细菌鉴定中常用的生理生化反应
陈金春,林琳，
郑重，陈晶瑜，王亚武
清华大学微生物实验室,100084
实验目的和内容
? a,了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定
中常用的生理生化反应的测定方法；
? b,通过不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分
解利用情况，了解细菌碳、氮代谢类型的多样
性；
? c,了解细菌在不同培养基中的不同生长现象及
其代谢产物在鉴别细菌中的意义；
实验原理
? 细菌生化试验
? 各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基
质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或
少地各有区别，可供鉴别细菌之用。用生化试
验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其
代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌
的生化反应。
实验原理－－ 细菌生化试验
? 糖 (醇 )类发酵试验
? 不同的细菌含有发酵不同糖 (醇 )的酶，因而发酵
糖 (醇 )的能力各不相同。其产生的代谢产物亦不
相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。酸的
产生可利用指示剂来判定。在配制培养基时预先
加入溴甲酚紫 [pH5,2(黄色 )一 6,8(紫色 )]，当发
酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产
生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证
明。
实验原理－－ 细菌生化试验
? 甲基红 (Methylred)试验 (该试验简称 MR试验 )
? 很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮
酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸
等，使培养基的 pH降低到 4,2以下，这时若加
甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色
范围是 pH4,4(红色 )～ pH6,2(黄色 )。若某些
细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但
很快将丙酮酸脱羧，转化成醇等物，则培养基
的 pH仍在 6,2以上，故此时加入甲基红指示剂，
呈现黄色。
实验原理－－ 大分子物质代谢实验
? 靛基质 (吲哚 )试验
? 某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色
氨酸，产生靛基质 (吲哚 )，靛基质与对二甲基
氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质 (红色化合
物 )。
? 硫化氢试验
? 某些细菌能分解含硫的氨基酸 (胱氨酸、半胱氨
酸等 )，产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐
或铁盐，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。为硫
化氢试验阳性，可借以鉴别细菌。
实验原理－－ 大分子物质代谢实验
? 明胶液化实验
? 某些细菌具有胶原酶，使明胶被分解，失去凝
固能力，呈现液体状态，是为阳性。
? 淀粉水解试验（在紫外诱变中做，本实验不
做）
? 细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产生
的胞外酶 (淀粉酶 )将淀粉水解为小分子糊精或
进一步水解为葡萄糖 (或麦芽糖 )，再被细菌吸
收利用，细菌水解淀粉的过程可通过底物的变
化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。
实验原理－－ 有机酸盐及氨盐利用试验
? 柠檬酸盐利用试验
? 柠檬酸盐培养基系一综合性培养基，其中柠檬酸
钠为碳的唯一来源。而磷酸二氢铵是氮的唯一来
源。有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳
源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠
檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时
培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝
色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培养
基上不生长，培养基不变色。
实验仪器,材料和用具
? 实验仪器
? 37℃ 恒温培养箱,20℃ 恒温培养箱（室温代替）。
? 微生物材料
? 大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、产气杆菌这四
种菌种的斜面各 1支。
? 试剂
? 甲基红试剂,V,P试剂、吲哚试剂、格里斯试剂
(硝酸盐利用试验 )、卢戈氏碘液 (淀粉水解试验 )
实验仪器,材料和用具
? 实验用具
? 试管：每份每个试验 2根试验,1根对照，
8个试验共 27根。
? 无菌乎皿：每份 2个
? 杜氏小管：每份 6个。
? 接种环、酒精灯、试管架、记号笔。
实验仪器,材料和用具
? 培养基
? 葡萄糖发酵培养基和乳糖发酵培养基：每份各 6支试管，每
支 5～ 10mi培养基，灭菌。用于糖类发酵试验。
? 葡萄糖蛋白胨水培养基：每份 3支试管，每支 5～ 10mi培养
基，灭菌。用于甲基红和 V,P试验。
? 胰蛋白水培养基：每份 3支每支 5～ 10mi培养基，灭菌。用
于吲哚试验。
? 柠檬酸铁铵或醋酸铅的半固体培养基；每份 3支，每支 5～
10ml培养基，灭菌。用于硫化氢试验。
? 营养明胶培养基：每份 3支，每支,5～ 10ml培养基、灭菌。
用于明胶液化试验。
? 淀粉培养基：每份 2个平皿，每平皿约 20ml培养基，灭菌后
倒入平皿。用于淀粉水解试验。
? 柠檬酸钠培养基：每份 3支，每支 5一 lOml培养基，灭菌，
做斜面。用于柠檬酸盐利用试验。
实验步骤
? 糖 (醇 )类发酵试验
? 编号 在各试管上分别标明发酵培养基名称，所接种的菌
名和组号，下同。
? 接种 取葡萄糖发酵培养基 3支，按编号 1支接种大肠杆菌，
另 1支接种普通变形杆菌，第 3支不接种，作为对照。同
样取 3支乳糖发酵培养基,1支接种大肠杆菌,1支接种普
通变形杆菌，第 3支不接种，作为对照。
? 将已接种好的培养基置 37℃ 温箱中培养 24h。
? 观察结果：被检细菌若能发酵培养基中的糖时，则使培
养基的 pH降低，这时培养基中的指示剂呈酸性反应 (为黄
色 )，若发酵培养基中的糖产酸产气，则培养基不仅显酸
色反应，并且在培养基中倒置的小玻璃管 (杜氏小管 )中
有气体。气体占整个倒置小玻管的 10％以上。若被检细
菌不分解培养基中的糖，则培养基不发生变化。
实验步骤
? 甲基红试验 (MR试验 )
? 将大肠杆菌和产气杆菌分别接种到葡萄糖蛋白
胨水培养基中,37℃ 培养 48h，加甲基红指示剂
数滴，观察结果，呈现红色者为阳性，呈现黄色
者为阴性。
? 伏一普二氏试验 (V,P．试验 )
? 将被检菌接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，
37℃ 培养 48h，取出，加入 40％ KOH 5～ 10滴，
然后再加入等量的 5％ ?一萘酚溶液，用力振荡，
再放入 37℃ 温箱中保温 15～ 30min，以加快反应
速度。若培养物呈现红色，为伏 — 普反应阳性。
实验步骤
? 靛基质 (吲哚 )试验
? 将被检菌接种到
胰蛋白胨水培养基
中,37℃ 培养 24h～
48h后，沿试管壁滴
加数滴吲哚试剂于
培养物液面，观察
结果。
? 出现红色者为阳
性，出现黄色者为
阴性。
实验步骤
? 硫化氢试验：
? 将大肠杆菌和变
形杆菌以接种针
穿刺接种到醋酸
铅或柠檬酸铁氨
培养基中,37℃
培养 24h，观察
结果，若有黑色
出现者为阳性。
实验步骤
? 明胶液化试验
? 取大肠杆菌和枯草杆菌的纯培养物少许，以接
种针分别穿刺接种到营养明胶培养基中，置 20℃
培养 5～ 7天。观察明胶培养基液化情况。若被检
细菌 20℃ 不易生长，可放 37℃ 培养，但在此温度
下明胶培养基呈液状，故观察结果时，应将明胶
培养基轻轻放入 4℃ 冰箱 30min，此时明胶又凝固。
若放置于冰箱 30min仍不凝固者，说明明胶被试
验细菌液化，是为阳性。
实验步骤
? 淀粉水解试验
? 将配制好的淀粉培养基冷却到 50℃ 左右，以无菌
操作制成平板。
? 用接种环取少许枯草杆菌划线接种在平板的一边，
再取少许大肠杆菌划线接种在平板的另一边。置
37℃ 温箱培养 24h。
? 将平皿取出，打开皿盖，滴加少量卢戈氏碘液于
平板上，轻轻摇动平皿，使碘液均匀铺满整个平
板。如菌苔周围有无色透明圈出现，说明淀粉已
被水解。透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力
的大小。
实验步骤
? 柠檬酸盐利用试验
? 取少量被检菌接种
到柠檬酸盐培养基
上,37℃ 培养 24h后，
观察结果。培养基
变深蓝色者为阳性。
培养基不变色，则
继续培养 7天，培养
基仍不变色者为阴
性。
实验结果
糖发酵实验
结果与讨论
? 记录上述各试验结果；
? 在吲哚试验和硫化氢试验中细菌各分解
何种氨基酸?
