备细胞因子的基质, 应使用严格的纯化手段, 以
去除可能引起安全性问题的污染物 。
（ 3） 在外来宿主中表达的天然的基因编码的细胞因
子, 其结构, 生物学或免疫学性质可能与天然的细胞
因子不同 。
（ 4） 生长程序中可能带来有害的中间产物, 如内毒
素, 表达产物中潜在的致癌性 DNA。
（ 5）制定生产规程应详尽介绍细胞系、添加物（如
诱生剂）、增强对或其他物质（如抗生素）等的特性。
二、测定方法
分离纯化后的细胞生长调节因子, 常用放射免疫
法直接测定, 但其 活性 和 细胞生物学作用机制 方面的
研究仍采用 细胞培养测定活性 。
测定中注意以下几点：
（ 1） 必须根据因子的作用特性, 掌握其生长需求条
件, 排除 细胞代谢产物 的影响, 若出现 生长抑制 的现
象, 可增加或 更换新鲜培养液 。
（ 2） 选择适宜的细胞培养系统和敏感的靶细胞 。
（ 3） 作用效应指标的选择 。
（ 4）必须采取特异性生物学试验来评价其活性。
（ 5）应测定 比活性,并有高纯度的参照品。
三、重要的细胞生长因 子
1、结构和性质
人促红细胞生成素（ hEPO）是由 166个或基酸残基组
成的糖蛋白激素。其分子量为 21.3KD，水解并除去 27
个疏水氨基酸肽段后得到分子量 18.4KD的激素。基因
工程生产的 hEPO分子量为 23KD，比天然产物大，说
明有少量低聚糖化。
4,作用与用途
促红细胞生成素主要由肾脏分泌，也可由巨噬细胞
或其他细胞产生，具有刺激活体内增生红细胞的功能。
（二）表皮细胞生长因子
1962年从中提取出一种多肽能直接刺激表皮的生长
和角化，故命名为表皮生长因子。
hEGF分子量为 6.2KD,等电点 pH4.5 。
4、作用与用途
EGF能促进细胞的增殖 ;实验证明 EGF对体外培养的
细胞的 增殖刺激作用 不限于上皮细胞，其作用是 广谱
的。
（三）抑素
专指组织特异性的 抗分裂素物质 。定义为一种由
机体内某种组织产生并通过 抑制有丝分裂作用 来控制
该组织生长的物质。
抑素 是一组与核酸或多糖有关的 生物活性蛋白质或
多肽,其抑裂活性具 组织特异性 而 无种属特异性,也
无细胞毒作用 。
可望在治疗肿瘤或免疫排斥等方面发挥作用 。
第二节 组织制剂
一,组织制剂 系指采用动物的组织、器官、腺体等提
取得到的具有生理作用的混合制剂。
该制剂所含成分未经纯化成单一组分，常常含有
多肽、激素、核梭类物质、多糖及少量蛋白质等多种
成分，组成较为复杂。
二, 组织制剂的一般制备方法
该类制剂的一般制备程序是：
（ 1） 将组织, 器官, 腺体等原料粉碎 。
（ 2） 采用亲水性溶剂将其有生物作用的物质提取出
来 。
（ 3） 依据蛋白质的特点, 采用适当的分离手段如 等
电点沉淀, 盐析, 有机溶剂沉淀, 吸咐, 离子交换,
超滤等 除去非有效成分, 特别是异种蛋白 。
（ 4） 提取物经浓缩或冷冻干燥成半成品
（ 5） 将半成品再配制成适宜的剂型 。
三、组织制剂的生理活性和临床应用
传统的中医中药结合现代提取、分离手段，则形成
为当今的动物组织提取制剂，井在临床应用中占有一
席之地。
第一节 细胞生长调节因子的概述
一、细胞生长调节因子的概念
细胞生长调节因子 系在 体内和体外 对 效应细胞 的
生长, 增殖和分化 起调控作用的一类物质 。
细胞生长因子 常称为 生长因子, 实际上应包括 负
性细胞生长因子, 即 细胞生长抑制因子, 因此以细胞
生长调节因子来表达 广义 的细胞生长因子 。
在很多情况下, 多种免疫细胞间的相互作用是通
过 细胞因子介导 的 。 在 固有性免疫应答 及 适应性免疫
应答 过程中, 细胞因子表现出重要的功能 。
二, 细胞因子的共同特性
共同的特征,
1,绝大多数细胞因子是 低分子量 （ 15～ 30kD）的 蛋
白或糖蛋白 。天然的细胞因子由 抗原、丝裂原 或其他
刺激物 活化的细胞 分泌。
细胞因子 通常以非特异方式发挥作用,即细胞因子
对靶细胞作用 无抗原特异性,也不受 MHC限制 。大
多数细胞因子都以 较高的亲和力 和其受体结合，因此，
很 微量（ pM） 的细胞因子就可对靶细胞产生显著的
生物学作用。细胞因子的分泌是一个 短时自限 的过程。
这是因为,细胞因子的基因 多在细胞受到刺激后 开始
转录, 转录出的 mRNA在短时工作后即被降解 。
2、细胞因子可以旁分泌、自分泌或内分泌的方式发
挥作用。
若某种细胞因子的 靶细胞 也是其产生细胞，则该
因子对靶细胞表现出的生物学作用称为 自分泌效应 ；
