第十五章 酶类药物
第一节 酶类药物的原料来源
一, 原料选择
选用原料应 注意以下几点,
（ 1） 不同酶的用料选择：哪里有, 含量高, 选哪 。
（ 2） 注意不同生长发育情况及营养状况,用微生物
制酶, 故需测其活力来决定取酶阶段 。 用动物器官 提
取酶, 则与动物年龄及饲养条件有关 。
（ 3） 从原料来源是否丰富考虑 ；
（ 4） 从简化提纯步骤着手
（ 5） 如用动物组织作原料, 则此动物 宰杀后应立即
取材 。
从动物或植物中提取酶受到原料的 限制, 随着酶
应用日益广泛和需求量的增加, 工业生产的重点已
逐渐转向 微生物 。 用微生物发酵法生产 药用酶, 不
受 季节, 气候 和 地域 的限制, 生产 周期短, 产量高,
成本低, 能大规模生产 。
二, 微生物酶制剂高产菌株的选育
菌种 是工业发酵生产酶制剂的重要条件 。 与 增加品
种, 缩短生产 周期, 改进发 酵和提炼工艺条件 等密切
相关 。
优良菌种的获得有三条途径：
① 是从自然界 分离筛选,
② 是用物理域化学方法处理, 诱变 ；
③ 是用 基因重组 与 细胞融合技术 。 因此微生物的 分离
筛选 是一切工作的基础 。
三, 微生物酶制剂生产的发酵技术
首先要合理选择 培养方法, 培养基, 培养温度,
pH和 通气量 等 。 还要研究酶的分离提纯技术和制备
工艺 。
（ — ） 原料
利用微生物生产酶制剂的主要原料为 碳源 和 氮源,
此外还有 无机盐, 生长因素 和 产酶促进剂 等 。
如果添加少量某种物质就能明显增加酶的产量时,
这类物质通称为 产酶促进剂 。 它们大多属于酶的 诱导
物 或 表面活性剂 。
1,固体培养法
固体培养法亦称 麸曲培养法,该法是利用 麸皮
或米糠 为主要原料，另外视需要添加其它谷糠、豆饼
等，加水拌成 含水适度 的 半固态物料 作为培养基 。
2,液体培养法
液体培养法是利用液体培养进行微生物的生长繁
殖和产酶。根据通气（供氧）方法的不同，又分为 液
体表面培养 和 液体深层培养 两种。
3,影响酶产生的一些因素
菌种 的产酶 性能 是 决定 发酵效果的重要因素, 但
是发酵工艺条件对产酶的影响也是十分明显的 。
（ 1） 温度 一般发酵温度比种子培养时 略高些, 这
样对产酶有利 。
（ 2） pH 可用糖或淀粉调节,pH低则可用氨来调节。
（ 3）通气（供氧） 临界氧浓度 。氧必须是溶解于培
养基中的氧 。
（ 4）搅拌 增加液体湍流速度, 减少气泡周围液膜
厚度 。 有利于促进细胞的新陈代谢 。
（ 5）泡沫和消沫剂 由于培养基中蛋白质分子排在
气泡表面形成一层 吸附膜,聚集成 泡沫层 之故 。
（ 6）添加诱导剂和抑制剂 诱导酶诱导酶的合成，
诱导酶是该酶作用底物或者是其 类似物 。抑制剂促进
酶的形成 。加入适量 表面活性剂 。
第二节酶类药物的提取和纯化
一, 生物材料的预处理
（ 一 ） 动物材料的预处理
1,机械处理
用绞肉机绞，一般细胞并不破碎 。有的酶 必须细胞
破碎 后才能有效地提取，在实验室常用的是 玻璃匀浆
器和组织捣碎器。
2,反复冻融
冷到 -10℃ 左右, 再缓慢溶解至室温, 如此反复多次 。
由于细胞中冰晶的形成, 及 剩下液体中盐浓度的增高,
能使细胞中颗粒及整个细胞破碎, 从而使某些 酶释放
出来 。
3,丙酮粉
组织经丙酮迅速脱水干燥制成 丙酮粉,不仅可 减
少酶的变性,同时因 细胞结构成份的破碎 使 蛋白质
与脂质结合 的某些 化学键打开,促使某些 结合酶 释
放到溶液中，常用的方法是将组织糜或匀浆悬浮于
0.0lmol／ L,pH6.5的磷酸缓冲液 中，在 0℃ 下 一边搅
拌，一边徐徐倒入 10倍体积的 -15℃ 无水丙酮 内,10
分钟后，离心过滤取其沉淀物，反复用冷丙酮洗几次，
真空干燥即得丙酮粉。 丙酮粉在低温下可保存数年 。
（ 二 ） 微生物的预处理
要是酶是 胞外酶,则可除去菌体后再直接从发酵
液中 吸附提取酶 。但对 胞内酶 则需将菌体细胞破壁，
制成 无细胞 的悬液后再行提取。
菌体用生理盐水洗涤除去培养基后，应 深冻保存 。
干燥法, 因为 干燥 常能导致 细胞自溶, 增加酶的
释放, 从而在后处理中破壁不必太剧烈就能达到预期
目的 。
1、干燥法,①空气干燥 25～ 30℃ ② 真空干燥还
原剂作保护剂 ③冷冻干燥对较敏感的酶 宜用此法。
2,机械法,常用的方法有研磨法, 组织匀浆法, 超
声波法, 高压匀浆法等 。
3,酶法处理
用得最多的是 溶菌酶, 如在 37℃, pH8.0下对小球
菌进行破壁处理, 历时 15分钟, 即可提取 核酸酶 。 也
有用 脱氧核糖核酸酶 处理, 操作与 溶菌酶 同 。
二, 酶的提取
1,水溶液法
常用 稀盐溶液或缓冲液提取 。一般在 低温下操作 。
在酸性条件下稳定的酶要在酸性条件下提取。 一般来
说, 碱性蛋白酶用酸性溶液提取, 酸性蛋白酶用碱性
溶液提取。
盐浓度 一般以 等渗为好, 相当于 0.15mol／ L NaCl
的离子强度是最适宜于酶的提取 。
2,有机溶剂法
