第三节 酶的 作用机理
（一）基本概念,酶的活性中心是指结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。酶的活性中心包括两个功能部位,结合部位和催化部位。
1．结合部位（ Binding site）
酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。此部位决定酶的专一性。
2．催化部位（ catalytic site ）
酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位 。 此部位决定酶所催化反应的性质。
（必需基团、非必需基团）
一,酶的活性中心
必需基团,酶分子中有些基团若经化学修饰
（氧化、还原、酰化、烷化）使其改变，
则酶的活性丧失，这些基团称为 必需基团。
非必需基团,有的酶温和水解掉几个 AA残基，仍能表现活性，这些基团即 非必需基团。
（二）酶活性中心的结构特点
1.活性中心只占酶分子总体积的很小一部分，往往只占整个酶分子体积的 1%-2%。
某些酶活性部位的 AA残基酶 AA残基数 活性部位的 AA残基核糖核酸酶 124 His12,His119,Lys41
溶菌酶 129 Asp52,Glu35
胰凝乳蛋白酶 241 His57,Asp102,Ser195
胃蛋白酶 348 Asp32,Asp215
木瓜蛋白酶 212 Cys25,His159
羧肽酶 A 307 Arg127,Glu270,Tyr248,Zn2+
2,酶的活性部位是一个三维实体,具有三维空间结构 。
活性中心的空间构象不是刚性的，在与底物接触时表现出一定的柔性和运动性。（邹承鲁研究酶变性的工作）
3,酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补的，而是在酶和底物的结合过程中，底物分子或酶分子、有时是两者的构象同时发生了一定的变化后才互补的，此时催化基团的位置正好处在所催化底物键的断裂和即将生成键的适当位置，这个动态辨认过程称为诱导契合（ induced-fit）,
4,酶的 活性部位位于酶分子表面的一个裂隙（ crevice）
内,裂隙内是一个相当疏水的环境，从而有利于同底物的结合。
5,底物靠许多弱的键力与酶结合。
（二）酶活性中心的结构特点
（三）判断和确定酶活性中心的主要方法
酶的专一性研究,研究酶的专一性底物的结构特点、酶的竞争性抑制剂结构特点等。
酶分子侧链基团的化学修饰法：例如 1.
用共价修饰的试剂作用于酶，查明保持酶活力的必需基团； 2.亲和标记（合成底物类似物）； 3.— SH保护剂的使用；
X- 射线晶体衍射法：
定点诱变法
用共价修饰的试剂作用于酶，查明保持酶活力的必需基团
DFP
的作用二异丙基氟磷酸牛胰蛋白酶二,酶作用专一性的机制
锁钥学说 （ 1894年 Emil Fischer） — lock and key或 模板学说 （ temolate）,认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。
酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样。
（ 酶的多底物现象、酶对正反方向的催化,相对专一性 ）
诱导契合学说 （ 1958年 D.Koshland)_induced fit,该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状,从而有利于底物的结合。 概括其要点：四个方面诱导契合学说的要点
A,酶有其原来的形状，不一定一开始就是底物的模板
B,底物能诱导酶蛋白的形状发生一定变化（专一性结合）
C,当酶的形状发生变化后，就使得其中的催化基团形成正确的排列。
D,在酶反应过程中，酶活性中心构象的变化是可逆的。即酶与底物结合时，产生一种诱导构象，
反应结束时，产物从酶表面脱落，酶又恢复其原来的构象。
（一）降低反应的活化能（ activation energy）
活化能,在一定温度下一摩尔底物全部进入活化态所需要的自由能，单位是 KJ/mol.
