特殊毒性试验
?致突变试验
?致 畸 试 验
?致 癌 试 验
目的意义
? 研究对遗传物质是否有损伤, 是
否会引起肿瘤, 衰老及畸胎等
? 特殊毒性试验存在着种属差异性
? 定性差异
? 定量差异
定性差异
? 反应停对家兔和７种灵长类动物致畸，但至少
对 10种品系大鼠,15种品系小鼠,2种家狗、３
种田鼠和８种灵长类动物不致畸
? 可的松对兔子和小鼠强力致畸，但对大鼠不致
畸
? 硫唑嘌呤对大鼠不致畸，但对兔子强致畸
? 氨磺丁脲引起大鼠、小鼠眼畸形，但对兔子却
引起脸和内脏畸形
定量差异
? 致畸剂量在人与动物、动物与动物间差异明显
表 人类与动物致畸剂量比较
药物 最低致畸剂量（ /kg/d) 人与动物比值
人 动 物
反应停 0.5-1.0mg 兔 2.5mg 5-2.5
氨基喋呤 50μg 大鼠 100μg 2
氨甲喋呤 42μg 大鼠 200μg 4.8
乙烯雌酚 20-80μg 恒河猴 200μg 10-2.5
苯妥英钠 2mg 小鼠 50mg 25
致突变试验
? 微生物回复试验 (Ames试验）
? +哺乳动物培养细胞基因突变试验
? +果蝇伴性隐性致死试验
? 染色体畸变试验
? +啮齿动物显性致死试验
? +精原细胞染色体畸变试验
? 动物微核试验
? +程序外 DNA合成 (UDS)试验
? +SOS显色试验
微生物回复试验
? 菌株, 组 胺 酸 缺 陷 型 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌
(S.Typhimurium),采用 TA98,100,97,102,检定
符合要求,-80℃ 或液氮冻存备用
? 剂量：由药物对细菌的毒性和溶解度决定
? 最高剂量,a.一般 5mg／皿, b.最高溶解度,
c.根据杀菌情况确定最大浓度
? 最低剂量：一般 1μg／皿或 0.1μg／皿 。
? 剂量级,5个以上
微生物回复试验
? 代谢活化：加肝脏微粒体酶 (S9)和不加 S9平行条
件下测试
? 对照：阴性, 阳性对照和 S9对照
? 方法：标准平板法或预培养法, 48h观察结果, 如
菌落太小, 可继续培养并延长到 72h观察结果 。 每
一浓度至少三皿, 实验至少重复一次
? 结果判定,① 受试物所诱发的回变菌落数 (ｘ ± ｓ )
增加, 超过对照 2倍, 量 --效关系； ② 某测试点超
过对照 2倍以上, 呈现可重复的并有统计学意义的
增加 。 符合上述任何一条即可判为阳性
微生物回复试验
? 如某些药物有明显杀菌作用, 可改用哺乳动物细
胞基因突变试验
? 如某些阳性或可疑阳性时, 可选择哺乳动物培养
细胞基因突变试验或果蝇伴性隐性致死试验
哺乳动物培养细胞染色体畸变试验
? 细胞, 建议首选中国仓鼠肺细胞 (CHL),需定期
检查核型和有无支原体等污染 。 -80℃ 或液氮
冻存
? 剂量：高剂量以 50％ 细胞生长抑制浓度为基准,
最高不要超过 10mM分子量 。 溶解受限时可采
用饱和浓度 。 中低剂量用倍量稀释法 。 至少３
个剂量
? 代谢活化：应用诱导剂处理后的哺乳动物肝微
粒体酶 （ S9） 进行体外代谢活化试验
哺乳动物培养细胞染色体畸变试验
? 药物作用时间, 药物和细胞接触非活化组作
用 24h和 48h收获细胞,代谢活化组作用 6小时
以上
? 标本制作时间：药物和细胞接触后起算, 分
别在 24h和 48h收获细胞
? 对照：空白, 溶剂, 阳性和Ｓ９对照
? 镜检：每种浓度至少观察 100个中期分裂相，
