第六章
微生物的生长及其控制
第一节 微生物生长的测定
第二节 微生物的生长规律
第三节 影响微生物生长的主要因素
第四节 微生物培养法概论
第五节 微生物生长的控制
第一节 微生物生长的测定
一,微生物的纯培养
二,微生物生长的测定
（一）微生物细胞数目的测定
（二）微生物生长量的测定
（三）丝状微生物菌丝长度的测定
一、微生物的纯培养
微生物在自然界中不仅分布很广, 而且都是
混杂地生活在一起 。 要想研究或利用某一微
生物, 必须把混杂的微生物类群分离开来,
以得到只含一种微生物的培养 。 微生物学中
将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群
繁殖得到的后代称为纯培养 。 纯培养的分离,
是研究和利用微生物的第一步, 是微生物工
作中最重要的环节之一 。 最常用的方法有稀
释平板法, 划线法, 单细胞挑取法及利用选
择培养基分离法等 。
纯培养的分离方法
稀释倒平板法
划线法
选择培养基分离法
单细胞挑取法
稀释倒平板法
（ 倾注法（混菌法）、涂布法 ） 这是最常用的纯种分离法, 先将待分离的材
料作一系列的稀释 (如 1,10,1,100,1：
1000,1,10,000…… ),然后分别取不同
稀释液少许, 与已熔化并冷却至 45℃ 的琼脂
培养基相混合, 摇匀后, 倾入灭过菌的培养
皿中, 待琼脂凝固后, 保温培养一定时间即
可出现菌落 。 如果稀释得当, 平皿上就可出
现分散的单个菌落, 这个菌落可能就是由一
个细胞繁殖形成的 。 随后挑取该单个菌落,
或重复以上操作数次, 便可得到纯培养 。
划线法
将已熔化的培养基倒入无菌平皿, 冷却凝固后,
用接种环沾取少许待分离的材料, 在培养基表
面进行平行划线, 扇形划线或其他形式的连续
划线, 微生物将随着划线次数的增加而分散,
经保温培养形成菌落 。 划线开始的部分细菌分
散度小, 形成的菌落往往连在一起 。 由于连续
划线, 微生物逐渐减少, 划到最后, 常可形成
单个孤立的菌落 。 这种单个菌落可能由一个细
胞繁殖而来, 故可获得纯培养 。 用其他工具如
弯形玻璃代替接种环, 在培养基表面涂布, 亦
可得到同样结果 。 此法较为简便 。
单细胞挑取法
这种方法是从待分离的材料中挑取一个细胞
来培养, 从而获得纯培养 。 具体方法是将显
微镜挑取器装臵在显微镜上, 把一滴菌悬液
臵于载玻片上, 用安装在显微镜挑取器上的
极细的毛细吸管, 在显微镜下对准某一个单
独的细胞挑取, 再接种到培养基上培养 。 此
法需要非常熟练的操作人员, 多限于高度专
业化的科学研究中采用 。
利用选择培养基分离法
不同微生物需要不同的营养物质 。 有些微生物生长适
于酸性环境, 有些则适于碱性环境 。 各种微生物对不
同的化学试剂如消毒剂 (酚 ),染料 (结晶紫等 ),抗生
素及其他物质等具有不同的抵抗能力 。 利用这些特性,
便可配制成适合于某种微生物生长而限制其他微生物
生长的各种选择性培养基, 以达到纯种分离的目的 。
另外, 也可以将待分离的样品先进行适当处理, 以消
除不希望分离到的微生物 。 对一些生理类型比较特殊
的微生物, 为了提高分离机率, 往往在涂布分离前先
进行富集培养, 其目的是提供一个特别设计的培养环
境, 以帮助所需的特殊生理类型的微生物的生长, 而
不利于其他类型微生物的生长 。
选择培养基分离法
1.dilute sample
1 ml
9 ml
10 100 1000 104 105 106 107
牛肉膏培养基
土豆培养基
高氏培养基
微生物纯培养分离方法的比较
稀释平板法 既可定性，又可定量，用途广泛
平板划线法 方法简便，多用于分离细菌
单细胞挑取法 局限于高度专业化的科学研究
利用选择培养基法 适用于分离某些生理类型
较特殊的微生物
二、微生物生长的测定
微生物特别是单细胞微生物, 体积很小, 个体的
生长很难测定, 而且也没有什么实际应用价值 。
因此, 在微生物学的研究和应用中, 通常是测定
群体的增加量, 即群体的生长 。
测定不同种类, 不同生长状态微生物的生长情况,
需要选用不同的指标 。 通常对单细胞微生物来说,
既可测定细胞数目, 又可测定生长量；而对多细
胞微生物 (尤其是丝状真菌 ),则常以菌丝生长的
长度等作为生长指标 。
（一）微生物细胞数目的测定
－－适用于单细胞微生物或丝状微生物的孢子
直接计数法 －－总菌计数
1,计数板计数法（常用）
2、比例计数法
间接计数法 －－活菌计数
1,平板菌落计数法
2、液体稀释法
3、厌氧菌菌落计数
其他计数法
1、比浊法
2、膜过滤法
血球计数板
各
种
型
号
的
全
自
动
血
球
计
数
仪
活菌计数的一般步骤
（二）微生物生长量的测定
－－适用于一切微生物
直接法
1、测体积法
2、称重法
间接法
1、含氮量测定法
2,DNA含量测定法
3、其他生理指标法
（三）丝状微生物菌丝长度的测定
培养基表面菌体生长速率测定法
培养料中菌体速率测定法
单个菌丝顶端生长速率测定法
第二节 微生物的生长规律
一、微生物的个体生长和同步生长
二、单细胞微生物的典型生长曲线
三、微生物的连续培养
四、微生物的高密度培养
一、微生物的个体生长和同步生长
微生物在适宜的环境条件下，不断地
吸收营养物质，并按照自己的代谢方
式进行代谢活动，如果同化作用大于
异化作用，则细胞质的量不断增加，
体积得以加大，于是表现为生长。简
单地说，生长就是有机体的细胞组分
与结构在量方面的增加。
同步培养技术,是指设法使某一群体
中的所有个体细胞尽可能都处于同样
细胞生长和分裂周期的一种培养方式。
通过分析此群体在各阶段的生物化学
特性变化，来间接了解单个细胞的相
应变化规律。
同步生长,通过同步培养的手段而使
细胞群体中各个体处于分裂步调一致
的生长状态的一种生长方式。
获得微生物同步生长的方法
选择法
诱导法
同步生长的细胞经过 2~3个分裂周期后会丧失同步性。
离心分离法
过滤分离法
膜洗脱法
控制温度
控制培养基成分
抑制 DNA合成法
选择法
又称机械筛选法，是通过物理学方法从
随机、不同步群体中选择出同步的群体。
此法可在不影响微生物代谢的情况下获
得同步培养物。
若微生物在相同发育阶段大小不一，则
不适宜用此法。
举例：过滤分离法、密度梯度离心法,
膜洗脱（常用）等。
诱导法
诱导因子：不影响微生物生长，可特异性抑制细
胞分裂，消除该抑制后，细胞同时出现分裂。
此法会扰乱细胞的正常代谢
举例,
1、温度调整法；
2、营养条件调整法；
3、抑制 DNA合成法 （代谢抑制剂：）
（ 抑制 DNA合成法是利用代谢抑制剂阻碍 DNA合成相当一
段时间，然后解除其抑制，可达到同步目的。常用的代
谢抑制剂：氨甲蝶呤、羟基尿素,5-氟脱氧尿苷、胸腺
苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷等。 ）
二、单细胞微生物的生长曲线
多数细菌的繁殖速度很快 。 大肠杆菌在适宜的条
件下繁殖 48h,其子代总重可达 2.2× 10 31g,这
是一个巨大的数字 。 然而, 实际情况是不可能的 。
那么, 细菌的群体生长规律到底怎样呢?