（ 增加温度、加入催化剂降低反应活化能）
酶促反应,E + S === ES === ES*? EP
E + P
非酶促反应：
三、酶作用高效率的机制
催化剂的作用是降低反应活化能,从而起到提高反应速度的作用反应过程中能的变化
Fe非酶促反应酶促反应 非酶促反应自由能能反应进程底物产物
ES
ES*
EP
实例,H2O2的分解无催化剂时活化能为
75.24 KJ/mol;
铂为催化剂时 48.9;
H2O2酶为催化剂 8.36
三、酶作用高效率的机制
（一）降低反应的活化能（ activation energy）
中间产物学说
在酶催化的反应中，第一步是酶与底物形成酶－底物中间复合物。当底物分子在酶作用下发生化学变化后，
中间复合物再分解成产物和酶。
E + S ==== E-S P + E
许多实验事实证明了 E－ S复合物的存在。 E－ S复合物形成的速率与酶和底物的性质有关。
（电子显微镜的观察结果,X-射线晶体结构分析、
酶与底物反应前后光谱特性分析、酶的溶解度变化、酶与底物的共沉降，获得 ES复合物结晶）
在酶促反应中，由于酶和底物分子之间的亲和性，
底物分子有向酶的活性中心靠近的趋势，最终结合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效浓度大大增加的效应叫做 邻近效应。
定向效应,当专一性底物向酶活性中心靠近时，
会诱导酶分子构象发生改变,使酶活性中心的相关基团和底物的反应基团正确定向排列,同时使反应基团之间的分子轨道以正确方向严格定位，
使酶促反应易于进行。以上两种效应使酶具有高效率和专一性特点。
（ 二 ） 邻近效应 （ proximity effect） 和定向效应 （ orientation effect）
（三）酶使底物分子中的敏感键发生变形（ distortion）
酶 -底复合物形成时，酶分子构象发生变化，底物分子也常常受到酶的作用而发生变化，甚至使底物分子发生扭曲变形，
从而使底物分子某些键的键能减弱，产生键扭曲，有助于过度态的中间产物形成,从而降低了反应的活化能。（ P276）
（四） 多功能催化作用
酶的活性中心部位，一般都含有多个起催化作用的基团，这些基团在空间有特殊的排列和取向，可以对底物价键的形变和极化及调整底物基团的位置等起到协同作用，
从而使底物达到最佳反应状态 。
1,酸－碱催化 (acid base catalysis)
酸 -碱催化可分为狭义的酸 -碱催化和广义的酸 -碱催化。酶参与的酸 -碱催化反应一般都是广义的酸－碱催化方式。
广义酸－碱催化是指通过质子酸提供部分质子,或是通过质子碱接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的过程 。
按酶催化反应的机制分类
广义酸基团 广义碱基团
（质子供体） （质子受体）
- C O O H,- N H 3,- S H,
+
OH NH N H
+
- C O O,- N H 2,- S,
-,,-
O
-
N HN:
酶分子中可以作为广义酸、碱的基团
His 是酶的酸碱催化作用中 最活泼 的一个催化功能团。 (pK=6) 半寿期小于 10?10秒
2,共价催化 （ covalent catalysis）
催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为 共价催化 。
酶中参与共价催化的基团主要包括以下 亲核基团：
His 的咪唑基,Cys 的硫基,Asp 的羧基,Ser
的羟基等； 亲电子基团,H+,Mg2+,Mn2+,Fe3+
某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。
１,需要金属的酶分类：
（ 1）金属酶－ metalloenzyme:含紧密结合的金属离子。
如 Fe2+,Fe3+,Cu2+,Zn2+,Mn2+
（ 2） 金属 -激活酶（ metal-activated enzyme）,含松散结合的金属离子，如 Na+ K+ Mg2+ Ca2+
2.金属离子的催化作用,
许多氧化 -还原酶中都含有铜或铁离子，它们作为酶的辅助因子起着传递电子的功能。
许多激酶的底物为 ATP-Mg2+复合物。
金属离子通过水的离子化促进亲核催化。
(五 ) 金属离子的催化作用酶活性中心处于一个非极性环境中，
从而有利于同底物的结合。
（ 水的极性和形成氢键的能力都较强，
能够减弱极性基团间的相互作用。 ）
（六）微环境的影响 （酶活性中心是低介电区域）
四、胰凝乳蛋白酶 （ chymotrypsin） 的作用机理三条肽链的折叠酶活性中心的ＡＡ
残基：
Asp102
His57
Ser195
胰凝乳蛋白酶 （ chymotrypsin）
EC3.4.4.5 的活性中心
Asp102-His57-Ser195
功能：在动物小肠中催化蛋白质的水解氢键体系 -电荷中继网胰凝乳蛋白酶 （ chymotrypsin）
的活性中心
