第五章 霉菌及其毒素分析 第一节 产毒霉菌及霉菌毒素的筛选 一、产毒霉菌的筛选 1、直接测定霉菌毒素。 2、动物试验 用于筛选产毒霉菌的动物主要有小白鼠和兔子。 ⑴ 小白鼠 常用于通过口服或注射毒性试验来筛选产毒青霉菌和曲霉菌等。方法是将分离纯化的霉菌接种于经过灭菌的饲料中，培养7～14天后，60℃干燥48h，以杀死或抑制霉菌生长，然后制成菌料，直接饲喂小白鼠，观察小白鼠的生长情况或死后变化。或用有机溶剂提取制成粗毒素，注射或投服，观察小白鼠的中毒情况或死后变化。 ⑵ 兔子 常用于皮肤局部刺激试验筛选镰刀菌或其它一些产生细胞毒素的霉菌。方法是将分离纯化的霉菌接种于经过灭菌的饲料或其它基质中，培养7～14天后，用有机溶剂提取制成粗毒素，将兔子背部毛剪净，涂搽粗毒素，观察兔子皮肤的毒性反应，如红肿、热痛、坏死等。 二、霉菌毒素的筛选和测定 霉菌毒素的发现通常有两种途径： ⑴ 在研究自然发生中毒过程中发现霉菌毒素，如黄曲霉毒素； ⑵ 在直接研究某种霉菌的产毒性能时发现毒素，如研究赭曲霉时发现赭曲霉毒素。 引起急性中毒的毒素易为人们发现和重视。但在多数情况下，引起慢性中毒如引起生产性能下降，对疾病的抵抗力降低等的霉菌毒素往往容易被人们忽视。所以，筛选及测定霉菌毒素对知道畜牧业生产、防病治病有重要的意义。 霉菌毒素的筛选和测定方法主要有： ㈠ 物理化学法 物理化学方法是利用气相色谱、高效液相色谱、薄层层析进行定量测定。这里主要就霉菌毒素的薄层层析分析作一介绍。 1、采样 由于霉菌毒素一般污染饲料的胚部，因而常规的随机抽样和分层定点采样方法有时不能代表成批饲料的真实情况。Cucullu等曾对2Kg花生样品进行逐粒观察，挑出其中20粒霉变花生，发现这些花生的黄曲霉毒素含量在0.3ppm至1100之间。即使样品中霉变花生比例变化很小，其结果也将发生很大的变化。所以，进行霉菌毒素分析时，其采集平均试样的采样点要比常规采样多。散装样品，需采100个点以上，袋装样品要采25%以上袋。平均试样经过粉碎后再缩分成试样，供测定用。 推荐的饿米军毒素的采样过程： 100个点以上 粉碎 匀浆 大批样品————3×3.5Kg（平均试样）——3×350g——3×2×100g。 25%袋以上 缩分 缩分 2、提取 霉菌毒素通常均为有机物，须用响应极性的有机溶剂提取。 常用有机溶剂： 粗提溶剂——甲醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙腈，这些溶剂单独使用或两种、两种以上配合使用。 纯化用溶剂（萃取）——石油醚，正己烷。 常用的提取方法：振荡提取30～45min； 高速匀浆提取3min。 3、纯化 霉菌毒素提取液的怀春化除了前述的萃取法、柱层析法和薄层色谱法外，还有液固提取法（Liquid-solid extractrion）和化学吸附法(Chemical absorption)。 液固提取法是利用多数霉菌毒素不溶于石油醚和正己烷的性质，用正己烷或石油醚除去试样中的脂肪、色素等弱极性杂质的一种纯化方法。此法常在试样提取前或与提取同时进行。 化学吸附法是吸附柱色谱的衍化，系用一些吸附剂如硅藻土、硅胶、活性炭、碳酸铜等将杂质吸附除去的一种方法，此法常与试样提取同时进行。 4、测定 下表所列的是几种霉菌毒素TLC进行测定的方法。 表5-1 几种霉菌毒素TLC分析方法 毒素名称 吸附剂 展开剂 Rf 显色方法  黄曲霉毒素B1 硅胶 氯仿—甲醇（97﹕3） 氯仿—丙酮—正己烷（7﹕2﹕1） 氯仿—丙酮（9﹕1） 0.44 0.35 0.27 UV365nm  桔青霉素 硅胶+草酸 氯仿—甲醇（98﹕2） 氯仿—丙酮（9﹕1） 0.52 0.51 UV365nm  赭曲霉毒素A 硅胶 苯—乙酸（4﹕1） 0.40 UV365nm  展青霉素 硅胶 苯—甲醇（97﹕3） 苯—丙酮（9﹕1） 0.22 0.16 UV254nm  杂色曲霉毒素 硅胶 氯仿—甲醇（97﹕3） 氯仿—丙酮（9﹕1） 0.67 0.27 UV254nm  T-2毒素 硅胶 氯仿—甲醇（97﹕3） 氯仿—丙酮（9﹕1） 0.45 0.22 硫酸铈  玉米赤霉烯酮 硅胶 氯仿—甲醇（97﹕3） 氯仿—丙酮（9﹕1） 0.40 0.38 UV254nm  震颤素 硅胶 氯仿—甲醇（97﹕3） 氯仿—丙酮—正己烷（7﹕2﹕1） 0.40 0.51 UV254nm 硫酸铈加热   ㈡ 生物学试验 生物学试验方法主要包括细胞学试验、微生物学试验、免疫学试验和动物试验等。 1、细胞学实验 细胞学试验是利用某些霉菌毒素具有细胞毒性，对组织培养细胞具有毒性作用，引起细胞变形、细胞数减少，形成巨细胞或引起细胞死亡等。 