微生物分离与观察
陈金春,林琳
清华大学微生物学实验室,100084
Chenjc@mail.tsinghua.edu.cn
现代生物学导论实验
实验目的和内容
? 熟悉常用微生物培养基名称 ;
? 掌握微生物的分离,接种技术 ;
? 用平板划线法和稀释法分离微生物 ;
? 认识微生物存在的普遍性 ;
实验原理
? 从土壤中分离纯化微生物
? 土壤中混杂着大量的微生物,从里面分离,得到只含
有这一种微生物的纯培养 ;
? 根据某微生物对营养,温度,氧气等条件要求不同而
供给它适宜的培养条件,或加入某种抑制剂造成只
利于该菌生长,而抑制其他菌生长 ;
? 用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离,纯化 ;
实验仪器,材料和用具
? 实验材料,
? 菌源,土样 10g;
? 培养基,
? 牛肉膏蛋白胨培养基 ;
? 实验仪器,
? 取液器 (5000 ul,1000ul,200ul 个一支 );
? 培养箱,摇床
实验仪器,材料和用具
? 实验试剂,
? 1N NaOH,1N HCl,
? 0.9% 无菌生理盐水 ;
? 250ml三角瓶中 99ml,每瓶加 20粒玻璃珠 ;
? 250ml三角瓶中 50ml,作 10倍稀释用 ;
实验仪器,材料和用具
? 实验用具,
? 平皿 35个 ;
? 无菌有帽试管 7只 ;
? 无菌涂棒 2根 ;
? 无菌 5000ul,1000ul,200ul 吸头各 3个 ;
? 记号笔,酒精灯 ;
? 试管架 ;
实验步骤 —— 周围环境中微生物的观察
? 在牛肉蛋白胨平板上作如下实验：
? 分别用未洗过的手指头,用肥皂洗过的手指头 (不用毛巾擦 )在平板
是涂抹（用力一致） ;
? 用正在使用的毛巾,旧纸币在培养基上拖动 ;
? 放置一根头发 ;
? 用无菌接种环分别沾一环自来水和河水在平板
上划线；
? 用无菌牙签取一点牙垢在培养基上划线；
? 打开培养皿置实验台上（空气中） 10min;
? 按无菌操作要求在酒精灯火焰边打开皿盖 1min.
? 对着培养皿上的培养基咳嗽。
? 稍稍打开嘴唇压在培养基上 ;
? 以上用报纸包好倒置 350C培养箱里培养 48小时观察结果 ;
实验步骤 —— 从土壤中分离微生物
? 采土样,
? 选择肥沃土壤,去表层土,挖 5~20cm深度的
土壤数 10g,装入已灭菌的牛皮纸袋,封好袋
口,带回实验室 ;
? 倒平板 ;
实验步骤 —— 从土壤中分离微生物
? 制备土壤稀释液 ;
? 称取土样 1.0g,放入盛 99ml无菌水并带有
玻璃珠的三角瓶中，置摇床振荡 5min使土
壤均匀分散成为土壤悬液（ 10-2）。用 1ml
的无菌吸头从中吸取 0.5ml土壤悬液，注入
事先分装有 4.5ml无菌水的试管中，吹吸 3
次，振荡均匀（ 10-3）。然后同样方法，
配置成稀释度为 10-4,10-5,10-6的土壤溶
液；
实验步骤 —— 从土壤中分离微生物
? 涂布
? 用一支新的无菌吸头，分别由各浓度土壤
稀释液中各吸取 100ul，对号较均匀地放入
已写好稀释度的牛肉蛋白胨培养基平板上，
用无菌玻璃涂棒涂匀。每个浓度做 2个平
板。
实验步骤 —— 从土壤中分离微生物
? 培养
? 将牛肉蛋白胨培养基平板倒置于 370C温箱
中培养 24h；统计所长出的菌落数；
? 挑菌（不做）
? 将培养后所需要的单个菌落（要求是细菌
菌落）分别挑取划线于平板上,370C培养
48h检查菌落是否单纯，也可以用显微镜
涂片染色镜检是否是单一的微生物；
实验步骤 —— 从土壤中分离微生物
? 菌落计数
? 计算相同稀释度的平均菌落数,
? 有较大片菌苔生长时,弃用,以无片菌苔生长的
平皿计数 ;
? 若成片菌苔大小不到培养皿的一半,其余一半
分布均匀,将此一半计数 *2;
实验步骤 —— 从土壤中分离微生物
? 菌落计数
? 选择平均菌落数在 30~300间的平板,
? 只有一个符合此范围时,以该平均菌落数乘稀
释倍数即为该样品中微生物总数 ;
? 有两个在 30~300间时,按两者菌落总数比值决
定,比值小于 2,取平均 ;比值大于 2,取较少的菌落
总数 ;
实验步骤 —— 从土壤中分离微生物
? 菌落计数
? 所有菌落数均大于 300,取稀释度最高的平
均菌落数乘稀释倍数 ;
? 所有菌落数均小于 30,取稀释度最低的平均
菌落数乘稀释倍数 ;
? 所有菌落数均不在 30~300间,以最接近 30或
300的平均菌落数乘稀释倍数 ;
结果与讨论
? 你所取的土壤中细菌数量级为多少？
? 从你周围环境中微生物的观察,你认为无菌操
作应注意什么?
? 说明饭前洗手,饭后刷牙的重要性 ;
? 在日常生活中如何讲究饮食卫生?