某些 结合酶 如 微粒体和线粒体膜的酶,由于 和脂
质牢固结合,为此必须除去结合的脂质，且不能使酶
变性，最常用的 有机溶剂是丁醇 。
3、表面活性剂法
表面活性剂能与蛋白质结含而分散在溶液中, 故
可用于提取结合酶 。
三, 酶制剂的工业提取法
（ 一 ） 发酵液的预处理及过滤
微生物发酵液的 分离, 过滤,发酵液中加 絮凝剂
或凝固剂 。 絮凝剂 有 聚丙烯酰胺、右旋糖酐和聚谷
氨酸 。
（ 二 ） 酶液的脱色
活性炭、脱色树脂 。
（ 三 ） 盐析法
用得最多的是（ NH4） 2SO4,在常温下不会造成酶
的失活,若 分级沉淀 应用得当，杂蛋白杂质也较少。
（ 四 ） 有机溶剂法
有机溶剂沉淀蛋白质的能力 为 丙酮＞异丙醇＞乙
醇＞甲醇 。 工业上通常采用乙醇作为沉淀剂 。
（ 五 ） 喷雾干燥直接制备粉末酶制剂
喷雾干燥用于 干燥菌体,药用酶常用冷冻干燥。
四, 酶的纯化
评价纯化工艺主要看二个指标，一是 酶比活, 二
是总活力 回收。
酶在纯化过程中的一些技术难点：
（ 一 ） 杂质的除去
酶提取液中，除所需酶外，还含有大量的 杂蛋白,
多糖、脂类和核酸 等 。
（ 1） pH和加热沉淀法
（ 2）蛋白质表面变性法 利用蛋白质 表面变性 性质的
差别，也可 除去杂蛋白,加入 氯仿和乙醇进行震荡,
可以除去杂蛋白。
（ 3） 选择性变性法
利用蛋白质稳定性的不同, 除去杂蛋白 。
甚至可用 2.5%三氯乙酸 处理 。
（ 4） 核酸沉淀剂法
用 核酸酶, 将核酸降解成核苷酸, 使粘度下降便
于离心分离 。
用 核酸沉淀剂 如 三甲基十六烷基溴化铵, 硫酸链
霉素, 聚乙烯亚胺, 鱼精蛋白和二氯化锰 等 。
（ 5） 将酶与底物结合
酶和底物结合或竞争性抑制剂结合后, 热稳定性
大大提高, 这样就可用加热法除去杂蛋白 。
（ 二 ） 脱盐和浓缩
1,脱盐
脱盐方法是 透析和凝胶过滤 。
2,浓缩
酶的 浓缩方法 很多，有冷冻干燥,离子交换、超滤,
凝胶吸水, 聚乙二醇吸水 等。
（ 三 ） 酶的结晶
把 酶提纯 到一定纯度以后 （ 通常 纯度应达 50%以
上 ）, 可使其结晶, 酶的纯度经常有 一定程度的提高 。
为研究蛋白质空间结构提供 X射线衍射样品 。
1,酶的结晶方法
酶的结晶方法主要是 缓慢地改变酶蛋白的溶解度,
使其略处于过饱和状态。
（ 1）盐析法
操作要在 低温下进行,加盐,缓冲液 pH要接近酶
的等电点。多数酶就可形成结晶 。有时也可 交替置
在 4℃ 冰箱中和室温下 来形成结晶。
（ 2）有机溶剂法 酶液中滴加有机溶剂，有时也能使
酶形成结晶。
一般要含少量无机盐的情况下，选择使酶稳定的
pH，缓慢地滴加 有机溶剂 。 使用的缓冲液 一般 不用
磷酸盐,而用 氯化物或乙酸盐 。
（ 3） 复合结晶法 有时可以利用某些酶与 有机化合物
或 金属离子形成复合物或盐的性质 来结晶 。
（ 4）透析平衡法
（ 5）等电点法
2,结晶条件的选择
（ 1）酶的纯度 酶的纯度越高，结晶越容易，长成大
的单晶可能性也越大。结晶对酶有明显的 纯化作用 。
（ 2） 酶的浓度
（ 3） 温度 结晶的温度通常在 4℃ 下或室温 25℃ 下,
低温条件下酶不仅溶解度低, 而且不易变性 。
（ 4） 时间 结晶形成的时间,数小时到几个月, 有的甚
至需要 1年 或更长时间 。 一般来说, 较大而性能好的
结晶是在生长慢的情况下得到的 。 一般希望使微晶的
形成快些, 然后慢慢地改变沉淀条件, 再使微晶慢慢
长大 。
（ 5） pH
调整 pH可使结晶长到 最佳大小, 也可 改变晶形 。
结晶溶液 pH一般选择在 被结晶酶的等电点附近 。
（ 6）金属离子
许多金属离子能 引起或有助于酶的结晶,在酶的
结晶过程中常用金属离子有 Ca2+,Zn2＋, Co2＋, Cu2
＋, Mg2＋, Mn2＋, Ni2＋ 等 。
（ 7） 晶种 不易结晶 的蛋白质和酶, 有的需 加入微量
的晶种才能结晶,
（ 8）结晶器皿处理
结晶用的器皿要充分 清洗、烘干 。使用前用结晶
母液 再冲洗 一次。 结晶的玻璃器皿，可用 硅涂料 进
行表面处理，以使表面 光滑且不润湿 。这样可 减少晶
核数目,形成大的结晶。
（ 四 ） 酶分离和纯化工作的注意事项
1,防止酶蛋白变性
2,防止辅因子的流失
3,防止酶被蛋白水解酶降解
第三节 酶类药物
一, 药用酶类的概述
早期酶制剂主要用于治疗 消化道疾病, 烧伤及感染
引起的 炎症疾病, 现在国内外己广泛应用于多种疾病
的治疗, 其制剂品种已超过 700余种 。
（ 一 ） 促进消化酶类
（ 二 ） 消炎酶类
（ 三 ） 与纤维蛋白溶解作用有关的酶类
（ 四 ） 抗肿瘤的酶
（ 五 ） 其它药用酶
（ 一 ） 胃蛋白酶 （ Pepsin,EC3.4.4.1）
胃蛋白酶 广泛存在于哺乳类动物的 胃液 中, 药用
胃蛋白酶系从猪, 牛, 羊等家畜的 胃粘膜中提取 。
1,组成 （ 结构 ）, 性质
药用胃蛋白酶是胃液中 多种蛋白水解酶 的 混合物, 含
有 胃蛋白酶, 组织蛋白酶, 胶原酶 等, 为粗制的酶制