用来做细胞学试验的组织细胞有：1日龄小鸡气管细胞；小牛肾细胞和鸡胚细胞等。 2、微生物学试验 许多霉菌毒素起初都是作为抗菌素被发现的。微生物学实验就是利用某些霉菌毒素的抑菌性能来测定其毒性。 常用的微生物有：巨大芽孢杆菌（Bacillus negaterium）、枯草杆菌(B. Su-btilis)、乳酸菌(Lactic acid bactria)。 由于不同霉菌毒素对不同动物、不同组织细胞的毒性不同，因此在结果分析时应注意：微生物学试验不可能测定所有对脊椎动物有毒的毒素，特别是侵害脊椎动物神经系统的毒素。同时，抑菌试验结果理想的毒素也不一定对脊椎动物有毒性。 3、免疫学试验 免疫学试验是测定霉菌毒素的高特异性和高灵敏度的定性定量方法。目前已用于测定赭曲霉毒素A、T-2毒素、黄曲霉毒素B1和M1、玉米赤霉烯酮等。 免疫学试验包括放射免疫试验和酶联免疫吸附试验。 ⑴ 放射免疫试验（Radioimmunoassay, RIA） 放射免疫试验是将同位素技术的高灵敏与抗原抗体反映的高特异性结合起来。其基本原理是放射性标记抗原与非标记抗原竞争性地和抗体结合，当样品中 的非标记抗原的量增加时，标记抗原与抗体形成的复合物的两减少，即样品中待测抗原的量与标记抗原抗体复合物的量成反比。所以可根据标记抗原抗体复合物的多少（放射性强度）来定量未知抗原。 ⑵ 酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA） 酶联免疫吸附试验的基本原理是酶标记抗原或抗体与相应的抗体或抗原后，结合在免疫复合物上的酶遇到相应的底物，催化底物水解、氧化或还原，产生有色物质，颜色的深浅与相应抗原或抗体的量成正比，借助颜色的深浅来定量抗原或抗体。 注意：霉菌毒素是一类半抗原，它们不能单独刺激机体产生抗体，必须将它们和载体（如丙种球蛋白、卵清蛋白等）结合后，才具免疫原性。 ４、动物试验 动物试验在霉菌毒素筛选中用得较多的有雏鸭试验和小白鼠子宫增重试验。 雏鸭试验用于黄曲霉毒素筛选。雏鸭对黄曲霉毒素特别敏感，当用含黄曲霉毒素的饲料饲喂雏鸭或用其粗提取液注射时，可引起雏鸭死亡，并出现特征性的病理组织学变化——胆小管增生。 小白鼠子宫增重试验用于玉米赤霉烯酮的筛选。玉米赤霉烯酮具有雌激素样作用，当用含玉米赤霉烯酮的饲料饲喂小白鼠或用粗提取液注射时，可引起小白鼠的子宫增大。 第二节 饲料中常见产毒霉菌属的鉴定 霉菌的鉴定，是在于确定一种未知菌的分类地位和属名、种名。其鉴定的主要依据是形态特征和培养性状。 一、培养条件 由于霉菌在不同的培养条件下形态有所不同，所以在鉴定霉菌时，需要用固定的培养条件。这些条件包括：特定的培养基、一定的培养温度和培养时间。 通常鉴定青霉和曲霉的标准培养基为察氏培养基，以麦牙汁琼脂培养基作为辅助培养基。培养温度为23～25℃；培养时间：3～5天时进行显微观察，7～14天时进行霉菌的形态特征观察。 ⑴ 察氏培养基（Capak agar，CA） 蔗糖 Sugar 30g 　NaNO3 30g 　　　 K2HPO4 1g MgSO4.7H2O 0.5g 　　 KCl 0.5g 　　FeSO4.7H2O 0.01g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml 化学试剂为分析纯 边搅拌边煮沸至全部溶解成透明状，调节pH为4.4～4.6。１５磅灭菌２０min。 ⑵ 麦牙汁琼脂培养基（低渗培养基，Beer wort） 麦牙浸膏 20g 葡萄糖 20g 蛋白胨 1g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml 将各种成分溶解水中，边加热边搅拌至培养基透明，10磅灭菌20min。 鉴定镰刀菌、根霉、毛霉和未知菌类的标准培养基为马铃薯葡萄糖培养基和马铃薯蔗糖培养基，培养温度为23～25℃，培养3～4天镜检，7～8天肉眼观察。 马铃薯葡萄糖培养基（PDA） 干净新鲜去皮的马铃薯 200～300g 葡萄糖 20g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml 将马铃薯切成小块，加水1000ml煮沸15min，用双层纱布过滤后加葡萄糖和琼脂各20g，边加热边搅拌至琼脂溶化，加水补足至液体1000ml，并调节pH至5.5。 马铃薯蔗糖培养基的成分和配制方法与PDA相似，只需将葡萄糖改为蔗糖即可。 其它霉菌多用察氏培养基和PDA培养基。 有些霉菌要求特殊培养时，也可采用特殊的选择性培养基。 二、培养方法 霉菌鉴定时的培养方法主要有平板培养法和载片培养法两种。 1、平板培养法 系将纯化的霉菌接种于标准培养基平板，然后用一定的条件培养、制片观察。