将少量单细胞纯培养物接种到一恒定容积的新鲜
液体培养基中, 在适宜的条件下培养, 定时取样
测定细胞含量, 可以看到以下现象：开始有一短
暂时间, 细胞数量并不增加, 随之细胞数目增加
很快, 继而细胞数又趋稳定, 最后逐渐下降 。 如
果以培养时间为横坐标, 以细胞数目的对数或生
长速度为纵坐标作图, 可以得到一条曲线, 称为
生长曲线 。
微生物的典型生长曲线 (growth curve)
总菌数
活菌数
培养时间 /h
Ⅱ,指数期 Ⅲ,稳定期 Ⅳ,衰亡期 Ⅰ,延滞期
细
菌
数
目
（
个/ml
）
对
数 Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅰ
? 根据微生物的 生长速率常数 的不同，可将生长
曲线大致分为四个时期,
（一）延滞期 (lag phase)
延滞期出现的原因
把少数单细胞微生物接种到新鲜的培养
基中培养时，细胞并不立即进行分裂繁殖，
微生物的增殖数为０，这时 细胞需要合成多
种酶，辅酶和某些中间代谢产物，因此要经
历一个调整和适应过程。
延滞期的特点
1、生长速率常数为零；
2、细胞形态变大或增长；
3、细胞内的 RNA含量增高，原生质呈嗜碱性；
4、合成代谢十分活跃；
5、对外界不良环境反应敏感。
影响延滞期长短的因素
1.菌种特性； 2.接种龄； 3.接种量； 4.培养基成分
缩短延滞期的方法
1,接种对数生长期的菌种，采用最适菌龄；
2,加大接种量；
3,用营养丰富的天然培养基等。
（二）指数期 (exponential phase)
指数期的特点
1、活菌数和总菌数接近
2、生长速率常数最大，代时 (generation time,G)最短
3、细胞进行平衡生长，细胞的化学组成及形态,
生理特性比较一致
4、酶系活跃，代谢旺盛
该期的微生物生产中多被用做种子和科学试验材料
x2
x1
t2 t1 培养时间
Lg 细胞数 /ml
t2 - t1
3.322(lgx2-lgx1) 生长速率常数 R=
t2 - t1
3.322(lgx2-lgx1)
代时 G=
指数期生长的数学模型
繁殖代数 n=3.322(lgx2-lgx1)
生长速率常数 R,指细胞每小时的分裂次数。
代时 G,细胞每分裂一次所需的时间。
R=1/G
影响指数期微生物代时长短的因素
菌种
营养成分
营养物浓度
培养温度
生长限制因子, 凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和
菌体产量的某营养物。
（三）稳定期 (stationary phase)
稳定期的特点
1、生长速率常数 R等于零，活菌数达到最高峰,
并保持相对稳定。
2、微生物细胞内代谢物积累达到最高峰。
3、芽孢杆菌这时开始形成芽孢。
4、这是产物（菌体或与菌体生长相平行的代谢
产物）的最佳收获时期。
稳定期到来的原因
1、营养物尤其是生长限制因子的耗尽
2、营养物的比例失调
3、有害代谢产物的积累
4,pH值,Eh值等理化条件不适宜
（四）衰亡期 (decline phase)
衰亡期的特点
1、微生物死亡数大于增殖数，活菌数大大减少,
群体衰落
2、细胞出现多形态,大小不等的畸形,变成衰退型
3、细胞死亡,出现自溶现象。
4、有的微生物在此期合成或释放次生代谢物。
5、芽孢杆菌在此期释放芽孢。
三、微生物的连续培养
将微生物臵于一定容积的培养基中, 经过培养生
长, 最后一次收获, 此称分批培养 (batch culture)。
通过对细菌纯培养的生长曲线的分析可知, 在分批
培养中, 培养基一次加入, 不予补充, 细菌的对数
生长期不可能长时间维持 。
如果在培养器中不断补充新鲜营养物质, 并及
时不断地以同样速度排出培养物 (包括菌体及代谢产
物 ),理论上讲, 对数生长期就可无限延长 。 这种方
法就叫连续培养法 。 连续培养方法的出现, 不仅可
随时为微生物的研究工作提供一定生理状态的实验
材料, 而且可提高发酵工业的生产效益和自动化水
平 。 此法已成为当前发酵工业的发展方向 。
优点,缩短发酵周期；便于自动控制；产物质量均一
缺点：菌种易退化；易染杂菌
(一 )恒浊连续培养
不断调节流速而使细菌培养液 浊度保持恒
定 的连续培养方法叫恒浊连续培养 。 在恒浊连
续培养中装有浊度计, 借光电池检测培养室中
的浊度 (即菌液浓度 ),并由光电效应产生的电
信号强弱变化, 来自动调节新鲜培养基流入和
培养物流出培养室的流速 。
(二 )恒化连续培养
控制 恒定的流速, 使由于细菌生长而耗去
的营养物及时得到补充, 培养室中营养物浓度
基本恒定, 从而保持细菌的恒定生长速率, 故
称恒化连续培养, 又叫恒组成连续培养 。
装臵 控制对象 培养基 培养液流速 生长速率 产物 应用范围
恒浊器 菌体密度 （内控制）
无限制
生长因
子
不恒定 最高速率
大量菌体
或与菌体
相平行的
代谢产物
生产为主
恒化器 培养液流速 （外控制）
有限制
生长因
子
恒定 低于最高速率
不同生长
速率的菌
体
实验室为
主
恒浊器与恒化器的比较
生长限制因子, 凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和
菌体产量的某营养物。
第三节 影响微生物生长的主要因素
一、温度
二、氧气
三,pH
一、温度
影响微生物生长繁殖的最重要因素之一 。
就总体而言, 微生物生长的温度范围较广,
已知的微生物在 -10～ 95℃ 范围内生长 。 而
对某一具体微生物而言, 只能在一定的温
度范围内生长, 且此温度范围有宽, 有窄 。
生长温度三基点：任何微生物的生长温度
总有 最低生长温度, 最适生长温度, 最高
生长温度 。
温 度 生长速
度
温度 停止生长 致死
最低 最高
最适
? 微生物按其最适生长温度
范围可分为,
嗜冷菌
嗜温菌
嗜热菌
? 最适生长温度,
即某微生物分裂
代时最短或生长速率
最高时的培养温度。
不同微生物的最适生