剂 。 水溶液呈 酸性, 难溶于乙醇, 氯仿等有机溶剂 。
pI为 pH1.0,最适 pH1.5～ 2.0。 可溶于 70％ 乙醇和
pH4的 20％ 乙醇中 。
胃蛋白酶能 水解大多数天然 蛋白质底物。
2,生产工艺
（ 1） 工艺路线：
胃蛋白酶原盐酸催化激活 成胃蛋白酶 。
常用的 脱脂剂 有 乙醚, 氯仿, 四氯化碳 。
（ 2） 工艺过程：
（ 3） 胃膜素和胃蛋白酶联产工艺,向经 消化, 提取,
脱脂, 分层, 浓缩 及 60％ 丙酮沉淀分离胃膜素 的母液
中, 边搅拌边加 冷丙酮, 至 比重为 0.91,即有淡黄色
胃蛋白酶沉出, 静放过夜, 去上清液, 沉淀真空干燥,
即得胃蛋白酶 。
（ 4） 结晶胃蛋白酶的制备,药用胃蛋白酶原粉, 溶
于 20％ 酒精 中, 加 H2SO4调 pH3.0,5℃ 静置 20h后过
滤, 加 硫酸镁 至饱和, 进行 盐析 。 盐析物再在
pH3.8～ 4.0的乙醇中溶解, 过滤, 滤液用 硫酸调 pH至
1.8～ 2.0,即析出针状胃蛋白酶 。 沉淀再溶于 20%
pH4的乙醇 中, 过滤, 滤液用硫酸调 pH至 1.8,在
20℃ 放置, 可得板状或针状结晶 。
（ 二 ） 胰蛋白酶
胰蛋白酶是从 牛, 羊胰脏 提取, 结晶的冻干制剂 。
易溶于水, 不溶于氯仿, 乙醇, 乙醚等有机溶剂 。 在
pH1.8时, 短时煮沸几乎不失活；在碱溶液中加热则
变性沉淀, Ca2+有保护和激活作用, 胰蛋白酶的 pI为
10.1。
牛胰蛋白酶在 肠激酶 或 自身 催化下, 释放出 6肽,
变成 有活性的胰蛋白酶 。 胰蛋白酶 分子量 24000,由
223个氨基酸残基组成 。
胰蛋白酶 专一作用于由 碱性氨基酸精氨酸及亮氨
酸羧基所组成的肽键 。 酶本身 很容易自溶 。
2,生产工艺
（ 1） 工艺路线：
（ 三 ） 糜蛋白酶 （ Chymotrypsin,EC3.4.4.5）
胰蛋白酶可激活糜蛋白酶原成 α-糜蛋白酶 。
2,生产工艺
（ 1） 工艺路线：
（ 2） 工艺过程：
酶原加少量胰蛋白酶, pH7.6
（ 四 ） 尿激酶 （ Urokinase,EC3.4.99.26）
尿激酶, 是一种 碱性蛋白酶 。 由 肾脏 产生, 主要存
在于人及哺乳动物的 尿中 。 人尿平均含量 5～ 6国际单
位／ m1。
1,组成 （ 结构 ） 性质
（ 1） 尿激酶有多种分子量形式 。 尿中的尿胃蛋白酶
原, 在 酸性条件下 可以激活生成 尿胃蛋白酶, 把天然
尿激酶 降解 成为 尿激酶 。
（ 2） 尿激酶是专一性很强的 蛋白水解酶, 血纤维蛋
白溶酶原是它 唯一 的天然蛋白质底物, 它作用于 精氨
酸 -缬氨酸键使纤溶酶原 转为纤溶酶 。 尿激酶也具有
酯酶活力 。
（ 3） 尿激酶的 pI为 pH8～ 9,主要部分在 pH8.6左右 。
溶液状态不稳定, 冻干状态可 稳定数年 。 加入 1％
EDTA,人血白蛋白或明胶 可防止酶的 表面变性 作用 。
2,生产工艺
（ 1） 工艺路线：
（ 2） 工艺过程：
硅藻土吸附, 0.02％氨水加 0.1mol／ L氯化钠洗脱。
QAE— Sephadex层析柱 去热原、色素。 CM— C浓缩 。
（ 五 ） 细胞色素 C（ Cytochrome C）
细胞色素 C存在于自然界中一切生物细胞里, 其含
量与组织的 活动强度成正比 。 以哺乳动物的 心肌, 鸟
类的 胸肌 和昆虫的 翼肌 含量最多, 肝, 肾 次之, 皮肤
和肺中最少 。
1,组成 （ 结构 ）, 性质
细胞色素 C是 含铁卟啉 的 结合蛋白质, 铁卟啉环
与蛋白质部分 比例为 1∶ 1。 猪心细胞色素 C分子量
12200。 pI为 pH10.2～ 10.8。
细胞色素 C对 干燥, 热和酸 都较稳定 。
氧化型 呈水溶液深红色, 在饱和硫酸铵中可溶解 。
还原型 水溶液呈桃红色, 溶解度较小 。
2,生产工艺
（ 1） 工艺路线：
人造沸石 pH7.5吸附,蒸馏水和氯化钠溶液反复洗
涤, 25％硫酸铵溶液洗脱 。
20％三氯醋酸沉淀细胞色素 C,Amberlite IRC－ 50
（ NH4＋ ）树脂柱吸附 。
（ 六 ） 溶菌酶 （ Lysozyme）
溶菌酶, 又称 胞壁质酶 或 N-乙酰胞壁质聚糖水解
酶 。 它广泛存在于 鸟类和家禽 的 蛋清, 哺乳动物的
泪, 唾液, 血浆, 尿, 乳汁, 白细胞和组织 （ 如肝,
肾 ） 细胞内, 其中以 蛋清含量最丰富 。
溶菌酶是一种具有 杀菌作用的天然抗感染物质,
具有 抗菌, 抗病毒, 抗炎症 。
1,组成 （ 结构 ） 和性质
溶菌酶是一 碱性球蛋白,分子中 碱性氨基酸, 酰
氨残基 及 芳香族氨基酸 （如色氨酸）比例很高。
溶菌酶能催化 粘多糖 或 甲壳素 中的 N-乙酰胞壁酸
和 N-乙酰氨基葡萄糖之间的 β-1,4糖苷键 。
溶菌酶是一种罕见的 稳定蛋白质 。在 pH5.5 加热 4h
后，酶变得更活泼。 低浓度的 Mn（ 10-7mol／ L）在
中性和碱性条件下 能使酶免受热的失活作用。
