第六章 农药分析 第一节 概述 农药是用于保护农作物等免受病虫害，以及促进植物生长、除草、灭鼠、杀菌的各种药剂之总称。自20世纪40年代以来，随着科技的进步和生产的不断发展，人工合成的农药品种日益增多。目前，全世界农药有1200余种，常用的约有250种。这些农药的应用，在农业、畜牧业及公共卫生等各方面都起到了积极的作用。但随着农药的长期和大量使用，环境和饲料的农药污染日益严重，并通过生物富集和食物链，可造成在动物体内蓄积而引起在畜禽产品中残留。农药污染已成当前主要公害之一。 一、农药污染饲料的途径1、农药在作物中的残留2、粮库或饲料库内应用农药防虫，使粮食及饲料残留农药。3、饲料在运输过程中受污染。 4、事故性污染 5、生物富集与食物链 二、兽医临床上农药中毒的原因1、用量过大。2、误用拌过或浸过农药的种子作饲料。3、家畜采食喷洒过农药的农作物、蔬菜或牧草等。4、农药保存不当或使用不按操作规程，污染了饲料或水源。5、报复投毒等等。 三、常见农药中毒的机理及症状农药的种类繁多，大部分属于化学性农药，常见的化学性农药按化学成分可分为：有机氯农药、有机磷农药、有机汞农药、有机砷农药、有机氟农药和有机硫农药等。这些农药中毒的机理及症状如下： ㈠ 有机氯农药（Organochloric pesticides） 1、特点 有机氯农药具有杀菌范围广、高效、急性毒性小，易于大量生产，价廉等优点，但由于性质稳定，残留时间长，累积浓度高，很容易污染环境、农作物和畜产品，易引起人畜的慢性中毒。因此，目前国内外都已采取措施，停止生产或控制应用一些残毒性较高的有机氯农药。我国已于1983年停止生产、1984年停止使用有机氯农药。 2、品种 常用的有机氯农药有DDT、六六六、艾氏剂、氯丹、毒杀芬等。这类农药曾经是应用最广、用量最大的农药，因此有机氯农药中毒是过去常见的畜禽中毒病。 3、中毒机理 根据对DDT和六六六的研究结果，认为有机氯农药能抑制ATP酶和单胺氧化酶的活性以及乙酰胆碱酯酶的合成。 4、中毒症状 有机氯农药中毒的临床症状主要是神经系统。急性中毒表现为听觉和感觉过敏、反射活动增强、兴奋性增高、肌肉震颤，牛羊出现流涎、腹泻，猪出现呕吐。蓄积性中毒症状不明显。 ㈡ 有机磷农药（Organophosphatic pesticides） 1、特点 有机磷农药不仅具有高效、广谱的杀虫作用，而且在生物体内残留时间短，残留量较少，因此是我国目前使用最广泛的杀虫剂，尤其在我国停止使用有机氯农药以后，已上升为最主要的一类农药，因而畜禽中毒的机会较多。 2、品种 有机磷农药是始创于20世纪30年代，在二次大战后广泛地用于农业上，常用的有机磷农药有对硫磷（1605）、乐果、敌百虫、敌敌畏、马拉硫磷（4049）、甲胺磷和稻瘟净等。 3、中毒机理 有机磷农药的中毒机理是它与体内的胆碱酯酶（CHE）结合，形成不易水解的磷酰化胆碱酯酶，使胆碱酯酶活性受抑制，分解乙酰胆碱的能力降低，致使体内乙酰胆碱大量蓄积，从而出现一系列与胆碱能神经机能亢进的临床症状。 4、中毒症状 中毒畜禽表现为流涎、呕吐、腹泻、瞳孔缩小、呼吸困难、肌肉震颤、多汗等。 5、解毒方法 解磷定、阿托品 ㈢ 有机汞农药 1、特点 有机汞农药主要用于防治农作物病毒危害。这类农药由于在外界环境中残留时间长，且易在体内蓄积，毒性大，因此，70年代后，世界各国都已禁止或限制使用。