第二章 样品的前处理 第一节 样品前处理的目的 饲料卫生检验所要检测的有毒有害物质通常都是微量存在于样品中，而一般的样品由于成分复杂、干扰因素多，不适于多数的检验项目。因此，在进行正式分析前必须对样品进行前处理。 前处理的目的是将样品中的有毒有害物质提取出来，进行纯化和浓缩，除去干扰物质，使样品符合分析要求。样品前处理的效果往往是决定分析成功如否的关键。其包括样品的提取、样品提取液的纯化和浓缩三个步骤。 第二节 样品的提取 由于被测物质的性质、所使用的分析方法不同，其提取的方法也不同。常用的提取方法有溶剂提取法、灰化法和蒸馏法三种。 一、溶剂提取法 溶剂提取法是利用有机溶剂将样品中的有机毒物如农药、真菌毒素等提取出来加以纯化、浓缩供检测用的一种分离技术。 为了使毒物尽可能完全地被提取出来，而其它成分则尽可能少地进入提取液中，以便于纯化、浓缩，必须正确地选择合适的提取溶剂和提取方法。 ㈠ 提取溶剂的选择 提取溶剂的选择主要根据相似者相溶原理，即根据被测物质的记性大小来选择相应的提取溶剂。常用溶剂的极性顺序为：氨水>水>乙酸>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>乙酸乙酯>氯仿>二氯甲烷>乙醚》苯>甲苯>四氯化碳>环己烷>正己烷。 其次，应考虑提取溶剂的沸点。一般认为提取溶剂以沸点为40～80℃者为宜。过高，则不易浓缩，在浓缩过程中易引起某些被测物质的破坏；过低则容易挥发，不便于定容。 此外，还需考虑溶剂的稳定性（即溶剂不能与样品发生反应）、价格、毒性以及分析所用的仪器（使用电子捕获检测仪时不能用含氯溶剂）等。 ㈡ 提取方法的选择 提取方法主要有振荡提取法、组织捣碎提取法和索氏提取法三种。 1、振荡提取法 这是一种最为常用的有机毒物提取法。将样品粉碎，过筛后放入磨口具塞的三角烧瓶中，加入适宜的溶剂，置于电动振荡器中振荡提取半小时至1小时，然后用过滤的方法将残渣与提取液分开，残渣再用有机溶剂洗涤数次，合并到提取液中。 2、组织捣碎提取法 本法主要用于新鲜蔬菜、牧草等含水量较多的样品。将样品切碎后放入组织捣碎机，加入适宜的溶剂，快速捣碎3～5分钟，然后过滤，残渣用溶剂洗涤数次，合并到提取液中。此法提取效率高，但杂质的溶出也较多，在捣碎过程中所产生的乳化现象，可用离心法除去。 3、索氏提取法 是一种应用索氏提取器进行连续回流提取的方法。索氏提取器又称脂肪提取器，有烧瓶、抽提筒和冷凝管三部分组成。将样品用滤纸包好，放在抽提筒内，溶剂放在烧瓶内，抽提时，加热下端烧瓶内的溶剂，溶剂不断蒸发，进入冷凝器中，被冷凝成液体进入抽提管中对样品进行抽提，当溶剂达到一定高度后，就借助虹吸管流到烧瓶中，溶剂不断地蒸发、冷凝、抽提、回流，直到样品中的被测物质全部地被抽提出来。此法常用于谷类的提取。优点是溶剂的使用量少，提取完全，回收率高，但较费时，一般每个样品要抽提12小时以上。 ㈡ 灰化法 本法是一种适用于分析样品中有毒矿物质的预处理方法。样品中的矿物质如Hg、F、Pb等在饲料中与有机物结合形成稳定、牢固的难以解离的物质，故不能用一般的化学反应进行检测。在分析样品中的有毒矿物质时，需将样品灰化，破坏有机物质，使结合状态的金属或非金属转变成无机物的形式，以便进行检测。