长温度是不一样的。
应该着重指出：最适
生长温度不一定是一
切代谢活动的最适温
度。
? 嗜冷菌 其生长温度范围在－ 10～ 20℃, 最适生长
温度为 15℃ 或以下, 它们常分布在地球两极地区的水
域和土壤中 。
嗜冷机制,① 酶系在低温下仍能起催化作用
② 细胞膜含较多的不饱和脂肪酸,
在低温下仍具有通透性。
? 嗜温菌 绝大多数微生物属于这一类。最适生长温
度在 20～ 45℃ 之间，最低生长温度 10～ 20℃,最高生
长温度 40～ 45℃ 。它们又可分为室温型（ 25℃ ）和体
温型（ 37℃ ） 。
? 嗜热菌 它们适于在 45～ 50℃ 以上的温度中生长,
在自然界中的分布仅局限制于某些地区, 如温泉, 日
照充足的土壤表面, 堆肥堆, 发酵饲料等腐烂有机物
中, 比如堆肥在发酵过程中温度常高达 60～ 70℃ 。
? 嗜热机制,
① 细胞内的酶具强抗热性。
② 产生的多胺，热亚胺和高温精胺物质对蛋白质
等组织结构具有保护作用。
③ 核酸也具有热稳定性的保护结构。
④ 细胞膜含有较多的饱和脂肪酸和直链脂肪酸,
使膜具有稳定性。
二、氧气
专性好氧菌, 需氧，正常大气压下呼吸产能
以呼吸为主，兼营发酵产能
好氧菌 兼性厌氧菌
以呼吸为主，兼营厌氧呼吸产能
微好氧菌, 需要微量氧下生活
耐氧菌, 不需氧，只以发酵产能，氧无毒害
厌氧菌
(专性 )厌氧菌, 氧有害或致死，以发酵或无氧呼吸产能
氧与细菌生长的关系
专性好氧菌（ obligate or strict aerobes）
必须在较高浓度分子氧的条件下才能生长，有完
整的呼吸链，以分子氧作最终氢受体，具有超氧化物
歧化酶（ SOD） 和过氧化氢酶（ Catalase ）。 绝大多
数真菌和多数细菌、放线菌都是专性好氧菌。
兼性厌氧菌（ facultative anaerobes）
在有氧条件下生长为主（以呼吸产能），兼在厌
氧条件下生长（以发酵或无氧呼吸产能）。细胞内含
有 SOD和过氧化氢酶。许多酵母菌和不少细菌都是兼性
厌氧菌。
微好氧菌（ microaerophilic bacteria）
在较低氧分压下才能正常生长。通过呼吸链以氧
作最终氢受体而产能。
耐氧菌（ aerotolerant anaerobes）
在分子氧存在下进行发酵性厌氧生活。不需要氧，
氧对其无害。不具有呼吸链，依靠专性发酵和底物水
平磷酸化获得能量。细胞内存在 SOD和过氧化物酶
（缺乏过氧化氢酶）。通常的乳酸菌多为耐氧菌。
厌氧菌（ anaerobes）
可分为一般厌氧菌和严格厌氧菌。
厌氧菌（ anaerobes）
将环境中氧吸掉；抽真空；深层培养 氧对其有毒
能量来源于发酵, 无氧呼吸, 环式光合磷酸化或甲烷发酵
O2,- 超氧阴离子自由基 普遍存在
H2O+1/2O2 过氧化氢酶 （好氧菌）
2H2O 过氧化物酶
（耐氧菌） NADH2 NAD
O2,+2H+ H2O2+O2 - SOD
（好氧菌及耐氧菌）
1
1
1
细胞内缺乏 SOD,细胞色素氧化酶和过氧化氢酶
A,+ B,A:B 共价结合 均裂
三,pH
作为一个整体来说，微生物生长的 pH范围极广
（＞ 2～ 10＜），有少数种类还可超出这一范围。
但绝大多数微生物的生长 pH都在 5～ 9之间。
不同微生物的生长 pH存在最低、最适与最高三个
数值。
不同微生物有其最适生长 pH,另外，同一微生物
在其不同生长阶段和不同生理、生化过程，也有
不同最适 pH要求。
各类微生物能够生长的 pH值较宽，但细胞内部 pH
值却接近中性。
微生物生命活动能改变外界环境 pH,如
糖类－－－－－ pH↓
有机物 脂肪－－－－－ pH↓
培养基内 蛋白质－－－－ pH↑
中性成分
(NH4)2SO4－－－－ pH↓
无机盐
NaNO3 －－－－ - pH↑
发酵、氧化
水解
脱羧
NH4＋ 选择吸收
NO3-选择吸收
过酸时,加 NaOH,Na2CO3等碱液中和
治标
过碱时,加 H2SO4,HCl等酸液中和
pH
调节 加适当氮源：加尿素,NaNO3,
过酸时 NH4OH 或蛋白质等
治本 提高通气量
加适当碳源：加糖、乳酸、醋酸,
柠檬酸或油脂
过碱时
降低通气量
第四节 微生物培养法概论
一、实验室的微生物培养法
二、生产实践中的微生物培养法
实验室的微生物培养法
好氧培养法
厌氧培养法
好氧菌液体培养法
好氧菌固体培养法
厌氧菌固体培养法
厌氧菌液体培养法
试管液体培养
浅层液体培养
摇瓶培养
台式发酵罐
高层琼脂柱法
厌氧培养皿法
厌氧罐技术
厌氧手套箱技术
亨盖特滚管技术
试管斜面、平板
茄瓶、曲盘
Different culture methods
Liquid Culture
Batch culture Batch & Continuous culture
10 ml 20 ml- 1 L 1 L - >1000L
Fermentor
,
,
,
,
,
,
,
,
.,
,
,
.,
,
,
,
,
Brewer 皿
.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,
高层琼脂柱 亨盖特技术
<> <> <>
厌氧罐
anaerobic jar
Anaerobic Glove Box
生产实践中的微生物培养法
好氧培养法
厌氧培养法
好氧菌液体培养法－－深层液体通风培养
好氧菌固体培养法－－曲法培养
厌氧菌固体培养法－－堆积培养
厌氧菌液体培养法－－液体静臵培养
生产实践中微生物培养的实例
发酵类型 生产实例 设 备
固体好氧 酱油, 食醋, 白酒,
制酱等制曲工艺
厚层通风池，固
体发酵罐
固体厌氧 白酒, 青贮饲料 池，罐，坛，缸，
坑，瓶等
液 体好氧 有机酸, 氨基酸,
抗生素, 酶制剂等
摇床，液体深层
发酵罐
液 体厌氧 啤酒, 葡萄酒, 酸乳等
池，罐，坛，缸，
坑，瓶等
挂曲
小
曲
红
曲
近代人工踏制大曲 A whole process of DA-QU prepation
固体好氧 ———— 通风曲