Asp102-His57-Ser195
除了胰凝乳蛋白酶外，在催化中具有,天冬氨酸 -组氨酸 -丝氨酸,电荷中继网 的酶还有：
胰蛋白酶、弹性蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶
研究表明：来自胰脏的三种酶如 胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶 有其相似的空间构象，相似的催化机理，并且活性中心处 Ser周围的 AA顺序也完全一样,Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro
但三者却表现出专一性上的很大差异,X-射线衍射技术研究表明主要由于底物结合部位在结构上的微小差异所致。 （ P288）
（一）基本概念,酶的活性中心是指结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。酶的活性中心包括两个功能部位,结合部位和催化部位。
1．结合部位（ Binding site）
酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。此部位决定酶的专一性。
2．催化部位（ catalytic site ）
酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位 。 此部位决定酶所催化反应的性质。
（必需基团、非必需基团）
一,酶的活性中心
必需基团,酶分子中有些基团若经化学修饰
（氧化、还原、酰化、烷化）使其改变，
则酶的活性丧失，这些基团称为 必需基团。
非必需基团,有的酶温和水解掉几个 AA残基，仍能表现活性，这些基团即 非必需基团。
（二）酶活性中心的结构特点
1.活性中心只占酶分子总体积的很小一部分，往往只占整个酶分子体积的 1%-2%。
某些酶活性部位的 AA残基酶 AA残基数 活性部位的 AA残基核糖核酸酶 124 His12,His119,Lys41
溶菌酶 129 Asp52,Glu35
胰凝乳蛋白酶 241 His57,Asp102,Ser195
胃蛋白酶 348 Asp32,Asp215
木瓜蛋白酶 212 Cys25,His159
羧肽酶 A 307 Arg127,Glu270,Tyr248,Zn2+
2,酶的活性部位是一个三维实体,具有三维空间结构 。
活性中心的空间构象不是刚性的，在与底物接触时表现出一定的柔性和运动性。（邹承鲁研究酶变性的工作）
3,酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补的，而是在酶和底物的结合过程中，底物分子或酶分子、有时是两者的构象同时发生了一定的变化后才互补的，此时催化基团的位置正好处在所催化底物键的断裂和即将生成键的适当位置，这个动态辨认过程称为诱导契合（ induced-fit）,
4,酶的 活性部位位于酶分子表面的一个裂隙（ crevice）
内,裂隙内是一个相当疏水的环境，从而有利于同底物的结合。
5,底物靠许多弱的键力与酶结合。
（二）酶活性中心的结构特点
（三）判断和确定酶活性中心的主要方法
酶的专一性研究,研究酶的专一性底物的结构特点、酶的竞争性抑制剂结构特点等。
酶分子侧链基团的化学修饰法：例如 1.
用共价修饰的试剂作用于酶，查明保持酶活力的必需基团； 2.亲和标记（合成底物类似物）； 3.— SH保护剂的使用；
X- 射线晶体衍射法：
定点诱变法
用共价修饰的试剂作用于酶，查明保持酶活力的必需基团
DFP
的作用二异丙基氟磷酸牛胰蛋白酶二,酶作用专一性的机制
锁钥学说 （ 1894年 Emil Fischer） — lock and key或 模板学说 （ temolate）,认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。
酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样。
（ 酶的多底物现象、酶对正反方向的催化,相对专一性 ）
诱导契合学说 （ 1958年 D.Koshland)_induced fit,该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状,从而有利于底物的结合。 概括其要点：四个方面诱导契合学说的要点
A,酶有其原来的形状，不一定一开始就是底物的模板
B,底物能诱导酶蛋白的形状发生一定变化（专一性结合）
C,当酶的形状发生变化后，就使得其中的催化基团形成正确的排列。
D,在酶反应过程中，酶活性中心构象的变化是可逆的。即酶与底物结合时，产生一种诱导构象，
反应结束时，产物从酶表面脱落，酶又恢复其原来的构象。
（一）降低反应的活化能（ activation energy）
活化能,在一定温度下一摩尔底物全部进入活化态所需要的自由能，单位是 KJ/mol.