根据分析项目不同，破坏样品中有机物质的方法主要有灰化法和湿消化法两类。 干灰化法（Dry ashing） 简称灰化法或灼烧法，是一种常用的有机物质破坏法，适用于除汞、砷以外的各种金属类金属元素。 ⑴ 干灰化的方法 根据灰化过程中是否加其它试剂，本法又分二种。 ① 直接灰化法：将样品放在坩埚中，在高温灼烧下，使样品脱水、焦化，在空气中氧的作用下，使样品中的有机物氧化分解成二氧化碳、水和其它气体而挥发，剩下无机物（盐类或氧化物），用适当溶剂溶解定容，供测定用。 ② 加助灰化剂灰化法：常用的助灰化剂有氧化镁、硝酸镁、氢氧化钠、氢氧化钙等。加入助灰化剂，可使样品呈疏松状态，加速灰化过程，并使灰化完全。此外，助灰化剂还可和被测物质结合成难挥发的盐类，防止灰化过程中被测物质的损失，如氧化镁或硝酸镁能使砷变成难挥发的焦砷酸镁（Mg2As2O7），氢氧化钙则转变成难挥发的CaF2等。 ⑵ 干式灰化法的优缺点 优点： ① 其它试剂少，减少了操作过程污染的可能性，因而空白值较低； ② 样品分解彻底，操作简便，仪器设备简单，一次可以处理大量的样品。 缺点： ① 干灰费时，一般500～550℃需4 hr，600℃需1hr～2hr； ② 长时间的高温加热易使一些被测物质挥发； ③ 瓷坩埚能吸附金属，可造成结果偏低。 ⑶ 干灰化法操作的注意事项 ① 灰化前应进行样品的预炭化，预炭化系指将坩埚内的样品先放在文火上加热，直至样品变黑，然后转入控温茂福炉内550℃灰化，预炭化的目的在于防止样品因急剧灼烧引起的残灰飞散。 ② 瓷坩埚对金属有吸附作用，特别是新的瓷坩埚，因此在使用时应选用用过的坩埚。 ③ 如果样品在灰化后仍不变白，可在冷却后沿坩埚边缘加入少量蒸馏水湿润，再使其充分干燥后继续灰化。加水的目的是有助于灰分溶解，解除低熔点灰分对炭粒的包裹。 2、湿灰化法（Wet digestions） 简称消化法，也是常用的样品无机化方法之一。系利用氧化性强酸，结合加热将有机物质破坏使待测的无机物分解释放出来并形成难挥发的无机化合物供测定用。它适用于易挥发散失的矿物质，除汞外，大多数金属均有良好效果。 （1）常用的氧化性强酸 在消化过程中常用的氧化性强酸有浓硝酸、浓硫酸和高氯酸三种。 ① 浓硝酸 通常使用的浓硝酸，其浓度为65～68%（ml/ml），有较强的氧化性，浓HNO3在温热条件下分解成O2、NO2和H2O，NO2进一步分解成O2及NO。 2HNO3 2NO2+O2+H2O 2NO+O2 沸点较低，硝酸易挥发，因而需要经常放冷补充，消化完成后消化液中常含有较多氮氧化物，必要时需加热或加水加热除去。 ② 高氯酸 冷的高氯酸无氧化能力，但热的高氯酸却是一种极强的氧化剂，氧化能力强于硝酸和硫酸。这是由于高氯酸在加热条件下能产生氧和氯的缘故。 4HClO4 7O2+2Cl2+H2O 应予注意的是，HClO4在高温下直接接触还原性较强的物质如酒精、脂肪、糖类、甘油等有发生爆炸的可能，故一般不单独使用，并且勿使消化液烧干，以免发生危险。 ③ 硫酸 热的浓硫酸具有一定的氧化作用。受热分解时，放出氧、二氧化硫和水。 H2SO4 O2+SO2+H2O 硫酸较硝酸、高氯酸弱得多，但硫酸沸点高，不易挥发。 （2）常用的消化方法 在实际工作中，除了单独使用浓硫酸的消化法外，经常采取两或两种以上氧化性强酸配合使用，利用各种酸的特点，取长补短，以达到安全快速、完全破坏有机物的目的。下面介绍常用的两种湿消化方法。 ① 硝酸-硫酸湿消化法 将5g样品置于100ml的凯氏烧瓶中，随之加入与浓硝酸等体积的蒸馏水，缓缓加热至沸腾，继续加热至容积减半。冷却后逐渐加入10ml硫酸，再加热，待内容物变黑，既加入少量浓硝酸，为防止过度炭化，加热必须适度，整个消化过程必须存在少量的硝酸，加热至发烟而不再变黑，最后至溶液无色，冷却、用蒸馏水稀释至一定体积备用。 本法可缩短炭化过程，减少消化时间，反应速度适中。但因消化过程中使用硫酸，而碱土金属的硫酸盐溶解度较小，故本法不宜作碱土金属的分析。 ② 硝酸-高氯酸湿消化法 将含有不超过2g干物质的样品至于200ml的凯氏烧瓶中，加入25ml硝酸（相对密度为1.42）缓慢蒸煮沸30min，冷却、加15ml高氯酸（60%w/w）。缓慢煮沸至无色或近乎无色，继续沸腾1hr（注意防止瓶中内容物蒸干）。冷却，用蒸馏水稀释至适当体积备用。 本法氧化能力强，反映速度快，炭化过程不明显；消化温度较低，挥发损失少。但由于硝酸和高氯酸加热后均容易挥发，故如温度过高、加热时间过长，容易烧干，并可能引起残余物燃烧或爆炸。本法对某些还原性较强的样品，如酒精、甘油、油脂和大量磷酸盐存在时，不宜采用。 ⑵ 湿消化法的特点 ① 优点：所用时间短，温度较低，因而挥发损失较少，同时应用玻璃仪器（凯氏烧瓶），吸附损失也较少。 ② 缺点：使用试剂较多，易造成高的试剂空白值，操作较复杂，危险性大，不便于大量样品的处理。为此，美国分析化学家协会（AOAC）推荐一种湿消化法和干灰化法相结合的消化方法，其过程如下： 1g样品置于上釉的高形陶瓷坩埚内，500℃灰化2hr，冷却，用10滴蒸馏水湿润，然后小心加入3～4ml硝酸（1:1），100～200℃下蒸发除去多余的硝酸，将坩埚转至马福炉内，500℃灰化1hr，冷却、用100ml盐酸（1:1）溶解并定量转至50ml的容量瓶中定容。 ⑶ 湿消化法的注意事项 ① 消化所用试剂要纯，同时必须做空白试验，以扣除消化试剂对测定数据的影响。 ② 样品中加入硫酸、硝酸后应先用文火加热，以防反应过于剧烈而产生大量泡沫，待反应平稳后方可加大火力，但整个消化过程的温度仍应严格控制，以防溶液溅出或消化不完全。 ③ 消化过程中一定要保证瓶中有少量的液体，以防发生危险。在补充氧化剂时要先停止加热，并稍微放冷后，然后沿瓶壁缓缓加入，以防反应过于剧烈而造成喷溅。 ㈢ 蒸馏法 蒸馏法是处理含挥发性毒物的样品的常用方法，兼有提取和纯化的双重作用。常用蒸馏法有通气蒸馏法和水蒸气蒸馏法。通气蒸馏法是使样品中的挥发性成分在一定条件下（加热或反应成气体）挥发，随通入的洁净气体（如二氧化碳、氧气或空气等）蒸馏出来，被吸收液固定下来（基本装置见粮油食品卫生检测P19）。水蒸气蒸馏法是用水蒸气代替洁净气体将有毒成分蒸馏出来，并被冷凝管冷凝进入接受器（基本装置见P21）。 蒸馏时由于有毒成分变成气体被蒸馏出来，因而需注意整个蒸馏装置的密封性，以防有毒气体逸漏，造成毒害。另外，水蒸气发生器要装一定安全管，以防蒸汽压力过高造成蒸馏装置炸裂。 