第二章 菌种的保藏与复壮
? 菌种衰退的基本原因是变异，
变异是不可避免的，而减缓变异速
度则是可能的。变异速度与菌种所
处的环境有密切的关系，不良环境
条件能促进变异，频繁或过多传代
也是造成衰退变异的重要原因。为
菌种创造良好条件，减缓菌种衰退，
这就是菌种保藏与复壮工作。
第二章 菌种的保藏与复壮
? 一、菌种保藏
? 二、菌种的提纯与复壮
一、菌种保藏
?工业微生物菌种保藏与其他目的
的菌种保藏要求有所不同 。 工业
微生物菌种保藏, 是要使菌种生
产能力和与生产工艺相适应的优
良性状保持稳定, 当然做不到绝
对不变, 只是力求把这种衰退现
象推迟减缓到最低限度 。
菌种保藏
? 菌种保藏有许多的方法, 其共同的目标是
把菌株的优良性状保存下来, 防止退化,
死亡或杂菌污染 。 保藏的一般程序是选取
优良的纯菌种, 最好是用其分生孢子或芽
孢等休眠体, 在其休眠和停止生长的条件
下保藏 。 微生物生长要求适宜的温度, 水
分, 空气和营养物质等, 如将菌种处于低
温, 干燥, 无氧和缺乏营养的条件下, 就
可以使菌种暂时处于休眠状态 。
菌种保藏
其中低温是保藏菌种的重要因素, 也是常用
的一种简单易行的方法 。 在作低温保藏时, 注意
尽量不损伤细胞 。 在缓慢冷冻时, 胞外基质一般
较快结冰而形成冰晶使基质浓度增高, 造成细胞
水分外渗而大量脱水, 可能使细胞死亡 。 如快速
降温, 胞内也很快形成冰晶, 胞内外渗透压基本
平衡, 同时胞内冰晶较小, 对细胞及原生质膜的
损伤也较小, 菌株不易死亡, 影响也较小 。 与低
温相关的保藏方法, 如冷冻干燥法, 超低温保藏
法等, 都是利用低温条件下细胞与环境的特殊平
衡原理而设计的 。
一、菌种保藏
? (一 )低温保藏法
? (二 )低温定期移植法
? (三 )石蜡油低温保藏法
? (四 )干燥保藏
? (五 )甘油管保藏法
? (六 )真空冷冻干燥法
? (七 )液氮超低温保存
现行的菌种保藏方法有下列诸种,
(一 )低温保藏法
? 这是一种常用的简便方法 。 一般的斜面孢
子, 液态孢子, 斜面种子以及用麸皮, 大
米, 小米或碎玉米制成的孢子, 可以放在
4℃ 冰箱内保藏, 这种温度条件下不能使
菌体进入休眠, 而仅是抑制微生物的生命
活动 。 因此, 保藏时间不宜过长, 一般不
超过 1～ 2个月为宜 。 本方法虽然简便, 但
由于菌株处于较高的水平活性下, 这对保
藏株的生产性状是不利的, 因此, 生产菌
种一般不采用此法保藏 。
(二 )低温定期移植法
? 把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存,
定期移植, 一般 3～ 6个月移植一次 (视菌种
特征而定 )。 也可以用穿刺培养, 定期移植
法保藏细菌, 其效果也较好 。 穿刺培养是
将含 0.6％ ～ 0.8％ 的琼脂培养基装试管灭
菌后直立冷凝后, 用接种针尖挑取少量菌
体, 垂直刺入琼脂培养基中心, 放在适当
温度下培养, 待菌长好后即可放低温保存,
此法较斜面保存有利, 大肠杆菌可保藏 2年
以上不发生明显变异 。
(二 )低温定期移植法
? 斜面定期移植与穿刺移植法有其缺陷，
即容易发生遗传变异；连续传代可使一
些生产性状丢失或减弱，也易于污染杂
菌。因此，一些贵重菌株及生产优良菌
株不宜用此法保藏。
(三 )石蜡油低温保藏法
? 本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖
灭菌的液体石蜡, 达到菌体与空气隔绝,
使菌处于生长和代谢停止状态, 同时石
蜡油还防止水分蒸发, 在低温下达到较
长期的保藏菌种的目的 。 保藏温度要求
在 -4～ 4℃ 下 。 液体石蜡法适用于不产孢
子的菌种 。
(三 )石蜡油低温保藏法
? 具体操作是：菌种为斜面培养菌种, 斜
面不宜过长；选择纯净优质石蜡油, 置
三角烧瓶中经过 121℃ 高压蒸汽灭菌 1～
2h,将其放烘箱中 (160℃ 左右 )干热处理,
去除灭菌时渗入的水分, 待石蜡油变得
清澈透明后冷却即可加入斜面, 斜面上
不能出现气泡, 液蜡添加量以高出斜面
顶部约 1cm左右为宜 。
(四 )干燥保藏
? 微生物生长需要水分, 干燥法是使菌处于
