2010-8-2
第四章
分子发光分析法
一,基本原理
principle
二 装置与技术
instrument and technology
三,化学发光分析的特点
characteristics第三节
化学发光分析法
molecular luminescence
analysis
chemiluminescence
analysis
2010-8-2
化学发光
某些物质在进行化学反应过程中, 由于吸收了反应产生
的 化学能 而被激发, 从激发态返回基态时, 发射出一定波长
的光, 这种吸收化学能使分子发光的过程称为 化学发光 。
化学发光反应存在于生物体 (萤火虫, 海洋发光生物 )中
,称 生物发光 (bioluminescence)。
化学发光分析
利用某些化学反应所产生的光发射现象而建立的一种分
析方法 。
2010-8-2
一,基本原理 principle
1,化学发光反应
在化学反应过程中, 某些反应产物 接受化学能而被 激发
,从激发态返回基态时, 发射出一定波长的光 。
A +B = C + D*
D* → D + h?
（ 1） 能 快速 地释放出 足够 的能量 。 能产生化学发光的物质大
多为有机化合物, 芳香族化合物；化学发光反应多为 氧化还
原反应, 激发能与 反应能 相当, ?E=170～ 300 kJ/mol；发光
位于可见光区；
（ 2） 反应历程有利于激发态产物的形成；
（ 3） 激发态分子能够以 辐射跃迁 的方式返回基态；
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2.化学发光效率和发光强度
化学效率：
fcl ??? ??? r参加反应的分子数
发射光子的分子数
参加反应的分子数
激发态分子数?
r?
发光效率：
激发态分子数
发射光子的分子数?
f?
化学效率 主要取决于发光所依赖的 化学反应本
身 ；而 发光效率 则取决于 发光体本身 的结构和性质
，也受 环境 的影响。
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发光强度
化学发光反应的发光强度 Icl是以单位时间内发射的光子
数表示，它与化学发光反应的速率有关。
时刻 t 的化学发光强度 (单位时间发射的光量子数 )：
? ? tctI ddclcl ?? ?
如果反应是一级动力学反应,t时刻的化学发光强度 Icl
与该时刻的分析物浓度 c成正比,即化学发光 峰值强度 与分
析物 浓度 c成 线性关系 。在化学发光分析中，常用已知时间
内的 发光总强度 来进行定量分析。
? ? cttcttIA tt ???? ?? cl0cl0 cl dddd ??
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3.化学发光反应的类型
（ 1）气相化学发光反应
主要有 O3,NO,S的化学发光反应，可用于监测
空气中的 O3,NO,NO2,H2S,SO2和 CO等,
a,一氧化氮与 O3的发光反应
NO + O3 → NO2* + O2
NO2* → NO 2 + h?
发射的光谱范围,600～ 875nm,灵敏度 1ng/cm-3；
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b,乙烯与 O3的发光反应
乙烯与 O3反应，生成激发态甲醛：
CH2O* → CH2O + h?
最大发射波长,435nm； 对 O3的特效反应；线性响应
范围 1 ng/cm-3 ～ 1?g/cm-3；
2010-8-2
（ 2） 液相中的化学发光反应
机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的 H2O2,
Cu,Mn,Co,V,Fe,Cr,Ce,Hg,Au,Th等。
应用最多的发光试剂,鲁米诺（ 3-氨基苯二甲酰肼） ；
化学发光反应效率,0.15～ 0,05；
鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的 反应过程：
2010-8-2
（ 1） 该发光反应速度慢，某些 金属离子 可 催化 反应；利用
这一现象可 间接测定 这些金属离子。可测痕量的 Cu2+, Mn2+
,Co2+,V4+,Fe2+,Fe3+,Ni2+,Ag+,Au3+,Hg2+等
（ 2） 可检测低至 10-9 mol/L 的 H2O2；
（ 3） 间接测定某些生物试样
氨基酸 + O2 ????? 酮酸 +NH3 + H2O2
氨基酸氧化酶
葡萄糖 + O2 + H2O ????? 葡萄糖酸 + H2O2
通过测定生成的 H2O2,确定 氨基酸、葡萄糖 含量。
葡萄糖氧化酶
2010-8-2
2010-8-2
二,装置与技术
instrument and technology