（ 增加温度、加入催化剂降低反应活化能）
酶促反应,E + S === ES === ES*? EP
E + P
非酶促反应：
三、酶作用高效率的机制
催化剂的作用是降低反应活化能,从而起到提高反应速度的作用反应过程中能的变化
Fe非酶促反应酶促反应 非酶促反应自由能能反应进程底物产物
ES
ES*
EP
实例,H2O2的分解无催化剂时活化能为
75.24 KJ/mol;
铂为催化剂时 48.9;
H2O2酶为催化剂 8.36
三、酶作用高效率的机制
（一）降低反应的活化能（ activation energy）
中间产物学说
在酶催化的反应中，第一步是酶与底物形成酶－底物中间复合物。当底物分子在酶作用下发生化学变化后，
中间复合物再分解成产物和酶。
E + S ==== E-S P + E
许多实验事实证明了 E－ S复合物的存在。 E－ S复合物形成的速率与酶和底物的性质有关。
（电子显微镜的观察结果,X-射线晶体结构分析、
酶与底物反应前后光谱特性分析、酶的溶解度变化、酶与底物的共沉降，获得 ES复合物结晶）
在酶促反应中，由于酶和底物分子之间的亲和性，
底物分子有向酶的活性中心靠近的趋势，最终结合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效浓度大大增加的效应叫做 邻近效应。
定向效应,当专一性底物向酶活性中心靠近时，
会诱导酶分子构象发生改变,使酶活性中心的相关基团和底物的反应基团正确定向排列,同时使反应基团之间的分子轨道以正确方向严格定位，
使酶促反应易于进行。以上两种效应使酶具有高效率和专一性特点。
（ 二 ） 邻近效应 （ proximity effect） 和定向效应 （ orientation effect）
（三）酶使底物分子中的敏感键发生变形（ distortion）
酶 -底复合物形成时，酶分子构象发生变化，底物分子也常常受到酶的作用而发生变化，甚至使底物分子发生扭曲变形，
从而使底物分子某些键的键能减弱，产生键扭曲，有助于过度态的中间产物形成,从而降低了反应的活化能。（ P276）
（四） 多功能催化作用
酶的活性中心部位，一般都含有多个起催化作用的基团，这些基团在空间有特殊的排列和取向，可以对底物价键的形变和极化及调整底物基团的位置等起到协同作用，
从而使底物达到最佳反应状态 。
1,酸－碱催化 (acid base catalysis)
酸 -碱催化可分为狭义的酸 -碱催化和广义的酸 -碱催化。酶参与的酸 -碱催化反应一般都是广义的酸－碱催化方式。
广义酸－碱催化是指通过质子酸提供部分质子,或是通过质子碱接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的过程 。
按酶催化反应的机制分类
广义酸基团 广义碱基团
（质子供体） （质子受体）
- C O O H,- N H 3,- S H,
+
OH NH N H
+
- C O O,- N H 2,- S,
-,,-
O
-
N HN:
酶分子中可以作为广义酸、碱的基团
His 是酶的酸碱催化作用中 最活泼 的一个催化功能团。 (pK=6) 半寿期小于 10?10秒
2,共价催化 （ covalent catalysis）
催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为 共价催化 。
酶中参与共价催化的基团主要包括以下 亲核基团：
His 的咪唑基,Cys 的硫基,Asp 的羧基,Ser
的羟基等； 亲电子基团,H+,Mg2+,Mn2+,Fe3+
某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。
１,需要金属的酶分类：
（ 1）金属酶－ metalloenzyme:含紧密结合的金属离子。
如 Fe2+,Fe3+,Cu2+,Zn2+,Mn2+
（ 2） 金属 -激活酶（ metal-activated enzyme）,含松散结合的金属离子，如 Na+ K+ Mg2+ Ca2+
2.金属离子的催化作用,
许多氧化 -还原酶中都含有铜或铁离子，它们作为酶的辅助因子起着传递电子的功能。
许多激酶的底物为 ATP-Mg2+复合物。
金属离子通过水的离子化促进亲核催化。
(五 ) 金属离子的催化作用酶活性中心处于一个非极性环境中，
从而有利于同底物的结合。
（ 水的极性和形成氢键的能力都较强，
能够减弱极性基团间的相互作用。 ）
（六）微环境的影响 （酶活性中心是低介电区域）
四、胰凝乳蛋白酶 （ chymotrypsin） 的作用机理三条肽链的折叠酶活性中心的ＡＡ
残基：
Asp102
His57
Ser195
胰凝乳蛋白酶 （ chymotrypsin）
EC3.4.4.5 的活性中心
Asp102-His57-Ser195
功能：在动物小肠中催化蛋白质的水解氢键体系 -电荷中继网胰凝乳蛋白酶 （ chymotrypsin）
的活性中心
Asp102-His57-Ser195
除了胰凝乳蛋白酶外，在催化中具有,天冬氨酸 -组氨酸 -丝氨酸,电荷中继网 的酶还有：
胰蛋白酶、弹性蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶
研究表明：来自胰脏的三种酶如 胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶 有其相似的空间构象，相似的催化机理，并且活性中心处 Ser周围的 AA顺序也完全一样,Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro
但三者却表现出专一性上的很大差异,X-射线衍射技术研究表明主要由于底物结合部位在结构上的微小差异所致。 （ P288）