fermenter
第五节 微生物生长的控制
一、几个基本概念
二、控制微生物生长的物理方法
三、控制微生物生长的化学方法
一、几个基本概念
杀菌
灭菌：彻底杀灭（一切微生物）
杀灭法 溶菌
消毒：部分杀灭（仅杀灭病原菌）
控制有害菌
的措施 防腐：抑制霉腐微生物
抑制法
化疗：抑制寄主体内的病原菌
灭菌（ sterilition）, 采用强烈的理化
因素使任何物体内外部的一切微生物永远
丧失其生长繁殖能力的措施。
消毒 (disinfection), 采用较温和的理化
因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人
体或动、植物有害的病原菌。而对被消毒
的对象基本无害的措施。
防腐 (antisepsis), 利用某种理化因素完
全抑制霉腐微生物的生长繁殖，即通过制
菌作用防止食品、生物制品等对象发生霉
腐的措施。
化疗 (chemotherapy), 利用具有高度选择
毒力即对病原菌具高度毒力而对其宿主基
本无毒的化学物质来抑制宿主体内病原微
生物的生长繁殖，借以达到治疗该宿主传
染病的一种措施。
二、控制微生物生长的物理方法
高温灭菌 （重点介绍）
低温抑菌
辐射
干燥和渗透压
过滤除菌
超声波
火焰灼烧法 （ 焚烧灭菌法）
干热灭菌法
烘箱内热空气灭菌法
高温灭菌
巴氏消毒法
常压下 煮沸消毒法
湿热灭菌法 间歇灭菌法
常规加压灭菌法
加压下
连续加压灭菌 法
高温灭菌
湿热灭菌效果比干热灭菌效果好
焚烧灭菌法 （ 火焰灼烧法 ）
此法灭菌彻底, 迅速简便, 但使用范
围有限 。 常用于接种工具, 污染物品以及
实验动物尸体等废弃物的处理 。
烘烤灭菌法
主要在干燥箱中利用热空气进行灭菌 。
通常 160℃ 处理 1～ 2h便可达到灭菌的目的 。
如果被处理物传热性差, 体积较大或堆积
过挤时, 需适当延长时间 。 此法只适用于
玻璃器皿, 金属用具等耐热物品的灭菌 。
其优点是可保持物品干燥 。
? 巴氏消毒法 (pasteurization)
是食品（牛奶）酿造（啤酒）工业中常用的方法。
具体做法是 61.7～ 62.8oＣ 处理 30min或 71.6oＣ 处
理 15min。
这样即可杀死病原微生物。又不致损坏营养，可
保留食品饮料原有用味。
根据结核杆菌在 62oＣ 下 15min被致死。
低温维持法 ; 高温瞬时灭菌
? 煮沸灭菌法（煮沸消毒法）
物品在水中煮沸 15min,可杀死所有营
养细胞和一部分芽孢。在水中加入１％的
Ｎ a2CO3或２～５％的碳酸效果更好。此法
适合注射器和解剖用具的消毒。
? 间歇灭菌法 (fractional sterilization)
是用常压蒸汽反复几次进行灭菌的方法。
主要用于不宜高压灭菌的培养基，不耐热
的药物和营养物等。
方法是将待灭菌物品臵于蒸锅内加热到沸腾维持
15～ 30min杀死营养细胞，取出冷却后在 37oＣ 恒
温培养 24小时，使芽孢萌发，再用此法灭菌，反
复三次，即可达到灭菌目的。
? 高压蒸汽灭菌
(normal autoclving)
是湿热灭菌中最好的方法，通常
在 1.05kg/cm2的压力下（此时温
度 121oＣ ）处理 15～ 30min。
要排冷，否则会形成假压，虽然
压力达到要求，温度却达不到相
应高度，而影响灭菌效果。
低温抑菌
低温的作用主要是抑菌。它可使微生物的
代谢活力降低，生长繁殖停滞，但仍能保
持活性。
低温法常用于保藏食品和菌种。
包括冷藏法和冷冻法
辐 射
辐射主要有紫外光、电离辐射、强可见光。
可用于控制微生物生长和保存食品。
紫外线,波长 265～ 266nm的紫外线杀菌力最强。
紫外辐射对微生物有明显的致死作用，是强杀菌
剂。由于紫外线穿透能力差，不易透过不透明的
物质，故紫外杀菌灯只适用于空气及物体表面消
毒。紫外辐射的杀菌机制是复杂的，现知主要是
由于它对 DNA的作用，最明显的是形成胸腺嘧啶
二聚体。经紫外辐射处理后，受损伤的微生物细
胞若再暴露于可见光中，一部分可恢复正常，称
光复活现象。
干燥和渗透压
微生物代谢离不开水。干燥或提高溶液渗
透压降低微生物可利用水的量或活度，从
而抑制其生长。
过滤除菌
过滤除菌是将液体通过某种多孔的材料，
使微生物与液体分离，现今大多用膜滤器
除菌。此法 可用于对热敏感液体的灭菌，
如含有酶或维生素的溶液、血清等，还可
用于啤酒生产代替巴氏消毒法。
超声波
超声波 (频率在 20000Hz以上 )具有强烈的
生物学作用。其作用是使细胞破裂，内含
物外溢，从而实现杀灭微生物的目的。几
乎所有的微生物都能受其破坏。
科研中常用此法破碎细胞，以研究细胞结
构及化学组成、抗原结构和酶的活性等。
三、控制微生物生长的化学方法
消毒剂和防腐剂
抗代谢物
抗生素
? 化学治疗剂 是指能直接干扰病原微生物的生长繁
殖并可用于治疗感染性疾病的化学药物，按其作用
和性质又可分为抗代谢物和抗生素。
消毒剂和防腐剂
消毒剂 是可抑制或杀灭微生物，对人体也可能产
生有害作用的化学药剂，主要用于抑制或杀灭非
生物体表面、器械、排泄物和环境中的微生物。
防腐剂 是可以抑制微生物但对人和动物毒性较低
的化学药剂，可用于机体表面如皮肤、黏膜、伤
口等处防止感染，也可用于食品、饮料、药品的
防腐。
理想的消毒剂和防腐剂应具有作用快、效力大、
渗透强、易配制、价格低、毒性小、无怪味的特
点。
1、醇类
醇类是脱水剂、蛋白质变性剂，也是脂溶剂，可
使蛋白质脱水、变性，损害细胞而具杀菌能力。
70%～ 75％的乙醇杀菌效果最好,常用于皮肤及器
械的消毒。
醇类物质，随着分子量的增大，杀菌力增强。例
如戊醇＞丁醇＞丙醇＞乙醇＞甲醇。那些高级醇
虽杀菌力强于乙醇，由于丙醇以上的醇不易与水
相混，故一般不用作消毒剂。
2、醛类
醛类的作用主要是使蛋白质烷基化，改变酶
或蛋白质的活性，使微生物的生长受到抑制
或死亡。
常用的醛类是甲醛,37％～ 40％甲醛溶液称
福尔马林,因有刺激性和腐蚀性，不宜在人