干燥条件下停止生长及处于休眠状态, 达
到较长期保藏的目的 。 此法用于细菌芽孢
或产分生孢子的菌种, 是现在发酵工业生
产中较常用的菌种保藏方法 。 为了转接方
便, 控制接种量以及对菌种的保护作用,
通常将菌种的分生孢子, 芽孢, 甚至菌丝
体吸附于一些载体表面放至干燥容器里进
行常压干燥或真空干燥, 所用载体有沙土,
滤纸, 硅胶及大 (小 )米等 。
1.沙土管法
取河 (海 )沙, 过 0.78mm(24目 )筛, 用 10％ 盐酸
浸泡 24h,倒去盐酸用清水冲洗至 pH呈中性, 去水
烘干或晒干 。 取菜园或果园土粉碎过筛, 把烘干
的沙土按 3,2或 1,1混合装入指形管或高 100mm，
直径为 10mm的小试管中, 高约 1cm(约 2g),塞棉塞
121℃ 灭菌 1h,也可用 170℃ 2h干热灭菌 (或蒸汽三
次间歇灭菌 ),蒸汽灭菌后需烘干 。 经肉汤检查确
实证明无菌即可使用 。 将要保存的斜面菌种制成
浓孢子悬液 (≥ 106/ml),用灭菌滴管或吸管吸取孢
子悬液滴入无菌沙土上, 每管约 0.3～ 0.5ml,用
接种环将其混合均匀 。
1.沙土管法
? 也可将真菌分生孢子用接种环从斜面直
接挑取放入沙土中 。 然后将沙土管抽真
空干燥 。 这时管内砂土松散, 表明已干
燥 。 将干燥的砂土管放置在干燥器或密
闭容器内, 干燥器下部放置变色硅胶等
干燥剂, 于 4℃ 下保存 。 从斜面取出的孢
子放入沙土管中混匀后, 可以不抽真空
直接放干燥器内保存 。
1.沙土管法
? 在沙土保藏初期, 菌死亡率高, 以后逐
渐减慢, 存活下来的孢子在以后保存期
间稳定性较好, 保藏的有效时间与菌种
存活率的关系见图 2-10。 用沙
土管保藏的某些抗生素产生菌保藏期可
达 18年 (土霉素和链霉素产生菌 )到 22年
(新霉素产生菌 ),但对利福霉素, 卡那
霉素, 四环素等容易产生变异的菌种,
就不适合作长期的沙土管保存 。
1.沙土管法
2.滤纸保藏法
? 本法是将要要保藏的微生物细胞或孢子吸
附在灭菌滤纸上, 干燥后冷藏 。
是 3#滤纸剪成 5mm× 50mm的小条, 放入干燥
的培养皿中灭菌 。 将培养好的菌种用灭菌
脱脂乳或奶粉复原乳制成孢子悬液, 用灭
菌镊子将准备好的滤纸条在灭菌操作下浸
入菌悬液中, 充分吸附菌细胞, 取出后放
入灭菌小试管或安瓿管中, 在真空干燥机
上抽干, 真空条件下火焰熔封, 冷藏 。
3.大 (小 )米保藏法
? 是根据我国制曲原理加以改进的一种
方法。此法是将曲霉等大量产生孢子的
菌直接培养在大 (小 )米培养基上，待孢子
充分成熟后干燥后保藏。
(五 )甘油管保藏法
? 本法也是利用微生物在甘油中生长和代
谢受到抑制的原理达到保藏目的 。 其方
法是, 将 80%的甘油高压蒸汽灭菌待用 。
将培养好的斜面菌种用无菌种用无菌水
制成高浓度的菌悬液 (108～ 1010/ml)。 取
1ml灭菌甘油放入与甘油充分混匀, 使甘
油浓度约为 40%,于 -20℃ 下冻存 。
(六 )真空冷冻干燥法
? 真空冷冻干燥保藏法是兼具低温, 干燥,
除氧三方面菌种保藏的主要因素, 除不
宜于丝状真菌的菌丝体外, 对病毒, 细
菌, 放线菌, 酵母及丝状菌孢子等各类
微生物都适用, 不宜用冻干法保存的微
生物不到 2%。 冷冻干燥保存的菌种存活
时间长, 效果好, 一般菌种可保存 5年以
上, 有的可保藏 15年以上不发生变异 。
还具有体积小, 不易污染, 便于运输等
优点, 是一种用得最为广泛的菌种保藏
方法 。
(六 )真空冷冻干燥法
? 冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结,
然后在真空条件下干燥, 使微生物的生
长和酶活动停止 。 为了防止在冷冻和水
分升华过程中对细胞的损害, 要采用保
护剂来制备细甩悬液, 使菌在冻结和脱
水过程中起到保护作用的溶质, 通过氢
键和离子键对水和细胞所产生的亲和力
来稳定细胞成分的构型 。
(六 )真空冷冻干燥法
? 1.冷冻干燥的基本原理
即是使样品中的水分在冰冻状态下, 抽真空减压,
使冻结的冰直接升华为水蒸气, 使样品达到干
燥 。 干燥后的微生物在真空下封装, 与空气隔
绝, 达到长期保藏的目的 。