若某种细胞因子的产生细胞和靶细胞非同一细胞，表
现出的生物学作用称为 旁分泌效应,在高剂量时也
作用于远处的靶细胞，表现为 内分泌效应 。
3、一种细胞可产生多种细胞因子，不同类型的细胞
也可产生一种或几种相同的细胞因子。一种 细胞因
子可对 多种 靶细胞发生作用，产生多种 不同 的生物学
效应，这种性质称为 多效性 ； 几种 不同的细胞因子也
可对 同一种 靶细胞发生作用，产生 相同或相似 的生物
学效应，这种性质称为 重叠性 。
一种细胞因子可以 抑制 另外一种细胞因子的某种生物
学作用, 表现为 拮抗效应 ；可以 增强 另一种细胞因子
的某种生物学作用, 表现为 协同效应 。 众多细胞因子
在机体内存在, 相互促进或相互抑制, 形成十分复杂
的 细胞因子网络 。
三 细胞因子的分类和生物学活性
（一）细胞因子的种类
细胞因子可被分为 白细胞介素, 干扰素, 肿瘤坏
死因子, 集落刺激因子, 生长因子和趋化性细胞因子
六类 。
白细胞介素 （ IL） 最初是指由白细胞产生又在 白细
胞间 发挥作用的细胞因子, 后来发现白细胞介素可由
其他细胞产生, 也可作用于其他细胞 。
干扰素 （ IFN） 是 最先发现的细胞因子, 因其具
有干扰病毒 感染和复制 的能力 故称干扰素 。 根据来源
和理化性质, 可将干扰素分为 α,β和 γ三种类型 。
IFN-α／ β主要由 白细胞, 成纤维细胞和病毒感染的组
织细胞产生, 也称为 Ⅰ 型干扰素 。 IFN-γ主要由活化
T细胞和 NK细胞产生, 也称为 Ⅱ 型干扰素 。
肿瘤坏死因子 （ TNF） 一种能使肿瘤发生出血
坏死的物质 。 肿瘤坏死因子分为 TNF-α和 TNF-β两种,
前者主要由 活化的单核 -巨噬细胞 产生, 抗原刺激的 T
细胞, 活化的 NK细胞和肥大细胞也分泌 TNF-α。
TNF- β主要由活化的 T细胞 产生, 又称 淋巴毒素 。
集落刺激因子（ CSF）是指能够刺激多能造血
干细胞和不同发育分化阶段的造血干细胞进行增殖
分化,并在 半固体培养基 中形成相应 细胞集落 的细
胞因子。
生长因子 （ GF） 是具有 刺激细胞生长作用 的细
胞因子 。 多种未以生长因子命名的细胞因子也具有
刺激细胞生长的作用, 从这个意义上讲, 它们也是
生长因子, 如 IL-2是 T细胞的生长因子, TNF是成纤
维细胞的生长因子 。 有些生长因子在一定条件下也
可表现对免疫应答的 抑制活性, 如 TGFβ可抑制细胞
毒性 T淋巴细胞 （ CTL） 的成熟 及 巨噬细胞的激活 。
趋化性细胞因子 是一个蛋白质家族，由十余种结
构有较大同源性、分子量多为 8～ 10kD的蛋白组成。
趋化性细胞因子主要由 白细胞与造血微环境中的
基质细胞分泌,可结合 在内皮细胞 的表面，具有对中
性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜
碱性粒细胞的 趋化和激活 活性。
淋巴细胞趋化蛋白,对淋巴细胞有趋化作用 。
二、细胞生长调节因子的一般制备方法与活性测定
（ － ） 一般制备方法
细胞生长调节因子以提取方法制备得量很低, 主
要是通过 组织培养 获得 。
动物细胞培养
1,基本概念
体外培养 就是将活的 生物体结构成分 或者活的 微
小个体 放到体外环境中让共 生存和生长 的技术 。
部分培养 所培养的生物成分无外乎有两种结构形
式, 其一是小块组织或称为 组织块, 其二是将生物组
织分散后制成的 单个细胞 。
体外培养分为 原代培养 和 继代培养 两大类 。
从生物体内取出而用于培养的小块组织一般称为 外植
块 （对于 动物组织 的称谓）,外植体 （对于 植物材料
的称谓）或者简称 植块 。由组织块分散后制成的单个
细胞一般称为 分离的细胞 或者 分散的细胞。
无论是外植块还是分散的单个细胞都可以 直接用
于培养。
体外培养 可分为 植块培养法 和 分离 （ 散 ） 细胞
培养法两大类方法 。 前者就是将植块直接进行培养,
使之在体外条件下存活和生长；而后者就是将细胞悬
液用于培养, 使分散的细胞在体外条件下存活和生长 。
体外培养的结果无外乎有 两种,一是维持生存，一是
发生显著增长。
2,动物细胞的形态和生理特点
（ 1） 形态
动物细胞的结构较原核细胞复杂得多, 而且已不
是靠一个细胞包办一切生理活动, 各种细胞都有明确
的分工 。 为了适应其功能的需要, 细胞的形态也有了
相应的变化, 我们称这种变化为 分化 （ 或称 特化 ） 。