在油镜下分别记录染色体的结构畸变，多倍
体以及畸变细胞数和畸变类型
哺乳动物培养细胞染色体畸变试验
? 受试物所诱发的染色体畸变数的增加与剂量
相关 ; CHL系统判定如下,
? 畸变率 < 5% 阴性 (-)
? 畸变率 > 5% 可疑 (± )
? 畸变率 >10% 阳性 (+)
? 畸变率 >20% 阳性 (++)
? 畸变率 >50% 阳性 (+++)
? 注意：遇阳性或可疑阳性时, 可选啮齿动物
显性致死试验或精原细胞染色体畸变试验
啮齿动物微核试验
? 动物：首选ＮＩＨ小鼠, 每组１０只性成熟小
鼠, 雌雄各半, 或至少６只性成熟雄性小鼠
? 给药途径与方法：尽可能和临床拟用途径相同,
一般为单次给药或诱导给药, 必要时可多次给
药
? 骨髓采样时间：通过预试, 在 12-72h不同时间
内, 取 5个作用点, 找出合适采样时间, 如无差
别一般采用 24h采样
? 剂量,≥3个, 最高剂量 1/2 LD50
? 对照组：用溶媒作阴性对照, 用已知能诱发微
核增加的物质作阳性对照
啮齿动物微核试验
? 标本制作：取骨髓, 涂片, Giemsa或丫啶橙荧光
染色
? 镜检：每只动物至少计数 1000个多染红细胞,
Giemsa染色, 观察其微核出现的频度及多染红细
胞和正常红细胞的比率 。 丫啶橙荧光染色, 则直
接观察微核出现的频度
? 判定：
? 1.受试物所诱发的微核率的增加与剂量相关
? 2.某一测试点微核增加可重复并有统计学意义
? 符合上述一条即可判为阳性
啮齿动物微核试验
? 注意：
? 1.对 Giemsa染色中获得可疑阳性或弱阳性结果
的药物, 必须用荧光染色以进一步肯定或否定
阳性结果
? 2.不易通过骨髓屏障的药物, 可补充用哺乳动
物胎肝细胞微核试验进一步研究
? 3.如遇阳性或可疑阳性时, 可选择 UDS试验或
SOS显色试验
生殖毒性试验
? 一般生殖毒性试验
? 致畸敏感期毒性试验
? 围产期毒性试验
生殖毒性试验 ----致畸敏感期毒性试验
? 动物：首选 Wistar 或 SD大鼠, 也可用小鼠或家兔
Ｉ类最好增加家兔或猪, 猴, 狗之一
? 动物数：每组孕大, 小鼠 ≥１５只, 孕兔 ≥８只
? 剂量：高, 中, 低三个剂量, 限度剂量为 1g/kg。
高剂量产生母体毒性, 或为最大给药量 。 摄食量
减少, 体重增加缓慢或下降,阴道流血, 流产等均
是毒性反应表现 。 低剂量无母体和胚胎毒性
? 给药途径：同推荐临床给药途径, 但不宜采用腹
腔注射, 口服制剂除灌胃外, 还可在严格测定其
消耗量的前提下自由摄取或拌入饲料
生殖毒性试验 ----致畸敏感期毒性试验
? 给药时期：于胚胎器官形成期连续给药, 大鼠孕
后 6-15天, 小鼠 6-15天, 家兔 6-18天
? 对照：必须设溶剂对照 。 必要时设阳性对照
? 观察和检查：查到精子或阴栓作为妊娠零天, 记
录实验动物症状, 大鼠于 0,3,7,10,13,16、
20天称量体重, ２０天处死, 记录孕鼠重, 黄体
数, 死胎数 （ 着床数, 吸收胎, 早期死胎, 晚期
死胎 ）, 活胎数, 活胎重, 性别, 外观异常等 。
约 1/2胎仔固定于 Bouin氏液, 作内脏检查, 另 1/2
固定于 95%洒精作骨骼畸形检查
生殖毒性试验 ----致畸敏感期毒性试验
? 报告：将数据列成表, 提供药物对孕期和胚胎的
影响, 包括孕鼠数及体重变化, 黄体总数及均数,
活胎总数及均数, 活胎重, 性别, 死胎总数及着