体使用，常以 2％甲醛溶液浸泡器械,10％
甲醛溶液进行熏蒸以消毒厂房、无菌室或者
传染病患者的家具、房屋等。
3、酚类
低浓度的酚可破坏细胞膜组分，高浓度的酚
可凝固菌体蛋白。酚还能破坏结合在膜上的
氧化酶与脱氢酶，引起细胞的迅速死亡。
石炭酸 O.5％ 可消毒皮肤,2％～ 5％可消
毒痰、粪便与器皿,5％可喷雾消毒空气。
甲酚 是酚的衍生物，杀菌效果比苯酚强几
倍，但在水中的溶解度较低，可在皂液或碱
性溶液中形成乳浊液。市售的消毒剂 来苏尔
就是甲酚与肥皂的混合液，常用 3％～ 5％的
溶液消毒皮肤、桌面及用具。
4、表面活性剂
主要是破坏菌体细胞膜的结构，造成胞内物质泄
漏、蛋白质变性、菌体死亡。
肥皂 一种阴离子表面活性剂，对肺炎链球菌或
链球菌有效，但对葡萄球菌、结核分枝杆菌无效，
0.25％的肥皂溶液对链球菌的作用比 0.7％来苏尔
或 0.1％的升汞还强，但一般认为肥皂的作用主要
是机械地移去微生物，微生物附着于肥皂泡沫中
被水冲洗掉。
新洁尔灭 人工合成的季铵盐阳离子表面活性剂，
0.05％～ 0.1％新洁尔灭溶液用于皮肤、黏膜和器
械消毒。
5、染料
一些碱性染料的阳离子可与菌体的羧基或磷酸基
作用，形成弱电离的化合物，妨碍菌体的正常代
谢，抑制生长。例如：结晶紫。
6、氧化剂类
氧化剂作用于蛋白质的巯基，使蛋白质和酶失活，
强氧化剂还可破坏蛋白质的氨基和酚羟基。
常用的氧化剂有卤素（碘酒、氯气等）、过氧化
氢、高锰酸钾。
7、重金属
高浓度的重金属及其化合物都是有效的杀菌剂或
防腐剂，其作用最强的是 Hg,Ag和 Cu。
升汞 l﹕ （ 500～ 2000） 液可杀灭大多数细菌，
腐蚀金属，对动物有剧毒，常用于组织分离时外
表消毒和器皿消毒。
红汞 2％红汞水溶液即红药水常消毒皮肤、黏膜
及小创伤，不可与碘酒共用。
银是温和的消毒剂,0.1％～ l％ 硝酸银可消毒皮
肤,l％ 硝酸银可防治新生儿传染性眼炎。硫酸铜
对真菌和藻类有强杀伤力，与石灰配制的波尔多
液可防治某些植物病害。
8、酸碱类
强酸与强碱具有杀菌力。
无机酸如硫酸、盐酸等杀菌力虽强，但腐蚀性大，
实际上不宜作消毒剂。某些有机酸如苯甲酸可用
作防腐剂。酸菜、饲料青贮则是利用乳酸菌发酵
产生的乳酸抑制腐败性微生物的生长，使之得以
久贮存。
强碱可用作杀菌剂，但由于它们的毒性大，其用
途局限于对排泄物及仓库、棚舍等环境的消毒。
抗代谢物
抗代谢药物又称代谢拮抗物或代谢类似物，是
指一类在化学结构上与细胞内必要代谢物的结
构相似，并可干扰正常代谢活动的化学物质。
具有良好的选择毒力
抗代谢物种类较多
如：磺胺类药物为对氨基苯甲酸的对抗物；
6-巯基嘌呤是嘌呤的对抗物；
5-甲基色氨酸是色氨酸的对抗物；
异烟胼 (雷米封 )是吡哆醇的对抗物。
二氢喋啶 二氢喋酸 二氢叶酸 四氢叶酸
核 酸
氨基酸
前 体
PABA
酶 ① 酶 ② 酶 ③
Glu TMP COOH H2N NH2 SO2 NHR
COOH H2N
NH2 SO2 NHR
磺胺药 (sulphonamides,sulfa drugs)抑菌机理
TMP:三甲基苄二氨嘧啶
(磺胺增效剂 )
磺胺
PABA
强选择毒力
酶①,二氢喋酸合成酶；酶②：二氢叶酸合成酶；酶③：二氢叶酸还原酶
竞争性拮抗作用
磺胺类药物广泛用于临床，是由于它们与微生物
生长所必需的代谢物对氨基苯甲酸 (PABA)间的竞争性
抑制作用，细菌生长所必需的对氨基苯甲酸可以自行
合成，也可从外界环境中获得。若自行合成时，正常
情况下，对氨基苯甲酸则和二氢喋啶在二氢叶酸合成
酶的作用下，合成二氢叶酸。二氢叶酸再通过二氢叶
酸还原酶的作用，生成四氢叶酸。然而磺胺的结构与
对氨基苯酸极其相似，在一定条件下，它们竞争性地
与二氢叶酸合成酶结合，阻止或取代了对氨基甲酸掺
入到叶酸分子中去，从而阻断了细菌细胞重要组分叶
酸的合成。而叶酸是一种辅酶，在氨基酸、维生素的
合成中起重要作用，缺乏此酶，细菌细胞活力受到明
显破坏。磺胺抑制细菌的生长是因为许多细菌需要自
己合成叶酸而生长。由于人和动物可利用现成的叶酸
生活，因此不受磺胺的干扰。
抗生素
一类由微生物或其他生物生命活动过程
中合成的次生代谢产物或其人工衍生物，
它们在很低浓度时就能抑制或干扰它种
生物（包括病原菌、病毒、癌细胞等）
的生命活动的化学治疗剂。
抗菌谱,每种抗生素的杀菌范围。
抗生素的效价
可怕的抗药性 (antibiotic resistance)
第一次用药剂量要足；
避免在一个时期或长期多次使用同种抗生素
不同抗生素（或其他药物）混合使用
对现有抗生素改造
筛选新的更有效的抗生素
生物药物素 (biopharmaceutin)
具有多种生理活性的比抗生素疗效
更为广泛的微生物次生代谢产物。
酶抑制剂
免疫调节剂
受体拮抗剂
抗氧化剂
…..,
微生物的生长及其控制
第一节 微生物生长的测定
第二节 微生物的生长规律
第三节 影响微生物生长的主要因素
第四节 微生物培养法概论
第五节 微生物生长的控制
第一节 微生物生长的测定
一,微生物的纯培养
二,微生物生长的测定
（一）微生物细胞数目的测定
（二）微生物生长量的测定
（三）丝状微生物菌丝长度的测定
一、微生物的纯培养
微生物在自然界中不仅分布很广, 而且都是
混杂地生活在一起 。 要想研究或利用某一微
生物, 必须把混杂的微生物类群分离开来,
以得到只含一种微生物的培养 。 微生物学中
将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群
繁殖得到的后代称为纯培养 。 纯培养的分离,
是研究和利用微生物的第一步, 是微生物工
作中最重要的环节之一 。 最常用的方法有稀
释平板法, 划线法, 单细胞挑取法及利用选
择培养基分离法等 。
纯培养的分离方法
稀释倒平板法
划线法
选择培养基分离法
单细胞挑取法
稀释倒平板法
（ 倾注法（混菌法）、涂布法 ） 这是最常用的纯种分离法, 先将待分离的材
料作一系列的稀释 (如 1,10,1,100,1：