我们通常将离体培养的细胞分为两类,贴壁依赖型 和
贴壁非依赖型, 前者可简称为 贴壁细胞, 后者可简称
为 悬浮细胞 。
在实践中我们还可以看到有些细胞并不 严格地依赖
支持物, 它们既可以贴附于支持物表面生长, 但在一
定条件下, 它们还可以在培养基中呈悬浮状态良好地
生长, 我们把这类细胞称之为 兼性贴壁细胞 。
（ 2）生理特点
① 细胞的分裂周期长
DNA合成期（ S期）
间期 DNA 合成前期（ G1期）
细胞分裂周期 DNA合成后期（ G2期）
分裂期（ M期）
G1期,DNA聚合酶和 RNA的合成。
S期,DNA合成期
G2期,DNA量加倍,RNA合成和染色体螺旋化。
M期：主要是染色体的变化、分裂，并形成子细胞
② 细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象
除少数悬浮培养细胞外,大多数正常二倍体细
胞的生长都需在一定的基质上贴附, 伸展后 才能 生长
增殖 。但在 无血清培养基 内即使加人了这些因子，有
些细胞仍不能贴附生长。 当前很少有适用于贴壁细胞
使用的无血清培养基。
当细胞在基质上分裂增殖，每个细胞与其周围的细
胞相互接触时，细胞就停止增殖。此时若能保持充足
的营养，细胞仍可存活 相当一段时间,但细胞 密度不
再增加,该现象又称之谓 接触抑制或密度依赖抑制现
象 。
一旦细胞转化为 异倍体 后, 该现象随之消失, 细胞
可 多层生长 。 细胞密度 也就可大大增加 。
③ 正常二倍体细胞的生长寿命是有限的
当细胞离体培养开始, 我们称为 原代培养 。 以
后经传代后, 即成为 有限细胞系 。 这时即使培养条
件都很理想, 大多数细胞也只能生长有限的时间 。
细胞经若干代传代培养后将逐渐死亡 。 该时间的长
短决定于细胞来源的种族和年龄 。 当细胞经自然的
或人为的因素转化为异倍体后, 该细胞即可转变成
无限细胞系, 或称 连续细胞系 。 此时细胞的 寿命将
是无限的, 因此更适合工业化生产的需要 。
④ 动物细胞对周围环境十分敏感
动物细胞对周围环境非常敏感, 包括对各种 物理
化学因素, 如渗透压, pH,离子浓度, 剪切力, 微
量元素等的变化耐受力很弱 。 在细胞膜外没有细胞壁
保护, 仅仅有一层很薄的粘多糖蛋白 。 细胞膜是由双
层脂质分子镶嵌着某些蛋白分子构成的膜, 因此一切
能 影响脂质和蛋白分子变性的因素 都会影响动物细
胞的存活 。
⑤ 动物细胞对培养基的要求高
动物细胞对营养的要求很高, 它不仅需要 12种必
需的氨基酸, 8种以上的维生素, 多种无机盐和微量
元素, 以及作为主要碳原的葡萄糖等外, 还需要多种
细胞生长因子和贴壁因子 等才能生长 。
水
水是细胞生命的化学基础,水具有显著的惰性，许多
物质溶在水中后不发生化学变化，这也是水的重要性
质。
1、水的溶剂作用
2、水的热稿定性和导热性
3、水的其它作用
二, 无机盐类
在所布细胞中, 无机盐都是以离子状态存在的 。
1,钠离子与氯离子
钠离子与氯离子都是与细胞活动密切相关的离子成
分 。 钠离子与氯离子在动物体内的主要作用是参与 生
物电活动, 维持水的平衡, 保持渗透压和酸碱平衡 。
2,钾离子
钾在细胞内外的分布也极不平衡, 主要 分布在细胞
内液, 在可兴奋细胞, 钾离子是形成静息电位的离子
基础 。 细胞内的钾离子对于激活某些酶是必需的 。 另
外, 钾离子在调节细胞内环境的酸碱平衡方面也有极
重要的意义 。
3、钙离子
虽然细胞内钙离子的含量还不到人体总含量的 0.l％，
但它的生物功能却非常复杂和异常重要。在 细胞外液
中，钙离子的重要作用之一是以钙盐的形式构成组织
的成分 。因而钙离子对于组织内部细胞之间 相互粘着
起着十分重要的作用。在 进行体外分离（散）细胞培
养时，若要将组织分散成单细胞悬液，可以通过螯合
细胞间钙离子以使之脱离细胞间质细构，从而达到分
散细胞的目的 。在细胞内，钙离子参与许多重要的细
胞生理活动。钙离子是一种 第二信使,钙离子本身或
与 胞浆中钙调节蛋白结合,可调节许多重要的细胞生
命活动。
4,镁离子
镁离子也是构成 细胞间质 的重要成分，对于细胞间
相互稳定结合 有很重要的意义 。
与 ATP的 β及 γ磷酸根螯合，可以降低 ATP的阴离子
浓度，使 ATP能反复地与蛋白质的特定部位结合。这
使得镁离子在蛋白质、核酸、核苷酸、脂类及糖类的
合成中以及肌肉收缩中都不可缺少。
此外，有多种其它的酶都以镁离子作为其 辅助因子 。
神经肌肉的传导也需要镁离子的参加。