制片方法是滴一滴乳酸苯酚液于干洁载玻片中央，用接种针从培养基上挑取少量典型材料（近菌落边缘包括菌丝和孢子的材料）置于液滴中，并将材料小心撕开，全部润湿，然后盖上盖玻片并轻轻按压，即成。 乳酸苯酚液的组成和配制方法如下： 苯酚 10g 乳酸 10ml 甘油 20ml 蒸馏水 10ml 先将苯酚加入10ml水中，加热至溶解后，再加入乳酸和甘油，混匀，即可。 对于产生极小而易碎孢子梗的真菌，制片观察很难看到完整而清楚的分生孢子头，为此可采用载片培养法。 2、载片培养法 系于培养皿底铺一圆形滤纸，纸上放一“U”型玻棒，其上再放一载玻片，培养皿内加入5ml左右水，盖好后灭菌。以无菌操作法切取1cm2平板培养基，并移至载玻片中央，培养基四周接种霉菌材料，盖上已灭菌的盖玻片，再盖好培养皿，于一定条件下培养，在培养适当时间后取出，置低倍显微镜下观察。 此法不仅能解决制片困难，而且对菌丝分枝、着生状态和分生孢子头等观察也可获得较为满意的效果。 三、霉菌鉴定的主要项目 霉菌鉴定的主要依据是形态特征和培养性状。因此，其鉴定的主要项目包括培养性状和形态特征观察。 肉眼观察 接种的平板，在培养过程中，需要在一定时间进行肉眼观察（必要时，可借助放大镜），并详细地记录菌落的外观。 ⑴ 生长速度：记录菌落生长的快、中、慢、极慢，一般用培养两周时菌落的直径（cm）表示。 ⑵ 菌落的颜色：这是霉菌菌种鉴定的重要依据之一。包括霉菌菌落本身的颜色和培养基的颜色。菌落本身的颜色是指菌丝、分生孢子梗、顶囊或分生孢子、分生孢子头的颜色；培养基颜色是指霉菌产生的色素使培养基出现的变化，与培养基的成分也有一定的关系。 ⑶ 菌落的表面：气生菌丝生长疏松或致密；平坦、隆起、凹陷或有皱，有无同心环或放射沟纹；边缘是否整齐，是全缘的、锯齿状的，还是树枝状和纤毛状等。 ⑷ 菌落的质地：指菌落的外观似毡状、绒状、棉絮状、羊毛状、束状、粉粒状、明胶状或皮革状等。 ⑸ 渗出液：有些菌种常常在菌落表面出现带颜色的液滴。观察时应注意其色调和分泌的数量。 ⑹ 气味：许多菌株在培养过程中有明显的 气味，如霉味、土气味和芳香味等，有时可作诶鉴定的参考。 2、显微镜检查 霉菌的显微镜检查时主要须注意以下几项内容： ⑴ 菌丝：菌丝的宽度、有无横隔、色泽、特殊的菌丝器官如假根、足细胞等。 菌丝是构成霉菌营养体的基本单位是菌丝。 菌丝是一种管状的细丝，把它放在显微镜下观察，很像一根透明胶管，它的直径一般为几十微米，比细菌和放线菌的细胞约粗几倍到几十倍。菌丝可伸长并产生分枝，许多分枝的菌丝相互交织在一起，就叫菌丝体。 根据菌丝中是否存在隔膜，可把霉菌菌丝分成无隔膜菌丝和有隔膜菌丝两种类型。无隔膜菌丝：菌丝中无隔膜，整团菌丝体就是一个单细胞，其中含有多个细胞核。这是低等真菌（即鞭毛菌亚门和接合菌亚门中的霉菌）所具有的菌丝类型。有隔膜菌丝：菌丝中有隔膜，被隔膜隔开的一段菌丝就是一个细胞，菌丝体由很多个细胞组成，每个细胞内有个或多个细胞核。在隔膜上有至多个小孔，使细胞之间的细胞质和营养物质可以相互沟通。这是高等真菌（即子囊菌亚门和半知菌亚门中的霉菌）所具有的菌丝类型。  霉菌菌丝的变态：为适应不同的环境条件和更有效地摄取营养满足生长发育的需要，许多霉菌的菌丝可以分化成一些特殊的形态和组织，这种特化的形态称为菌丝变态。 假根：根霉属霉菌的菌丝与营养基质接触处分化出的根状结构，有固着和吸收养料的功能。  菌网和菌环：某些捕食性霉菌的菌丝变态成环状或网状，用于捕捉其它小生物如线虫、草履虫等。 左图：霉菌的菌环和菌网 a.菌环；b.简单菌网；c.复杂菌网 菌核：大量菌丝集聚成的紧密组织，是一种休眠体，可抵抗不良的环境条件。其外层组织坚硬，颜色较深；内层疏松，大多呈白色。如药用的茯苓、麦角都是菌核。. 左图：麦角菌的菌核 子实体：是由大量气生菌丝体特化而成，子实体是指在里面或上面可产生孢子的、有一定形状的任何构造。例如有三类能产有性孢子的结构复杂的子实体，分别称为闭囊壳、子囊壳和子囊盘。 ⑵ 繁殖体：各种孢子的大小、形态、色泽及产孢子结构如分生孢子、后壁孢子、包囊孢子、子囊孢子、分生孢子头、子囊、子座等。 霉菌有着极强的繁殖能力，而且繁殖方式也是多种多样的。虽然霉菌菌丝体上任一片段在适宜条件下都能发展成新个体，但在自然界中，霉菌主要依靠产生形形色色的无性或有性孢子进行繁殖。孢子像植物的种子，不过数量特别多，特别小。 霉菌的无性孢子直接由生殖菌丝分化而形成，常见的有节孢子、厚垣孢子、孢囊孢子和分生孢子。 节孢子：菌丝生长到一定阶段时出现横隔膜，然后从隔膜处断裂而形成的细胞称为节孢子。如产生的节孢子。 白地霉的节孢子 如厚垣孢子：某些霉菌种类在菌丝中间或顶端发生局部的细胞质浓缩和细胞壁加厚，最后形成一些厚壁的休眠孢子，称为厚垣孢子。  毛霉属中的总状毛霉的厚垣孢子。 