1000,1,10,000…… ),然后分别取不同
稀释液少许, 与已熔化并冷却至 45℃ 的琼脂
培养基相混合, 摇匀后, 倾入灭过菌的培养
皿中, 待琼脂凝固后, 保温培养一定时间即
可出现菌落 。 如果稀释得当, 平皿上就可出
现分散的单个菌落, 这个菌落可能就是由一
个细胞繁殖形成的 。 随后挑取该单个菌落,
或重复以上操作数次, 便可得到纯培养 。
划线法
将已熔化的培养基倒入无菌平皿, 冷却凝固后,
用接种环沾取少许待分离的材料, 在培养基表
面进行平行划线, 扇形划线或其他形式的连续
划线, 微生物将随着划线次数的增加而分散,
经保温培养形成菌落 。 划线开始的部分细菌分
散度小, 形成的菌落往往连在一起 。 由于连续
划线, 微生物逐渐减少, 划到最后, 常可形成
单个孤立的菌落 。 这种单个菌落可能由一个细
胞繁殖而来, 故可获得纯培养 。 用其他工具如
弯形玻璃代替接种环, 在培养基表面涂布, 亦
可得到同样结果 。 此法较为简便 。
单细胞挑取法
这种方法是从待分离的材料中挑取一个细胞
来培养, 从而获得纯培养 。 具体方法是将显
微镜挑取器装臵在显微镜上, 把一滴菌悬液
臵于载玻片上, 用安装在显微镜挑取器上的
极细的毛细吸管, 在显微镜下对准某一个单
独的细胞挑取, 再接种到培养基上培养 。 此
法需要非常熟练的操作人员, 多限于高度专
业化的科学研究中采用 。
利用选择培养基分离法
不同微生物需要不同的营养物质 。 有些微生物生长适
于酸性环境, 有些则适于碱性环境 。 各种微生物对不
同的化学试剂如消毒剂 (酚 ),染料 (结晶紫等 ),抗生
素及其他物质等具有不同的抵抗能力 。 利用这些特性,
便可配制成适合于某种微生物生长而限制其他微生物
生长的各种选择性培养基, 以达到纯种分离的目的 。
另外, 也可以将待分离的样品先进行适当处理, 以消
除不希望分离到的微生物 。 对一些生理类型比较特殊
的微生物, 为了提高分离机率, 往往在涂布分离前先
进行富集培养, 其目的是提供一个特别设计的培养环
境, 以帮助所需的特殊生理类型的微生物的生长, 而
不利于其他类型微生物的生长 。
选择培养基分离法
1.dilute sample
1 ml
9 ml
10 100 1000 104 105 106 107
牛肉膏培养基
土豆培养基
高氏培养基
微生物纯培养分离方法的比较
稀释平板法 既可定性，又可定量，用途广泛
平板划线法 方法简便，多用于分离细菌
单细胞挑取法 局限于高度专业化的科学研究
利用选择培养基法 适用于分离某些生理类型
较特殊的微生物
二、微生物生长的测定
微生物特别是单细胞微生物, 体积很小, 个体的
生长很难测定, 而且也没有什么实际应用价值 。
因此, 在微生物学的研究和应用中, 通常是测定
群体的增加量, 即群体的生长 。
测定不同种类, 不同生长状态微生物的生长情况,
需要选用不同的指标 。 通常对单细胞微生物来说,
既可测定细胞数目, 又可测定生长量；而对多细
胞微生物 (尤其是丝状真菌 ),则常以菌丝生长的
长度等作为生长指标 。
（一）微生物细胞数目的测定
－－适用于单细胞微生物或丝状微生物的孢子
直接计数法 －－总菌计数
1,计数板计数法（常用）
2、比例计数法
间接计数法 －－活菌计数
1,平板菌落计数法
2、液体稀释法
3、厌氧菌菌落计数
其他计数法
1、比浊法
2、膜过滤法
血球计数板
各
种
型
号
的
全
自
动
血
球
计
数
仪
活菌计数的一般步骤
（二）微生物生长量的测定
－－适用于一切微生物
直接法
1、测体积法
2、称重法
间接法
1、含氮量测定法
2,DNA含量测定法
3、其他生理指标法
（三）丝状微生物菌丝长度的测定
培养基表面菌体生长速率测定法
培养料中菌体速率测定法
单个菌丝顶端生长速率测定法
第二节 微生物的生长规律
一、微生物的个体生长和同步生长
二、单细胞微生物的典型生长曲线
三、微生物的连续培养
四、微生物的高密度培养
一、微生物的个体生长和同步生长
微生物在适宜的环境条件下，不断地
吸收营养物质，并按照自己的代谢方
式进行代谢活动，如果同化作用大于
异化作用，则细胞质的量不断增加，
体积得以加大，于是表现为生长。简
单地说，生长就是有机体的细胞组分
与结构在量方面的增加。
同步培养技术,是指设法使某一群体
中的所有个体细胞尽可能都处于同样
细胞生长和分裂周期的一种培养方式。
通过分析此群体在各阶段的生物化学
特性变化，来间接了解单个细胞的相
应变化规律。
同步生长,通过同步培养的手段而使
细胞群体中各个体处于分裂步调一致
的生长状态的一种生长方式。
获得微生物同步生长的方法
选择法
诱导法
同步生长的细胞经过 2~3个分裂周期后会丧失同步性。
离心分离法
过滤分离法
膜洗脱法
控制温度
控制培养基成分
抑制 DNA合成法
选择法
又称机械筛选法，是通过物理学方法从
随机、不同步群体中选择出同步的群体。
此法可在不影响微生物代谢的情况下获
得同步培养物。
若微生物在相同发育阶段大小不一，则
不适宜用此法。
举例：过滤分离法、密度梯度离心法,
膜洗脱（常用）等。
诱导法
诱导因子：不影响微生物生长，可特异性抑制细
胞分裂，消除该抑制后，细胞同时出现分裂。
此法会扰乱细胞的正常代谢
举例,
1、温度调整法；
2、营养条件调整法；
3、抑制 DNA合成法 （代谢抑制剂：）
（ 抑制 DNA合成法是利用代谢抑制剂阻碍 DNA合成相当一
段时间，然后解除其抑制，可达到同步目的。常用的代
谢抑制剂：氨甲蝶呤、羟基尿素,5-氟脱氧尿苷、胸腺
苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷等。 ）
二、单细胞微生物的生长曲线
多数细菌的繁殖速度很快 。 大肠杆菌在适宜的条
件下繁殖 48h,其子代总重可达 2.2× 10 31g,这
是一个巨大的数字 。 然而, 实际情况是不可能的 。
那么, 细菌的群体生长规律到底怎样呢?