5,磷
人体内的磷大部分是以 磷酸钙化合物 的形式存在于
骨质 内。
磷的化合物对细胞物质代谢和生理功能调控的功用
是十分广泛而不可缺少的。
6,碳酸盐
在 维持酸碱平衡 方面非常重要 。 碳酸盐缓冲对是体
内最重要的缓冲体系 。
葡萄糖
葡萄糖是细胞的主要营养物质 。 在葡萄糖分解代
谢过程中, 释放的能量用以合成 ATP,进而为生命活
动提供能量 。 葡萄糖分解可在有氧条件下进行, 其反
应在 线粒体内 发生；亦可在无氧条件下进行, 其反应
在 细胞胞浆内 发生 。
维生素
维生素在细胞代谢中起调节及控制作用, 虽然所
需甚微, 但为代谢正常进行的, 不可缺少 。
血液里有 4个缓冲体系, 分别为 碳酸盐缓冲对, 磷
酸盐缓冲对, 血红蛋白缓冲对 （ KHb／ HHb） 以及
血浆蛋白质缓冲对 。 其中以碳酸盐缓冲体系为多 。
体液渗透压
体液渗透压 主要来自体液中不能自由透过细胞膜的
颗粒 。 溶于血浆中的晶体物质构成血浆晶体渗透压,
而血浆中的蛋白质则构成血浆胶体渗透压 。 主要靠水
的转移来维持细胞内, 外渗透压的相对平衡 。
在生物学实验使用的各种溶液中, 其 渗透压在正常
血浆渗透压范围内的称为等渗溶液 （ 如 0,85％ NaCl
溶液 ） 。
动物细胞培养基大致可以分成 3类：
天然培养基
在细胞培养的早期阶段人们多采用该类材料做培
养基, 如 血浆凝块, 血清, 淋巴液, 胚胎浸液以及
羊水, 腹水等 。
合成培养基
成分明确的化学试剂配制而成 。 单纯采用这种合
成培养基，细胞常常仍不能很好地增殖，甚至细胞都
不能贴壁。因此在使用时常常需要加人一定量的 动物
血清，最常用的是添加 5％～ 10%的小牛血清。在杂
交瘤细胞的培养中，血清的要求更高，常需用 10%
～ 20％的胎牛血清。
无血清培养基
⑥ 动物细胞蛋白修饰功能与细菌不同
动物细胞的蛋白质合成除了在 游离的核糖体 上进
行外, 还在与 糙面内质网上结合的核糖体 上进行 。 在
游离核糖体上合成的蛋白质都用于 细胞质基质内, 而
在与膜结合的核糖体上合成的蛋白质是 分泌性 的和 膜
中的整合蛋白, 它们多数为 糖蛋白 。 这些寡糖链, 有
的在内质网中加接, 有的在高尔基体内加接 。 在内质
网中加接的是 N-链寡糖, 在高尔基体内加接的是 O-
链寡糖, 蛋白质的 糖基化 与细胞的许多生理功能密切
相关, 如 细胞识别, 表面受体, 胞内消化 和 外排分
泌 物等 。 原核生物由于缺少糙面内质网结构, 因此
无法对蛋白质迸行糖基化和其他一系列 翻译后修饰 。
综观动物细胞的上述 6点生理特点, 不难想象,
与采用原核细胞相比, 采用动物细胞作为宿主细胞
生产药品, 有它不足的一面, 如培养条件要求高,
成本贵, 产量低等；但也有它优越的一面, 即它们
多半是 分泌在胞外 的, 收集纯化方便；得到了较完
善的翻译后修饰, 特别是 糖基化, 因此更与天然的
产品一致, 更适于临床使用 。
今后随着动物细胞培养和表达水平的提高, 培养
基成本的下降, 以及动物细胞使用范围的扩大, 如
人造器官, 基因治疗 等, 由动物细胞带来的产值可
能会 超过原核细胞 。
3,生产用动物细胞的要求
（ 1）、什么样的细胞允许用以生产人用的药品 。
正常组织分离的原代细胞
只要是二倍体细胞,二倍体细胞的寿命一般都不会
超过 50代 。
取消了对传代细胞使用的限制
（ 2）、用于生产的动物细胞不外乎 3类
① 原代细胞
原代细胞 是直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消
化而获得的细胞悬液。
② 二倍体细胞系
原代细胞 经过传代、筛选、克隆，从而从多种细
胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细
胞株。
③ 转化细胞系
这类细胞是通过某个转化过程形成的，它常常由于
染色体的断裂变成了 异倍体,从而失去了 正常细胞的
特点,而获得了 无限增殖 的能力。
这种转化过程可以是 自发的,即正常细胞在传代
培养过程中，大部分细胞随着传代次数的增加，寿命
逐渐终结,但其中有个别细胞可自发地转化而形成
有无限生命力的细胞系。
此外,直接从动物的肿瘤组织中建立的细胞系也
是转化的细胞 。由于转化的细胞 具有无限生命力,
而且常常 倍增时间较短, 对培养条件和生长因子等
要求较低,故更适于大规模工业化生产的需要。
为了获取上述所需细胞, 除 原代细胞 需靠自己临