2,生产工艺
（ 1） 工艺路线
（ 七 ） L-天门冬酰胺酶 （ L-asparaginase）
1,组成 （ 结构 ）, 性质
L-天门冬酰胺酶 是 酰胺基水解酶, 是从 大肠杆菌
菌体中提取分离的酶类药物, 用于治疗白血病 。
性状呈白色粉末状, 微有湿性, 溶于水, 不溶于
丙酮, 氯仿, 乙醚及甲醇 。 最适 pH8.5,最适温度
37℃ 。
L-天门冬酰胺酶的产生菌是 霉菌和细菌, 故可作
制造酶的原料 。
2,生产工艺
（ 1） 工艺路线：
（ 八 ） 激肽释放酶 （ Kallikrein）
激肽释放酶 是一种 蛋白酶 。 哺乳动物的激肽释放
酶有两大类,血液激肽释放酶 和 组织激肽释放酶 。 药
用激肽释放酶又称 血管舒缓素, 主要来自 颌下腺或胰
腺 。
猪胰激肽释放酶是一种 糖蛋白, 含有唾液酸,在腺
体中以 酶原形式 存在。 唾液酸的除去并不影响酶的
活性 。
（ 1）专一性 激肽释放酶是一种 内切蛋白水解酶,当
它作用于蛋白质底物 激肽原 后释放出 激肽 。激肽释放
酶只作用于 天然激肽原 。
（ 2）稳定性 一般说，激肽释放酶的 纯度越高, 稳
定性越差 。 在水溶液中不稳定，但在 pH8.0的水或缓
冲液中，可在冷冻状态下保存相当长时间不失活。
2,生产工艺
（ 1） 工艺路线：
（ 2） 工艺过程：
冷丙酮 33％, 70％，用丙酮、乙醚 脱脂、脱水 。
40%,60%冷丙酮 分级沉淀。
弱酸性阳树脂 Amberlite CG－ 50（钠型）
（ 九 ） 超氧化物歧化酶 （ Superoxide dismutase SOD）
超氧化物歧化酶是一种重要的氧 自由基清除剂, 作
为药用酶在美国, 德国, 澳大利亚等国有产品, 此酶
属 金属酶, 它催化的化学反应是：
由于 SOD能专一清除 超氧阴离子自由基 （ O2-） ；
故引起国内外生化界和医药界的极大关注 。 目前 SOD
临床应用集中在自身免疫性疾病上如类风湿关节炎,
红斑性狼疮, 皮肌炎, 肺气肿等；也用抗辐射, 抗肿
瘤, 治疗氧中毒, 心肌缺氧与缺血再灌注综合征以及
某些心血管疾病 。
1,组成 （ 结构 ）, 性质
SOD属金属酶, 其性质不仅取决于蛋白质部分,
还取决于活性中心金属离子的存在 。 按金属离子种
类不同, SOD有 Cu,Zn-SOD,Mn-SOD和 Fe-SOD。
三种酶都催化同一反应, 但其性质有所不同, 其中
Cu,Zn-SOD与其它两种 SOD差别较大, 而 Mn-SOD
与 Fe-SOD之间差别较小 。
（ 2） SOD的活性中心和构象比较特殊,金属辅基 Cu
和 Zn与必需基团 His等形成咪唑桥 。
（ 3） SOD的理化性质 SOD是一种金属蛋白, 因此它
对热, 对 pH及在某些性质上表现出异常的稳定性 。
① 对热稳定性 SOD对热稳定 。 但 SOD对热稳定性与
溶液的 离子强度 有关, 如果离子强度非常 低, 即使 加
热到 95℃, SOD活性损失亦很少 。
② pH对 SOD的影响 SOD在 pH5.3～ 10.5范围 内其催化
速度不受影响 。 如 pH3.6时 SOD中 Zn要脱落 95％,
pH12.2时, SOD的构象会发生 不可逆的转变, 导致酶
活性丧失 。
③ 吸收光谱
④ 金属辅基与酶活性 SOD是金属酶, Cu与 Zn的作用
是不同的, Zn仅与酶分子结构有关, 而与催化 活性
无关, 而 Cu与催化活性有关, 透析去除 Cu则酶活性
全部丧失, 一旦重新加入 Cu,酶活性又可恢复 。 同
样, Mn和 Fe与 Cu一样, 对酶活性是必需的 。
2,生产工艺
（ 1） 牛红细胞提取 Cu,Zn-SOD的生产工艺：
DEAE－ SephadexA50柱层析
（ 十 ） 弹性蛋白酶 （ Elastase）
弹性蛋白酶, 又称 胰肽酶, 是一种 肽链内切酶,
广泛存在于哺乳动物 胰脏 。 根据它 水解弹性蛋白 的 专
一性 又称为 弹性水解酶 。
胰弹性酶原 合成于胰脏的腺泡组织, 经 胰蛋白酶
或 肠激酶 激活后才成为活性酶 。
弹性蛋白酶有 降血脂, 防止 动脉斑块 形成, 降血
压, 增加心肌血流量和提高血中 cAMP含量等功能 。
1,组成 （ 结构 ）, 性质
弹性蛋白酶为白色针状结晶, 分子量为 25000,pI
为 pH9.5,其 最适 pH通常为 7.4～ 10.3。 结晶 弹性酶 难
溶于水, 电泳纯 的弹性酶 易溶于水和稀盐溶液 （ 可
达 50mg／ ml）, 在 pH4.5以下 溶解度较小, 增加 pH
可以增加溶解度 。
弹性酶在 pH4.0～ 10.5，于 2℃ 较稳定,pH＜ 6.0稳
定性有所增加，冻干粉于 5℃ 可保存 6～ 12个月。 在 -
10℃ 保存更为稳定。
弹性蛋白唯有 弹性酶才能水解。弹性酶除能水解
弹性蛋白 外还可水解 血红蛋白, 血纤维蛋白 等。
2,生产工艺
（ 1） 工艺路线：
（ 2） 工艺过程：
Amberlite CG-50树脂, PH6.4吸附, pH9.3,0.5mol
／ L氯化铵缓冲液洗脱 。