装置流程：
发光反应室 光检测器 信号放大器 显示与记录
发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：
静态方式, 用注射器分别将试剂加入到反应器中混合,
测最大光强度或 总发光强度 ；试样量小, 重复性差；
流动注射方式, 用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器,
定时 通过测量室, 连续发光, 测定 最大光强度 ；试样量大；
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三,特点 characteristics
1,灵敏度极高
例：荧光素酶和磷酸三腺甙 (ATP)的化学发光分析, 可测
定 2?10-17mol/L的 ATP,即可检测出 一个细菌中 的 ATP含量
2,仪器设备简单
不需要光源, 单色器和背景校正；
3,发射光强度测量无干扰
无背景光, 散射光等干扰；
4,线性范围宽
5,分析速度快
缺点,可供发光用的试剂少；发光反应效率低 （ 大大低于生
物体中的发光 ） ；机理研究少 。
2010-8-2
本章小结
一, 荧光与磷光的产生
辐射跃迁,荧光及磷光 ;
非辐射跃迁,振动弛豫，系间窜越，内转换，外转换；
激发光谱与发射光谱 ;
荧光量子产率
荧光效率与物质分子结构的关系,跃迁类型，共轭
效应，刚性平面结构，取代基效应 ;
荧光效率与环境因素的关系,溶剂，温度,pH。
???? if
f
f KK
K
激发态分子总数
发荧光的分子数?
2010-8-2
二, 荧光与磷光分析法
仪器结构, 两个单色器，光源与检测器成直角
定量依据与方法, If=Kc,Ip=Kc
应用,定量，有机，无机
三, 化学发光分析
化学发光的产生
化学发光效率 φcl=φr·φf
总发光强度与浓度的关系,A=φcl·c=Kc
化学发光装置
发光反应室－光检测器－信号放大－显示
本章作业,p65,1,2,4三大题。
2010-8-2
内容选择：
第一节 分子荧光和磷光
molecular fluorescence and phosphorescence
第二节 分子荧光和磷光分析法
molecular fluorescence and phosphorescence
analysis
第三节 分子发光分析
chemiluminescence analysis
结束
第四章
分子发光分析法
一,基本原理
principle
二 装置与技术
instrument and technology
三,化学发光分析的特点
characteristics第三节
化学发光分析法
molecular luminescence
analysis
chemiluminescence
analysis
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化学发光
某些物质在进行化学反应过程中, 由于吸收了反应产生
的 化学能 而被激发, 从激发态返回基态时, 发射出一定波长
的光, 这种吸收化学能使分子发光的过程称为 化学发光 。
化学发光反应存在于生物体 (萤火虫, 海洋发光生物 )中
,称 生物发光 (bioluminescence)。
化学发光分析
利用某些化学反应所产生的光发射现象而建立的一种分
析方法 。
2010-8-2
一,基本原理 principle
1,化学发光反应
在化学反应过程中, 某些反应产物 接受化学能而被 激发
,从激发态返回基态时, 发射出一定波长的光 。
A +B = C + D*
D* → D + h?
（ 1） 能 快速 地释放出 足够 的能量 。 能产生化学发光的物质大
多为有机化合物, 芳香族化合物；化学发光反应多为 氧化还
原反应, 激发能与 反应能 相当, ?E=170～ 300 kJ/mol；发光
位于可见光区；
（ 2） 反应历程有利于激发态产物的形成；
（ 3） 激发态分子能够以 辐射跃迁 的方式返回基态；
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2.化学发光效率和发光强度
化学效率：
fcl ??? ??? r参加反应的分子数
发射光子的分子数
参加反应的分子数
激发态分子数?
r?
发光效率：
激发态分子数
发射光子的分子数?
f?
化学效率 主要取决于发光所依赖的 化学反应本
身 ；而 发光效率 则取决于 发光体本身 的结构和性质
，也受 环境 的影响。
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发光强度
化学发光反应的发光强度 Icl是以单位时间内发射的光子
数表示，它与化学发光反应的速率有关。
时刻 t 的化学发光强度 (单位时间发射的光量子数 )：
? ? tctI ddclcl ?? ?