我国自1972年起已禁止生产、进口和使用。但是由于高效的有机汞杀菌剂的禁用，给一些由种子传染的病毒性疾病（如麦类黑穗病等）的防治造成很大的困难。因此，我国政府有关部门于1979年根据生产的实际情况，对有机汞农药的使用问题重新加以考虑并作了新的规定，不再全面禁用，可限制使用。 2、品种 主要品种有西力生（氯化乙基汞）、赛力散（醋酸苯汞）、谷仁乐生（磷酸二乙基汞）、富民隆（磺胺苯汞）等， 3、中毒机理 有机汞农药属于高毒类农药① 通过对局部的强烈刺激，造成胃炎、肠炎；② 易与蛋白质或其它活性物质中的—SH结合，使各种含SH的酶活性抑制，蛋白质凝固，组织坏死，而呈现毒性作用。 4、中毒症状 中毒家畜以消化道损害，肾损害及神经症状为特征，表现为口唇糜烂、腹泻、蛋白尿、血尿、共济失调、感觉异常等。剖解可见消化道糜烂、溃疡，肾溃疡。 ㈣ 有机硫农药 1、特点 有机硫农药是近年来发展起来的一种新型杀菌剂，具有高效、低毒之特点，正在替代汞制剂等在农业生产上起着重要作用。有机硫农药对人畜毒性低，但家畜偶然大量偷食使用过有机硫农药不久的作物，也可引起中毒。 2、品种 常用的有机硫农药有代森类（如代森锌、代森铵）和福美类（如福美锌、福美铁等）。 3、中毒机理 这类农药主要是通过干扰细胞的新陈代谢过程而产生毒性。 4、中毒症状 中毒家畜先出现呕吐、腹泻等消化系统症状，继而出现兴奋不安，共济失调等神经症状，最后呼吸和循环衰竭而死亡。 ㈤ 有机砷农药 1、特点 这类农药为一类主要用于防治水稻纹枯病的杀菌剂，属中等毒或低毒类。 2、品种 常用的品种有稻脚青、退菌特、甲基硫砷、稻宁等。 3、中毒机理 有机砷化合物被动物吸收后，转化为无机的三价砷及衍生物，与体内酶蛋白分子上的—SH结合，特别是与含双SH的酶（如丙酮酸氧化酶），形成稳定的复合物，使酶失去活性，从而阻碍细胞的正常呼吸和代谢，导致细胞死亡，故主要为慢性中毒或亚急性中毒。 4、中毒症状 有机砷农药主要表现为消化系统和神经系统症状。 ㈥ 有机氟农药 1、品种 有机氟农药的主要品种有氟乙酰胺、氟乙酸钠。 2、中毒机理 有机氟农药主要是通过阻断三羧酸循环而产生毒作用。 3、中毒症状 中毒的食草家畜主要表现为心血管系统症状，如心跳过快、节律不齐；肉食动物主要表现为神经症状，如兴奋不安，共济失调等；杂食动物则心血管系统症状和神经症状均有。 以上叙述了常见农药中毒的机理和症状。一般来说，兽医临床上的农药中毒多数是急性、亚急性中毒，但在长期少量摄入某些农药特别是有机氯农药和有机汞农药时，动物也可表现为慢性中毒。另外，有些农药在体内蓄积，虽然没有使动物在临床上表现中毒症状，但动物产品如肉、蛋、奶却带有一定程度的毒性。有人发现，奶牛在采食含DDT7~8ppm的干草后，其乳汁中DDT含量可高达3ppm之多，如果用这种严重带毒的乳汁或乳制品喂幼畜或食用，将有引起中毒的危险，这是一个应予严重关注的问题。 有机氯农药的分析 一、概述 ㈠ 种类 有机氯农在83年以前一直是我国主要的农药品种，占总用药量的50~70%。最常用的有机氯农药有六六六、DDT、林丹（高丙体六六六）、氯丹、狄氏剂、毒杀芬等。 ㈡ 理化性质 多数有机氯农药对光、热、酸稳定，如DDT 115~200℃加热15h不发生分解，遇碱易失效。