第一节 酶类药物的原料来源
一, 原料选择
选用原料应 注意以下几点,
（ 1） 不同酶的用料选择：哪里有, 含量高, 选哪 。
（ 2） 注意不同生长发育情况及营养状况,用微生物
制酶, 故需测其活力来决定取酶阶段 。 用动物器官 提
取酶, 则与动物年龄及饲养条件有关 。
（ 3） 从原料来源是否丰富考虑 ；
（ 4） 从简化提纯步骤着手
（ 5） 如用动物组织作原料, 则此动物 宰杀后应立即
取材 。
从动物或植物中提取酶受到原料的 限制, 随着酶
应用日益广泛和需求量的增加, 工业生产的重点已
逐渐转向 微生物 。 用微生物发酵法生产 药用酶, 不
受 季节, 气候 和 地域 的限制, 生产 周期短, 产量高,
成本低, 能大规模生产 。
二, 微生物酶制剂高产菌株的选育
菌种 是工业发酵生产酶制剂的重要条件 。 与 增加品
种, 缩短生产 周期, 改进发 酵和提炼工艺条件 等密切
相关 。
优良菌种的获得有三条途径：
① 是从自然界 分离筛选,
② 是用物理域化学方法处理, 诱变 ；
③ 是用 基因重组 与 细胞融合技术 。 因此微生物的 分离
筛选 是一切工作的基础 。
三, 微生物酶制剂生产的发酵技术
首先要合理选择 培养方法, 培养基, 培养温度,
pH和 通气量 等 。 还要研究酶的分离提纯技术和制备
工艺 。
（ — ） 原料
利用微生物生产酶制剂的主要原料为 碳源 和 氮源,
此外还有 无机盐, 生长因素 和 产酶促进剂 等 。
如果添加少量某种物质就能明显增加酶的产量时,
这类物质通称为 产酶促进剂 。 它们大多属于酶的 诱导
物 或 表面活性剂 。
1,固体培养法
固体培养法亦称 麸曲培养法,该法是利用 麸皮
或米糠 为主要原料，另外视需要添加其它谷糠、豆饼
等，加水拌成 含水适度 的 半固态物料 作为培养基 。
2,液体培养法
液体培养法是利用液体培养进行微生物的生长繁
殖和产酶。根据通气（供氧）方法的不同，又分为 液
体表面培养 和 液体深层培养 两种。
3,影响酶产生的一些因素
菌种 的产酶 性能 是 决定 发酵效果的重要因素, 但
是发酵工艺条件对产酶的影响也是十分明显的 。
（ 1） 温度 一般发酵温度比种子培养时 略高些, 这
样对产酶有利 。
（ 2） pH 可用糖或淀粉调节,pH低则可用氨来调节。
（ 3）通气（供氧） 临界氧浓度 。氧必须是溶解于培
养基中的氧 。
（ 4）搅拌 增加液体湍流速度, 减少气泡周围液膜
厚度 。 有利于促进细胞的新陈代谢 。
（ 5）泡沫和消沫剂 由于培养基中蛋白质分子排在
气泡表面形成一层 吸附膜,聚集成 泡沫层 之故 。
（ 6）添加诱导剂和抑制剂 诱导酶诱导酶的合成，
诱导酶是该酶作用底物或者是其 类似物 。抑制剂促进
酶的形成 。加入适量 表面活性剂 。
第二节酶类药物的提取和纯化
一, 生物材料的预处理
（ 一 ） 动物材料的预处理
1,机械处理
用绞肉机绞，一般细胞并不破碎 。有的酶 必须细胞
破碎 后才能有效地提取，在实验室常用的是 玻璃匀浆
器和组织捣碎器。
2,反复冻融
冷到 -10℃ 左右, 再缓慢溶解至室温, 如此反复多次 。
由于细胞中冰晶的形成, 及 剩下液体中盐浓度的增高,
能使细胞中颗粒及整个细胞破碎, 从而使某些 酶释放
出来 。
3,丙酮粉
组织经丙酮迅速脱水干燥制成 丙酮粉,不仅可 减
少酶的变性,同时因 细胞结构成份的破碎 使 蛋白质
与脂质结合 的某些 化学键打开,促使某些 结合酶 释
放到溶液中，常用的方法是将组织糜或匀浆悬浮于
0.0lmol／ L,pH6.5的磷酸缓冲液 中，在 0℃ 下 一边搅
拌，一边徐徐倒入 10倍体积的 -15℃ 无水丙酮 内,10
分钟后，离心过滤取其沉淀物，反复用冷丙酮洗几次，
真空干燥即得丙酮粉。 丙酮粉在低温下可保存数年 。
（ 二 ） 微生物的预处理
要是酶是 胞外酶,则可除去菌体后再直接从发酵
液中 吸附提取酶 。但对 胞内酶 则需将菌体细胞破壁，
制成 无细胞 的悬液后再行提取。
菌体用生理盐水洗涤除去培养基后，应 深冻保存 。
干燥法, 因为 干燥 常能导致 细胞自溶, 增加酶的
释放, 从而在后处理中破壁不必太剧烈就能达到预期
目的 。
1、干燥法,①空气干燥 25～ 30℃ ② 真空干燥还
原剂作保护剂 ③冷冻干燥对较敏感的酶 宜用此法。
2,机械法,常用的方法有研磨法, 组织匀浆法, 超
声波法, 高压匀浆法等 。
3,酶法处理
用得最多的是 溶菌酶, 如在 37℃, pH8.0下对小球
菌进行破壁处理, 历时 15分钟, 即可提取 核酸酶 。 也
有用 脱氧核糖核酸酶 处理, 操作与 溶菌酶 同 。
二, 酶的提取
1,水溶液法
常用 稀盐溶液或缓冲液提取 。一般在 低温下操作 。
在酸性条件下稳定的酶要在酸性条件下提取。 一般来
说, 碱性蛋白酶用酸性溶液提取, 酸性蛋白酶用碱性
溶液提取。
盐浓度 一般以 等渗为好, 相当于 0.15mol／ L NaCl
的离子强度是最适宜于酶的提取 。
2,有机溶剂法