如果反应是一级动力学反应,t时刻的化学发光强度 Icl
与该时刻的分析物浓度 c成正比,即化学发光 峰值强度 与分
析物 浓度 c成 线性关系 。在化学发光分析中，常用已知时间
内的 发光总强度 来进行定量分析。
? ? cttcttIA tt ???? ?? cl0cl0 cl dddd ??
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3.化学发光反应的类型
（ 1）气相化学发光反应
主要有 O3,NO,S的化学发光反应，可用于监测
空气中的 O3,NO,NO2,H2S,SO2和 CO等,
a,一氧化氮与 O3的发光反应
NO + O3 → NO2* + O2
NO2* → NO 2 + h?
发射的光谱范围,600～ 875nm,灵敏度 1ng/cm-3；
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b,乙烯与 O3的发光反应
乙烯与 O3反应，生成激发态甲醛：
CH2O* → CH2O + h?
最大发射波长,435nm； 对 O3的特效反应；线性响应
范围 1 ng/cm-3 ～ 1?g/cm-3；
2010-8-2
（ 2） 液相中的化学发光反应
机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的 H2O2,
Cu,Mn,Co,V,Fe,Cr,Ce,Hg,Au,Th等。
应用最多的发光试剂,鲁米诺（ 3-氨基苯二甲酰肼） ；
化学发光反应效率,0.15～ 0,05；
鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的 反应过程：
2010-8-2
（ 1） 该发光反应速度慢，某些 金属离子 可 催化 反应；利用
这一现象可 间接测定 这些金属离子。可测痕量的 Cu2+, Mn2+
,Co2+,V4+,Fe2+,Fe3+,Ni2+,Ag+,Au3+,Hg2+等
（ 2） 可检测低至 10-9 mol/L 的 H2O2；
（ 3） 间接测定某些生物试样
氨基酸 + O2 ????? 酮酸 +NH3 + H2O2
氨基酸氧化酶
葡萄糖 + O2 + H2O ????? 葡萄糖酸 + H2O2
通过测定生成的 H2O2,确定 氨基酸、葡萄糖 含量。
葡萄糖氧化酶
2010-8-2
2010-8-2
二,装置与技术
instrument and technology
装置流程：
发光反应室 光检测器 信号放大器 显示与记录
发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：
静态方式, 用注射器分别将试剂加入到反应器中混合,
测最大光强度或 总发光强度 ；试样量小, 重复性差；
流动注射方式, 用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器,
定时 通过测量室, 连续发光, 测定 最大光强度 ；试样量大；
2010-8-2
三,特点 characteristics
1,灵敏度极高
例：荧光素酶和磷酸三腺甙 (ATP)的化学发光分析, 可测
定 2?10-17mol/L的 ATP,即可检测出 一个细菌中 的 ATP含量
2,仪器设备简单
不需要光源, 单色器和背景校正；
3,发射光强度测量无干扰
无背景光, 散射光等干扰；
4,线性范围宽
5,分析速度快
缺点,可供发光用的试剂少；发光反应效率低 （ 大大低于生
物体中的发光 ） ；机理研究少 。
2010-8-2
本章小结
一, 荧光与磷光的产生
辐射跃迁,荧光及磷光 ;
非辐射跃迁,振动弛豫，系间窜越，内转换，外转换；
激发光谱与发射光谱 ;
荧光量子产率
荧光效率与物质分子结构的关系,跃迁类型，共轭
效应，刚性平面结构，取代基效应 ;
荧光效率与环境因素的关系,溶剂，温度,pH。
???? if
f
f KK
K
激发态分子总数
发荧光的分子数?
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二, 荧光与磷光分析法
仪器结构, 两个单色器，光源与检测器成直角
定量依据与方法, If=Kc,Ip=Kc
应用,定量，有机，无机
三, 化学发光分析
化学发光的产生
化学发光效率 φcl=φr·φf
总发光强度与浓度的关系,A=φcl·c=Kc
化学发光装置
发光反应室－光检测器－信号放大－显示
本章作业,p65,1,2,4三大题。
2010-8-2
内容选择：
第一节 分子荧光和磷光
molecular fluorescence and phosphorescence
第二节 分子荧光和磷光分析法
molecular fluorescence and phosphorescence
analysis
第三节 分子发光分析
chemiluminescence analysis
结束