谢谢大家！
陈金春,林琳，
郑重，陈晶瑜，王亚武
清华大学微生物实验室,100084
实验目的和内容
? a,了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定
中常用的生理生化反应的测定方法；
? b,通过不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分
解利用情况，了解细菌碳、氮代谢类型的多样
性；
? c,了解细菌在不同培养基中的不同生长现象及
其代谢产物在鉴别细菌中的意义；
实验原理
? 细菌生化试验
? 各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基
质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或
少地各有区别，可供鉴别细菌之用。用生化试
验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其
代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌
的生化反应。
实验原理－－ 细菌生化试验
? 糖 (醇 )类发酵试验
? 不同的细菌含有发酵不同糖 (醇 )的酶，因而发酵
糖 (醇 )的能力各不相同。其产生的代谢产物亦不
相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。酸的
产生可利用指示剂来判定。在配制培养基时预先
加入溴甲酚紫 [pH5,2(黄色 )一 6,8(紫色 )]，当发
酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产
生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证
明。
实验原理－－ 细菌生化试验
? 甲基红 (Methylred)试验 (该试验简称 MR试验 )
? 很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮
酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸
等，使培养基的 pH降低到 4,2以下，这时若加
甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色
范围是 pH4,4(红色 )～ pH6,2(黄色 )。若某些
细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但
很快将丙酮酸脱羧，转化成醇等物，则培养基
的 pH仍在 6,2以上，故此时加入甲基红指示剂，
呈现黄色。
实验原理－－ 大分子物质代谢实验
? 靛基质 (吲哚 )试验
? 某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色
氨酸，产生靛基质 (吲哚 )，靛基质与对二甲基
氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质 (红色化合
物 )。
? 硫化氢试验
? 某些细菌能分解含硫的氨基酸 (胱氨酸、半胱氨
酸等 )，产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐
或铁盐，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。为硫
化氢试验阳性，可借以鉴别细菌。
实验原理－－ 大分子物质代谢实验
? 明胶液化实验
? 某些细菌具有胶原酶，使明胶被分解，失去凝
固能力，呈现液体状态，是为阳性。
? 淀粉水解试验（在紫外诱变中做，本实验不
做）
? 细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产生
的胞外酶 (淀粉酶 )将淀粉水解为小分子糊精或
进一步水解为葡萄糖 (或麦芽糖 )，再被细菌吸
收利用，细菌水解淀粉的过程可通过底物的变
化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。
实验原理－－ 有机酸盐及氨盐利用试验
? 柠檬酸盐利用试验
? 柠檬酸盐培养基系一综合性培养基，其中柠檬酸
钠为碳的唯一来源。而磷酸二氢铵是氮的唯一来
源。有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳
源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠
檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时
培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝
色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培养
基上不生长，培养基不变色。
实验仪器,材料和用具
? 实验仪器
? 37℃ 恒温培养箱,20℃ 恒温培养箱（室温代替）。
? 微生物材料
? 大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、产气杆菌这四
种菌种的斜面各 1支。
? 试剂
? 甲基红试剂,V,P试剂、吲哚试剂、格里斯试剂
(硝酸盐利用试验 )、卢戈氏碘液 (淀粉水解试验 )
实验仪器,材料和用具
? 实验用具
? 试管：每份每个试验 2根试验,1根对照，
8个试验共 27根。
? 无菌乎皿：每份 2个
? 杜氏小管：每份 6个。
? 接种环、酒精灯、试管架、记号笔。
实验仪器,材料和用具
? 培养基
? 葡萄糖发酵培养基和乳糖发酵培养基：每份各 6支试管，每
支 5～ 10mi培养基，灭菌。用于糖类发酵试验。
? 葡萄糖蛋白胨水培养基：每份 3支试管，每支 5～ 10mi培养
基，灭菌。用于甲基红和 V,P试验。
? 胰蛋白水培养基：每份 3支每支 5～ 10mi培养基，灭菌。用
于吲哚试验。
? 柠檬酸铁铵或醋酸铅的半固体培养基；每份 3支，每支 5～
10ml培养基，灭菌。用于硫化氢试验。
? 营养明胶培养基：每份 3支，每支,5～ 10ml培养基、灭菌。
用于明胶液化试验。
? 淀粉培养基：每份 2个平皿，每平皿约 20ml培养基，灭菌后
倒入平皿。用于淀粉水解试验。
? 柠檬酸钠培养基：每份 3支，每支 5一 lOml培养基，灭菌，
做斜面。用于柠檬酸盐利用试验。
实验步骤
? 糖 (醇 )类发酵试验
? 编号 在各试管上分别标明发酵培养基名称，所接种的菌
名和组号，下同。
? 接种 取葡萄糖发酵培养基 3支，按编号 1支接种大肠杆菌，
另 1支接种普通变形杆菌，第 3支不接种，作为对照。同
样取 3支乳糖发酵培养基,1支接种大肠杆菌,1支接种普
通变形杆菌，第 3支不接种，作为对照。
? 将已接种好的培养基置 37℃ 温箱中培养 24h。
? 观察结果：被检细菌若能发酵培养基中的糖时，则使培
养基的 pH降低，这时培养基中的指示剂呈酸性反应 (为黄
色 )，若发酵培养基中的糖产酸产气，则培养基不仅显酸
色反应，并且在培养基中倒置的小玻璃管 (杜氏小管 )中
有气体。气体占整个倒置小玻管的 10％以上。若被检细
菌不分解培养基中的糖，则培养基不发生变化。
实验步骤
? 甲基红试验 (MR试验 )
? 将大肠杆菌和产气杆菌分别接种到葡萄糖蛋白
胨水培养基中,37℃ 培养 48h，加甲基红指示剂
数滴，观察结果，呈现红色者为阳性，呈现黄色
者为阴性。
? 伏一普二氏试验 (V,P．试验 )
? 将被检菌接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，
37℃ 培养 48h，取出，加入 40％ KOH 5～ 10滴，
然后再加入等量的 5％ ?一萘酚溶液，用力振荡，
再放入 37℃ 温箱中保温 15～ 30min，以加快反应
速度。若培养物呈现红色，为伏 — 普反应阳性。
实验步骤
? 靛基质 (吲哚 )试验
? 将被检菌接种到
胰蛋白胨水培养基
中,37℃ 培养 24h～
48h后，沿试管壁滴
加数滴吲哚试剂于
培养物液面，观察
结果。
? 出现红色者为阳
性，出现黄色者为
阴性。
实验步骤
? 硫化氢试验：
? 将大肠杆菌和变
形杆菌以接种针
穿刺接种到醋酸
铅或柠檬酸铁氨
培养基中,37℃
培养 24h，观察
结果，若有黑色
出现者为阳性。
实验步骤
? 明胶液化试验
? 取大肠杆菌和枯草杆菌的纯培养物少许，以接
种针分别穿刺接种到营养明胶培养基中，置 20℃
培养 5～ 7天。观察明胶培养基液化情况。若被检
细菌 20℃ 不易生长，可放 37℃ 培养，但在此温度
下明胶培养基呈液状，故观察结果时，应将明胶
培养基轻轻放入 4℃ 冰箱 30min，此时明胶又凝固。
若放置于冰箱 30min仍不凝固者，说明明胶被试
验细菌液化，是为阳性。
实验步骤
? 淀粉水解试验
? 将配制好的淀粉培养基冷却到 50℃ 左右，以无菌
操作制成平板。
? 用接种环取少许枯草杆菌划线接种在平板的一边，
再取少许大肠杆菌划线接种在平板的另一边。置
37℃ 温箱培养 24h。
? 将平皿取出，打开皿盖，滴加少量卢戈氏碘液于
平板上，轻轻摇动平皿，使碘液均匀铺满整个平
板。如菌苔周围有无色透明圈出现，说明淀粉已
被水解。透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力
的大小。
实验步骤
? 柠檬酸盐利用试验
? 取少量被检菌接种
到柠檬酸盐培养基
上,37℃ 培养 24h后，
观察结果。培养基
变深蓝色者为阳性。
培养基不变色，则
继续培养 7天，培养
基仍不变色者为阴
性。
实验结果
糖发酵实验
结果与讨论
? 记录上述各试验结果；
? 在吲哚试验和硫化氢试验中细菌各分解
何种氨基酸?
谢谢大家！
