噬菌体 T2DNA长约 50μm
E-coli DNA 长约 1mm
人生殖细胞 DNA长约 1m
（三） DNA的三级结构
双链环状 DNA（ double stranded cyclic DNA,DSCDNA）
双链环状 DNA在自然界是广泛存在的，如一些病毒 DNA、
一些噬菌体 DNA、细菌质粒 DNA、线粒体和叶绿体 DNA等。
1．共价闭合环状 DNA（ covalently closed circular
DNA,cccDNA）的 超螺旋 结构（ superhelical structure）
形成超螺旋的基础,
DNA双螺旋的扭曲形成超螺旋
（ superhelix）
负超螺旋
正超螺旋
超螺旋 DNA的性质
结构紧密，粘度较低，浮力密度大，沉降速度快。
变
性
2．开环 DNA（ open circular DNA,ocDNA）
也称松环 DNA（ relaxed circular DNA,rcDNA）
+
3．连环 DNA（ Catenanes DNA）
单体 二聚体
1．重复序列 （ repeated sequence ）
（ 1）高度重复序列（ highly repeated sequence）
卫星 DNA（ satellite DNA）
基因组（ genome）
（四）真核细胞染色体 DNA结构
主体 DNA（ bulk DNA）
卫星 DNA（ satellite DNA）
（ 2）中度重复序列（ moderately repeated sequence）
（ 3）单一序列（ unique sequence）
2．回文结构（ palindromic structure）
(1) 回文结构
回文结构也称反向重复（ inverted repeats）
(2) 发夹形和十字形
（一） RNA的类别
1．核糖体 RNA（ ribosomal RNA,rRNA）
2．转移 RNA（ transfer RNA,tRNA）
3．信使 RNA（ messenger RNA,mRNA）
五,RNA的结构
4．其它类别的 RNA
（ 1）病毒 RNA（ Viral RNA,rRNA）
（ 2）核内 RNA（ nuclear RNA,nRNA）
① 不均一核 RNA（ heterogeneous nuclear RNA,HnRNA）
② 小分子核 RNA（ small nuclear RNA,sn RNA）
③ 小分子核仁 RNA（ small nucleolar RNA,sno RNA）
④ 染色体 RNA（ chromosomal RNA,ch RNA）
（ 3）线粒体 RNA（ mitochondrial RNA,mit RNA）
（ 4）叶绿体 RNA（ chloroplast RNA,chlRNA或 ctRNA）
（二） RNA的一级结构
1,RNA分子中核苷酸之间的连接方式
3′,5′-磷酸二酯键
2,RNA分子中核苷酸的排列顺序
酵母 tRNAAla
小片段重叠法
直接阅读法（直读法）
1965年
3．几类 RNA的一级结构
（ 1） tRNA的一级结构
tRNA一级结构的共同点,
① Mr较小（ Mr25000），沉降常数 4S。
② 各种 tRNA的链长很接近，一般在 73～ 93个核苷酸之间。
③ tRNA分子中约 20多个位置上的核苷酸是保守的（不变和半不变的）
④ 各种 tRNA的 3′一端为 CCA； 5′一端大多数为 pG，少数为 pC。
⑤ tRNA分子中含有较多的修饰成分。
（ 2） rRNA的一级结构
原核生物核糖体
70S
50S
30S
5S rRNA,23S rRNA
34种蛋白质
16S rRNA
21种蛋白质
真核生物核糖体
80S
60S
40S
5SrRNA,5.8SrRNA,28SrRNA
49种蛋白质
18SrRNA
33种蛋白质
（ 3） mRNA的一级结构
真核生物 mRNA的一级结构可用下式表示,
5′-帽子 5′-非密码区 密码区 3′-非密码区 polyA
5′-cap,m7G(5′)pppNmp
5′-cap
cap0,m7G(5′)pppNp
cap1,m7G(5′)pppNmpNp
cap2,m7G(5′)pppNmpNmpNp
5′-cap的功能
(1) 防止 mRNA被核酸酶降解。
(2) 为 mRNA翻译活性所必需。
(3) 与蛋白质合成的正确起始有关。
3′-polyA, polyA的残基数 20~200个，或更多。
polyA的功能
(1) 保护 mRNA，免受核酸外切酶的作用。
(2) 与翻译有关，没有 polyA翻译活性降低。
(3) 与 mRNA从细胞核转移到细胞质有关。
RNA前体 成熟 RNA（有功能的 RNA）断裂、修剪、修饰
（三） RNA的二级结构
大多数天然 RNA是一条单链，通过自身回折形成部分螺旋区，
部分非螺旋区。
少数病毒 RNA如水稻矮缩病毒、呼肠孤病毒、伤瘤病毒等 RNA
是双链螺旋，类似于 DNA的双螺旋结构。
RNA中双螺旋结构稳定的因素主要是碱基堆
积力，其次是氢键。
1,tRNA的二级结构
（ 1） aa接受臂（ amino acid arm）
（ 2）二氢尿嘧啶环
（ dihydrouridine loop,DHU loop）
（ 3）反密码环（ anticodon loop）
（ 4）额外环（ extra loop）
（ 5） TψC环（ TψC loop）
X光晶体衍射解出的 tRNA 立体结构
1980年牛心线粒体 tRNAser只有 63个核苷酸，
沉降常数 3S，缺少 D环和 D臂，呈二叶草型。
近年来发现 2种线虫线粒体 tRNA也不是标准
的三叶草结构。
2,rRNA的二级结构
3,mRNA的二级结构
The secondary structure of HEC-SOD’s mRNA,
the free energy of result is –587.9J.