床数, 吸收胎, 早期和晚期死胎等；药物对胎仔
各器官的影响, 包括在外观和内部检查中发现的
各种畸形；药物对胎仔骨骼发育的影响, 包括头
颅骨, 胸骨, 前, 后肢骨和其它骨骼的骨化程度,
变异和畸形等
? 判定：各项数据经统计处理后判定药物的胚胎毒
性和致畸潜力
致癌试验
? 短期 致癌试验
? 哺乳动物培养细胞恶性转化试验
? 小鼠肺肿瘤诱发短期试验
? 长期致癌试验
致癌试验
哺乳动物培养细胞恶性转化试验 (短期 )
? 剂量,≥3组, 高剂量一般以抑制 50%集落生长浓
度为基准
? 药物接触时间：药品一般和细胞接触 24h,然后再
培养 7-14天
? 代谢活化：应说明外源性代谢活化系统
? 对照：空白, 溶媒, 阴性和阳性对照
? 观察报告：将细胞固定, 染色, 分别计算每皿集
落数, 转化集落数, 转化频度＝转化集落数 /106
存活细胞, 转化率＝转化集落数 /总集落数
致癌试验
哺乳动物培养细胞恶性转化试验 (短期 )
? 判定,1.有明确量效关系； 2.若无量效关系, 但在
≥２个浓度中发生细胞转化； 3.在单一剂量下出现
≥３个转化集落时
? 符合上述一条件者可判为阳性，否则为阴性。如
判定有困难时，应进一步对细胞进行核型分析，
软琼脂接种等观察判定，必要时可做动物接种生
瘤试验
长期致癌试验
? 动物：幼年小, 大鼠, ♀♂ 各半 。 每组１００只
? 剂量,≥３个, 低剂量１ -３ ACD,其余剂量可根
据药理毒理作用等因素综合考虑
? 对照：空白, 溶媒或赋形剂对照 。
? 实验期限：大鼠２年, 小鼠 1,5年 。
? 给药途径：同临床拟用途径
? 观察与检查：观察记录一般情况, 肉眼观察到肿
瘤病变时, 取各器官系统做病检
? 评定：根据各组肿瘤发生率、潜伏期和多发性等
做出全面的科学评价
有关问题
? 特殊毒性研究必须加强
? 简, 快, 灵, 准
? 正确理解审批办法对特殊毒理学研究要
求
? 规定一, 二类新药必需完成特殊毒理
学研究
? 致突变试验必须做 Ames‘试验, 染色
体畸变试验和微核试验
有关问题
? 生殖毒性试验
? 致畸敏感期试验 (-),?一般生殖毒性 (x), 围产期生
殖毒性试验 (x)
? 避孕药, 性激素和致突变试验阳性或有细胞毒作用
新药才报送
? 致癌试验
? 受试品或其代谢产物与已知致癌物结构相似
? 受试品长期毒性试验中发现有细胞毒作用或某些脏
器, 组织细胞异常显著活跃
? 受试品致突变试验结果为阳性
? 报送致癌试验资料, 先做短期, 阴性者不必做长期
有关问题
? 受试物配制
? 样品难溶于水或其它溶剂, 不能注射给药时, 可改为
灌胃 。 口服给药尽量研磨均匀, 必要时制成混悬液 。
对细菌或细胞试验时, 则可以将样品充分研磨均匀,
用水或其它合适的溶剂充分浸取灭菌后使用 。
? 剂量设计
? 剂量设计与急性毒性的 LD50值有关。但少数低毒西药
和许多基因工程产品，往往测不出 LD50值，只能测
MTD；也有少数药品制备困难和价格昂贵，此时允许
用多少倍 ACD或 MTD来表示。细胞染色体畸变试验，
毒性很低不能测出 50%细胞生长抑制浓度时，其最高浓
度以不超过 10mM为宜
有关问题
? 结果的判定
? 阳性：有统计学意义, 量－效关系, 可重复
? 阴性：结合是否达到 MTD,有无阳性对照
? 阳性物对照组不可省
? 其它问题
? 实验设计：剂量，对照组、观察指标、统计方
法、给药周期、给药途径、结果判定应合理
? 资料整理应规范