孢囊孢子：在孢子囊内形成的孢子叫孢囊孢子。孢子囊是由菌丝顶端细胞膨大而成，膨大部分的下方形成隔膜与菌丝隔开，膨大细胞的原生质分化成许多小块，每小块可发育成一个孢子。孢囊孢子有两种类型，一种为生鞭毛，能游动的叫游动孢子，如鞭毛菌亚门中的绵霉属；另一种是不生鞭毛，不能游动的叫静孢子，如接合菌亚门中的根霉属。  霉菌的游动孢子  霉菌的静孢子 左：毛霉的孢子囊；中：孢子囊壁破裂，露出静孢子；右：囊轴 分生孢子：是在生殖菌丝顶端或已分化的分生孢子梗上形成的孢子，分生孢子有单生、成链或成簇等排列方式，是子囊菌和半知菌亚门的霉菌产生的一类无性孢子。 霉菌分生孢子的着生和形态（青霉、曲霉、镰刀霉）      曲霉的分生孢子梗和顶囊上的分生孢子 镰刀霉的镰刀形大分生孢子 青霉的帚状分生孢子梗和分生孢子 曲霉的分生孢子头彩图  三、霉菌的有性繁殖和有性孢子 经过两性细胞结合而形成的孢子称为有性孢子。霉菌的有性繁殖过程一般分为三个阶段，即质配、核配和减数分裂。 质配是两个配偶细胞的原生质融合在同一细胞中，而两个细胞核并不结合，每个核的染色体数都是单倍的。 核配即两个核结合成一个双倍体的核。 减数分裂则使细胞核中的染色体数目又恢复到原来的单倍体。 有性孢子的产生不及无性孢子那么频繁和丰富，它们常常只在一些特殊的条件下产生。常见的有卵孢子、接合孢子、子囊孢子和担孢子，分别由鞭毛菌亚门、接合菌亚门、子囊菌亚门和担子菌亚门的霉菌所产生。 卵孢子：菌丝分化成形状不同的雄器和藏卵器，雄器与藏卵器结合后所形成的有性孢子叫卵孢子。  霉菌的卵孢子　1.雄器；2. 藏卵器；3. 卵孢子 接合孢子：由菌丝分化成两个形状相同、但性别不同的配子囊结合而形成的有性孢子叫接合孢子。 子囊孢子：菌丝分化成产囊器和雄器，两者结合形成子囊，在子囊内形成的有性孢子即为子囊孢子。 担孢子：菌丝经过特殊的分化和有性结合形成担子，在担子上形成的有性孢子即为担孢子。  霉菌的接合孢子。 左：毛霉的(+)和(-)型菌丝在交界处结合产生黑色的带状，肉眼可见； 右：取小黑点用显微镜观察所看到的接合孢子  霉菌的子囊孢子 a．子囊果；b．子囊；c．伪侧丝；d．子囊孢子  担孢子的形成过程示意图 a~d．双核细胞；e．核融合；f~g．核分裂；h．担孢子形成；i．担孢子成熟并释放 霉菌的孢子具有小、轻、干、多，以及形态色泽各异、休眠期长和抗逆性强等特点，每个个体所产生的孢子数，经常是成千上万的，有时竟达几百亿、几千亿甚至更多。这些特点有助于霉菌在自然界中随处散播和繁殖。对人类的实践来说，孢子的这些特点有利于接种、扩大培养、菌种选育、保藏和鉴定等工作，对人类的不利之处则是易于造成污染、霉变和易于传播动植物的霉菌病害。 四、霉菌的鉴定 目前所发现的能引起人类和动物中毒的产毒霉菌，主要是曲霉菌属、青霉属和镰刀菌属的一些菌种。这里近就这些有关的霉菌属的分类系统和形态特征加以介绍。 曲霉属 曲霉属（Aspergillus）在真菌分类上属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科。 霉菌属的分类，主要是根据瑞波（K.B.Paper）和菲内尔（D.I.Fennell）合著的《曲霉属》（The Gens Aspergillus 1956）一书，本属共分为18个群，132个钟，18个变种。 ⑴ 培养特征 ① 质地 曲霉属菌落绒状或絮状； ② 表面 有同心环和放射沟纹； ③ 颜色 初为白灰色或灰白色，长出孢子后，因种类不同而有各种不同的颜色，但同一种菌颜色比较稳定，是分类的重要依据之一。 ④ 生长速度 培养10～14天后菌落直径3～5cm左右。   各种曲霉的菌落 ⑵ 显微镜检查特征 ① 菌丝无色或淡色，少数类型有明亮的颜色，有横隔，多分枝。分气生菌丝和营养菌丝。菌丝的某些细胞膨大，形成厚壁，称为足细胞。 ② 分生孢子梗自足细胞生长，并与足细胞的长轴垂直，无横隔膜，光滑或粗糙，顶端膨大形成顶囊。顶囊呈棍棒状、椭圆形、半球形或近球形。顶囊表面着生单层或双层小梗。双层小梗的下面一层，即直接着生在顶囊上的小梗称梗基或初生小梗。每个梗基上各着生一个或几个小梗（或称次生小梗）。小梗的顶端着生成串的分生孢子，叫分生孢子链。顶囊、小梗和分生孢子链构成分生孢子头。分生孢子头有各种颜色和形状，如球形、放射形、棍棒状、直柱形等。    曲霉的分生孢子梗和顶囊上的分生孢子 曲霉的分生孢子头彩图  大多数曲霉为无性繁殖，它们的抵抗力较弱，少数曲霉能形成有性阶段，产生闭囊壳，内生很多子囊，故抵抗力较强。闭囊壳成熟时子囊破裂，释放出子囊孢子。 其特征性产孢结果：具有分生孢子链。 曲霉属的基本形态见（《食品微生物》P43页）。 曲霉属常见的产毒霉菌有黄曲霉、寄生曲霉、棒曲霉、赭曲霉、杂色曲霉、白曲霉、烟曲霉、构巢曲霉等。