（四） RNA的三级结构
tRNA的三级结构
六、核酸酶类
包括核酸水解酶、合成酶、连接酶等。
（一）核酸水解酶的分类
1．底物：核糖核酸酶（ ribonuclease,RNase）
脱氧核糖核酸酶（ deoxyribonuclease,DNase）
2．作用方式：核酸内切酶（ endonuclease）
3．按磷酸二酯键断裂的方式
4．其它：如双链酶、单链酶等
核酸外切酶（ exonuclease）
（二）核糖核酸酶类
1．牛胰核糖核酸酶（ pancreatic ribonuclease,
简称 RNase A或 RNase I）
2．核糖核酸酶 T1（ ribonuclease T1，简称 RNase T1）
3．核糖核酸酶 T2（ ribonuclease T2，简称 RNase T2）
主要作用点为 Ap残基，水解速度 A>>U>G>C
P P P P P PP
A U C G A G
（三）脱氧核糖核酸酶
1．牛胰脱氧核糖核酸酶
（ pancreatic deoxyribonuclease简称 DNase I）
P P P P P PP P
2．牛脾脱氧核糖核酸酶
（ spleen deoxyribonuclease,简称 DNase II）
P P P P P PP P P
3．限制性内切酶（ restriction endonuclease）
简称限制酶
限制性内切酶主要降解外源的未经特殊修饰的
DNA，对自身起了保护作用。
发现概况,
（ 1）限制性内切酶的特征
① 具有严格的碱基专一性，有专一的识别顺序、切点
② 粘性未端，平整末端
（ 2）限制性内切酶的命名
EcoRI
（ 3）限制性内切酶举例
（四）非专一性核酸酶类（ nonspecific nuclease）
介绍二种外切酶
1．蛇毒磷酸二酯酶（ venom phosphodiesterase）
P P P O HP
5?-核苷酸
P P O HP P O H+
蛇毒磷酸二酯酶对末端磷酸基有严格的要求
寡核苷酸 水解速度
最快
较慢，水解速度降低 10倍
最慢，几乎不作用，水解速
度再降低 100倍
P P P O HP
P P P O HH O
P P P PH O
橘青霉磷酸二酯酶专一性：
与蛇毒磷酸二酯酶相同
2．牛脾磷酸二酯酶
对末端磷酸基的要求与蛇毒磷酸二酯酶相反
P P P PH O P
PHO
+
P P PH O P
3′-核苷酸
（五）磷酸单酯酶
将单核苷酸或寡核苷酸末端的磷酸单酯键切开
，得到磷酸和其它产物
1．特异性磷酸单酯酶
2．非特异性磷酸单酯酶
磷酸基无论在 3′或 5′位，都能水解，如 E,coli磷酸单酯酶
（ 1） 磷酸基连在 5′位才能水解，如牛精液 5′-核苷酸酶NP
（ 2） 磷酸基连在 3′位才能水解，如麦芽 3′一核苷酸酶N
P
（一）一般性质：分子大小、性状、溶解度。
分子大小,DNA Mr 106～ 1010或更大
性状,DNA为白色纤维状固体，而 RNA为白色粉末。
溶解度,DNA和 RNA均不溶于一般的有机溶剂，微溶于水，
但它们的钠盐在水中溶解度较大。
RNA Mr 104～ 106或更大
七、核酸的性质和最常用的研究方法
（二）粘度
（三）酸碱性质
（四）紫外吸收
由于核酸中碱基的共轭双键，所以对紫外有
强烈吸收，最大吸收峰在 260nm附近，利用这
一特性可进行核酸的定量测定。
1．紫外分光光度法
首先根据 A260/A280的比值判断核酸样品的纯度
纯 DNA,A260/A280=1.8
纯 RNA,A260/A280=2.0
（若样品中含有杂蛋白或苯酚，则 A260/A280比值明显降低）
纯的核酸样品可根据 260nm的光吸收值算出其含量
若 260nm光吸收值为 1相当于 50μg/ml双螺旋 DNA
或相当于 40μg/ml单链 DNA或 RNA
或相当于 20μg/ml寡核苷酸。
2．摩尔磷消光系数（ molar absorptivity）法
A：样品的光吸收值
C：每升溶液中磷的摩尔数
L：光径
∵
∴
L??? C
A
)p(
8)磷的原子量( 3 0, 9
每升中磷的重量C ( g ) W?