某些 结合酶 如 微粒体和线粒体膜的酶,由于 和脂
质牢固结合,为此必须除去结合的脂质，且不能使酶
变性，最常用的 有机溶剂是丁醇 。
3、表面活性剂法
表面活性剂能与蛋白质结含而分散在溶液中, 故
可用于提取结合酶 。
三, 酶制剂的工业提取法
（ 一 ） 发酵液的预处理及过滤
微生物发酵液的 分离, 过滤,发酵液中加 絮凝剂
或凝固剂 。 絮凝剂 有 聚丙烯酰胺、右旋糖酐和聚谷
氨酸 。
（ 二 ） 酶液的脱色
活性炭、脱色树脂 。
（ 三 ） 盐析法
用得最多的是（ NH4） 2SO4,在常温下不会造成酶
的失活,若 分级沉淀 应用得当，杂蛋白杂质也较少。
（ 四 ） 有机溶剂法
有机溶剂沉淀蛋白质的能力 为 丙酮＞异丙醇＞乙
醇＞甲醇 。 工业上通常采用乙醇作为沉淀剂 。
（ 五 ） 喷雾干燥直接制备粉末酶制剂
喷雾干燥用于 干燥菌体,药用酶常用冷冻干燥。
四, 酶的纯化
评价纯化工艺主要看二个指标，一是 酶比活, 二
是总活力 回收。
酶在纯化过程中的一些技术难点：
（ 一 ） 杂质的除去
酶提取液中，除所需酶外，还含有大量的 杂蛋白,
多糖、脂类和核酸 等 。
（ 1） pH和加热沉淀法
（ 2）蛋白质表面变性法 利用蛋白质 表面变性 性质的
差别，也可 除去杂蛋白,加入 氯仿和乙醇进行震荡,
可以除去杂蛋白。
（ 3） 选择性变性法
利用蛋白质稳定性的不同, 除去杂蛋白 。
甚至可用 2.5%三氯乙酸 处理 。
（ 4） 核酸沉淀剂法
用 核酸酶, 将核酸降解成核苷酸, 使粘度下降便
于离心分离 。
用 核酸沉淀剂 如 三甲基十六烷基溴化铵, 硫酸链
霉素, 聚乙烯亚胺, 鱼精蛋白和二氯化锰 等 。
（ 5） 将酶与底物结合
酶和底物结合或竞争性抑制剂结合后, 热稳定性
大大提高, 这样就可用加热法除去杂蛋白 。
（ 二 ） 脱盐和浓缩
1,脱盐
脱盐方法是 透析和凝胶过滤 。
2,浓缩
酶的 浓缩方法 很多，有冷冻干燥,离子交换、超滤,
凝胶吸水, 聚乙二醇吸水 等。
（ 三 ） 酶的结晶
把 酶提纯 到一定纯度以后 （ 通常 纯度应达 50%以
上 ）, 可使其结晶, 酶的纯度经常有 一定程度的提高 。
为研究蛋白质空间结构提供 X射线衍射样品 。
1,酶的结晶方法
酶的结晶方法主要是 缓慢地改变酶蛋白的溶解度,
使其略处于过饱和状态。
（ 1）盐析法
操作要在 低温下进行,加盐,缓冲液 pH要接近酶
的等电点。多数酶就可形成结晶 。有时也可 交替置
在 4℃ 冰箱中和室温下 来形成结晶。
（ 2）有机溶剂法 酶液中滴加有机溶剂，有时也能使
酶形成结晶。
一般要含少量无机盐的情况下，选择使酶稳定的
pH，缓慢地滴加 有机溶剂 。 使用的缓冲液 一般 不用
磷酸盐,而用 氯化物或乙酸盐 。
（ 3） 复合结晶法 有时可以利用某些酶与 有机化合物
或 金属离子形成复合物或盐的性质 来结晶 。
（ 4）透析平衡法
（ 5）等电点法
2,结晶条件的选择
（ 1）酶的纯度 酶的纯度越高，结晶越容易，长成大
的单晶可能性也越大。结晶对酶有明显的 纯化作用 。
（ 2） 酶的浓度
（ 3） 温度 结晶的温度通常在 4℃ 下或室温 25℃ 下,
低温条件下酶不仅溶解度低, 而且不易变性 。
（ 4） 时间 结晶形成的时间,数小时到几个月, 有的甚
至需要 1年 或更长时间 。 一般来说, 较大而性能好的
结晶是在生长慢的情况下得到的 。 一般希望使微晶的
形成快些, 然后慢慢地改变沉淀条件, 再使微晶慢慢
长大 。
（ 5） pH
调整 pH可使结晶长到 最佳大小, 也可 改变晶形 。
结晶溶液 pH一般选择在 被结晶酶的等电点附近 。
（ 6）金属离子
许多金属离子能 引起或有助于酶的结晶,在酶的
结晶过程中常用金属离子有 Ca2+,Zn2＋, Co2＋, Cu2
＋, Mg2＋, Mn2＋, Ni2＋ 等 。
（ 7） 晶种 不易结晶 的蛋白质和酶, 有的需 加入微量
的晶种才能结晶,
（ 8）结晶器皿处理
结晶用的器皿要充分 清洗、烘干 。使用前用结晶
母液 再冲洗 一次。 结晶的玻璃器皿，可用 硅涂料 进
行表面处理，以使表面 光滑且不润湿 。这样可 减少晶
核数目,形成大的结晶。
（ 四 ） 酶分离和纯化工作的注意事项
1,防止酶蛋白变性
2,防止辅因子的流失
3,防止酶被蛋白水解酶降解
第三节 酶类药物
一, 药用酶类的概述
早期酶制剂主要用于治疗 消化道疾病, 烧伤及感染
引起的 炎症疾病, 现在国内外己广泛应用于多种疾病
的治疗, 其制剂品种已超过 700余种 。
（ 一 ） 促进消化酶类
（ 二 ） 消炎酶类
（ 三 ） 与纤维蛋白溶解作用有关的酶类
（ 四 ） 抗肿瘤的酶
（ 五 ） 其它药用酶
（ 一 ） 胃蛋白酶 （ Pepsin,EC3.4.4.1）
胃蛋白酶 广泛存在于哺乳类动物的 胃液 中, 药用
胃蛋白酶系从猪, 牛, 羊等家畜的 胃粘膜中提取 。
1,组成 （ 结构 ）, 性质
药用胃蛋白酶是胃液中 多种蛋白水解酶 的 混合物, 含
有 胃蛋白酶, 组织蛋白酶, 胶原酶 等, 为粗制的酶制