有机氯农药属脂溶性化合物，不溶于水，而易溶于多种有机溶剂，如苯、二甲苯、氯仿、正已烷、石油醚等。 ㈢ 残留 有机氯农药化学性质稳定，不易分解，在环境中的残留期长，例如六六六喷施后一年，土壤残留量为65%，其残留期可达十年以上。DDT喷施后一年，还有88%残留在土壤中，残留期长达15年之久。因而，此类农药可在空气、土壤、水和动植物体内长期蓄积，并通过食物链进入畜禽体内蓄积，易引起畜禽慢性中毒。我国已于1983年停止生产、1984年停止使用有机氯农药。 ㈣ 毒性作用 有机氯农药在体内可蓄积于脂肪组织、神经组织和肝、肾等器官中，动物长期少量摄入有机氯农药可产生慢性中毒。轻度中毒畜禽表现为生产性能下降，消瘦，精神沉郁，严重者表现为肌肉震颤、共济失调、衰竭等。无论是急性中毒，还是慢性中毒，剖检均无特征性病变。 几种有机氯农药的口服LD50见表6-1。 表6-1 几种有机氯农药的口服LD50 名称 动物 LD50(mg/Kg)  DDT 多数动物 200～500  六六六 小白鼠 86   家兔 60～200  艾氏剂 小白鼠 42.1   家兔 25.1  狄氏剂 小白鼠 41.1   家兔 22.3  有机氯农药多为中等毒性农药，在现在已停止生产和使用的情况下，急性和亚急性中毒几乎不再发生。但由于目前我国的土壤、水体等普遍受到有机氯农药的污染，故此类农药慢性中毒仍有可能发生。 ㈤ 饲料中有机氯农药的卫生标准 我国国家饲料卫生标准中饲料原料和饲料中六六六、DDT的允许量标准见表6-2、3。 表6-2 我国国家饲料卫生标准饲料原料和饲料品种中六六六允许量 饲料原料或饲料品种 允许量（mg/kg）  米糠、小麦麸 ≤0.05  大豆饼、粕 ≤0.05  鱼 粉 ≤0.05  肉仔鸡、生长鸡配合饲料 ≤0.03  产蛋鸡配合饲料 ≤0.03  生长肥育猪配、混合饲料 ≤0.04  表6-3 我国国家饲料卫生标准猪、鸡饲料中DDT允许量标准 饲料原料或饲料品种 充许量（mg/kg）  米糠、小麦麸 ≤0.02  大豆、饼、粕、鱼粉 ≤0.02  鸡配合、猪混、配合饲料 ≤0.02  我国“食品中六六六，DDT残留量”国家标准（GB2763—81）见表6—4。 表6-4 我国粮食、蔬菜等食品中六六六、DDT允许量标准 食 品 品 种 允许量   六六六（mg/kg） DDT（mg/kg）  成 品 粮 ≤0.3 ≤0.2  蔬菜、水果 ≤0. 2 ≤0.1  鱼 ≤2 ≤1  二、提取、纯化和浓缩 提取 最常用的提取方法为振荡提取法和组织提取法。 常用的提取有机溶剂有正已烷、石油醚、乙腈、丙酮、苯或这些有机溶剂的混合液。具体应用溶剂通常视样品的含水量不同进行选择。 ⑴ 对含水量低的谷物、饲料，可用正已烷或石油醚直接提取。 ⑵ 对含水量高的蔬菜、牧草等，应先以亲水性溶剂丙酮或乙腈进行提取，然后加硫酸钠溶液稀释，再以正已烷或石油醚萃取有机氯农药，以便纯化和浓缩。 加硫酸钠溶液的目的是增大丙酮或乙腈液的极性，降低农药在它们中的溶解度，使其更完全地转移到正已烷或石油醚中，而水溶性杂质则留在丙酮层或乙腈层弃去。 2、纯化和浓缩 提取液中常含有脂肪、色素、蜡质等杂质，干扰测定，故必须进行纯化。由于多数有机氯农药对酸都极为稳定，所以可用磺化法纯化。 