LLL W
A98.30
98.30
W
A
C
A
)p( ?
?
?
?
??
在 pH7.0时； DNA的 为～ 6600,RNA的 为 7700～ 7800。
)p(?)p(?
：摩尔磷消光系数，也称摩尔磷吸光系数
)p(?
知道了磷的含量就可知核酸的含量
3．增色效应与减色效应
增色效应（ hyperchromic effect）
减色效应（ hypochromic effect）
（五）沉降特性
1．核酸浮力密度的测定
浮力密度：经密度梯度沉降平衡法测出的密度
氯化绝（ CsCl）密度梯度沉降平衡
用 1～ 2个已知浮力密度的标准 DNA样品作参考
1020220 10)rr(2.4 ????????
式中 ρ：未知 DNA的密度
ρ0：标准 DNA的密度
ω：角速度（弧度 /秒）
r,未知 DNA与转轴之间的距离
r0：已知 DNA与转轴之间的距离
2,DNA中 G-C含量的测定
G-C对的含量与浮力密度之间呈正比关系
Rolfe-Meselson导出了如下公式：
ρ=0.100（ G-C%） +1.658(g/cm3)
知道了浮力密度就可计算出 G-C对的含量
3．核酸的构象和分离
ρ,RNA>环状 DNA>线状 DNA>蛋白质
DNA 沉降
（六）核酸的变性、复性和杂交
1．变性（ denaturation）
核酸变性的概念
引起核酸变性的因素
（ 1）热变性
结构：螺旋 →线团
理化性质：紫外吸收 ↑
粘度 ↓比旋光度 ↓
生物活性：生物活性 ↓或丧失
（ 2）熔点（ Tm）
Tm,熔点，熔解温度，
变性温度，解链温度
（ 3）影响 Tm值的因素
① DNA的均一性
② DNA中 G-C对的含量
经验式,
(G-C)%=(Tm-69.3)× 2.44
③ 盐离子强度
2．复性（ renaturation）
（ 1）复性
理化性质, ↓ 比旋光度 ↑ 粘度 ↑
)p(?
高于 Tm值 5℃
复性
也称退火
缓 慢
冷 却
（ annealing）
迅 速
冷 却
生物活性得到部分恢复
（ 2）影响复性的因素
① 样品的性质
② DNA的浓度
③ DNA片段的大小
④ 温度
⑤ 离子强度
（ 3）复性动力学
DNA的复性过程是一种双分子反应
DSS k? ????
S,single strand DNA
D,double strand DNA
2kc
dt
dc ??
经重排，积分等
式中 C0,t=0时，起始 DNA的浓度（ mol/L）
C,t时间时，单链 DNA的浓度（ mol/L）
k：复性反应常数（ L/mol·sec）
t：复性时间（ sec）
C
C0 =
1
1+kC0t
2
1
C
C
0
?