剂 。 水溶液呈 酸性, 难溶于乙醇, 氯仿等有机溶剂 。
pI为 pH1.0,最适 pH1.5～ 2.0。 可溶于 70％ 乙醇和
pH4的 20％ 乙醇中 。
胃蛋白酶能 水解大多数天然 蛋白质底物。
2,生产工艺
（ 1） 工艺路线：
胃蛋白酶原盐酸催化激活 成胃蛋白酶 。
常用的 脱脂剂 有 乙醚, 氯仿, 四氯化碳 。
（ 2） 工艺过程：
（ 3） 胃膜素和胃蛋白酶联产工艺,向经 消化, 提取,
脱脂, 分层, 浓缩 及 60％ 丙酮沉淀分离胃膜素 的母液
中, 边搅拌边加 冷丙酮, 至 比重为 0.91,即有淡黄色
胃蛋白酶沉出, 静放过夜, 去上清液, 沉淀真空干燥,
即得胃蛋白酶 。
（ 4） 结晶胃蛋白酶的制备,药用胃蛋白酶原粉, 溶
于 20％ 酒精 中, 加 H2SO4调 pH3.0,5℃ 静置 20h后过
滤, 加 硫酸镁 至饱和, 进行 盐析 。 盐析物再在
pH3.8～ 4.0的乙醇中溶解, 过滤, 滤液用 硫酸调 pH至
1.8～ 2.0,即析出针状胃蛋白酶 。 沉淀再溶于 20%
pH4的乙醇 中, 过滤, 滤液用硫酸调 pH至 1.8,在
20℃ 放置, 可得板状或针状结晶 。
（ 二 ） 胰蛋白酶
胰蛋白酶是从 牛, 羊胰脏 提取, 结晶的冻干制剂 。
易溶于水, 不溶于氯仿, 乙醇, 乙醚等有机溶剂 。 在
pH1.8时, 短时煮沸几乎不失活；在碱溶液中加热则
变性沉淀, Ca2+有保护和激活作用, 胰蛋白酶的 pI为
10.1。
牛胰蛋白酶在 肠激酶 或 自身 催化下, 释放出 6肽,
变成 有活性的胰蛋白酶 。 胰蛋白酶 分子量 24000,由
223个氨基酸残基组成 。
胰蛋白酶 专一作用于由 碱性氨基酸精氨酸及亮氨
酸羧基所组成的肽键 。 酶本身 很容易自溶 。
2,生产工艺
（ 1） 工艺路线：
（ 三 ） 糜蛋白酶 （ Chymotrypsin,EC3.4.4.5）
胰蛋白酶可激活糜蛋白酶原成 α-糜蛋白酶 。
2,生产工艺
（ 1） 工艺路线：
（ 2） 工艺过程：
酶原加少量胰蛋白酶, pH7.6
（ 四 ） 尿激酶 （ Urokinase,EC3.4.99.26）
尿激酶, 是一种 碱性蛋白酶 。 由 肾脏 产生, 主要存
在于人及哺乳动物的 尿中 。 人尿平均含量 5～ 6国际单
位／ m1。
1,组成 （ 结构 ） 性质
（ 1） 尿激酶有多种分子量形式 。 尿中的尿胃蛋白酶
原, 在 酸性条件下 可以激活生成 尿胃蛋白酶, 把天然
尿激酶 降解 成为 尿激酶 。
（ 2） 尿激酶是专一性很强的 蛋白水解酶, 血纤维蛋
白溶酶原是它 唯一 的天然蛋白质底物, 它作用于 精氨
酸 -缬氨酸键使纤溶酶原 转为纤溶酶 。 尿激酶也具有
酯酶活力 。
（ 3） 尿激酶的 pI为 pH8～ 9,主要部分在 pH8.6左右 。
溶液状态不稳定, 冻干状态可 稳定数年 。 加入 1％
EDTA,人血白蛋白或明胶 可防止酶的 表面变性 作用 。
2,生产工艺
（ 1） 工艺路线：
（ 2） 工艺过程：
硅藻土吸附, 0.02％氨水加 0.1mol／ L氯化钠洗脱。
QAE— Sephadex层析柱 去热原、色素。 CM— C浓缩 。
（ 五 ） 细胞色素 C（ Cytochrome C）
细胞色素 C存在于自然界中一切生物细胞里, 其含
量与组织的 活动强度成正比 。 以哺乳动物的 心肌, 鸟
类的 胸肌 和昆虫的 翼肌 含量最多, 肝, 肾 次之, 皮肤
和肺中最少 。
1,组成 （ 结构 ）, 性质
细胞色素 C是 含铁卟啉 的 结合蛋白质, 铁卟啉环
与蛋白质部分 比例为 1∶ 1。 猪心细胞色素 C分子量
12200。 pI为 pH10.2～ 10.8。
细胞色素 C对 干燥, 热和酸 都较稳定 。
氧化型 呈水溶液深红色, 在饱和硫酸铵中可溶解 。
还原型 水溶液呈桃红色, 溶解度较小 。
2,生产工艺
（ 1） 工艺路线：
人造沸石 pH7.5吸附,蒸馏水和氯化钠溶液反复洗
涤, 25％硫酸铵溶液洗脱 。
20％三氯醋酸沉淀细胞色素 C,Amberlite IRC－ 50
（ NH4＋ ）树脂柱吸附 。
（ 六 ） 溶菌酶 （ Lysozyme）
溶菌酶, 又称 胞壁质酶 或 N-乙酰胞壁质聚糖水解
酶 。 它广泛存在于 鸟类和家禽 的 蛋清, 哺乳动物的
泪, 唾液, 血浆, 尿, 乳汁, 白细胞和组织 （ 如肝,
肾 ） 细胞内, 其中以 蛋清含量最丰富 。
溶菌酶是一种具有 杀菌作用的天然抗感染物质,
具有 抗菌, 抗病毒, 抗炎症 。
1,组成 （ 结构 ） 和性质
溶菌酶是一 碱性球蛋白,分子中 碱性氨基酸, 酰
氨残基 及 芳香族氨基酸 （如色氨酸）比例很高。
溶菌酶能催化 粘多糖 或 甲壳素 中的 N-乙酰胞壁酸
和 N-乙酰氨基葡萄糖之间的 β-1,4糖苷键 。
溶菌酶是一种罕见的 稳定蛋白质 。在 pH5.5 加热 4h
后，酶变得更活泼。 低浓度的 Mn（ 10-7mol／ L）在
中性和碱性条件下 能使酶免受热的失活作用。