? 2.设备
冷冻干燥备有不同型号和类型，但都由四个部
分组成：干燥箱、蒸汽捕集器、真空泵、冷冻
系统。干燥箱可控制温度范围为 -40～ 40℃
(六 )真空冷冻干燥法
? 3.操作方法
? (1)安瓿管准备 选取规格约直径为 8mm，
高 100mm的中性玻璃安瓿管，先用 2%盐
酸浸泡 8～ 10h，再经自来水冲洗多次，
用蒸馏水涮洗 2～ 3次，烘干；在每管内
放入打好菌号及日期的标签，字面朝向
管壁，管口塞好棉塞，灭菌备用。
(六 )真空冷冻干燥法
(六 )真空冷冻干燥法
? (2)保护剂的选择及制备 冷冻干燥保
藏法使用的保护剂种类很多, 列于表 2-8，
效果不尽相同, 通常采用高分子化合物与
低分子化合物混合使用效果更好 。 在配制
时注意比例, 浓度, PH和灭菌方法 。 一些
对热敏感的保护剂如血清等用过滤除菌,
牛奶, 葡萄糖及乳糖等要控制灭菌温度 。
一般情况下, 多数菌种可以用脱脂乳糖等
要控制灭菌温度 。 一般情况下, 多数菌种
可以用脱乳为保护剂 。
(六 )真空冷冻干燥法
? (3)菌种准备及分装 菌种要求为生长良好
的纯种，菌龄以处于稳定期为好，孢子是
新鲜的。每支长好的斜面加 2～ 3ml保护剂，
用接种环将菌苔轻轻刮起 (注意勿刮起培养
基 )，制成菌悬液。如用液体培养的菌种，
则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细
胞，收集的菌体用保护剂悬浮制成菌悬液。
悬液中菌数要求达到 10 8～ 10 10cfu/ml
为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。分
装安瓿时可用灭菌的长滴入安瓿管底部，
装量可依据冷冻干燥机效能而定。
(六 )真空冷冻干燥法
? (4)预冻 分装好的安瓿管需要进行预冻, 即放在 -
30～ 40℃ 下冻结 20～ 60min,也可以用干冰和无水
乙醇冻 5～ 10min。
? (5)冷冻干燥 经预冻的安瓿放入干燥箱中开始
抽真空干燥 。 此时干燥箱温度控制在 -30℃ 以下,
并尽快使真度达到 66Pa以下 。 此后可还渐升温以加
速水分升华, 但升温不宜过快, 以免引起样品融化 。
干燥时间视冻干机效率, 样品装量及性质等而寂,
以样品最终水分含量达到 1%～ 3%为准 。 具体操作时
是根据冻干样品呈酥块工松散片状；真空度接近空
载时最高真空；样品温度与管外温度接近 。
完毕将安瓿管在真空下用火焰烧熔密封, 并用高频
真空检测真空度 。
(六 )真空冷冻干燥法
? (6)保藏及冻干管的启用 密封好的冻
干管在 4℃ 或 -18℃ 下保藏 。 当需用冻干
菌种时, 取出安瓿管用酒精表面消毒,
用小砂轮在无菌条件下打开, 或将安瓿
顶部在酒精灯火焰上灼烧, 迅速滴上冷
的无菌水, 使管破裂, 然后用镊子等轻
轻敲碎管口, 加入 0.3～ 0.5ml液体培养
基溶解冻干菌块成为悬液, 用无菌滴管
或接种环移至斜面或液体培养基进行培
养 。
(六 )真空冷冻干燥法
? 4.简易冷冻干燥装置 在缺乏真空冷冻干
燥机的情况下，可以自己装配一个简易
冻干装置 (图 2-11)，它主要由歧管 (玻璃或
金属管制成 )、冰浴、冷凝器 (水汽接收 )
和真空泵组成。冰浴用干冰 (固体 CO2)和
甲基溶纤剂致冷，干燥后期也可作温度
控制用。冷凝器也要置冰浴中，必要时
用一根 U玻璃弯管代用。安瓿管在冻干前
也要预冻
(六 )真空冷冻干燥法
? 1)菌的质量 保藏的菌种应培养地营
养丰富的最适条件下, 使之进入稳定期,
稍老一些的菌体对环境抵抗力强 。 另处,
作为冷冻干燥的菌悬液细胞浓度要高不
同的菌对冷冻干燥的耐受程度不同, 如
果保存的菌液细胞浓度不高, 就会使以
后传种造成困难, 保存期也会受到影响 。
(六 )真空冷冻干燥法
? (2)保护剂 不同种类的保护剂对不同
微生物的作用是不同的, 如个别菌种在
脱脂乳作保护剂的情况下死亡率高达
99.99%,而采用葡聚糖等混和保护剂时
死亡率大大减少 。 一般情况下, 那些容
易保存的菌种对保护剂的要求不很严格,
而不易保存的菌种对保护剂的要求却很
苛刻 。 因此, 选择好的保护剂是冷冻干
燥保存菌种的关键因素 。
(六 )真空冷冻干燥法