时用动物组织制备外, 一般都可从各国的 细胞库, 如
美国细胞保存中心 和 欧洲动物细胞保存中心等, 或
有关研究机构索取 。 而各单位自己建立的细胞系除保
存在各自单位外, 多数同时也送交细胞保存中心保存 。
我国目前还未成立中心, 细胞分散保存在各研究所 。
4、基因工程细胞的构建和筛选
尽管上述的 原代细胞, 二倍体细胞 系和 转化细胞
系三者都已被用于生产中，但在生产中采用更多的、
更有前景的是 融合细胞 及采用基因工程手段构建的各
种 工程细胞 。
（ 1）, 真核细胞基因表达载体的构建
为了要将 外源基因 在动物细胞中高效表达，首
先要将其构建在一个 高效表达载体 内。目前一般使用
的载体有两类：
一类是 病毒载体,如牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒
和杆状病毒等。
另一类是 质粒载体,而且常常是 穿梭质粒载体,
即在细菌和哺乳动物细胞两者体内都能扩增 。
（ 2）, 基因载体的导人和高效表达工程细胞株的筛
选
载体构建后，如何导人动物细胞呢？目前的方法大致
可分为 4类,
融合法 化学法 物理法 病毒法
细胞融合法 DNA-磷酸钙沉淀法 电穿孔法 重组逆转录病毒介导法
脂质体介导法 DEAE一葡聚糖法 显微注射法 重组洲 A病毒介导法
原生质融合法 染色体介导法 基因枪法 多瘤病毒样颗粒介导法
微细胞介导法
鬼影红细胞介导法
外源基因导入动物细胞 的效率是很低的，依靠构
建载体内的 选择标记 采用相应的 筛选系统,从上百
万个细胞中筛选出已整合并表达外源基因的工程细
胞 。
FDA的规定, 用于生产的工程细胞必须建立两个细
胞库,原始细胞库 和 生产用细胞库 。
5,动物细胞的培养条件
（ 1） 所有的与细胞接触的设备, 器材和溶液, 都必
须保持绝对无菌, 避免细胞外微生物的污染 。
（ 2） 必须有足够的营养供应, 绝对不可有有害的物
质, 避免即使是极微量的有害离子的掺入 。
（ 3） 保证有适量的氧气供应 。
（ 4） 需随时清除细胞代谢中产生的有害产物 。
（ 5） 有良好的适于生存的外界环境, 包括 pH,渗透
压和离子浓度等 。
（ 6） 及时分种, 保持合适的细胞密度 。
6、动物细胞大规模培养的方法
动物细胞培养的方法，一般可根据培养细胞的种
类分为 原代细胞培养 和 传代细胞培养 。
又可根据培养基的不同分为 液体培养 和 固体培养 。
还可根据培养容器和方式的不同分为 静止培养,
旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、
固定床或流化床培养 等。
但从生产实际看，动物细胞的大规模培养主要可
分为 悬浮培养, 贴壁培养和贴壁 -悬浮培养 。
1、悬浮培养 所谓悬浮培养即让细胞自由地悬浮于培
养基内生长增殖。
2、贴壁培养 是必须让细胞贴附在某种基质上生长繁
殖的培养方法。它适用于一切贴附依赖性细胞（贝占
壁细胞），也适用于兼性贴壁细胞。该方法的优缺点
与悬浮培养正好相反，优点是适用的细胞种类广（因
为生产中所使用的细胞绝大多数是贴壁细胞），较容
易采用灌流培养的方式使细胞达到高密度 。
3、贴壁一悬浮培养，或称假悬浮培养
（ 1）微载体培养
（ 2） 包埋和微囊培养
动物细胞生物反应器
1、搅拌罐式生物反应器
2、气升式生物反应器
3、中空纤维式生物反应器
4、透析袋或膜式生物反应器
5、固定床或流化床生物反应器
植物组织和细胞培养 是指在无菌和人工控制的营养
（ 培养基 ） 及环境条件 （ 光照, 温度等 ） 下, 研究植
物的细胞, 组织和器官以及控制其生长发育的技术 。
植 物 细 胞 培 养
一、基本概念
1、植物组织和细胞培养
① 幼苗及较大植株的培养，即为,植物培养, ；
②从植物体各种器官的外植体增殖而形成的愈伤组
织的培养叫做,愈伤组织培养, ；
植物无菌培养技术分如下几类：
③ 能够保持较好分散性的 离体细胞 或 较小细胞团 的液
体培养，称为,悬浮培养, ；
④离体器官的培养，如茎尖、根尖、叶片、花器官各
部分 原基 或 未成熟的花器官 各部分以及未成熟果实的
培养，称为,器官培养,
⑤ 未成熟或成熟的胚胎 的离体培养，则为,胚胎培
养, 。
悬浮培养 是指在液体培养基中, 能够保持良好分散性
的细胞和小的细胞聚集体的培养 。 在此培养条件下组
织化水平较低 。
2、悬浮培养
3,细胞培养
分生组织培养 又称 生长锥培养,是指在人工培养基
上培养茎端分生组织细胞。分生组织，如茎尖分生