2,生产工艺
（ 1） 工艺路线
（ 七 ） L-天门冬酰胺酶 （ L-asparaginase）
1,组成 （ 结构 ）, 性质
L-天门冬酰胺酶 是 酰胺基水解酶, 是从 大肠杆菌
菌体中提取分离的酶类药物, 用于治疗白血病 。
性状呈白色粉末状, 微有湿性, 溶于水, 不溶于
丙酮, 氯仿, 乙醚及甲醇 。 最适 pH8.5,最适温度
37℃ 。
L-天门冬酰胺酶的产生菌是 霉菌和细菌, 故可作
制造酶的原料 。
2,生产工艺
（ 1） 工艺路线：
（ 八 ） 激肽释放酶 （ Kallikrein）
激肽释放酶 是一种 蛋白酶 。 哺乳动物的激肽释放
酶有两大类,血液激肽释放酶 和 组织激肽释放酶 。 药
用激肽释放酶又称 血管舒缓素, 主要来自 颌下腺或胰
腺 。
猪胰激肽释放酶是一种 糖蛋白, 含有唾液酸,在腺
体中以 酶原形式 存在。 唾液酸的除去并不影响酶的
活性 。
（ 1）专一性 激肽释放酶是一种 内切蛋白水解酶,当
它作用于蛋白质底物 激肽原 后释放出 激肽 。激肽释放
酶只作用于 天然激肽原 。
（ 2）稳定性 一般说，激肽释放酶的 纯度越高, 稳
定性越差 。 在水溶液中不稳定，但在 pH8.0的水或缓
冲液中，可在冷冻状态下保存相当长时间不失活。
2,生产工艺
（ 1） 工艺路线：
（ 2） 工艺过程：
冷丙酮 33％, 70％，用丙酮、乙醚 脱脂、脱水 。
40%,60%冷丙酮 分级沉淀。
弱酸性阳树脂 Amberlite CG－ 50（钠型）
（ 九 ） 超氧化物歧化酶 （ Superoxide dismutase SOD）
超氧化物歧化酶是一种重要的氧 自由基清除剂, 作
为药用酶在美国, 德国, 澳大利亚等国有产品, 此酶
属 金属酶, 它催化的化学反应是：
由于 SOD能专一清除 超氧阴离子自由基 （ O2-） ；
故引起国内外生化界和医药界的极大关注 。 目前 SOD
临床应用集中在自身免疫性疾病上如类风湿关节炎,
红斑性狼疮, 皮肌炎, 肺气肿等；也用抗辐射, 抗肿
瘤, 治疗氧中毒, 心肌缺氧与缺血再灌注综合征以及
某些心血管疾病 。
1,组成 （ 结构 ）, 性质
SOD属金属酶, 其性质不仅取决于蛋白质部分,
还取决于活性中心金属离子的存在 。 按金属离子种
类不同, SOD有 Cu,Zn-SOD,Mn-SOD和 Fe-SOD。
三种酶都催化同一反应, 但其性质有所不同, 其中
Cu,Zn-SOD与其它两种 SOD差别较大, 而 Mn-SOD
与 Fe-SOD之间差别较小 。
（ 2） SOD的活性中心和构象比较特殊,金属辅基 Cu
和 Zn与必需基团 His等形成咪唑桥 。
（ 3） SOD的理化性质 SOD是一种金属蛋白, 因此它
对热, 对 pH及在某些性质上表现出异常的稳定性 。
① 对热稳定性 SOD对热稳定 。 但 SOD对热稳定性与
溶液的 离子强度 有关, 如果离子强度非常 低, 即使 加
热到 95℃, SOD活性损失亦很少 。
② pH对 SOD的影响 SOD在 pH5.3～ 10.5范围 内其催化
速度不受影响 。 如 pH3.6时 SOD中 Zn要脱落 95％,
pH12.2时, SOD的构象会发生 不可逆的转变, 导致酶
活性丧失 。
③ 吸收光谱
④ 金属辅基与酶活性 SOD是金属酶, Cu与 Zn的作用
是不同的, Zn仅与酶分子结构有关, 而与催化 活性
无关, 而 Cu与催化活性有关, 透析去除 Cu则酶活性
全部丧失, 一旦重新加入 Cu,酶活性又可恢复 。 同
样, Mn和 Fe与 Cu一样, 对酶活性是必需的 。
2,生产工艺
（ 1） 牛红细胞提取 Cu,Zn-SOD的生产工艺：
DEAE－ SephadexA50柱层析
（ 十 ） 弹性蛋白酶 （ Elastase）
弹性蛋白酶, 又称 胰肽酶, 是一种 肽链内切酶,
广泛存在于哺乳动物 胰脏 。 根据它 水解弹性蛋白 的 专
一性 又称为 弹性水解酶 。
胰弹性酶原 合成于胰脏的腺泡组织, 经 胰蛋白酶
或 肠激酶 激活后才成为活性酶 。
弹性蛋白酶有 降血脂, 防止 动脉斑块 形成, 降血
压, 增加心肌血流量和提高血中 cAMP含量等功能 。
1,组成 （ 结构 ）, 性质
弹性蛋白酶为白色针状结晶, 分子量为 25000,pI
为 pH9.5,其 最适 pH通常为 7.4～ 10.3。 结晶 弹性酶 难
溶于水, 电泳纯 的弹性酶 易溶于水和稀盐溶液 （ 可
达 50mg／ ml）, 在 pH4.5以下 溶解度较小, 增加 pH
可以增加溶解度 。
弹性酶在 pH4.0～ 10.5，于 2℃ 较稳定,pH＜ 6.0稳
定性有所增加，冻干粉于 5℃ 可保存 6～ 12个月。 在 -
10℃ 保存更为稳定。
弹性蛋白唯有 弹性酶才能水解。弹性酶除能水解
弹性蛋白 外还可水解 血红蛋白, 血纤维蛋白 等。
2,生产工艺
（ 1） 工艺路线：
（ 2） 工艺过程：
Amberlite CG-50树脂, PH6.4吸附, pH9.3,0.5mol
／ L氯化铵缓冲液洗脱 。