其操作方法是于100ml提取液中加10ml（即提取液的1/10）的浓硫酸，振摇1min后，静置分层，弃去下层水溶液，上层溶液由分液漏斗上口倒置另一250ml分液漏斗中，用少许石油醚洗原分液漏斗后，并入250ml分液漏斗中，加入100m l 2%硫酸溶液振摇后，静置分层，弃去下层水溶液，用滤纸吸干分液漏斗颈外的水。加硫酸钠溶液的目的是洗去沾附的硫酸，否则在样液浓缩后出现蓝色或黑色，从而影响结果。 将石油醚经盛有约15g无水硫酸钠的漏斗过滤，并以少许石油醚洗涤盛有无水硫酸钠的漏斗数次，洗液并入滤液中，然后用减压浓缩至1ml，供TLC用。 此外，提取液也可用柱层析或萃取法纯化。如果一种纯化方法不能达到纯化要求时，可系数通过第二或第三种方法纯化。 三、测定方法 有机氯农药定量分析的常用方法有GC和TLC法。前者已成为常规的检验方法，后者操作简便，特别适合于一般实验室分析。 1、吸附剂 有机氯农药薄层定量的吸附剂有硅胶G和氧化铝G，其中氧化铝薄层色谱的灵敏度较硅胶略高。 制备薄层时加入少量硝酸银溶液，可提高测量的灵敏度，更有效地对复杂混合物进行分离。但硝酸银溶液应先与水混匀，再在乳钵中与氧化铝G一起研磨。若氧化铝G先加硝酸银溶液，往往造成局部硝酸银含量偏高，使底板变黑而降低灵敏度。 薄层板制备 称取氧化铝G45g加1ml1%硝酸银和6ml水，研磨成糊状，立即涂布于3块薄层板（5×20cm）上，厚度为0.25mm，于100℃活化0.5h，置干燥器中，避光保存。 2、展开剂 正已烷—丙酮（99﹕1）、石油醚—丙酮（99﹕1） 3、显色剂 有机氯农药的显色剂有两类： ⑴ 硝酸银显色液 是有机氯农药最常用的显色剂，其灵敏度较高，最低检出量可达到0.01(g，并且显色斑点稳定。 硝酸银显色液配制方法：称取硝酸银0.05g溶于数滴水中，加苯氧乙醇10ml，用丙酮稀释至100ml，加30%过氧化氢溶液10(l，混合后贮于棕色瓶中，放冰箱内保存。 硝酸银的作用是与有机氯农药中的氯在紫外光照射下生成氯化银，并进一步分解成氧化银的少量单质银的混合物，而显黑色斑点。 mAgClAgCl2·AgCl·nAgCl2+Ag+AgclO·AgCl·AgO 苯氧乙醇可促使斑点迅速显色，提高灵敏度。加入过氧化氢可避免因硝酸银还原成银而增加薄层板背景的颜色，但加入量过多又会使斑点模糊，故应掌握好用量。 ⑵ 苯胺类显色剂 如联苯胺、联邻甲苯胺、二苯胺等。这类显色剂灵敏度较低，显色不稳定，且毒性较大。其优点：可使不同的有机氯农药显示出不同的颜色，有助于定性鉴定。 联邻甲苯胺对集中有机氯农药的显色结果见表6-5。 表6-5 联邻甲苯胺对集中有机氯农药的显色结果 农药名称 最低检出量((g) 不同农药量时斑点的颜色    0.02～0.2(g 0.2～2.5(g 2.5～10(g  DDE 0.3 — 浅米黄 深米黄  DDT 0.02 黄 绿黄 叶黄  DDD 0.25 — 极弱棕 明棕  林丹 0.02 浅蓝 鲜蓝 深蓝  艾氏剂 0.25 — 极弱黄绿 浅黄绿  六六六 0.02 极浅蓝 鲜蓝 深蓝   四、显色反应（快速定性分析） 当饲料中有机氯农药含量较高，且只需作定性检验时，可用显色反应。最常用的显色反应是荧光黄试纸快速法。 