谢谢大家 !
陈金春,林琳
清华大学微生物学实验室,100084
Chenjc@mail.tsinghua.edu.cn
现代生物学导论实验
实验目的和内容
? 熟悉常用微生物培养基名称 ;
? 掌握微生物的分离,接种技术 ;
? 用平板划线法和稀释法分离微生物 ;
? 认识微生物存在的普遍性 ;
实验原理
? 从土壤中分离纯化微生物
? 土壤中混杂着大量的微生物,从里面分离,得到只含
有这一种微生物的纯培养 ;
? 根据某微生物对营养,温度,氧气等条件要求不同而
供给它适宜的培养条件,或加入某种抑制剂造成只
利于该菌生长,而抑制其他菌生长 ;
? 用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离,纯化 ;
实验仪器,材料和用具
? 实验材料,
? 菌源,土样 10g;
? 培养基,
? 牛肉膏蛋白胨培养基 ;
? 实验仪器,
? 取液器 (5000 ul,1000ul,200ul 个一支 );
? 培养箱,摇床
实验仪器,材料和用具
? 实验试剂,
? 1N NaOH,1N HCl,
? 0.9% 无菌生理盐水 ;
? 250ml三角瓶中 99ml,每瓶加 20粒玻璃珠 ;
? 250ml三角瓶中 50ml,作 10倍稀释用 ;
实验仪器,材料和用具
? 实验用具,
? 平皿 35个 ;
? 无菌有帽试管 7只 ;
? 无菌涂棒 2根 ;
? 无菌 5000ul,1000ul,200ul 吸头各 3个 ;
? 记号笔,酒精灯 ;
? 试管架 ;
实验步骤 —— 周围环境中微生物的观察
? 在牛肉蛋白胨平板上作如下实验：
? 分别用未洗过的手指头,用肥皂洗过的手指头 (不用毛巾擦 )在平板
是涂抹（用力一致） ;
? 用正在使用的毛巾,旧纸币在培养基上拖动 ;
? 放置一根头发 ;
? 用无菌接种环分别沾一环自来水和河水在平板
上划线；
? 用无菌牙签取一点牙垢在培养基上划线；
? 打开培养皿置实验台上（空气中） 10min;
? 按无菌操作要求在酒精灯火焰边打开皿盖 1min.
? 对着培养皿上的培养基咳嗽。
? 稍稍打开嘴唇压在培养基上 ;
? 以上用报纸包好倒置 350C培养箱里培养 48小时观察结果 ;
实验步骤 —— 从土壤中分离微生物
? 采土样,
? 选择肥沃土壤,去表层土,挖 5~20cm深度的
土壤数 10g,装入已灭菌的牛皮纸袋,封好袋
口,带回实验室 ;
? 倒平板 ;
实验步骤 —— 从土壤中分离微生物
? 制备土壤稀释液 ;
? 称取土样 1.0g,放入盛 99ml无菌水并带有
玻璃珠的三角瓶中，置摇床振荡 5min使土
壤均匀分散成为土壤悬液（ 10-2）。用 1ml
的无菌吸头从中吸取 0.5ml土壤悬液，注入
事先分装有 4.5ml无菌水的试管中，吹吸 3
次，振荡均匀（ 10-3）。然后同样方法，
配置成稀释度为 10-4,10-5,10-6的土壤溶
液；
实验步骤 —— 从土壤中分离微生物
? 涂布
? 用一支新的无菌吸头，分别由各浓度土壤
稀释液中各吸取 100ul，对号较均匀地放入
已写好稀释度的牛肉蛋白胨培养基平板上，
用无菌玻璃涂棒涂匀。每个浓度做 2个平
板。
实验步骤 —— 从土壤中分离微生物
? 培养
? 将牛肉蛋白胨培养基平板倒置于 370C温箱
中培养 24h；统计所长出的菌落数；
? 挑菌（不做）
? 将培养后所需要的单个菌落（要求是细菌
菌落）分别挑取划线于平板上,370C培养
48h检查菌落是否单纯，也可以用显微镜
涂片染色镜检是否是单一的微生物；
实验步骤 —— 从土壤中分离微生物
? 菌落计数
? 计算相同稀释度的平均菌落数,
? 有较大片菌苔生长时,弃用,以无片菌苔生长的
平皿计数 ;
? 若成片菌苔大小不到培养皿的一半,其余一半
分布均匀,将此一半计数 *2;
实验步骤 —— 从土壤中分离微生物
? 菌落计数
? 选择平均菌落数在 30~300间的平板,
? 只有一个符合此范围时,以该平均菌落数乘稀
释倍数即为该样品中微生物总数 ;
? 有两个在 30~300间时,按两者菌落总数比值决
定,比值小于 2,取平均 ;比值大于 2,取较少的菌落
总数 ;
实验步骤 —— 从土壤中分离微生物
? 菌落计数
? 所有菌落数均大于 300,取稀释度最高的平
均菌落数乘稀释倍数 ;
? 所有菌落数均小于 30,取稀释度最低的平均
菌落数乘稀释倍数 ;
? 所有菌落数均不在 30~300间,以最接近 30或
300的平均菌落数乘稀释倍数 ;
结果与讨论
? 你所取的土壤中细菌数量级为多少？
? 从你周围环境中微生物的观察,你认为无菌操
作应注意什么?
? 说明饭前洗手,饭后刷牙的重要性 ;
? 在日常生活中如何讲究饮食卫生?
谢谢大家 !