这些曲霉的形态特征可参阅《食品微生物》P42-48页）。 2、青霉属 青霉属（Penicillum）和曲霉属十分接近，在真菌分类学上也属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、从梗孢科。 青霉属Pitt(1979年)的分类，有四个系150个种。 ⑴ 培养特征 ① 质地 青霉属菌落呈绒状、束状、皮革状等，最后由于产生大量分生孢子成粉粒状，质地相对较曲霉属致密。 ② 颜色 菌落多带绿色色调，如绿色、黄绿色或灰绿色等。 ③ 生长速度 相对较曲霉属缓慢，一般培养10～14天后菌落直径3cm以下。   青霉的菌落 ⑵ 形态特征  青霉的帚状分生孢子梗和分生孢子 ① 菌丝有横隔，多无色或淡色，分气生菌丝和营养菌丝（基质菌丝）。分生孢子梗可由营养菌丝或气生菌丝生出，直立，基部不形成膨大的足细胞，有横膈膜。 ② 青霉属的特征性结构是分生孢子梗顶端形成扫帚状分枝，称为帚状枝。帚状枝由单轮、双轮以及多轮的分枝系统构成，对称或不对称。这些分枝依部位不同自上而下分别称为小梗、梗基、分枝（副枝）。即最后一级分枝为小梗，着生小梗的细胞叫梗基，支持梗基的细胞叫副枝。小梗上产生分生孢子，分生孢子具有各种形状和颜色，光滑或粗糙，形成不分支的链。 帚状枝的形状和复杂程度是青霉属分类的重要依据。青霉属跟军帚状枝轮状分枝的不同，可分为四种类型： 单轮青霉组：帚状枝由分生孢子梗上轮生的一层小梗组成。 b、对称二轮青霉组：帚状枝由在分生孢子梗上紧密轮生的梗基和每个梗基上着生的几个细长尖锐的小梗组成。全部帚状枝对分生孢子梗而言大体对称、紧密象漏斗状。 C、不对称青霉组：包括一切帚状枝作两次或更多次分枝，对分生孢子梗而言不对称的种。如果接近对称时，也没有对称二轮青霉组那样紧密的结构及细长尖锐的小梗（即小梗结构松散）。 D、多轮青霉组：帚状枝极为复杂，作多次分枝，而且常是对称的。 曲霉属的基本形态见（《食品微生物》P49页）。 青霉属常见的产毒霉菌有：岛青霉、桔青霉、黄绿青霉、红色青霉、扩展青霉、圆弧青霉、鲜绿青霉等。 3、镰刀菌属 镰刀菌属(Fusarium)又名链孢霉属，在分类学的位置为半知菌亚门、丝孢纲、瘤座孢目、瘤座孢科。 产毒镰刀菌主要侵染玉米、大麦、小麦和饲草（稻草和干草）。  镰刀霉的镰刀形大分生孢子 多数镰刀菌气生菌丝很发达，菌落呈絮状，质地较曲霉、青霉疏松，可呈白色、粉红色等。反面颜色基本相同，但较深。培养基也常被染色。镰刀菌生长远较曲霉、青霉迅速，一般培养5～7天菌落直径可达7～10cm。 镜检镰刀菌多有两种分生孢子； 小型分生孢子生于分枝或不分枝的分生孢子梗上，假头状或链状着生，形态多样，有卵圆形、圆形、梨形、纺锥形等，单细胞或双细胞； 大型分生孢子产生在分生孢子座上，或产生在粘孢团中，形态多样，有镰刀形、线形、纺锥形等，一般为3～5个分隔。有些菌种可产生后壁孢子、后壁孢子间生或顶生，单生或串生，光滑或粗糙，多形成于菌丝体内。有些菌种可产生菌核、子囊壳等结构。 镰刀菌属的基本形态见图4-3。 常见的产毒镰刀菌属有禾谷镰刀菌、梨孢镰刀菌、串珠镰刀菌、茄病镰刀菌、木贼镰刀菌等。 其它霉菌属 ⑴ 葡萄穗霉属（Stachybotrye Corde） 该属分类属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、暗色孢科。 本属常见的均是黑色葡萄穗霉，又称葡萄穗霉或纸样葡萄穗霉，是一种腐生菌，能分解纤维素，在富纤维素的稻草、干草上生长良好，特别在其茎节上形成黑色或烟灰色斑点。本菌也能在湿的滤纸、察氏培养基、沙堡肉培养基上生长。 培养：在PDA上生长较局限、呈茸毛状，初期烟褐色至绿褐色，后期成黑色。反面颜色相同，培养基不着色。 镜检： ① 菌丝透明、有隔，呈广角或近于直角分枝。 ② 分生孢子梗自菌丝直立生出，基部近于透明，顶部呈烟褐色，有隔，分枝或不分枝，顶端产生瓶状小梗。 ③ 小梗单生、轮生或对生，一般6～19个，透明或呈浅褐色。 ④ 分生孢子产生于细小小梗的顶端，单生，卵圆形或圆形，透明或烟褐色、黑色，壁光滑或有刺状突起。 葡萄穗霉的基本形态见《食品微生物》P49页图2-67。 来源及毒性：本菌遍布于全国，从土壤、种子、有机残体中均可分离到。其可产生黑葡萄穗霉毒素A和C（Stachybotrytoxin A和C），污染饲料时可引起动物葡萄岁没中毒症，中毒家畜表现为白细胞减少，广泛性出血和坏死。当人、畜吸入大量的孢子时，则可引起咽炎和出血性鼻炎，严重者出现发热和白细胞减少，广泛性出血和坏死。当人、蓄吸入大量的孢子时，则可引起咽炎和出血性鼻炎，严重者出现发热和白细胞减少。 ⑵ 长喙壳属（Ceratosystis Ellis ﹠ Halst） 长喙壳属属于子囊菌亚门、核菌纲、球壳目、长喙壳科。 长喙壳属以其子囊壳具有细长的颈为特征。其中主要的菌是甘薯黑斑病菌（C. Fimbriata），引起甘薯黑斑病，这是植物的十大病害之一。 培养：菌落在麦芽汁琼脂平板上初为白色，棉絮状，2～3天内成灰褐色，最后成黑色，一周后菌落直径约2cm，培养物具有香蕉油味或水果味。 镜检：气生菌丝无色至淡褐色，分枝，有隔，壁薄，顶端即为分生孢子梗，产生内生分生孢子，内生孢子陆续排列到分生孢子梗顶端而离开分生孢子梗。分生孢子圆形、椭圆形，透明或淡褐色。 子囊壳生于基物表面或埋于基物内部，黑色、球形，基部平坦，颈黑色，顶端透明，长是子囊壳直径的数倍，颈内孔道有8～15根纤细的菌丝，子囊孢子具有胶质鞘，帽形。 本菌侵害甘薯，引起甘薯黑斑病，病变处于干涸、硬化，稍略凹陷，圆形或不规则形，黑色，周边界限清晰，产生的毒素包括甘薯酮（Ipomeamronre），甘薯醇（Ipomeamaronol）和甘薯宁（Ipomeanine）等，中毒家畜主要表现为呼吸困难。病薯经干燥，磨粉，酿酒后仍具有一定的毒性。 第三节 黄曲霉毒素及其分析 一、概述 黄曲霉素（Aflatoxin，缩写AFT）为黄曲霉（Aspergillus flavus Link.）和寄生曲霉（A. perasiticusSpeave）产毒菌株的代谢产物。此外，在热带地区，温特曲霉(A. wehamer)和软毛青霉(Pencillium puberulum Biourge)也能产生少量的黄曲霉毒素。 ㈠ 黄曲霉毒素的结构 黄曲霉毒素是一类二呋喃环和香豆素（氧杂萘邻酮）的衍生物，目前已明确分子结构的约有17种，饲料在自然条件下污染的AFT主要有四种，即AFTB1、B2、G1、G2，其中以B1最多，G1其次，B2和G2很少。其结构如下： ㈡ 黄曲霉毒素的理化性质 1、溶解性 黄曲霉毒素溶于多种极性有机溶剂，如氯仿、甲醇、乙醇、丙酮、乙二甲基酰胺，难溶于水（在水中最大溶解度为10mg/L），不溶于石油醚、乙醚和己烷，这是提取和溶解黄曲霉毒素的依据。 2、荧光 在365nm波长的紫外灯下，B族黄曲霉毒素呈蓝色荧光，G族呈黄绿色荧光。它们的命名分别取自“blue”和green“之首字母。 3、稳定性 黄曲霉毒素对光、热、酸较稳定，但对强酸、强碱和氧化剂不稳定。 黄曲霉毒素能耐高温，一般的蒸煮不易破坏，只有加热到280~300℃时才裂解，15磅高压灭菌2h，毒力降低1/4~1/3，4h降低1/2。 对紫外光也相对稳定，但在强紫外光照射下可破坏。 在酸性和中性介质中稳定；但PH＜3时分解。 黄曲霉毒素对碱不稳定，当PH9~10时，其内酯环开裂生成几乎无毒的盐，荧光也随之消失，但此反应是可逆的，在酸性条件下又复原。 黄曲霉毒素对氧化剂也不稳定，很多氧化剂如次氯酸钠、氯、过氧化氢、臭氧和高硼酸钠等均可使毒素破坏，荧光消失，且氧化剂浓度越高，黄曲霉毒素分解越快。其中5%次氯酸钠常作为实验室里黄曲霉毒素的消除剂。 ㈢黄曲霉毒素毒性 黄曲霉毒素属剧毒物质，是目前发现最强的化学致癌物质，在世界卫生组织（WHO）确定重点研究的毒物中被列为首位。不同黄曲霉毒素之间毒性差异很大，根据雏鸭的口服LD50（mg/Kg），AFTB1的毒性最大（LD50为0.24~0.56）；G1次之（LD50为0.78~1.20）；B2的LD50为1.68；G2的LD50为3.45。 由于自然界黄曲霉产毒菌株产生的毒素以B1的比例为高，加之其毒性和致癌性最大，因此在检验饲料中黄曲霉毒素含量和对其进行卫生评价时，一般只以B1作为分析指标。 几乎所有的动物对AFT都很敏感，但不同的品种、性别、营养状况对AFT的敏感性不同。一般地说幼年动物比成年动物敏感；雄性动物比雌性动物敏感；高蛋白饲料可降低动物对AFT 的敏感性。不同动物中，雏鸭、仔猪、火鸡为最敏感，绵羊对黄曲霉毒素有较高的耐受性。 急性AFT中毒主要表现为出血、贫血、黄疸、血清谷丙转氨酶（GPT）升高。剖解主要病理变化为广泛性出血、中毒性肝炎。组织学检查可见肝细胞变性坏死，部分肝小叶增生，胆小管增粗。 慢性AFT中毒主要表现为贫血、消瘦。剖解可见肝萎缩硬化和胸腹腔积液；组织学检查可见肝结缔组织增生，病程长的可见肝癌结节。 ㈣ 黄曲霉毒素的卫生标准 饲料名称 AFTB1允许量（mg/Kg）  肉用仔鸡、生长鸡、仔猪配合饲料 ≤0.01  产蛋鸡配合饲料 ≤0.02  生长肥育猪配合、混合饲料 ≤0.02  二、一般分析方法： 黄曲霉毒素的分析方法很多，有微柱法（与柱层析相似，常用作筛选），高效液相色谱法（HPLC），气相色谱法（GC）和薄层色谱法（TLC）。 薄层色谱法分析黄曲霉毒素一般要经过以下步骤：毒素的提取和纯化，定量测定、理化鉴定。 