?致突变试验
?致 畸 试 验
?致 癌 试 验
目的意义
? 研究对遗传物质是否有损伤, 是
否会引起肿瘤, 衰老及畸胎等
? 特殊毒性试验存在着种属差异性
? 定性差异
? 定量差异
定性差异
? 反应停对家兔和７种灵长类动物致畸，但至少
对 10种品系大鼠,15种品系小鼠,2种家狗、３
种田鼠和８种灵长类动物不致畸
? 可的松对兔子和小鼠强力致畸，但对大鼠不致
畸
? 硫唑嘌呤对大鼠不致畸，但对兔子强致畸
? 氨磺丁脲引起大鼠、小鼠眼畸形，但对兔子却
引起脸和内脏畸形
定量差异
? 致畸剂量在人与动物、动物与动物间差异明显
表 人类与动物致畸剂量比较
药物 最低致畸剂量（ /kg/d) 人与动物比值
人 动 物
反应停 0.5-1.0mg 兔 2.5mg 5-2.5
氨基喋呤 50μg 大鼠 100μg 2
氨甲喋呤 42μg 大鼠 200μg 4.8
乙烯雌酚 20-80μg 恒河猴 200μg 10-2.5
苯妥英钠 2mg 小鼠 50mg 25
致突变试验
? 微生物回复试验 (Ames试验）
? +哺乳动物培养细胞基因突变试验
? +果蝇伴性隐性致死试验
? 染色体畸变试验
? +啮齿动物显性致死试验
? +精原细胞染色体畸变试验
? 动物微核试验
? +程序外 DNA合成 (UDS)试验
? +SOS显色试验
微生物回复试验
? 菌株, 组 胺 酸 缺 陷 型 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌
(S.Typhimurium),采用 TA98,100,97,102,检定
符合要求,-80℃ 或液氮冻存备用
? 剂量：由药物对细菌的毒性和溶解度决定
? 最高剂量,a.一般 5mg／皿, b.最高溶解度,
c.根据杀菌情况确定最大浓度
? 最低剂量：一般 1μg／皿或 0.1μg／皿 。
? 剂量级,5个以上
微生物回复试验
? 代谢活化：加肝脏微粒体酶 (S9)和不加 S9平行条
件下测试
? 对照：阴性, 阳性对照和 S9对照
? 方法：标准平板法或预培养法, 48h观察结果, 如
菌落太小, 可继续培养并延长到 72h观察结果 。 每
一浓度至少三皿, 实验至少重复一次
? 结果判定,① 受试物所诱发的回变菌落数 (ｘ ± ｓ )
增加, 超过对照 2倍, 量 --效关系； ② 某测试点超
过对照 2倍以上, 呈现可重复的并有统计学意义的
增加 。 符合上述任何一条即可判为阳性
微生物回复试验
? 如某些药物有明显杀菌作用, 可改用哺乳动物细
胞基因突变试验
? 如某些阳性或可疑阳性时, 可选择哺乳动物培养
细胞基因突变试验或果蝇伴性隐性致死试验
哺乳动物培养细胞染色体畸变试验
? 细胞, 建议首选中国仓鼠肺细胞 (CHL),需定期
检查核型和有无支原体等污染 。 -80℃ 或液氮
冻存
? 剂量：高剂量以 50％ 细胞生长抑制浓度为基准,
最高不要超过 10mM分子量 。 溶解受限时可采
用饱和浓度 。 中低剂量用倍量稀释法 。 至少３
个剂量
? 代谢活化：应用诱导剂处理后的哺乳动物肝微
粒体酶 （ S9） 进行体外代谢活化试验
哺乳动物培养细胞染色体畸变试验
? 药物作用时间, 药物和细胞接触非活化组作
用 24h和 48h收获细胞,代谢活化组作用 6小时
以上
? 标本制作时间：药物和细胞接触后起算, 分
别在 24h和 48h收获细胞
? 对照：空白, 溶剂, 阳性和Ｓ９对照
? 镜检：每种浓度至少观察 100个中期分裂相，