Cot,
2
1 时的 Cot值，即指复性完成一半时的 Cot值。
3．杂交（ hybridization）
核酸的杂交：是指不同来源的单链核酸之间可通过
碱基互补形成双螺旋结构。
单链 DNA与单链 DNA杂交（ DNA-DNA）
利用核酸杂交可检测特定的核苷酸片段或研究同源性等。
单链 DNA与单链 RNA杂交（ DNA-RNA）
单链 RNA与单链 RNA杂交（ RNA-RNA）
用硝酸纤维素膜作为支持物进行杂交
1975年英国 E,M,Southern首创的 Southern blotting（ Southern
印迹）
原理
方法
探针：作为检测用的已知 DNA序列或 RNA序列的片段
1977年 G.K.Stark首创 Northern blotting
（ Northern印迹）
Western blotting（ Western 印迹）
（七）凝胶电泳
核酸研究中最常用的方法
优点：简单、快速、灵敏、成本低。
通过凝胶电泳
（ 1）可进行核酸分离，知道核酸的纯度。
（ 2）测定分子大小。
（ 3）估计核酸的构象。
凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应
1．琼脂糖凝胶电泳（ agarose gel electrophoresis）
琼脂糖凝胶电泳的迁移率主要与分子大小、胶浓度、
核酸构象、电流等有关。
2．聚丙烯酰胺凝胶电泳
（ polyacrylamide gel electrophoresis）
用于分析 RNA或 Mr小于 1000bp的 DNA片段
适用于大分子核酸，一般用于 DNA分析。
（一） DNA的生物功能
1,DNA与遗传
（ 1） DNA是主要的遗传物质
间接证据
直接证据
八、核酸的生物功能
① 细菌转化作用 （ transformation ）
肺炎球菌（ pneumococcus）
1928年细菌学家 Griffith 细菌毒性实验
1944年 Avery细菌转化实验
转化作用：
转化作用的物质称转化因子
从一种细菌中得到 DNA通过一定途径进入另一种细菌，
从而引起后者遗传特性的改变。
② 噬菌体感染实验
1952年美国 Hershey
噬菌体感染实验
③ 转导作用（ transduction）
④ 人工合成基因的表达
3,DNA与遗传性疾病、癌变的关系
（ 1）镰刀状红细胞贫血病的 DNA点突变
（ 2）白化病的基因缺失
（ 3）癌变
（二） RNA的生物功能
1,RNA与蛋白质的生物合成
（ 1） mRNA与遗传密码
遗传密码（ genetic code）
密码子（ codon）
mRNA的主要功能
（ 2） tRNA的作用
tRNA的作用是多方面的，它接受氨基酸、携带氨基酸，
把氨基酸转运到核糖体上，然后按照 mRNA上的密码顺序装
配成多肽或蛋白质。
tRNA必须识别相应的氨基酸和识别 mRNA上相应的密
码子。
tRNA怎样识别相应的氨基酸, 主要靠高度专一的氨
酰 -tRNA合成酶。
Ea a + t R N A a a t R N A + E
tRNA怎样识别 mRNA上相应的密码子
（ 3） rRNA的作用
详见网上参考材料
九、核酸的分离、纯化和核苷酸的制备
（一）核酸的分离、提取通则
为了得到完整的大分子核酸，一般要注意 3点,
1．保持低温（ 0o～ 4℃ ）。
2．防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌。
3．防止核酸酶的作用。
抑制 DNase：
可加柠檬酸钠,EDTA等金属螯合剂；或加去污剂 十
二烷基硫酸钠（ SDS）；或加蛋白变性剂。
抑制 RNase：
（ 1）实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的用
具用 0.1%二乙基焦碳酸盐（ diethyl pyrocarbonate,
DEPC）处理。
（ 2）加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等。
（ 3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（ RNasin）等 RNase的抑制剂。
（二）大分子 DNA的提取
1．材料的选择
2．细胞破碎
3,DNA-蛋白质（ DNP）的提取
真核细胞 DNA与蛋白质结
合成核蛋白（ DNP）,RNA与蛋
白质结合成 RNP，而且 DNP和
RNP常常混在一起。利用 DNP和
RNP在不同浓度 NaCl中溶解度的
不同来分离 DNP和 RNP。
可用 1mol/LNaCl溶液提取 DNP。
0.5 1.0
0
1
2
0,14
相
对
溶
解
度
NaCl（ mol/L）
DNP在 NaCl中的溶解度
4．去蛋白质
（ 1） SDS
（ 2）苯酚法
（ 3）氯仿法
（ 4）酚,氯仿,异戊醇 ＝ 25:24:1
5．沉淀 DNA
6．去杂质
（ 1）去 RNA
（ 2）去多糖
7．进一步纯化
生物材料 DNP（ RNP） DNP
纤维状 DNA 较纯 DNA 纯 DNA
*原核生物的 DNA是裸露的，与蛋白质结合不多，分离纯化要简单些。
破细胞 1.0mol/L NaCl* 去蛋白质
酒精沉淀 去 RNA 柱层析，电泳
密度梯度离心去多糖
（三） RNA的提取
1．不同种类 RNA的提取
2．大分子 RNA的提取
（ 1）酚提取
（ 2）酚 -氯仿 -SDS法
3,mRNA的提取
4．工业上制备 RNA
（ 1）稀碱法
（ 2）浓盐法
清 液 调 p H 至 2, 5 R N A ↓
酵 母
稀 碱
法
1 %
N a O
H
浓 盐
法
1 0 %
N a C
l
破 细 胞 壁
释 放 R N A
中 和 后 离 心
除 去 菌 体
离 心
（四）核酸纯度鉴定
1.A260/A280
2.电泳
（五）核酸含量的测定
1.定磷法