组织的部位仅限于顶端 圆锥区,其长度不超过 0.1
mm。研究表明，通过组织培养技术进行植物的快速
繁殖试验时往往并没有利用这么小的外植体，而是
利用较大的茎尖组织，通常包括 1～ 2个叶原基。
4,分生组织培养
细胞培养是指利用单个细胞进行液体或固体培养, 诱
导其 增殖及分化 。 其目的是为了得到 单细胞无性繁殖
系 。
5,外植体
外植体 是指用于植物组织 （ 细胞 ） 培养的器官或组
织 （ 的 切段 ）, 植物的各部位如根, 茎, 叶, 花, 果,
穗, 胚珠, 胚乳, 花药和花粉等均可作为外植体进行
组织培养 。
6,器官形成
器官形成 一般是指在组织培养或悬浮培养物中芽、
根或花等器官的 分化与形成 。或者在先形成的 小根基
部迅速形成愈伤组织,然后再 形成芽 ；或者在不同部
位分别形成 芽和根 之后，再形成 维管组织 而将二者连
成一个轴，最后形成 小植株 。
如果在培养过程中小植株的发生途径与正常的受精卵
发育方式 极为近似 时, 通常称为, 胚胎形成, 。 当
在体细胞或花药培养中培养物是小孢子这样的 单倍体
细胞, 其所形成的胚胎结构叫做, 胚状体, （ 或, 不
定胚, ） 。
7,无性繁殖系
无性繁殖系 （ clone） 又叫 克隆, 是指使用母体培
养物反复进行 继代培养 时, 通过同种外植体而获得越
来越多的无性繁殖后代而言, 如 根无性系, 组织无性
系, 悬浮培养物无性系 等 。 在上述 无性系 的培养中,
有时其局部的组织无论在结构, 生长速度以及颜色方
面都表现出明显的区别, 如继续进行 选择培养, 则从
同一无性系可分离形成二个或多个不同的系列, 该系
列称为, 无性系的变异体,
8,突变体
细胞本身发生遗传变异或应用诱变处理发生的遗传
变异所得的新细胞, 即为 突变体 。 由单细胞形成的无
性系称为, 单细胞无性系, ；如果这种单细胞无性系
是从同一组织分离得到的, 并彼此不同时, 叫做, 单
细胞变异体, 。
9,继代培养
由最初的外植体上切下的新增殖的组织, 培养一代
称为, 第一代培养, 。 连续多代的培养即为, 继代培
养,, 又称, 连续培养, 。 但习惯上, 连续培养, 一
词多用于不断加人新的培养基, 并连续收集培养物以
保持平衡而进行的长期不转移的悬浮培养 。
二, 植物细胞的结构特征
植物细胞内部的细微结构只有在透射电子显微镜下
才能观察到 。 植物细胞由 细胞壁和原生质体 两部分组
成 。 原生质体包括细胞质, 细胞核和液泡 。 细胞质和
细胞核组成原生质 。 后含物常存在于细胞质和液泡中 。
与动物细胞与微生物细胞相比, 植物细胞有 3个特点,
即具有 细胞壁, 液泡和质体 （ 如叶绿体 ）
三, 细胞后含物和生理活性物质
细胞中除含有生命的原生质体外, 还有许多 非生
命的物质, 它们均为细胞代谢过程中的产物 。 一类是
后含物, 系 储藏物质或废弃物质, 分布于液泡内,
如糖类, 盐类, 生物碱, 苷, 有机酸, 挥发油等；另
一类为 生理活性物质, 对细胞内生化代谢和生理活动
起着调节作用, 含量虽少, 但其生理作用却非常重要,
如酶, 维生素, 植物激素和抗生素等 。
四, 植物培养细胞的生理特性
由于植物细胞自身的特性，使得植物细胞培养的操
作条件与微生物培养不尽相同。
植物培养细胞重量的增加主要是取决于 对数期,而
次级代谢产物的累积则主要在 稳定期完成 。
就植物培养细胞而言，它们很少以 单一细胞悬浮生
长,而多以 非均相集合体 的 细胞团形式存在 。根据细
胞系的来源、培养基及培养时间等的不同,细胞团 的
细胞数目在 2～ 200之间,直径为 2 mm左右。
原因有二,
①细胞分裂之后没有进行细胞分离；
②在间歇培养过程中细胞处于对数生长后期时，
开始分泌 粘多糖和蛋白质,或者以其他方式形成 粘性
表面,从而形成细胞团。
植物细胞形态上的 另一个特性,就是其 纤维素细胞
壁 使得其外骨架相当脆弱，表现为抗张力强度大，抗
剪切能力小。
所有的植物细胞都是好气性的。
与微生物细胞相反，它并不需要很高的 气液传质速
率,而是要 控制供氧量,以保持 较低的溶氧水平 。此
外，大多数植物细胞液体培养的 pH为 5～ 7，在此 pH
水平，通气速率过高会 驱除二氧化碳而抑制细胞生长,
这个问题可通过在通气过程中 加人一定浓度的二氧化
碳来解决。
应该指出的是，植物培养细胞的碳源供应仅有很少
一部分是通过光合作用实现的，这是由于入射光的穿
透性不强所导致的植物培养细胞的 光合作用效率低下 。