(六 )真空冷冻干燥法
? 3)干燥速度 实验表明, 慢速干燥比
快速干燥存活率高, 如青霉菌 6h干燥存
活率为 67.3%,而 3h为 59%。
? (4)空气的影响 冷冻干燥后空气对细菌
细胞影响较大，可导致细胞损伤进而死
亡，故在冻干后应立即在真空下融封，
? (5)温度的影响
在干燥和真空状况下温度的影响远没有
上述几项因素重要, 因此可以在室温下
保存, 但许多微生物在 4℃ 保存的存活率
要比在室温下高 1倍 。
? (6)含水量的影响
水分含量过高对菌存活不利，完全脱
水也不利于保存，一般把干燥后的细胞
含水量控制在 3%以下 (1%～ 3%)。
(六 )真空冷冻干燥法
(六 )真空冷冻干燥法
? (7)复苏培养 打开安瓿管后加入无菌水使
冻干菌融化, 融化速度慢比快速融化的成活率
要高 。
? 菌种能否适宜竽冻干保存, 需经过实验来证明,
一般是在保存 1个月进行复苏培养, 如果菌的
成活率高于 01.%,即认为可用冻干保存法保存,
以后 6个月, 2年, 5年, 10年再进行检查存活
情况, 以确定保存期的上限 。
? 冻干保藏的效果因微生物种类而异, 一般是细
菌＞放线菌＞真菌＞藻类, 而菌丝体不宜用此
法保存 。
(七 )液氮超低温保存
? 本方法是近年推广使用的一种菌种保存法。
大多数微生物如病毒、噬菌体，立克氏体，
各种细菌、放细菌、支原体，各种丝状菌、
酵母、藻类和原虫，特别是一些无法用冻
干保存的微生物，都可用此法长期保存。
工业微生物高产菌种也逐步采用此法保存。
液氮保存的原理是微生物在 -130℃ 以下温
度时，它的新陈代谢作用停止，化学反应
也消失，而液氮温度可达 -196℃,在这种
情况下可以长期保存。
(七 )液氮超低温保存
? 1.保护剂 与冷冻干燥保存一样, 液
氮保存菌种也需要有保护物质, 可以用
10%的甘油, 使用方便, 效果好, 但有些
菌对甘油敏感, 效果不佳, 可选用其他
保护剂, 常用的有 5%～ 10%(V/V)二甲基
亚砜； 20%二甲亚砜加 1%蛋白陈；汪温 80
及 0.4mmol聚乙烯氮戊环等, 糖类也可作
为一种保护剂, 但浓度适当加以控制 。
(七 )液氮超低温保存
? 2.操作程序
? (1)安瓿管 一般要求用 95%料或 GG17的玻管
制作, 以能承受巨大的温差变化而不破损, 大
小根据需要而定 。 用印同在管壁上书写菌号,
160℃ 烘干, 加棉塞灭菌备用 。
? (2)菌种准备 在最适培养基斜面上培养得
到健壮菌种, 制成悬浮液, 如为不产孢子的真
菌, 则采用斜面或液体振荡培养, 制成菌丝片
段 。 将菌悬淮分装至灭菌安瓿管中, 每管
0.2～ 0.5ml,然后用火焰将安瓿熔封 。
(七 )液氮超低温保存
? 3)冻结 将熔封后的安瓿管入大慢速
冻结器上, 以每分钟下降 1℃ 的速度冷冻,
当安瓿管温度下降至 -35℃ 时, 即可把安
瓿管移入液氮内作长期保藏 。
? (4)菌种的复苏培养 直至全部溶化为
止, 当溶化后即开启安瓿移至培养基内
培养, 扣作时应特别注意安全, 防止爆
炸或冻伤, 不宜戴线手套, 要戴皮手套
操作 。
二、菌种的提纯与复壮
? (一 )菌种的提纯
? (二 )通过寄主体进行复壮
? (三 )淘汰已衰退的个体
(一 )菌种的提纯
? 即从已衰退的菌种中, 通过分离纯化, 将
尚未退化的个体分离出来, 以恢复和建立
具有原来生产性状的群体, 继续供科研及
生产使用 。
? 菌种提纯：一是只要求达到菌落纯化的水
平, 通过稀释平板法, 划线法, 表面涂血
法等常规操作法, 该方法较为粗放, 适用
于菌退化不太严重的情况 。 另一类方法,
可达到, 细胞纯, 的水平, 采用单胞分离
法, 也可以二者结合, 先用前一种方法获
得较纯的菌种后再采用单胞分离法进一步
纯化 。
(二 )通过寄主体进行复壮
? 对于寄 生性微生物如苏云金杆菌、白僵
菌、多角体病毒等，由于长期使用，其
毒力会下降，导致杀虫效率降低待衰退
现象。这时可以用菌种却感染菜青虫幼
虫等，然后从致死的虫体上重新分离，
经过几次重复感染与分离，就可以逐步
(三 )淘汰已衰退的个体
? 通过物理, 化学的方法处理菌体 (或孢
子 ),使大部分死亡 (80%以上 ),存活的
菌多为生长健壮者, 可从中选出优良菌