黄曲霉毒素的提取和纯化 黄曲霉毒素提取常用的有机溶剂有甲醇、氯仿、丙酮。根据样品的性质不同，通常在这几种有机溶剂中加入一定比例的水。如花生中黄曲霉毒素分析的BF法是用甲醇—水（55﹕45V/V）提取的，而棉籽中黄曲霉毒素分析的Pons法是用丙酮—水（85﹕15V/V）提取的。 常用的提取方法是振荡提取法和匀浆提取法。提取液用萃取法纯化或在提取过程中用液固提取法纯化。纯化后的提取液浓缩至干。再用苯—乙腈（98﹕2）溶解定容，供薄层色谱分析。 定量分析： 黄曲霉毒素分析常用的展开剂有：氯仿丙酮（92：8），苯—甲醛—乙酸（90：5：5），乙醚—甲醇—水（96：3：1）。 将上述样液和标准液点于薄层板上，用适合的有机溶剂展开，然后于365nm的紫外灯下观察，用下述方法定量：将提取液稀释，直至薄层板刚好能看到兰紫色荧光，通过荧光的黄曲霉毒素的最低量（一般情况下是0.0004ug）推知提取液中黄曲霉毒素的浓度，或将不同量标准黄曲霉毒素和提取液在同一薄层板上展开，通过肉眼比较或薄层扫描仪扫描，求出待测样品的含量。 有时将点好样的薄层板先用无水乙醚预展，目的是消除一些杂质的干扰，预展后，黄曲霉毒素应在原点不动。 3、理化鉴定： 为了区别其它可能产生荧光并与黄曲霉毒素Rf值相似的物质，必须对黄曲霉毒素进行鉴定。常用鉴定方法有两种： ⑴ 光谱分析法 将薄层板上的荧光斑点（或带）剥离下来，用氯仿—甲醇（2﹕1）洗脱，洗脱液蒸发至干，再用氯彷溶解，测定其紫外吸收光谱，并和标准液比较。 ⑵ 衍生物法 黄曲霉毒素能与三氟乙酸反应形成黄曲霉毒素的衍生物，通过标准黄曲霉毒素形成的衍生物与待测样品形成的衍生物的Rf值的比较，即可对待测样品进行鉴定。 三、饲料中黄曲霉毒素B1的薄层色谱分析 1、原理 样品中的AFTB1经提取、纯化、浓缩和TLC后，在波长365nm紫外灯下产生蓝色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。 2、试剂 ⑴ 氯仿(溶解标准毒素)、石油醚（固液提取法，除去油脂和色素）、甲醇（提取用）、乙腈、苯（定容用）、丙酮（供配制展开剂）、无水乙醚（预展用）。 以上试剂需先进行空白试验，如不干扰测定，才能使用，否则逐一检查，进行重蒸馏。 ⑵ 甲醇—水（55﹕45） 即55ml甲醇加45ml水混匀。 ⑶ 苯—乙腈（98﹕2） 取98ml苯，加2ml乙腈混匀，作定容用。 ⑷ 三氟乙酸 供理化鉴定。 ⑸ 硅胶G 薄层层析用。 ⑹ 无水硫酸钠 脱水。 ⑺ 氯仿—丙酮（92﹕8）——展开剂。 ⑻ 黄曲霉毒素B1标准液 含AFT B1 10(g/ml的苯—乙腈溶液。 必要时可用紫外分光光度计测定其含量，并用TLC进行纯度检定。即在硅胶G上用氯仿—甲醇（96﹕4）或氯仿—丙酮（92﹕8）展开后应只有单一荧光点，无其它杂质荧光点，原点上没有残留的荧光物质。 ⑼ 黄曲霉毒素标准使用液 通常有两种，即含B1分别为0.2(g/ml和0.04(g/ml的苯—乙腈溶液。 ⑽ 次氯酸钠溶液 消除AFT之用。 3、仪器 ⑴ 小型粉碎器； ⑵ 样筛（20目）； ⑶ 电动振荡器； ⑷ 干洁玻璃板（5×20cm）； ⑸ 层析缸（6宽×4高×25长，cm） ⑹ 紫外分析灯 波长365nm； ⑺ 微量注射器。 4、操作方法 ⑴ 提取和纯化 甲法 适用于玉米、大米、麦类、薯干、豆类和花生等。 称取粉碎并通过20目筛的样品20g于250ml具塞锥形瓶中，加30ml石油醚和100ml甲醇—水（55﹕45），盖严，振荡提取30min[此时饲料中的油脂、色素等杂质进入石油醚（可弃去）；AFTB1和一些水溶性杂质存在于甲醇—水层]。过滤，取20ml甲醇—水（相当于原样品4g），加20ml氯仿和少量氯化钠（防止乳化，同时有盐析作用，促进甲醇—水中的AFTB1进入氯仿层），振摇2min，静置分层（由于AFTB1更易溶于氯仿，所以几乎全部AFTB1转入氯仿层，而水溶性杂质则留在甲醇—水中），氯仿洗涤液一并过滤到蒸发皿中，最后用少量氯仿洗涤滤器，洗液并入蒸发皿中（防止操作过程中黄曲霉毒素B1的损失），将蒸发皿置于通风柜中，65℃水浴蒸干，然后在冰浴上冷却2~3min后，准确加入1ml苯—乙腈溶液，用滴管的尖端混匀，然后从冰浴上取出，继续混匀至无苯结晶，再用滴管吸取上清液于2ml具塞试管中，冷藏（防止苯—乙腈蒸发引起试液浓缩），此时1ml点样液相当于4g原样品。 乙法 适用于玉米、大米、小麦及制品。 称取过20目筛的样品20g于250ml具塞锥形瓶中，用滴管加6ml水，使样品湿润，准确加入60ml氯仿，振荡30min，加12g无水硫酸钠，振荡后静置30min，过滤，取滤液12ml，于蒸发皿中，在65℃水浴上挥干，置冰盒上冷却，用1ml苯—乙腈定容至2ml具塞试管中备用。 ⑵ 制板 称取3g硅胶G，加8ml水，用力研磨1~2min，调成糊状后，立即倒于玻板上，制成5×20cm、厚度为0.25mm的薄层板三块，在空气中晾干，100℃活化2h。取出，于干燥器中保存备用。一般可保存三天左右，若放置时间过长，应重新活化后使用。 ⑶ 点样 将薄层板边缘附着的吸附剂括净，在距离板下端3cm的基线上用微量注射器滴加样液。一块板可滴加四个点，点距边缘和点间距离约为1cm，原点直径约3mm，在同一块上滴加点的大小应一致，点样时，可用吹风机边吹边点样。滴加样式如下： 第一点：10(l 0.04(g/ml的黄曲霉毒素B1标准使用液； 第二点：20(l样品液； 第三点：20(l样品液加10(l0.04(g/ml黄曲霉毒素B1标准使用液； 第四点：20(l样品液加10(l0.2(g/ml黄曲霉毒素B1标准使用液。 ⑷ 展开和观察 展开 薄层板先于展开槽内用无水乙醚预展12cm（薄层层析纯化，部分杂质可被推至薄层板的另一端，AFTB1则留在原点不动）。取出，挥干后再放于另一展开槽中，用氯仿—丙酮（92﹕8）展开12cm，取出吹干，在365nm波长的紫外灯下观察。 观察 第二点（样液）在第一、三、四点相应Rf的位置上不显蓝紫色荧光，则表示样品中黄曲霉毒素B1含量在5(g/Kg(5ppb)以下，此时，第一、三点荧光强度相同，可用以检查在该实验条件下最低检出量是否正常出现荧光。第四点主要起定位作用。如第二点（样液）在第一、三、四点相应Rf的位置上显示蓝紫色荧光，则需进行确证试验。 ⑸ 确证试验 为了证实样液斑点荧光系由AFT B1所产生的，可利用AFT B1在三氟乙酸（Ttifluoroacetic acid，TFA）作用下产生的衍生物AFTB2a在上述展开条件下Rf仅为0.1左右的特点，进一步确定。 由于TFA酸性较强，能使AFT B1水解成AFT B2a，反应式如下： 由于在AFT B2a分子中比AFT B1增加了—OH，增强了极性。故Rf值下降，由原来的0.6变成0.1左右。 确证方法如下： 于薄层板左边依次滴加四个点： 第一点：20(l样品液； 第二点：10(l 0.04(g/ml的黄曲霉毒素B1标准使用液； 第三点：20(l样品液； 第四点：10(l 0.04(g/ml的黄曲霉毒素B1标准使用液。 然后，在第一点和第二点上各加TFA1小滴，反应5min后，用电吹风吹热风2min（热风吹到薄层板上的温度不高于40）。用氯仿—丙酮（92﹕8）展开，在紫外灯下观察。 如果第一、二点荧光斑点的Rf值相同（衍生物对照），第三、四点荧光斑点的Rf值也相同（衍生物空对照），则说明样液斑点的荧光系由AFTB1产生。 ⑹ 稀释定量 样液中的AFT B1斑点的荧光强度如与其标准点的最低检出量（0.0004(g）的荧光一致，则样品中AFT B1含量为5(g/Kg（5ppb）。如果样液中荧光强度比最低检出量强，则需根据其强度估计减少滴加微升数或将样液稀释后再点加不同微升数，直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致。滴加式样如下： 第一点：10(l 0.04(g/ml的黄曲霉毒素B1标准使用液； 第二点：根据情况滴加10(l样品液； 第三点：根据情况滴加15(l样品液； 第四点：根据情况滴加20(l样品液。 ⑺ 计算 AFTB1（(g/Kg或ppb）=0.0004××D× 式中：V1为加入苯—乙腈混合液的体积（ml）； V2为出现最低检出量荧光时点加样液的体积（ml）； D为样液的总稀释倍数； m为用苯—乙腈混合液溶解时相当样品的质量（g）； 0.0004是黄曲霉毒素B1的最低检出量（(g）。 四、预防危害的措施 1、饲料的防霉与去毒 防霉是预防饲料被黄曲霉毒素污染的最根本的措施。如果饲料已被黄曲霉污染并产生毒素，则应设法将毒素破坏或除去。 加碱去毒法对去除油或饲料中的黄曲霉毒素均有效果，其机理是黄曲霉毒素在碱性条件下，结构中的内酯环被破坏，形成香豆素钠盐而溶于水，再用水洗可将毒素去除。 2、防止毒素危害的营养性措施 目前的去毒方法尚难彻底地将黄曲霉毒素从已被污染的饲料中除去，为了防止摄入的毒素被吸收，或减轻已吸收毒素的毒性作用，可采取一些营养性措施： ⑴ 在饲料中添加吸附剂，如活性炭、沸石等，可稳定地吸附黄曲霉毒素，从而阻止其被胃肠道吸收。 ⑵ 在鸡的饲粮中添加蛋氨酸、硒、胡萝卜素以及提高饲粮的蛋白水平，均可降低黄曲霉毒素对鸡的毒性作用。 ⑶ 用苯巴比妥等作为酶诱导剂给予畜禽，可诱导肝脏线粒体酶的代谢作用，增强机体对已吸收的黄曲霉毒素的解毒作用。 3、严格执行食品和饲料中黄曲霉毒素最高允许量标准，禁止高毒饲料的销售、生产等。