植物细胞液体培养过程中的 泡沫问题,气泡比微生
物培养系统中的大，而且由于其含有蛋白质或粘多糖，
粘度较大，细胞极易被包埋在泡沫中，并从循环的营
养液中带出来，这就造成了 非均相培养 。
通常要采用化学或机械的方法加以控制 。
植物细胞培养的基本技术
－, 植物材料的准备
用于植物组织培养的 外植体, 必须是无杂菌材料 。
如果不是取自 种子库, 而是来自温室或生长在大田植
物的种子, 幼苗, 器官, 组织等, 因此培养前必须对
外植体进行严格的 灭菌处理 。
原则上 应尽可能选择那些 灭菌后易于除去或容易分
解的试剂 。 灭菌剂的 选择和处理时间 的长短取决于所
用材料对试剂的敏感性 。
最常用的灭菌剂是 次氯酸钙、次氯酸钠和氯化汞 。
二, 培养基及其组成
培养基实际上是植物离体器官, 组织或细胞等的
,无菌土壤,, 其特点是营养成分的可调控性 。
植物组织和细胞培养所用培养基种类较多，但通
常都含有无机盐、碳源、有机氮源、植物生长激素、
维生素等化学成分。
1,无机盐
2,碳源
植物细胞培养物通常均为异养细胞 。 因此, 人们经
常使用碳水化合物, 肌醇作为碳源, 有时也用甘油,
乳糖和半乳糖等化合物 。
有些培养物还可通过同化二氧化碳而获得所需的能
量, 此所谓 光自养培养物 。
3,植物生长调节剂
植物激素 是指植物代谢过程中形成的生长调节物质，
在极低浓度时即能调节植物的生育过程，并 能从合成
部位转运到作用部位而发挥作用 。植物激素只限于天
然产生的调节物质，到目前为止，已发现植物组织中
可以形成 5种植物激素，即 生长素、分裂素、赤霉素、
脱落酸和乙烯。
4,有机氮源
5,维生素
三、培养方法
植物细胞培养，按培养对象来说，可分为 原生质
体培养和单倍体细胞培养 ；按培养基类型可分为 固
体培养和液体培养 ；按培养方式可分为 悬浮细胞培
养和固定化细胞培养 。
所谓 固体培养 系统实际上包括利用琼脂作为支持物
的固体培养和固定化细胞培养。
固体培养的特点是 简便易行,所占 空间小 。
但也有一些 缺点,
①外植体或其愈伤组织仅有一部分与培养基相接触，
该部位的营养物质可被迅速吸收，从而形成培养基中
营养物质的浓度差，并进而导致愈伤组织生长的不平
衡；
②由于外植体的基部插人固体培养基中，因此该
处呈现 气体交换不畅 的状态，阻碍了组织呼吸作用的
正常进行，同时也会堆积生长过程中排出的 有害物质 ；
③在静止状态下，由于重力作用，以及光线从上部
或一侧射人，因而在愈伤组织细胞间出现了 极化现象,
结果导致细胞群体的不均匀状态。
④固体培养物有时需要测定一些生理生化指标 。
常用的 固化剂 有 琼脂、藻酸盐、角叉藻聚糖、明胶、
羟乙基纤维素、聚丙烯酰胺、淀粉和硅胶 等。
这些物质可 与水可逆性结合,而且可以保证培养基
的湿度，这一切均取决于固化剂的浓度。最常用的凝
固剂是琼脂，其最适浓度为 0.6％～ 1.0％。硅胶或明
胶也可作为凝固剂使用。明胶的使用浓度为 10%。近
年来，尚有人使用聚丙烯酰胺或泡沫塑料作为固化剂。
固体培养还是液体培养一般温度控制在 25± 1℃ 之
间。有些植物材料在诱导愈伤组织时需要在黑暗条件
下进行，但诱导愈伤组织的器官分化和其他材料的培
养都需要光照。光照以 每天 16h为宜，光照度因材料
不同而异，数百到数千勒克司（ lx）的光源，一般为
日光灯。
外植体在培养 3周左右 必须移换至新鲜培养基上，以
保持培养物的继续正常生长。移换一次培养基称一次
继代培养 。一种外植体经过 一定次数 的继代培养，其
培养物就可用于 悬浮培养 。由于外植体诱导形成的愈
伤组织开始比较紧密坚实，所以需要经过较长时间的
多次继代培养后,愈伤组织变得较为疏松 时才能进行
悬浮培养。
液体培养系统包括小规模的 悬浮培养 和大规模的
成批培养,半 连续和连续培养 。悬浮培养可分为 静止
和振荡 两类。静止液体培养具有简便易行的特点，而
且培养基还不会出现营养物质浓度差的现象。振荡液
体培养，是使悬浮细胞在液体培养基中，并不断振
（转）动下进行培养。
1、成批培养法
将培养基一次性加入反应器，接种、培养一定时间后
收获细胞的操作方式称为成批培养法 。
植物细胞培养过程中，次级代谢产物的大量累积往
往发生在细胞生长的 稳定期,人们基于此原理设计了
植物细胞的 两步培养法,即使用两个生物反应器，第
一个反应器用于细胞生物量的 累积,第二个反应器用
于次级代谢产物的 生产 。
2,半连续培养法