2.定糖法
3.紫外吸收法
（六）核苷酸的制备
1．碱水解
2．酶水解
3.自溶法
E-coli DNA 长约 1mm
人生殖细胞 DNA长约 1m
（三） DNA的三级结构
双链环状 DNA（ double stranded cyclic DNA,DSCDNA）
双链环状 DNA在自然界是广泛存在的，如一些病毒 DNA、
一些噬菌体 DNA、细菌质粒 DNA、线粒体和叶绿体 DNA等。
1．共价闭合环状 DNA（ covalently closed circular
DNA,cccDNA）的 超螺旋 结构（ superhelical structure）
形成超螺旋的基础,
DNA双螺旋的扭曲形成超螺旋
（ superhelix）
负超螺旋
正超螺旋
超螺旋 DNA的性质
结构紧密，粘度较低，浮力密度大，沉降速度快。
变
性
2．开环 DNA（ open circular DNA,ocDNA）
也称松环 DNA（ relaxed circular DNA,rcDNA）
+
3．连环 DNA（ Catenanes DNA）
单体 二聚体
1．重复序列 （ repeated sequence ）
（ 1）高度重复序列（ highly repeated sequence）
卫星 DNA（ satellite DNA）
基因组（ genome）
（四）真核细胞染色体 DNA结构
主体 DNA（ bulk DNA）
卫星 DNA（ satellite DNA）
（ 2）中度重复序列（ moderately repeated sequence）
（ 3）单一序列（ unique sequence）
2．回文结构（ palindromic structure）
(1) 回文结构
回文结构也称反向重复（ inverted repeats）
(2) 发夹形和十字形
（一） RNA的类别
1．核糖体 RNA（ ribosomal RNA,rRNA）
2．转移 RNA（ transfer RNA,tRNA）
3．信使 RNA（ messenger RNA,mRNA）
五,RNA的结构
4．其它类别的 RNA
（ 1）病毒 RNA（ Viral RNA,rRNA）
（ 2）核内 RNA（ nuclear RNA,nRNA）
① 不均一核 RNA（ heterogeneous nuclear RNA,HnRNA）
② 小分子核 RNA（ small nuclear RNA,sn RNA）
③ 小分子核仁 RNA（ small nucleolar RNA,sno RNA）
④ 染色体 RNA（ chromosomal RNA,ch RNA）
（ 3）线粒体 RNA（ mitochondrial RNA,mit RNA）
（ 4）叶绿体 RNA（ chloroplast RNA,chlRNA或 ctRNA）
（二） RNA的一级结构
1,RNA分子中核苷酸之间的连接方式
3′,5′-磷酸二酯键
2,RNA分子中核苷酸的排列顺序
酵母 tRNAAla
小片段重叠法
直接阅读法（直读法）
1965年
3．几类 RNA的一级结构
（ 1） tRNA的一级结构
tRNA一级结构的共同点,
① Mr较小（ Mr25000），沉降常数 4S。
② 各种 tRNA的链长很接近，一般在 73～ 93个核苷酸之间。
③ tRNA分子中约 20多个位置上的核苷酸是保守的（不变和半不变的）
④ 各种 tRNA的 3′一端为 CCA； 5′一端大多数为 pG，少数为 pC。
⑤ tRNA分子中含有较多的修饰成分。
（ 2） rRNA的一级结构
原核生物核糖体
70S
50S
30S
5S rRNA,23S rRNA
34种蛋白质
16S rRNA
21种蛋白质
真核生物核糖体
80S
60S
40S
5SrRNA,5.8SrRNA,28SrRNA
49种蛋白质
18SrRNA
33种蛋白质
（ 3） mRNA的一级结构
真核生物 mRNA的一级结构可用下式表示,
5′-帽子 5′-非密码区 密码区 3′-非密码区 polyA
5′-cap,m7G(5′)pppNmp
5′-cap
cap0,m7G(5′)pppNp
cap1,m7G(5′)pppNmpNp
cap2,m7G(5′)pppNmpNmpNp
5′-cap的功能
(1) 防止 mRNA被核酸酶降解。
(2) 为 mRNA翻译活性所必需。
(3) 与蛋白质合成的正确起始有关。
3′-polyA, polyA的残基数 20~200个，或更多。
polyA的功能
(1) 保护 mRNA，免受核酸外切酶的作用。
(2) 与翻译有关，没有 polyA翻译活性降低。
(3) 与 mRNA从细胞核转移到细胞质有关。
RNA前体 成熟 RNA（有功能的 RNA）断裂、修剪、修饰
（三） RNA的二级结构
大多数天然 RNA是一条单链，通过自身回折形成部分螺旋区，
部分非螺旋区。
少数病毒 RNA如水稻矮缩病毒、呼肠孤病毒、伤瘤病毒等 RNA
是双链螺旋，类似于 DNA的双螺旋结构。
RNA中双螺旋结构稳定的因素主要是碱基堆
积力，其次是氢键。
1,tRNA的二级结构
（ 1） aa接受臂（ amino acid arm）
（ 2）二氢尿嘧啶环
（ dihydrouridine loop,DHU loop）
（ 3）反密码环（ anticodon loop）
（ 4）额外环（ extra loop）
（ 5） TψC环（ TψC loop）
X光晶体衍射解出的 tRNA 立体结构
1980年牛心线粒体 tRNAser只有 63个核苷酸，
沉降常数 3S，缺少 D环和 D臂，呈二叶草型。
近年来发现 2种线虫线粒体 tRNA也不是标准
的三叶草结构。
2,rRNA的二级结构
3,mRNA的二级结构
The secondary structure of HEC-SOD’s mRNA,
the free energy of result is –587.9J.