种来 。
? 菌种衰退的基本原因是变异，
变异是不可避免的，而减缓变异速
度则是可能的。变异速度与菌种所
处的环境有密切的关系，不良环境
条件能促进变异，频繁或过多传代
也是造成衰退变异的重要原因。为
菌种创造良好条件，减缓菌种衰退，
这就是菌种保藏与复壮工作。
第二章 菌种的保藏与复壮
? 一、菌种保藏
? 二、菌种的提纯与复壮
一、菌种保藏
?工业微生物菌种保藏与其他目的
的菌种保藏要求有所不同 。 工业
微生物菌种保藏, 是要使菌种生
产能力和与生产工艺相适应的优
良性状保持稳定, 当然做不到绝
对不变, 只是力求把这种衰退现
象推迟减缓到最低限度 。
菌种保藏
? 菌种保藏有许多的方法, 其共同的目标是
把菌株的优良性状保存下来, 防止退化,
死亡或杂菌污染 。 保藏的一般程序是选取
优良的纯菌种, 最好是用其分生孢子或芽
孢等休眠体, 在其休眠和停止生长的条件
下保藏 。 微生物生长要求适宜的温度, 水
分, 空气和营养物质等, 如将菌种处于低
温, 干燥, 无氧和缺乏营养的条件下, 就
可以使菌种暂时处于休眠状态 。
菌种保藏
其中低温是保藏菌种的重要因素, 也是常用
的一种简单易行的方法 。 在作低温保藏时, 注意
尽量不损伤细胞 。 在缓慢冷冻时, 胞外基质一般
较快结冰而形成冰晶使基质浓度增高, 造成细胞
水分外渗而大量脱水, 可能使细胞死亡 。 如快速
降温, 胞内也很快形成冰晶, 胞内外渗透压基本
平衡, 同时胞内冰晶较小, 对细胞及原生质膜的
损伤也较小, 菌株不易死亡, 影响也较小 。 与低
温相关的保藏方法, 如冷冻干燥法, 超低温保藏
法等, 都是利用低温条件下细胞与环境的特殊平
衡原理而设计的 。
一、菌种保藏
? (一 )低温保藏法
? (二 )低温定期移植法
? (三 )石蜡油低温保藏法
? (四 )干燥保藏
? (五 )甘油管保藏法
? (六 )真空冷冻干燥法
? (七 )液氮超低温保存
现行的菌种保藏方法有下列诸种,
(一 )低温保藏法
? 这是一种常用的简便方法 。 一般的斜面孢
子, 液态孢子, 斜面种子以及用麸皮, 大
米, 小米或碎玉米制成的孢子, 可以放在
4℃ 冰箱内保藏, 这种温度条件下不能使
菌体进入休眠, 而仅是抑制微生物的生命
活动 。 因此, 保藏时间不宜过长, 一般不
超过 1～ 2个月为宜 。 本方法虽然简便, 但
由于菌株处于较高的水平活性下, 这对保
藏株的生产性状是不利的, 因此, 生产菌
种一般不采用此法保藏 。
(二 )低温定期移植法
? 把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存,
定期移植, 一般 3～ 6个月移植一次 (视菌种
特征而定 )。 也可以用穿刺培养, 定期移植
法保藏细菌, 其效果也较好 。 穿刺培养是
将含 0.6％ ～ 0.8％ 的琼脂培养基装试管灭
菌后直立冷凝后, 用接种针尖挑取少量菌
体, 垂直刺入琼脂培养基中心, 放在适当
温度下培养, 待菌长好后即可放低温保存,
此法较斜面保存有利, 大肠杆菌可保藏 2年
以上不发生明显变异 。
(二 )低温定期移植法
? 斜面定期移植与穿刺移植法有其缺陷，
即容易发生遗传变异；连续传代可使一
些生产性状丢失或减弱，也易于污染杂
菌。因此，一些贵重菌株及生产优良菌
株不宜用此法保藏。
(三 )石蜡油低温保藏法
? 本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖
灭菌的液体石蜡, 达到菌体与空气隔绝,
使菌处于生长和代谢停止状态, 同时石
蜡油还防止水分蒸发, 在低温下达到较
长期的保藏菌种的目的 。 保藏温度要求
在 -4～ 4℃ 下 。 液体石蜡法适用于不产孢
子的菌种 。
(三 )石蜡油低温保藏法
? 具体操作是：菌种为斜面培养菌种, 斜
面不宜过长；选择纯净优质石蜡油, 置
三角烧瓶中经过 121℃ 高压蒸汽灭菌 1～
2h,将其放烘箱中 (160℃ 左右 )干热处理,
去除灭菌时渗入的水分, 待石蜡油变得
清澈透明后冷却即可加入斜面, 斜面上
不能出现气泡, 液蜡添加量以高出斜面
顶部约 1cm左右为宜 。
(四 )干燥保藏
? 微生物生长需要水分, 干燥法是使菌处于
干燥条件下停止生长及处于休眠状态, 达