将少量单细胞纯培养物接种到一恒定容积的新鲜
液体培养基中, 在适宜的条件下培养, 定时取样
测定细胞含量, 可以看到以下现象：开始有一短
暂时间, 细胞数量并不增加, 随之细胞数目增加
很快, 继而细胞数又趋稳定, 最后逐渐下降 。 如
果以培养时间为横坐标, 以细胞数目的对数或生
长速度为纵坐标作图, 可以得到一条曲线, 称为
生长曲线 。
微生物的典型生长曲线 (growth curve)
总菌数
活菌数
培养时间 /h
Ⅱ,指数期 Ⅲ,稳定期 Ⅳ,衰亡期 Ⅰ,延滞期
细
菌
数
目
（
个/ml
）
对
数 Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅰ
? 根据微生物的 生长速率常数 的不同，可将生长
曲线大致分为四个时期,
（一）延滞期 (lag phase)
延滞期出现的原因
把少数单细胞微生物接种到新鲜的培养
基中培养时，细胞并不立即进行分裂繁殖，
微生物的增殖数为０，这时 细胞需要合成多
种酶，辅酶和某些中间代谢产物，因此要经
历一个调整和适应过程。
延滞期的特点
1、生长速率常数为零；
2、细胞形态变大或增长；
3、细胞内的 RNA含量增高，原生质呈嗜碱性；
4、合成代谢十分活跃；
5、对外界不良环境反应敏感。
影响延滞期长短的因素
1.菌种特性； 2.接种龄； 3.接种量； 4.培养基成分
缩短延滞期的方法
1,接种对数生长期的菌种，采用最适菌龄；
2,加大接种量；
3,用营养丰富的天然培养基等。
（二）指数期 (exponential phase)
指数期的特点
1、活菌数和总菌数接近
2、生长速率常数最大，代时 (generation time,G)最短
3、细胞进行平衡生长，细胞的化学组成及形态,
生理特性比较一致
4、酶系活跃，代谢旺盛
该期的微生物生产中多被用做种子和科学试验材料
x2
x1
t2 t1 培养时间
Lg 细胞数 /ml
t2 - t1
3.322(lgx2-lgx1) 生长速率常数 R=
t2 - t1
3.322(lgx2-lgx1)
代时 G=
指数期生长的数学模型
繁殖代数 n=3.322(lgx2-lgx1)
生长速率常数 R,指细胞每小时的分裂次数。
代时 G,细胞每分裂一次所需的时间。
R=1/G
影响指数期微生物代时长短的因素
菌种
营养成分
营养物浓度
培养温度
生长限制因子, 凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和
菌体产量的某营养物。
（三）稳定期 (stationary phase)
稳定期的特点
1、生长速率常数 R等于零，活菌数达到最高峰,
并保持相对稳定。
2、微生物细胞内代谢物积累达到最高峰。
3、芽孢杆菌这时开始形成芽孢。
4、这是产物（菌体或与菌体生长相平行的代谢
产物）的最佳收获时期。
稳定期到来的原因
1、营养物尤其是生长限制因子的耗尽
2、营养物的比例失调
3、有害代谢产物的积累
4,pH值,Eh值等理化条件不适宜
（四）衰亡期 (decline phase)
衰亡期的特点
1、微生物死亡数大于增殖数，活菌数大大减少,
群体衰落
2、细胞出现多形态,大小不等的畸形,变成衰退型
3、细胞死亡,出现自溶现象。
4、有的微生物在此期合成或释放次生代谢物。
5、芽孢杆菌在此期释放芽孢。
三、微生物的连续培养
将微生物臵于一定容积的培养基中, 经过培养生
长, 最后一次收获, 此称分批培养 (batch culture)。
通过对细菌纯培养的生长曲线的分析可知, 在分批
培养中, 培养基一次加入, 不予补充, 细菌的对数
生长期不可能长时间维持 。
如果在培养器中不断补充新鲜营养物质, 并及
时不断地以同样速度排出培养物 (包括菌体及代谢产
物 ),理论上讲, 对数生长期就可无限延长 。 这种方
法就叫连续培养法 。 连续培养方法的出现, 不仅可
随时为微生物的研究工作提供一定生理状态的实验
材料, 而且可提高发酵工业的生产效益和自动化水
平 。 此法已成为当前发酵工业的发展方向 。
优点,缩短发酵周期；便于自动控制；产物质量均一
缺点：菌种易退化；易染杂菌
(一 )恒浊连续培养
不断调节流速而使细菌培养液 浊度保持恒
定 的连续培养方法叫恒浊连续培养 。 在恒浊连
续培养中装有浊度计, 借光电池检测培养室中
的浊度 (即菌液浓度 ),并由光电效应产生的电
信号强弱变化, 来自动调节新鲜培养基流入和
培养物流出培养室的流速 。
(二 )恒化连续培养
控制 恒定的流速, 使由于细菌生长而耗去
的营养物及时得到补充, 培养室中营养物浓度
基本恒定, 从而保持细菌的恒定生长速率, 故
称恒化连续培养, 又叫恒组成连续培养 。
装臵 控制对象 培养基 培养液流速 生长速率 产物 应用范围
恒浊器 菌体密度 （内控制）
无限制
生长因
子
不恒定 最高速率
大量菌体
或与菌体
相平行的
代谢产物
生产为主
恒化器 培养液流速 （外控制）
有限制
生长因
子
恒定 低于最高速率
不同生长
速率的菌
体
实验室为
主
恒浊器与恒化器的比较
生长限制因子, 凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和
菌体产量的某营养物。
第三节 影响微生物生长的主要因素
一、温度
二、氧气
三,pH
一、温度
影响微生物生长繁殖的最重要因素之一 。
就总体而言, 微生物生长的温度范围较广,
已知的微生物在 -10～ 95℃ 范围内生长 。 而
对某一具体微生物而言, 只能在一定的温
度范围内生长, 且此温度范围有宽, 有窄 。
生长温度三基点：任何微生物的生长温度
总有 最低生长温度, 最适生长温度, 最高
生长温度 。
温 度 生长速
度
温度 停止生长 致死
最低 最高
最适
? 微生物按其最适生长温度
范围可分为,
嗜冷菌
嗜温菌
嗜热菌
? 最适生长温度,
即某微生物分裂
代时最短或生长速率
最高时的培养温度。
不同微生物的最适生
长温度是不一样的。
应该着重指出：最适
生长温度不一定是一
切代谢活动的最适温
度。
? 嗜冷菌 其生长温度范围在－ 10～ 20℃, 最适生长
温度为 15℃ 或以下, 它们常分布在地球两极地区的水
域和土壤中 。
嗜冷机制,① 酶系在低温下仍能起催化作用
② 细胞膜含较多的不饱和脂肪酸,
在低温下仍具有通透性。
? 嗜温菌 绝大多数微生物属于这一类。最适生长温
度在 20～ 45℃ 之间，最低生长温度 10～ 20℃,最高生
长温度 40～ 45℃ 。它们又可分为室温型（ 25℃ ）和体
温型（ 37℃ ） 。
? 嗜热菌 它们适于在 45～ 50℃ 以上的温度中生长,
在自然界中的分布仅局限制于某些地区, 如温泉, 日
照充足的土壤表面, 堆肥堆, 发酵饲料等腐烂有机物
中, 比如堆肥在发酵过程中温度常高达 60～ 70℃ 。
? 嗜热机制,
① 细胞内的酶具强抗热性。
② 产生的多胺，热亚胺和高温精胺物质对蛋白质
等组织结构具有保护作用。
③ 核酸也具有热稳定性的保护结构。
④ 细胞膜含有较多的饱和脂肪酸和直链脂肪酸,
使膜具有稳定性。
二、氧气
专性好氧菌, 需氧，正常大气压下呼吸产能
以呼吸为主，兼营发酵产能
好氧菌 兼性厌氧菌
以呼吸为主，兼营厌氧呼吸产能
微好氧菌, 需要微量氧下生活
耐氧菌, 不需氧，只以发酵产能，氧无毒害
厌氧菌
(专性 )厌氧菌, 氧有害或致死，以发酵或无氧呼吸产能
氧与细菌生长的关系
专性好氧菌（ obligate or strict aerobes）
必须在较高浓度分子氧的条件下才能生长，有完