（四） RNA的三级结构
tRNA的三级结构
六、核酸酶类
包括核酸水解酶、合成酶、连接酶等。
（一）核酸水解酶的分类
1．底物：核糖核酸酶（ ribonuclease,RNase）
脱氧核糖核酸酶（ deoxyribonuclease,DNase）
2．作用方式：核酸内切酶（ endonuclease）
3．按磷酸二酯键断裂的方式
4．其它：如双链酶、单链酶等
核酸外切酶（ exonuclease）
（二）核糖核酸酶类
1．牛胰核糖核酸酶（ pancreatic ribonuclease,
简称 RNase A或 RNase I）
2．核糖核酸酶 T1（ ribonuclease T1，简称 RNase T1）
3．核糖核酸酶 T2（ ribonuclease T2，简称 RNase T2）
主要作用点为 Ap残基，水解速度 A>>U>G>C
P P P P P PP
A U C G A G
（三）脱氧核糖核酸酶
1．牛胰脱氧核糖核酸酶
（ pancreatic deoxyribonuclease简称 DNase I）
P P P P P PP P
2．牛脾脱氧核糖核酸酶
（ spleen deoxyribonuclease,简称 DNase II）
P P P P P PP P P
3．限制性内切酶（ restriction endonuclease）
简称限制酶
限制性内切酶主要降解外源的未经特殊修饰的
DNA，对自身起了保护作用。
发现概况,
（ 1）限制性内切酶的特征
① 具有严格的碱基专一性，有专一的识别顺序、切点
② 粘性未端，平整末端
（ 2）限制性内切酶的命名
EcoRI
（ 3）限制性内切酶举例
（四）非专一性核酸酶类（ nonspecific nuclease）
介绍二种外切酶
1．蛇毒磷酸二酯酶（ venom phosphodiesterase）
P P P O HP
5?-核苷酸
P P O HP P O H+
蛇毒磷酸二酯酶对末端磷酸基有严格的要求
寡核苷酸 水解速度
最快
较慢，水解速度降低 10倍
最慢，几乎不作用，水解速
度再降低 100倍
P P P O HP
P P P O HH O
P P P PH O
橘青霉磷酸二酯酶专一性：
与蛇毒磷酸二酯酶相同
2．牛脾磷酸二酯酶
对末端磷酸基的要求与蛇毒磷酸二酯酶相反
P P P PH O P
PHO
+
P P PH O P
3′-核苷酸
（五）磷酸单酯酶
将单核苷酸或寡核苷酸末端的磷酸单酯键切开
，得到磷酸和其它产物
1．特异性磷酸单酯酶
2．非特异性磷酸单酯酶
磷酸基无论在 3′或 5′位，都能水解，如 E,coli磷酸单酯酶
（ 1） 磷酸基连在 5′位才能水解，如牛精液 5′-核苷酸酶NP
（ 2） 磷酸基连在 3′位才能水解，如麦芽 3′一核苷酸酶N
P
（一）一般性质：分子大小、性状、溶解度。
分子大小,DNA Mr 106～ 1010或更大
性状,DNA为白色纤维状固体，而 RNA为白色粉末。
溶解度,DNA和 RNA均不溶于一般的有机溶剂，微溶于水，
但它们的钠盐在水中溶解度较大。
RNA Mr 104～ 106或更大
七、核酸的性质和最常用的研究方法
（二）粘度
（三）酸碱性质
（四）紫外吸收
由于核酸中碱基的共轭双键，所以对紫外有
强烈吸收，最大吸收峰在 260nm附近，利用这
一特性可进行核酸的定量测定。
1．紫外分光光度法
首先根据 A260/A280的比值判断核酸样品的纯度
纯 DNA,A260/A280=1.8
纯 RNA,A260/A280=2.0
（若样品中含有杂蛋白或苯酚，则 A260/A280比值明显降低）
纯的核酸样品可根据 260nm的光吸收值算出其含量
若 260nm光吸收值为 1相当于 50μg/ml双螺旋 DNA
或相当于 40μg/ml单链 DNA或 RNA
或相当于 20μg/ml寡核苷酸。
2．摩尔磷消光系数（ molar absorptivity）法
A：样品的光吸收值
C：每升溶液中磷的摩尔数
L：光径
∵
∴
L??? C
A
)p(
8)磷的原子量( 3 0, 9
每升中磷的重量C ( g ) W?