到较长期保藏的目的 。 此法用于细菌芽孢
或产分生孢子的菌种, 是现在发酵工业生
产中较常用的菌种保藏方法 。 为了转接方
便, 控制接种量以及对菌种的保护作用,
通常将菌种的分生孢子, 芽孢, 甚至菌丝
体吸附于一些载体表面放至干燥容器里进
行常压干燥或真空干燥, 所用载体有沙土,
滤纸, 硅胶及大 (小 )米等 。
1.沙土管法
取河 (海 )沙, 过 0.78mm(24目 )筛, 用 10％ 盐酸
浸泡 24h,倒去盐酸用清水冲洗至 pH呈中性, 去水
烘干或晒干 。 取菜园或果园土粉碎过筛, 把烘干
的沙土按 3,2或 1,1混合装入指形管或高 100mm，
直径为 10mm的小试管中, 高约 1cm(约 2g),塞棉塞
121℃ 灭菌 1h,也可用 170℃ 2h干热灭菌 (或蒸汽三
次间歇灭菌 ),蒸汽灭菌后需烘干 。 经肉汤检查确
实证明无菌即可使用 。 将要保存的斜面菌种制成
浓孢子悬液 (≥ 106/ml),用灭菌滴管或吸管吸取孢
子悬液滴入无菌沙土上, 每管约 0.3～ 0.5ml,用
接种环将其混合均匀 。
1.沙土管法
? 也可将真菌分生孢子用接种环从斜面直
接挑取放入沙土中 。 然后将沙土管抽真
空干燥 。 这时管内砂土松散, 表明已干
燥 。 将干燥的砂土管放置在干燥器或密
闭容器内, 干燥器下部放置变色硅胶等
干燥剂, 于 4℃ 下保存 。 从斜面取出的孢
子放入沙土管中混匀后, 可以不抽真空
直接放干燥器内保存 。
1.沙土管法
? 在沙土保藏初期, 菌死亡率高, 以后逐
渐减慢, 存活下来的孢子在以后保存期
间稳定性较好, 保藏的有效时间与菌种
存活率的关系见图 2-10。 用沙
土管保藏的某些抗生素产生菌保藏期可
达 18年 (土霉素和链霉素产生菌 )到 22年
(新霉素产生菌 ),但对利福霉素, 卡那
霉素, 四环素等容易产生变异的菌种,
就不适合作长期的沙土管保存 。
1.沙土管法
2.滤纸保藏法
? 本法是将要要保藏的微生物细胞或孢子吸
附在灭菌滤纸上, 干燥后冷藏 。
是 3#滤纸剪成 5mm× 50mm的小条, 放入干燥
的培养皿中灭菌 。 将培养好的菌种用灭菌
脱脂乳或奶粉复原乳制成孢子悬液, 用灭
菌镊子将准备好的滤纸条在灭菌操作下浸
入菌悬液中, 充分吸附菌细胞, 取出后放
入灭菌小试管或安瓿管中, 在真空干燥机
上抽干, 真空条件下火焰熔封, 冷藏 。
3.大 (小 )米保藏法
? 是根据我国制曲原理加以改进的一种
方法。此法是将曲霉等大量产生孢子的
菌直接培养在大 (小 )米培养基上，待孢子
充分成熟后干燥后保藏。
(五 )甘油管保藏法
? 本法也是利用微生物在甘油中生长和代
谢受到抑制的原理达到保藏目的 。 其方
法是, 将 80%的甘油高压蒸汽灭菌待用 。
将培养好的斜面菌种用无菌种用无菌水
制成高浓度的菌悬液 (108～ 1010/ml)。 取
1ml灭菌甘油放入与甘油充分混匀, 使甘
油浓度约为 40%,于 -20℃ 下冻存 。
(六 )真空冷冻干燥法
? 真空冷冻干燥保藏法是兼具低温, 干燥,
除氧三方面菌种保藏的主要因素, 除不
宜于丝状真菌的菌丝体外, 对病毒, 细
菌, 放线菌, 酵母及丝状菌孢子等各类
微生物都适用, 不宜用冻干法保存的微
生物不到 2%。 冷冻干燥保存的菌种存活
时间长, 效果好, 一般菌种可保存 5年以
上, 有的可保藏 15年以上不发生变异 。
还具有体积小, 不易污染, 便于运输等
优点, 是一种用得最为广泛的菌种保藏
方法 。
(六 )真空冷冻干燥法
? 冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结,
然后在真空条件下干燥, 使微生物的生
长和酶活动停止 。 为了防止在冷冻和水
分升华过程中对细胞的损害, 要采用保
护剂来制备细甩悬液, 使菌在冻结和脱
水过程中起到保护作用的溶质, 通过氢
键和离子键对水和细胞所产生的亲和力
来稳定细胞成分的构型 。
(六 )真空冷冻干燥法
? 1.冷冻干燥的基本原理
即是使样品中的水分在冰冻状态下, 抽真空减压,
使冻结的冰直接升华为水蒸气, 使样品达到干
燥 。 干燥后的微生物在真空下封装, 与空气隔
绝, 达到长期保藏的目的 。
? 2.设备