1、原理：有机氯农药被新生态的氢还原成氯化氢，又被氧化生成氯气，氯气与溴化钠作用生成溴，溴与荧光黄反应生成四溴荧光黄，呈桃红色。 H2SO4+Zn Zn SO4+2[H] C6H6 Cl6+12[H] C6H12 +6HCl 2KMnO4 +3H2SO4 K2SO4 +2Mn SO4+5[O]+ 3H2O 10HCl+5[O] 5 Cl2 +5H2O Cl2+ 2NaBr 2NaCl+ Br2 2、试剂 荧光黄试纸：称取0.1g荧光黄溶于少量乙醇中，另称取1g溴化钠溶于20ml蒸馏水中，两液混合后加10%氢氧化钠2滴，摇匀。将滤纸条浸入，1~2分钟后取出，晾干，备用。 3、操作 取有机溶剂提取液5~10ml，加蒸馏水3ml，低温挥去溶剂，再加蒸馏水至5ml，然后加0.5~1g锌粉，充分搅拌，加1.5ml硫酸，于50℃水浴上加热5min，冷却后用湿润滤纸过滤至试管中，容器用水洗涤，洗液并入试管中，并使其体积达10ml（如滤液仍浑浊，可用锌粉和硫酸再处理一次），然后加0.1g高锰酸钾和1.5ml硫酸，混匀，迅速塞上装有荧光黄试纸的单孔塞，将试管放于50℃水浴中10min，如含有机氯农药，则试纸由原来的橙黄色变成桃红色。 注意应排除无机氯的干扰，因此，所用的器皿、试纸、试剂均不得含氯离子，同时以空白试验作对照，进行判定。 第三节 有机磷农药分析 一、概述 有机磷农药是一类高效、广谱的化学杀虫剂。它的优点是残效期短，分解较快，在生物体内受酶作用而水解，不易产生蓄积，因此是目前农业上应用最广泛的杀虫剂，尤其是我国停止使用有机氯农药以后，有机磷农药上升为最主要的一类农药。但其急性毒性强，易引起人畜中毒。 ㈠ 常见的有机磷农药 有机磷农药属磷酸酯类化合物，其结构通式为 根据R和X的基团不同，构成不同的有机磷农药。目前有机磷农药约有127种，大量生产的至少有60种之多，常见的有内吸磷（1059）、对硫磷（1605）、敌敌畏（DDVP）、敌百虫、乐果、甲拌磷（3911）、马拉硫磷（4049）、甲胺磷等。 有机磷农药的急性毒性随品种不同，差异很大，按大白鼠口服LD50（mg/kg体重）可分为三类： 高毒类：LD50＜50mg/kg体重，如对硫磷（1605）、甲基对硫磷、内吸磷（1059）、甲拌磷（3911）、乙拌磷、特普（TEPP）、硫特普（STEPP、苏化203）、三硫磷、磷胺、二氯磷、久效磷、甲胺磷、杀螟威等。 中毒类：LD50 50~500 mg/kg体重，如敌敌畏、甲基内吸磷、二甲硫吸磷、乐果、稻丰散、乙硫磷、亚胺硫磷、倍硫磷、杀螟松、二溴磷等。 低毒类：LD50＞500mg/kg体重，如马拉硫磷（4049）、敌百虫、辛硫磷、双硫磷、乙酰甲胺磷等。 ㈡ 理化性质 1、极性 有机磷农药的极性差异很大，几种主要有机磷农药的极性顺序从弱到强是：辛硫磷、溴硫磷、甲拌磷、二拌磷、对硫磷、甲基对硫磷、倍硫磷、稻丰散、杀螟松、马拉硫磷、亚胺硫磷、对氧磷、敌敌畏、内吸磷、乐果、敌百虫、氧乐果、磷胺。 2、溶解性 由于各种有机磷农药的极性强弱不同，它们在水和各种有机溶剂的溶解性能也不一样。多数有机磷农药不溶于水；易溶于丙酮、石油醚、正已烷、苯、氯仿、二氯甲烷、乙腈、二甲基亚砜（DMSO）等有机溶剂，此外，也易溶于脂肪，故能通过皮肤侵入体内。 3、水解性 由于有机磷农药属于属于酯类——磷酸酯或硫代磷酸酯类，故在一定条件下能水解，特别是在碱性介质、高温以及某些金属离子催化下，更加容易水解。 