LLL W
A98.30
98.30
W
A
C
A
)p( ?
?
?
?
??
在 pH7.0时； DNA的 为～ 6600,RNA的 为 7700～ 7800。
)p(?)p(?
：摩尔磷消光系数，也称摩尔磷吸光系数
)p(?
知道了磷的含量就可知核酸的含量
3．增色效应与减色效应
增色效应（ hyperchromic effect）
减色效应（ hypochromic effect）
（五）沉降特性
1．核酸浮力密度的测定
浮力密度：经密度梯度沉降平衡法测出的密度
氯化绝（ CsCl）密度梯度沉降平衡
用 1～ 2个已知浮力密度的标准 DNA样品作参考
1020220 10)rr(2.4 ????????
式中 ρ：未知 DNA的密度
ρ0：标准 DNA的密度
ω：角速度（弧度 /秒）
r,未知 DNA与转轴之间的距离
r0：已知 DNA与转轴之间的距离
2,DNA中 G-C含量的测定
G-C对的含量与浮力密度之间呈正比关系
Rolfe-Meselson导出了如下公式：
ρ=0.100（ G-C%） +1.658(g/cm3)
知道了浮力密度就可计算出 G-C对的含量
3．核酸的构象和分离
ρ,RNA>环状 DNA>线状 DNA>蛋白质
DNA 沉降
（六）核酸的变性、复性和杂交
1．变性（ denaturation）
核酸变性的概念
引起核酸变性的因素
（ 1）热变性
结构：螺旋 →线团
理化性质：紫外吸收 ↑
粘度 ↓比旋光度 ↓
生物活性：生物活性 ↓或丧失
（ 2）熔点（ Tm）
Tm,熔点，熔解温度，
变性温度，解链温度
（ 3）影响 Tm值的因素
① DNA的均一性
② DNA中 G-C对的含量
经验式,
(G-C)%=(Tm-69.3)× 2.44
③ 盐离子强度
2．复性（ renaturation）
（ 1）复性
理化性质, ↓ 比旋光度 ↑ 粘度 ↑
)p(?
高于 Tm值 5℃
复性
也称退火
缓 慢
冷 却
（ annealing）
迅 速
冷 却
生物活性得到部分恢复
（ 2）影响复性的因素
① 样品的性质
② DNA的浓度
③ DNA片段的大小
④ 温度
⑤ 离子强度
（ 3）复性动力学
DNA的复性过程是一种双分子反应
DSS k? ????
S,single strand DNA
D,double strand DNA
2kc
dt
dc ??
经重排，积分等
式中 C0,t=0时，起始 DNA的浓度（ mol/L）
C,t时间时，单链 DNA的浓度（ mol/L）
k：复性反应常数（ L/mol·sec）
t：复性时间（ sec）
C
C0 =
1
1+kC0t
2
1
C
C
0
?