冷冻干燥备有不同型号和类型，但都由四个部
分组成：干燥箱、蒸汽捕集器、真空泵、冷冻
系统。干燥箱可控制温度范围为 -40～ 40℃
(六 )真空冷冻干燥法
? 3.操作方法
? (1)安瓿管准备 选取规格约直径为 8mm，
高 100mm的中性玻璃安瓿管，先用 2%盐
酸浸泡 8～ 10h，再经自来水冲洗多次，
用蒸馏水涮洗 2～ 3次，烘干；在每管内
放入打好菌号及日期的标签，字面朝向
管壁，管口塞好棉塞，灭菌备用。
(六 )真空冷冻干燥法
(六 )真空冷冻干燥法
? (2)保护剂的选择及制备 冷冻干燥保
藏法使用的保护剂种类很多, 列于表 2-8，
效果不尽相同, 通常采用高分子化合物与
低分子化合物混合使用效果更好 。 在配制
时注意比例, 浓度, PH和灭菌方法 。 一些
对热敏感的保护剂如血清等用过滤除菌,
牛奶, 葡萄糖及乳糖等要控制灭菌温度 。
一般情况下, 多数菌种可以用脱脂乳糖等
要控制灭菌温度 。 一般情况下, 多数菌种
可以用脱乳为保护剂 。
(六 )真空冷冻干燥法
? (3)菌种准备及分装 菌种要求为生长良好
的纯种，菌龄以处于稳定期为好，孢子是
新鲜的。每支长好的斜面加 2～ 3ml保护剂，
用接种环将菌苔轻轻刮起 (注意勿刮起培养
基 )，制成菌悬液。如用液体培养的菌种，
则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细
胞，收集的菌体用保护剂悬浮制成菌悬液。
悬液中菌数要求达到 10 8～ 10 10cfu/ml
为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。分
装安瓿时可用灭菌的长滴入安瓿管底部，
装量可依据冷冻干燥机效能而定。
(六 )真空冷冻干燥法
? (4)预冻 分装好的安瓿管需要进行预冻, 即放在 -
30～ 40℃ 下冻结 20～ 60min,也可以用干冰和无水
乙醇冻 5～ 10min。
? (5)冷冻干燥 经预冻的安瓿放入干燥箱中开始
抽真空干燥 。 此时干燥箱温度控制在 -30℃ 以下,
并尽快使真度达到 66Pa以下 。 此后可还渐升温以加
速水分升华, 但升温不宜过快, 以免引起样品融化 。
干燥时间视冻干机效率, 样品装量及性质等而寂,
以样品最终水分含量达到 1%～ 3%为准 。 具体操作时
是根据冻干样品呈酥块工松散片状；真空度接近空
载时最高真空；样品温度与管外温度接近 。
完毕将安瓿管在真空下用火焰烧熔密封, 并用高频
真空检测真空度 。
(六 )真空冷冻干燥法
? (6)保藏及冻干管的启用 密封好的冻
干管在 4℃ 或 -18℃ 下保藏 。 当需用冻干
菌种时, 取出安瓿管用酒精表面消毒,
用小砂轮在无菌条件下打开, 或将安瓿
顶部在酒精灯火焰上灼烧, 迅速滴上冷
的无菌水, 使管破裂, 然后用镊子等轻
轻敲碎管口, 加入 0.3～ 0.5ml液体培养
基溶解冻干菌块成为悬液, 用无菌滴管
或接种环移至斜面或液体培养基进行培
养 。
(六 )真空冷冻干燥法
? 4.简易冷冻干燥装置 在缺乏真空冷冻干
燥机的情况下，可以自己装配一个简易
冻干装置 (图 2-11)，它主要由歧管 (玻璃或
金属管制成 )、冰浴、冷凝器 (水汽接收 )
和真空泵组成。冰浴用干冰 (固体 CO2)和
甲基溶纤剂致冷，干燥后期也可作温度
控制用。冷凝器也要置冰浴中，必要时
用一根 U玻璃弯管代用。安瓿管在冻干前
也要预冻
(六 )真空冷冻干燥法
? 1)菌的质量 保藏的菌种应培养地营
养丰富的最适条件下, 使之进入稳定期,
稍老一些的菌体对环境抵抗力强 。 另处,
作为冷冻干燥的菌悬液细胞浓度要高不
同的菌对冷冻干燥的耐受程度不同, 如
果保存的菌液细胞浓度不高, 就会使以
后传种造成困难, 保存期也会受到影响 。
(六 )真空冷冻干燥法
? (2)保护剂 不同种类的保护剂对不同
微生物的作用是不同的, 如个别菌种在
脱脂乳作保护剂的情况下死亡率高达
99.99%,而采用葡聚糖等混和保护剂时
死亡率大大减少 。 一般情况下, 那些容
易保存的菌种对保护剂的要求不很严格,
而不易保存的菌种对保护剂的要求却很
苛刻 。 因此, 选择好的保护剂是冷冻干
燥保存菌种的关键因素 。
(六 )真空冷冻干燥法
(六 )真空冷冻干燥法