三、提取液的纯化 样品经提取，被测成分进入提取液中，但提取液成分仍很复杂，常含有多种杂质，有时会干扰正常的测定。因此，必须将样品提取液经过适当处理，除去其中的杂质。这个处理过程称为纯化（Clean up）。根据样品的性质，可采用不同的纯化方法。常用的纯化方法有： 液液分配法（又称萃取法） 是利用物质在两种互不相溶的溶剂中溶解度不同，将被测的有机污染物从抽提液转移到另一种溶剂中（即萃取剂）而与干扰物质分离，达到纯化目的的一种方法。此法操作简便、快速、回收率高，因而被广泛应用。 为了获得较好的分离效果，萃取剂的选择至关重要。萃取剂需要具备以下条件： ① 与抽提液互不相溶； ② 对被测的有机毒物（农药、真菌毒素等）有较大的溶解性； ③ 对色素、脂肪、蜡质等杂质有较小的溶解性。 一般来说，农药、真菌毒素等的极性较色素、脂肪等杂质为大，即前者在强极性溶剂中溶解度大，而后者在弱极性溶剂中溶解度大。因而通常萃取是用极性较大的氯仿、甲醇等溶剂来萃取石油醚等极性较小的抽提液，这样，极性物质被转移到萃取液中，而杂质仍在抽提液中。 用强极性的溶剂萃取虽然能达到纯化的目的，但强极性溶剂往往沸点较高，不易浓缩，因而需要进行反萃取。反萃取就是将萃取剂中的被测物质再转移到易浓缩的低沸点的弱极性有机溶剂中。反萃取的操作方法是向萃取液中加入一定量水相溶液与极性溶剂互溶，使被测物质的溶解度降低，再用低沸点弱极性溶剂进行反萃取。在水相溶液中加入少量盐类可大大提高反萃取的效率，这种现象称为盐析作用。 2、柱层析法 系利用抽提液中被测物质与干扰物质在固体吸附剂表面的吸附力不同，亦即它们在吸附剂与洗脱剂之间的分布情况不同而达到分离的目的。为了获得较好的分离效果，必须选择适当的吸附剂和洗脱剂。 常用的吸附剂有活性炭、硅胶、氧化铝等。一般而言，活性炭对色素的吸附力较强，而硅胶、氧化铝则对油脂等有较强的吸附力。吸附剂的选择，主要根据其特性，同时考虑被测物质和杂质的性质。在实际应用时，为了使色谱柱对各种杂质都有较好的吸附作用，集中吸附剂常以一定比例混合使用。吸附剂的吸附活性与其含水量有关，水分含量越高，活性越低，吸附力越弱，因此，可通过活化或减活处理调整吸附剂的活性。 洗脱剂一般为各种有机溶剂或几种有机溶剂按一定比例配成的混合溶剂，主要根据被测物质和杂质的性质选择。 2、磺化法 是利用色素、油脂等杂质能与浓硫酸反应生成强极性而易溶于水的物质，从而与不和硫酸反应的被测物质分离的一种纯化方法。 色素、脂肪中的不饱和键、羟基都可与硫酸发生磺化反应。 本法操作简便，纯化效果好，回收率高，但只限于性质极为稳定的有机氯农药提取液的纯化。 操作方法：将抽提液置于分液漏斗中，加入十分之一量的硫酸，振摇，静置风层，弃去下层酸液（含色素等），必要时重复一次，然后加入适量2%硫酸纳以洗去残留硫酸和其它极性杂质。 三、样品液的浓缩 经提取和纯化后的样品液，由于体积较大，其中被测成分的浓度往往较低，不适宜直接分析。所以，一般均需要浓缩。浓缩的方法主要有减压蒸馏浓缩法和直接水浴浓缩法两种。 1、减压蒸馏浓缩法 适用于遇热不稳定以及易挥发的化合物，如有机磷农药等。 2、直接水浴浓缩法 适用于被测成分遇热稳定和非挥发性化合物。