在油镜下分别记录染色体的结构畸变，多倍
体以及畸变细胞数和畸变类型
哺乳动物培养细胞染色体畸变试验
? 受试物所诱发的染色体畸变数的增加与剂量
相关 ; CHL系统判定如下,
? 畸变率 < 5% 阴性 (-)
? 畸变率 > 5% 可疑 (± )
? 畸变率 >10% 阳性 (+)
? 畸变率 >20% 阳性 (++)
? 畸变率 >50% 阳性 (+++)
? 注意：遇阳性或可疑阳性时, 可选啮齿动物
显性致死试验或精原细胞染色体畸变试验
啮齿动物微核试验
? 动物：首选ＮＩＨ小鼠, 每组１０只性成熟小
鼠, 雌雄各半, 或至少６只性成熟雄性小鼠
? 给药途径与方法：尽可能和临床拟用途径相同,
一般为单次给药或诱导给药, 必要时可多次给
药
? 骨髓采样时间：通过预试, 在 12-72h不同时间
内, 取 5个作用点, 找出合适采样时间, 如无差
别一般采用 24h采样
? 剂量,≥3个, 最高剂量 1/2 LD50
? 对照组：用溶媒作阴性对照, 用已知能诱发微
核增加的物质作阳性对照
啮齿动物微核试验
? 标本制作：取骨髓, 涂片, Giemsa或丫啶橙荧光
染色
? 镜检：每只动物至少计数 1000个多染红细胞,
Giemsa染色, 观察其微核出现的频度及多染红细
胞和正常红细胞的比率 。 丫啶橙荧光染色, 则直
接观察微核出现的频度
? 判定：
? 1.受试物所诱发的微核率的增加与剂量相关
? 2.某一测试点微核增加可重复并有统计学意义
? 符合上述一条即可判为阳性
啮齿动物微核试验
? 注意：
? 1.对 Giemsa染色中获得可疑阳性或弱阳性结果
的药物, 必须用荧光染色以进一步肯定或否定
阳性结果
? 2.不易通过骨髓屏障的药物, 可补充用哺乳动
物胎肝细胞微核试验进一步研究
? 3.如遇阳性或可疑阳性时, 可选择 UDS试验或
SOS显色试验
生殖毒性试验
? 一般生殖毒性试验
? 致畸敏感期毒性试验
? 围产期毒性试验
生殖毒性试验 ----致畸敏感期毒性试验
? 动物：首选 Wistar 或 SD大鼠, 也可用小鼠或家兔
Ｉ类最好增加家兔或猪, 猴, 狗之一
? 动物数：每组孕大, 小鼠 ≥１５只, 孕兔 ≥８只
? 剂量：高, 中, 低三个剂量, 限度剂量为 1g/kg。
高剂量产生母体毒性, 或为最大给药量 。 摄食量
减少, 体重增加缓慢或下降,阴道流血, 流产等均
是毒性反应表现 。 低剂量无母体和胚胎毒性
? 给药途径：同推荐临床给药途径, 但不宜采用腹
腔注射, 口服制剂除灌胃外, 还可在严格测定其
消耗量的前提下自由摄取或拌入饲料
生殖毒性试验 ----致畸敏感期毒性试验
? 给药时期：于胚胎器官形成期连续给药, 大鼠孕
后 6-15天, 小鼠 6-15天, 家兔 6-18天
? 对照：必须设溶剂对照 。 必要时设阳性对照
? 观察和检查：查到精子或阴栓作为妊娠零天, 记
录实验动物症状, 大鼠于 0,3,7,10,13,16、
20天称量体重, ２０天处死, 记录孕鼠重, 黄体
数, 死胎数 （ 着床数, 吸收胎, 早期死胎, 晚期
死胎 ）, 活胎数, 活胎重, 性别, 外观异常等 。
约 1/2胎仔固定于 Bouin氏液, 作内脏检查, 另 1/2
固定于 95%洒精作骨骼畸形检查
生殖毒性试验 ----致畸敏感期毒性试验
? 报告：将数据列成表, 提供药物对孕期和胚胎的
影响, 包括孕鼠数及体重变化, 黄体总数及均数,
活胎总数及均数, 活胎重, 性别, 死胎总数及着