4、氧化性 硫代磷酸酯类农药在一定条件下能氧化成磷酸酯农药。例如，在溴作用下或在紫外光照射下，硫代磷酸酯中的S被O取代，生成毒性较大的磷酸酯，抑制酶的效果增强，从而可提高酶抑制薄层法测定的灵敏度。 ㈢ 有机磷农药在作物中的残留 有机磷农药的化学性质不稳定，在自然界容易分解，与有机氯农药相比，在作物中的残留甚微，残留时间也较短。但品种不同，有机磷农药在农作物上的残留时间差异甚大，有的施药后数小时至2~3天可完全分解失效，如辛硫磷、敌敌畏等；而也有些农药，由于对作物的穿透性强，易产生残留，可维持较长时间的药效，有的甚至能达1~2个月以上，如甲拌磷。同时，由于不少有机磷农药对哺乳动物急性毒性很强，如使用保管不当，引起误食误用，造成严重中毒。 ㈣ 有机磷农药对生物体的毒害作用 有机磷农药可通过皮肤、呼吸道、消化道吸收而引起中毒。有机磷农药进入机体后很快分布于各器官组织中，与体内的胆碱酯酶结合形成磷化胆碱酯酶，使胆碱酯酶失去活性，大量的乙酰胆碱蓄积而使胆碱能神经过度兴奋。动物表现出一系列症状：分泌物增加（流涎、多汗）、瞳孔缩小、肌肉震颤、呼吸困难、胃肠蠕动音增强，腹痛、腹泻等。 ㈤ 粮食蔬菜中一些有机磷农药的允许量标准 基于有机磷农药对生物体的毒害作用，我国对粮食蔬菜中常见有机磷农药的残留量作了规定（见6—6） 表6—6 粮食蔬菜中有机磷农药的允许量标准 农 药 粮食（小麦、玉米、糙米）（mg/kg） 蔬菜（mg/kg）  甲 拌 磷 0.02 不得检出  杀 螟 松 0.4 0.04  倍 硫 磷 0.05 0.05  乐 果 暂不定 1.0  敌 敌 畏 暂不定 0.2  对 硫 磷 0.1 不得检出  马拉硫磷 3.0 暂不定  二、有机磷农药的提取和纯化 有机磷农药的提取和一般的有机毒物提取一样，主要根据其极性大小选择相应的有机溶剂进行提取。极性大的有机磷农药如敌百虫、乐果、敌敌畏等可用醇类和酮类有机溶剂提取；极性小的如对硫磷、甲基对硫磷等则用正己烷、苯等非极性溶剂提取。 在样品提取时，除应考虑农药的极性外，还需注意样品的种类，特别是样品的脂肪和含水量。 常用的有机磷农药的提取方法是匀浆提取法和振荡提取法。 提取液的纯化主要有液—液分配法、柱层析法和化学吸附法等。 三、有机磷农药的分析 有机磷农药的测定方法，早期采用酶化学法，单项的还有比色法和同位素法等。这些方法准确度低，分析时间长或复杂，已很少应用。但这些方法灵敏度较高，可检出极微量的有机磷农药，可作为定性检定。目前广泛应用的是薄层层析法和气相色谱法。气相色谱法采用火焰光度检测器检测，具有很好的选择性和灵敏度，而且能同时进行多种有机磷农药残留的测定。这里仅介绍薄层层析法和显色反应。 ㈠ 薄层层析法（定量分析） 1、吸附剂 有机磷农药薄层层析最常用的吸附剂为硅胶G，有时也用氧化铝G。 2、展开剂 可根据农药极性的大小选择适当的溶剂系统。一般以正已烷或苯加上适当比例的极性溶剂如丙酮、乙酸乙酯等作为展开剂，通过调节极性溶剂的比例使展开剂的极性与被分离农药的极性相适应。 3、显色方法 有机磷农药薄层层析的显色方法很多，最常用且灵敏度最高，并适合各种有机磷农药的显色方法是酶抑制法，其它还有刚果红法和间二苯酚法等。 ⑴ 酶抑制法 原理 胆碱酯酶能分解β—乙酸萘酯，生成乙酸和β—萘酚，后者可与牢固蓝B盐（Fast blue B salt）作用生成玫瑰红色偶氮化合物，反应式如下： 当有机磷农药存在时，由于胆碱酯酶活性受到抑制，β—乙酸萘酯不能水解成β—萘酚，因而不会与牢固蓝B盐作用产生显色反应。所以，在喷酶液的薄层板玫瑰红色的背景上出现有机磷农药的白色斑点，按斑点大小与标准比较，便可确定样品中有机磷农药的含量。 试剂 a、酶溶液：取新鲜鼠肝（或兔肝）1份于乳钵中，边研磨边加冰蒸馏水9份，研成匀浆状，移入离心管中，2500rpm离心30min，吸取上清液贮于冰箱中。临用时取此酶液1ml加蒸馏水稀释至15ml。 B、底质溶液 Ⅰ液 β—乙酸萘酯溶液：取0.125gβ—乙酸萘酯溶于100ml无水乙醇中，贮于冰箱中。 Ⅱ液 牢固蓝溶液：称取牢固蓝0.2g溶于160ml水中，此液应新鲜配制。 临用时，取Ⅰ液4ml和Ⅱ液16ml混匀。 显色 将展开后的薄层板挥发溶剂,喷酶溶液至板面湿润，于37℃潮湿空气中放置30min，然后再喷底质溶液。结果在玫瑰红色的背景上显示有机磷农药的白色斑点。 ③ 注意事项 A、本法的灵敏度可达0.005~25毫微克，某些农药如经过活化处理，还可提高其灵敏度。常用的活化方法有以下几种： 溴水或溴蒸汽活化法：将展开后的薄层板放入预先饱和的溴蒸汽缸中，1分钟取出，放入通风柜中将溴除尽；或将展开好的薄板用饱和溴水喷雾至板面微湿，放置12分钟后除溴。 紫外光活化法：将展开后的薄层板喷雾水至板面湿润，置于紫外灯下照射20分钟。 上述两种活化方法适用于硫代磷酸酯类农药（如对硫磷、乐果等）。其原理是这类有机磷农药对酶的抑制能力较弱，但当喷溴水、熏溴蒸汽或用紫外光照射等时，硫代磷酸酯转变成磷酸酯，从而提高灵敏度。如对硫磷经活化处理，可氧化成对氧磷（反应式见《食品检验》P102）。 氨水活化法：将展好的薄层板喷1：4氨水至板面湿润，在通风柜中除氨至板面无氨味。本法适用于敌百虫的活化。 B、薄层酶抑制法的操作关键之一是掌握酶的效价，包括酶液的浓度和喷洒量。如果酶液的浓度过低或用量不足，底板不显玫瑰红色，将无法辨认农药斑点；反之，如果浓度过高用量过多，有机磷农药不能完全抑制酶的活性，在农药玉器处仍带粉红色，降低测定的灵敏度。通常可在点滴板上进行预试。即在空穴中滴加农药标准液及一系列不同稀释倍数的酶液，分别滴加—乙酸萘酯保温一定时间后，加牢固蓝B盐，选择不显玫瑰红色的最大酶浓度即可。喷雾酶液的量，应使薄层板湿透，但无液滴流下为宜。 C、薄层酶抑制法对于有机磷和氨基甲酸酯类农药的分析具有较大的实际意义。它与化学分析法相比，具有很高的灵敏度，可达到毫微克数量级；此外，由于酶的特异性，干扰较少，所以，除气相色谱法外，该法是分析有机磷农药的最好方法。但其缺点是影响因素太多，如酶源的种类与喷雾液的浓度、底质的种类与浓度、喷雾试剂的pH值、薄层的种类和厚度、展开剂的性质、样品中存在的杂质以及采用的活化手段等，所以，使用薄层酶抑制法分析有机磷农药时，必须注意以上各因素。 ⑵ 溴—刚果红法 ①　原理 含硫有机磷农药与溴和水作用生成溴化氢，使刚果红由红变兰,故含硫有机磷农药呈现兰色斑点。刚果红的变色范围是PH3.0（兰紫色）~5.2（红色）。 ② 试剂 a、0.5%溴四氯化碳液 b、0.4%刚果红溶液 取0.4g刚果红溶于100ml50%乙醇溶液中，再加2~3ml5%氢氧化钠溶液。 ③ 操作 将展开好的薄层板于溴蒸汽缸内薰1分钟，取出于通风柜中除溴，再喷刚果红溶液，含硫有机磷农药呈蓝色斑点，背景为桃红色。 ⑶ 间二苯酚—氢氧化钠法 ①　原理 如敌百虫与敌敌畏等不含硫的有机磷农药在碱性溶液中水解生成二氯乙醛，后者与间二苯酚反应生成红色化合物。 ② 试剂 a、1%间二苯酚乙醇溶液 b、5%氢氧化钠乙醇溶液 ③　操作 临用时将上述两种试剂等量混合，喷雾至板面湿润，将薄板置100℃烘箱中数分钟，敌百虫与敌敌畏等不含硫的有机磷农药呈红色斑点。显色，背景为无色或污绿色。 ㈡ 显色反应(定性分析) 有机磷农药的显色反应很多，有间二苯酚反应、亚硝酰铁氰化钠反应、酶化学法等。其中酶化学法是有机磷农药共有的特异性反应，灵敏度较高。下面作一介绍。 1、原理 胆碱酯酶能迅速分解乙酰胆碱，当有机磷农药存在时酶活性被抑制，未被分解的乙酰胆碱怀羟胺和三氯化铁作用使溶液呈红褐色。 2、试剂 ⑴ pH7.4磷酸盐缓冲液：9.09g磷酸二氢钾加水溶解，并稀释至1000ml；3.86g7分子结晶水的磷酸氢二钾加水溶解，至1000ml。取前者2份，后者8份，混匀，调pH至7.3~7.4。 ⑵ 2M盐酸羟胺溶液：34.8g盐酸羟胺溶于水并至250ml。 ⑶ 3.5M氢氧化钠溶液：35g氢氧化钠溶于水并至250ml。 ⑷ 三氯化铁溶液：7.5g三氯化铁加0.1N盐酸溶解并至250ml。 ⑸ 羊（兔）血浆：羊或兔静脉血3份加3.8%柠檬酸钠溶液1份混合，离心分离血浆，于冰箱中保存。 ⑹ 0.3%氯化乙酰胆碱水溶液：冰箱保存。 3、操作 ⑴ 胆碱用量选择试验 取试管5支，各加入缓冲液0.5ml，血浆0.5ml，分别加入氯化乙酰胆碱溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5ml，各补加5%甲醇水溶液至2ml。37℃水浴，每10分钟振摇1 次，30分钟后取出，各加盐酸溶液及三氯化铁溶液各0.5ml，混匀观察管内容物颜色，选择溶液呈微红色管所加的乙酰胆碱量。 ⑵ 样品试验 样品提取液于80℃以下水浴挥干，残渣以5%甲醇溶液，取试管两支，一支加样品甲醇液0.5ml，另一支加5%甲醇液0.5ml作为空白对照，再各加缓冲液0.5ml，血浆0.5ml，乙酰胆碱溶液适量，并至总体积2ml，以后同上操作。 当样品管溶液颜色比空白管颜色深时，可确证样品中存在有机磷农药。 ⑴ 胆碱用量试验 1 2 3 4 5  缓 冲 液 0.5ml  血 浆 0.5ml  氯化乙酰胆碱 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5  5%甲醇水 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5   37℃水浴，30分钟  盐酸羟胺与氢氧化钠等体积混合液 1ml   混匀，放置3分钟  稀 盐 酸 0.5ml  三氯化铁 0.5ml  ⑵ 样品测定 提取液80℃以下水浴挥干，残渣用5%甲醇水溶液溶解. 1 2  样品甲醇液 0.5ml   5%甲醇水  0.5ml  缓 冲 液 0.5ml  氯化乙酰胆碱 适量  5%甲醇水 至2ml