? 3)干燥速度 实验表明, 慢速干燥比
快速干燥存活率高, 如青霉菌 6h干燥存
活率为 67.3%,而 3h为 59%。
? (4)空气的影响 冷冻干燥后空气对细菌
细胞影响较大，可导致细胞损伤进而死
亡，故在冻干后应立即在真空下融封，
? (5)温度的影响
在干燥和真空状况下温度的影响远没有
上述几项因素重要, 因此可以在室温下
保存, 但许多微生物在 4℃ 保存的存活率
要比在室温下高 1倍 。
? (6)含水量的影响
水分含量过高对菌存活不利，完全脱
水也不利于保存，一般把干燥后的细胞
含水量控制在 3%以下 (1%～ 3%)。
(六 )真空冷冻干燥法
(六 )真空冷冻干燥法
? (7)复苏培养 打开安瓿管后加入无菌水使
冻干菌融化, 融化速度慢比快速融化的成活率
要高 。
? 菌种能否适宜竽冻干保存, 需经过实验来证明,
一般是在保存 1个月进行复苏培养, 如果菌的
成活率高于 01.%,即认为可用冻干保存法保存,
以后 6个月, 2年, 5年, 10年再进行检查存活
情况, 以确定保存期的上限 。
? 冻干保藏的效果因微生物种类而异, 一般是细
菌＞放线菌＞真菌＞藻类, 而菌丝体不宜用此
法保存 。
(七 )液氮超低温保存
? 本方法是近年推广使用的一种菌种保存法。
大多数微生物如病毒、噬菌体，立克氏体，
各种细菌、放细菌、支原体，各种丝状菌、
酵母、藻类和原虫，特别是一些无法用冻
干保存的微生物，都可用此法长期保存。
工业微生物高产菌种也逐步采用此法保存。
液氮保存的原理是微生物在 -130℃ 以下温
度时，它的新陈代谢作用停止，化学反应
也消失，而液氮温度可达 -196℃,在这种
情况下可以长期保存。
(七 )液氮超低温保存
? 1.保护剂 与冷冻干燥保存一样, 液
氮保存菌种也需要有保护物质, 可以用
10%的甘油, 使用方便, 效果好, 但有些
菌对甘油敏感, 效果不佳, 可选用其他
保护剂, 常用的有 5%～ 10%(V/V)二甲基
亚砜； 20%二甲亚砜加 1%蛋白陈；汪温 80
及 0.4mmol聚乙烯氮戊环等, 糖类也可作
为一种保护剂, 但浓度适当加以控制 。
(七 )液氮超低温保存
? 2.操作程序
? (1)安瓿管 一般要求用 95%料或 GG17的玻管
制作, 以能承受巨大的温差变化而不破损, 大
小根据需要而定 。 用印同在管壁上书写菌号,
160℃ 烘干, 加棉塞灭菌备用 。
? (2)菌种准备 在最适培养基斜面上培养得
到健壮菌种, 制成悬浮液, 如为不产孢子的真
菌, 则采用斜面或液体振荡培养, 制成菌丝片
段 。 将菌悬淮分装至灭菌安瓿管中, 每管
0.2～ 0.5ml,然后用火焰将安瓿熔封 。
(七 )液氮超低温保存
? 3)冻结 将熔封后的安瓿管入大慢速
冻结器上, 以每分钟下降 1℃ 的速度冷冻,
当安瓿管温度下降至 -35℃ 时, 即可把安
瓿管移入液氮内作长期保藏 。
? (4)菌种的复苏培养 直至全部溶化为
止, 当溶化后即开启安瓿移至培养基内
培养, 扣作时应特别注意安全, 防止爆
炸或冻伤, 不宜戴线手套, 要戴皮手套
操作 。
二、菌种的提纯与复壮
? (一 )菌种的提纯
? (二 )通过寄主体进行复壮
? (三 )淘汰已衰退的个体
(一 )菌种的提纯
? 即从已衰退的菌种中, 通过分离纯化, 将
尚未退化的个体分离出来, 以恢复和建立
具有原来生产性状的群体, 继续供科研及
生产使用 。
? 菌种提纯：一是只要求达到菌落纯化的水
平, 通过稀释平板法, 划线法, 表面涂血
法等常规操作法, 该方法较为粗放, 适用
于菌退化不太严重的情况 。 另一类方法,
可达到, 细胞纯, 的水平, 采用单胞分离
法, 也可以二者结合, 先用前一种方法获
得较纯的菌种后再采用单胞分离法进一步
纯化 。
(二 )通过寄主体进行复壮
? 对于寄 生性微生物如苏云金杆菌、白僵
菌、多角体病毒等，由于长期使用，其
毒力会下降，导致杀虫效率降低待衰退
现象。这时可以用菌种却感染菜青虫幼
虫等，然后从致死的虫体上重新分离，
经过几次重复感染与分离，就可以逐步
(三 )淘汰已衰退的个体
? 通过物理, 化学的方法处理菌体 (或孢
子 ),使大部分死亡 (80%以上 ),存活的
菌多为生长健壮者, 可从中选出优良菌
种来 。