Cot,
2
1 时的 Cot值，即指复性完成一半时的 Cot值。
3．杂交（ hybridization）
核酸的杂交：是指不同来源的单链核酸之间可通过
碱基互补形成双螺旋结构。
单链 DNA与单链 DNA杂交（ DNA-DNA）
利用核酸杂交可检测特定的核苷酸片段或研究同源性等。
单链 DNA与单链 RNA杂交（ DNA-RNA）
单链 RNA与单链 RNA杂交（ RNA-RNA）
用硝酸纤维素膜作为支持物进行杂交
1975年英国 E,M,Southern首创的 Southern blotting（ Southern
印迹）
原理
方法
探针：作为检测用的已知 DNA序列或 RNA序列的片段
1977年 G.K.Stark首创 Northern blotting
（ Northern印迹）
Western blotting（ Western 印迹）
（七）凝胶电泳
核酸研究中最常用的方法
优点：简单、快速、灵敏、成本低。
通过凝胶电泳
（ 1）可进行核酸分离，知道核酸的纯度。
（ 2）测定分子大小。
（ 3）估计核酸的构象。
凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应
1．琼脂糖凝胶电泳（ agarose gel electrophoresis）
琼脂糖凝胶电泳的迁移率主要与分子大小、胶浓度、
核酸构象、电流等有关。
2．聚丙烯酰胺凝胶电泳
（ polyacrylamide gel electrophoresis）
用于分析 RNA或 Mr小于 1000bp的 DNA片段
适用于大分子核酸，一般用于 DNA分析。
（一） DNA的生物功能
1,DNA与遗传
（ 1） DNA是主要的遗传物质
间接证据
直接证据
八、核酸的生物功能
① 细菌转化作用 （ transformation ）
肺炎球菌（ pneumococcus）
1928年细菌学家 Griffith 细菌毒性实验
1944年 Avery细菌转化实验
转化作用：
转化作用的物质称转化因子
从一种细菌中得到 DNA通过一定途径进入另一种细菌，
从而引起后者遗传特性的改变。
② 噬菌体感染实验
1952年美国 Hershey
噬菌体感染实验
③ 转导作用（ transduction）
④ 人工合成基因的表达
3,DNA与遗传性疾病、癌变的关系
（ 1）镰刀状红细胞贫血病的 DNA点突变
（ 2）白化病的基因缺失
（ 3）癌变
（二） RNA的生物功能
1,RNA与蛋白质的生物合成
（ 1） mRNA与遗传密码
遗传密码（ genetic code）
密码子（ codon）
mRNA的主要功能
（ 2） tRNA的作用
tRNA的作用是多方面的，它接受氨基酸、携带氨基酸，
把氨基酸转运到核糖体上，然后按照 mRNA上的密码顺序装
配成多肽或蛋白质。
tRNA必须识别相应的氨基酸和识别 mRNA上相应的密
码子。
tRNA怎样识别相应的氨基酸, 主要靠高度专一的氨
酰 -tRNA合成酶。
Ea a + t R N A a a t R N A + E
tRNA怎样识别 mRNA上相应的密码子
（ 3） rRNA的作用
详见网上参考材料
九、核酸的分离、纯化和核苷酸的制备
（一）核酸的分离、提取通则
为了得到完整的大分子核酸，一般要注意 3点,
1．保持低温（ 0o～ 4℃ ）。
2．防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌。
3．防止核酸酶的作用。
抑制 DNase：
可加柠檬酸钠,EDTA等金属螯合剂；或加去污剂 十
二烷基硫酸钠（ SDS）；或加蛋白变性剂。
抑制 RNase：
（ 1）实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的用
具用 0.1%二乙基焦碳酸盐（ diethyl pyrocarbonate,
DEPC）处理。
（ 2）加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等。
（ 3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（ RNasin）等 RNase的抑制剂。
（二）大分子 DNA的提取
1．材料的选择
2．细胞破碎
3,DNA-蛋白质（ DNP）的提取
真核细胞 DNA与蛋白质结
合成核蛋白（ DNP）,RNA与蛋
白质结合成 RNP，而且 DNP和
RNP常常混在一起。利用 DNP和
RNP在不同浓度 NaCl中溶解度的
不同来分离 DNP和 RNP。
可用 1mol/LNaCl溶液提取 DNP。
0.5 1.0
0
1
2
0,14
相
对
溶
解
度
NaCl（ mol/L）
DNP在 NaCl中的溶解度
4．去蛋白质
（ 1） SDS
（ 2）苯酚法
（ 3）氯仿法
（ 4）酚,氯仿,异戊醇 ＝ 25:24:1
5．沉淀 DNA
6．去杂质
（ 1）去 RNA
（ 2）去多糖
7．进一步纯化
生物材料 DNP（ RNP） DNP
纤维状 DNA 较纯 DNA 纯 DNA
*原核生物的 DNA是裸露的，与蛋白质结合不多，分离纯化要简单些。
破细胞 1.0mol/L NaCl* 去蛋白质
酒精沉淀 去 RNA 柱层析，电泳
密度梯度离心去多糖
（三） RNA的提取
1．不同种类 RNA的提取
2．大分子 RNA的提取
（ 1）酚提取
（ 2）酚 -氯仿 -SDS法
3,mRNA的提取
4．工业上制备 RNA
（ 1）稀碱法
（ 2）浓盐法
清 液 调 p H 至 2, 5 R N A ↓
酵 母
稀 碱
法
1 %
N a O
H
浓 盐
法
1 0 %
N a C
l
破 细 胞 壁
释 放 R N A
中 和 后 离 心
除 去 菌 体
离 心
（四）核酸纯度鉴定
1.A260/A280
2.电泳
（五）核酸含量的测定
1.定磷法
2.定糖法
3.紫外吸收法
（六）核苷酸的制备
1．碱水解
2．酶水解
3.自溶法