在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培
养液和新鲜培养液进行交换的培养方法称为 半连续培
养法。
3,连续培养法
连续培养法是利用连续培养反应器, 在投料和接种
培养一段时间后, 以一定速度连续采集细胞和培养液,
并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境长期
维持恒定的方法 。
4,固定化培养法
植物次级代谢产物的累积主要在细胞生长的稳定期,
表明细胞 成块而趋于分化 时, 细胞块中各个细胞处于
一定 理化梯度 之下, 此现象与完整植株类似, 由此人
们提出了植物细胞固定化培养技术 。
细胞位置固定, 易于获得 高密度细胞群体 及维持细
胞间的 物理化学梯度, 利于细胞组织化, 易于控制培
养条件及获得 次级代谢产物 。
四、植物细胞培养的生物反应器
（一）、机械搅拌式生物反应器
（二）、鼓泡塔生物反应器
（三）、气升式生物反应器
（四）、转鼓式生物反应器
（五）、固定化细胞生物反应器
细胞生长过程可归纳为,
① 生长细胞体积倍增, 可制备同步化的细胞 。
② 生长细胞复制 DNA,也有蛋白质的含量变化 。
制备中应特别注意以下几点,
（ 1） 生产中必须保证生产条件的一致性, 以免影响
质量 。
（ 2） 使用转化细胞系 （ 特别是肿瘤原性细胞系 ） 作
为制备细胞因子的基质, 应使用严格的纯化手段, 以
去除可能引起安全性问题的污染物 。
（ 3） 在外来宿主中表达的天然的基因编码的细胞因
子, 其结构, 生物学或免疫学性质可能与天然的细胞
因子不同 。
（ 4） 生长程序中可能带来有害的中间产物, 如内毒
素, 表达产物中潜在的致癌性 DNA。
（ 5）制定生产规程应详尽介绍细胞系、添加物（如
诱生剂）、增强对或其他物质（如抗生素）等的特性。
二、测定方法
分离纯化后的细胞生长调节因子, 常用放射免疫
法直接测定, 但其 活性 和 细胞生物学作用机制 方面的
研究仍采用 细胞培养测定活性 。
测定中注意以下几点：
（ 1） 必须根据因子的作用特性, 掌握其生长需求条
件, 排除 细胞代谢产物 的影响, 若出现 生长抑制 的现
象, 可增加或 更换新鲜培养液 。
（ 2） 选择适宜的细胞培养系统和敏感的靶细胞 。
（ 3） 作用效应指标的选择 。
（ 4）必须采取特异性生物学试验来评价其活性。
（ 5）应测定 比活性,并有高纯度的参照品。
三、重要的细胞生长因 子
1、结构和性质
人促红细胞生成素（ hEPO）是由 166个或基酸残基组
成的糖蛋白激素。其分子量为 21.3KD，水解并除去 27
个疏水氨基酸肽段后得到分子量 18.4KD的激素。基因
工程生产的 hEPO分子量为 23KD，比天然产物大，说
明有少量低聚糖化。
4,作用与用途
促红细胞生成素主要由肾脏分泌，也可由巨噬细胞
或其他细胞产生，具有刺激活体内增生红细胞的功能。
（二）表皮细胞生长因子
1962年从中提取出一种多肽能直接刺激表皮的生长
和角化，故命名为表皮生长因子。
hEGF分子量为 6.2KD,等电点 pH4.5 。
4、作用与用途
EGF能促进细胞的增殖 ;实验证明 EGF对体外培养的
细胞的 增殖刺激作用 不限于上皮细胞，其作用是 广谱
的。
（三）抑素
专指组织特异性的 抗分裂素物质 。定义为一种由
机体内某种组织产生并通过 抑制有丝分裂作用 来控制
该组织生长的物质。
抑素 是一组与核酸或多糖有关的 生物活性蛋白质或
多肽,其抑裂活性具 组织特异性 而 无种属特异性,也
无细胞毒作用 。
可望在治疗肿瘤或免疫排斥等方面发挥作用 。
第二节 组织制剂
一,组织制剂 系指采用动物的组织、器官、腺体等提
取得到的具有生理作用的混合制剂。
该制剂所含成分未经纯化成单一组分，常常含有
多肽、激素、核梭类物质、多糖及少量蛋白质等多种
成分，组成较为复杂。
二, 组织制剂的一般制备方法
该类制剂的一般制备程序是：
（ 1） 将组织, 器官, 腺体等原料粉碎 。
（ 2） 采用亲水性溶剂将其有生物作用的物质提取出
来 。
（ 3） 依据蛋白质的特点, 采用适当的分离手段如 等
电点沉淀, 盐析, 有机溶剂沉淀, 吸咐, 离子交换,
超滤等 除去非有效成分, 特别是异种蛋白 。
（ 4） 提取物经浓缩或冷冻干燥成半成品
（ 5） 将半成品再配制成适宜的剂型 。
三、组织制剂的生理活性和临床应用
传统的中医中药结合现代提取、分离手段，则形成
为当今的动物组织提取制剂，井在临床应用中占有一
席之地。