床数, 吸收胎, 早期和晚期死胎等；药物对胎仔
各器官的影响, 包括在外观和内部检查中发现的
各种畸形；药物对胎仔骨骼发育的影响, 包括头
颅骨, 胸骨, 前, 后肢骨和其它骨骼的骨化程度,
变异和畸形等
? 判定：各项数据经统计处理后判定药物的胚胎毒
性和致畸潜力
致癌试验
? 短期 致癌试验
? 哺乳动物培养细胞恶性转化试验
? 小鼠肺肿瘤诱发短期试验
? 长期致癌试验
致癌试验
哺乳动物培养细胞恶性转化试验 (短期 )
? 剂量,≥3组, 高剂量一般以抑制 50%集落生长浓
度为基准
? 药物接触时间：药品一般和细胞接触 24h,然后再
培养 7-14天
? 代谢活化：应说明外源性代谢活化系统
? 对照：空白, 溶媒, 阴性和阳性对照
? 观察报告：将细胞固定, 染色, 分别计算每皿集
落数, 转化集落数, 转化频度＝转化集落数 /106
存活细胞, 转化率＝转化集落数 /总集落数
致癌试验
哺乳动物培养细胞恶性转化试验 (短期 )
? 判定,1.有明确量效关系； 2.若无量效关系, 但在
≥２个浓度中发生细胞转化； 3.在单一剂量下出现
≥３个转化集落时
? 符合上述一条件者可判为阳性，否则为阴性。如
判定有困难时，应进一步对细胞进行核型分析，
软琼脂接种等观察判定，必要时可做动物接种生
瘤试验
长期致癌试验
? 动物：幼年小, 大鼠, ♀♂ 各半 。 每组１００只
? 剂量,≥３个, 低剂量１ -３ ACD,其余剂量可根
据药理毒理作用等因素综合考虑
? 对照：空白, 溶媒或赋形剂对照 。
? 实验期限：大鼠２年, 小鼠 1,5年 。
? 给药途径：同临床拟用途径
? 观察与检查：观察记录一般情况, 肉眼观察到肿
瘤病变时, 取各器官系统做病检
? 评定：根据各组肿瘤发生率、潜伏期和多发性等
做出全面的科学评价
有关问题
? 特殊毒性研究必须加强
? 简, 快, 灵, 准
? 正确理解审批办法对特殊毒理学研究要
求
? 规定一, 二类新药必需完成特殊毒理
学研究
? 致突变试验必须做 Ames‘试验, 染色
体畸变试验和微核试验
有关问题
? 生殖毒性试验
? 致畸敏感期试验 (-),?一般生殖毒性 (x), 围产期生
殖毒性试验 (x)
? 避孕药, 性激素和致突变试验阳性或有细胞毒作用
新药才报送
? 致癌试验
? 受试品或其代谢产物与已知致癌物结构相似
? 受试品长期毒性试验中发现有细胞毒作用或某些脏
器, 组织细胞异常显著活跃
? 受试品致突变试验结果为阳性
? 报送致癌试验资料, 先做短期, 阴性者不必做长期
有关问题
? 受试物配制
? 样品难溶于水或其它溶剂, 不能注射给药时, 可改为
灌胃 。 口服给药尽量研磨均匀, 必要时制成混悬液 。
对细菌或细胞试验时, 则可以将样品充分研磨均匀,
用水或其它合适的溶剂充分浸取灭菌后使用 。
? 剂量设计
? 剂量设计与急性毒性的 LD50值有关。但少数低毒西药
和许多基因工程产品，往往测不出 LD50值，只能测
MTD；也有少数药品制备困难和价格昂贵，此时允许
用多少倍 ACD或 MTD来表示。细胞染色体畸变试验，
毒性很低不能测出 50%细胞生长抑制浓度时，其最高浓
度以不超过 10mM为宜
有关问题
? 结果的判定
? 阳性：有统计学意义, 量－效关系, 可重复
? 阴性：结合是否达到 MTD,有无阳性对照
? 阳性物对照组不可省
? 其它问题
? 实验设计：剂量，对照组、观察指标、统计方
法、给药周期、给药途径、结果判定应合理
? 资料整理应规范