整的呼吸链，以分子氧作最终氢受体，具有超氧化物
歧化酶（ SOD） 和过氧化氢酶（ Catalase ）。 绝大多
数真菌和多数细菌、放线菌都是专性好氧菌。
兼性厌氧菌（ facultative anaerobes）
在有氧条件下生长为主（以呼吸产能），兼在厌
氧条件下生长（以发酵或无氧呼吸产能）。细胞内含
有 SOD和过氧化氢酶。许多酵母菌和不少细菌都是兼性
厌氧菌。
微好氧菌（ microaerophilic bacteria）
在较低氧分压下才能正常生长。通过呼吸链以氧
作最终氢受体而产能。
耐氧菌（ aerotolerant anaerobes）
在分子氧存在下进行发酵性厌氧生活。不需要氧，
氧对其无害。不具有呼吸链，依靠专性发酵和底物水
平磷酸化获得能量。细胞内存在 SOD和过氧化物酶
（缺乏过氧化氢酶）。通常的乳酸菌多为耐氧菌。
厌氧菌（ anaerobes）
可分为一般厌氧菌和严格厌氧菌。
厌氧菌（ anaerobes）
将环境中氧吸掉；抽真空；深层培养 氧对其有毒
能量来源于发酵, 无氧呼吸, 环式光合磷酸化或甲烷发酵
O2,- 超氧阴离子自由基 普遍存在
H2O+1/2O2 过氧化氢酶 （好氧菌）
2H2O 过氧化物酶
（耐氧菌） NADH2 NAD
O2,+2H+ H2O2+O2 - SOD
（好氧菌及耐氧菌）
1
1
1
细胞内缺乏 SOD,细胞色素氧化酶和过氧化氢酶
A,+ B,A:B 共价结合 均裂
三,pH
作为一个整体来说，微生物生长的 pH范围极广
（＞ 2～ 10＜），有少数种类还可超出这一范围。
但绝大多数微生物的生长 pH都在 5～ 9之间。
不同微生物的生长 pH存在最低、最适与最高三个
数值。
不同微生物有其最适生长 pH,另外，同一微生物
在其不同生长阶段和不同生理、生化过程，也有
不同最适 pH要求。
各类微生物能够生长的 pH值较宽，但细胞内部 pH
值却接近中性。
微生物生命活动能改变外界环境 pH,如
糖类－－－－－ pH↓
有机物 脂肪－－－－－ pH↓
培养基内 蛋白质－－－－ pH↑
中性成分
(NH4)2SO4－－－－ pH↓
无机盐
NaNO3 －－－－ - pH↑
发酵、氧化
水解
脱羧
NH4＋ 选择吸收
NO3-选择吸收
过酸时,加 NaOH,Na2CO3等碱液中和
治标
过碱时,加 H2SO4,HCl等酸液中和
pH
调节 加适当氮源：加尿素,NaNO3,
过酸时 NH4OH 或蛋白质等
治本 提高通气量
加适当碳源：加糖、乳酸、醋酸,
柠檬酸或油脂
过碱时
降低通气量
第四节 微生物培养法概论
一、实验室的微生物培养法
二、生产实践中的微生物培养法
实验室的微生物培养法
好氧培养法
厌氧培养法
好氧菌液体培养法
好氧菌固体培养法
厌氧菌固体培养法
厌氧菌液体培养法
试管液体培养
浅层液体培养
摇瓶培养
台式发酵罐
高层琼脂柱法
厌氧培养皿法
厌氧罐技术
厌氧手套箱技术
亨盖特滚管技术
试管斜面、平板
茄瓶、曲盘
Different culture methods
Liquid Culture
Batch culture Batch & Continuous culture
10 ml 20 ml- 1 L 1 L - >1000L
Fermentor
,
,
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Brewer 皿
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高层琼脂柱 亨盖特技术
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厌氧罐
anaerobic jar
Anaerobic Glove Box
生产实践中的微生物培养法
好氧培养法
厌氧培养法
好氧菌液体培养法－－深层液体通风培养
好氧菌固体培养法－－曲法培养
厌氧菌固体培养法－－堆积培养
厌氧菌液体培养法－－液体静臵培养
生产实践中微生物培养的实例
发酵类型 生产实例 设 备
固体好氧 酱油, 食醋, 白酒,
制酱等制曲工艺
厚层通风池，固
体发酵罐
固体厌氧 白酒, 青贮饲料 池，罐，坛，缸，
坑，瓶等
液 体好氧 有机酸, 氨基酸,
抗生素, 酶制剂等
摇床，液体深层
发酵罐
液 体厌氧 啤酒, 葡萄酒, 酸乳等
池，罐，坛，缸，
坑，瓶等
挂曲
小
曲
红
曲
近代人工踏制大曲 A whole process of DA-QU prepation
固体好氧 ———— 通风曲
fermenter
第五节 微生物生长的控制
一、几个基本概念
二、控制微生物生长的物理方法
三、控制微生物生长的化学方法
一、几个基本概念
杀菌
灭菌：彻底杀灭（一切微生物）
杀灭法 溶菌
消毒：部分杀灭（仅杀灭病原菌）
控制有害菌
的措施 防腐：抑制霉腐微生物
抑制法
化疗：抑制寄主体内的病原菌
灭菌（ sterilition）, 采用强烈的理化
因素使任何物体内外部的一切微生物永远
丧失其生长繁殖能力的措施。
消毒 (disinfection), 采用较温和的理化
因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人
体或动、植物有害的病原菌。而对被消毒
的对象基本无害的措施。
防腐 (antisepsis), 利用某种理化因素完
全抑制霉腐微生物的生长繁殖，即通过制
菌作用防止食品、生物制品等对象发生霉
腐的措施。
化疗 (chemotherapy), 利用具有高度选择
毒力即对病原菌具高度毒力而对其宿主基
本无毒的化学物质来抑制宿主体内病原微
生物的生长繁殖，借以达到治疗该宿主传
染病的一种措施。
二、控制微生物生长的物理方法
高温灭菌 （重点介绍）
低温抑菌
辐射
干燥和渗透压
过滤除菌
超声波
火焰灼烧法 （ 焚烧灭菌法）
干热灭菌法
烘箱内热空气灭菌法
高温灭菌
巴氏消毒法
常压下 煮沸消毒法
湿热灭菌法 间歇灭菌法
常规加压灭菌法
加压下
连续加压灭菌 法
高温灭菌
湿热灭菌效果比干热灭菌效果好
焚烧灭菌法 （ 火焰灼烧法 ）
此法灭菌彻底, 迅速简便, 但使用范
围有限 。 常用于接种工具, 污染物品以及
实验动物尸体等废弃物的处理 。
烘烤灭菌法
主要在干燥箱中利用热空气进行灭菌 。
通常 160℃ 处理 1～ 2h便可达到灭菌的目的 。
如果被处理物传热性差, 体积较大或堆积
过挤时, 需适当延长时间 。 此法只适用于
玻璃器皿, 金属用具等耐热物品的灭菌 。
其优点是可保持物品干燥 。
? 巴氏消毒法 (pasteurization)
是食品（牛奶）酿造（啤酒）工业中常用的方法。
具体做法是 61.7～ 62.8oＣ 处理 30min或 71.6oＣ 处
理 15min。
这样即可杀死病原微生物。又不致损坏营养，可
保留食品饮料原有用味。
根据结核杆菌在 62oＣ 下 15min被致死。
低温维持法 ; 高温瞬时灭菌
? 煮沸灭菌法（煮沸消毒法）
物品在水中煮沸 15min,可杀死所有营
养细胞和一部分芽孢。在水中加入１％的
Ｎ a2CO3或２～５％的碳酸效果更好。此法
适合注射器和解剖用具的消毒。
? 间歇灭菌法 (fractional sterilization)
是用常压蒸汽反复几次进行灭菌的方法。
主要用于不宜高压灭菌的培养基，不耐热
的药物和营养物等。
方法是将待灭菌物品臵于蒸锅内加热到沸腾维持
15～ 30min杀死营养细胞，取出冷却后在 37oＣ 恒
温培养 24小时，使芽孢萌发，再用此法灭菌，反
复三次，即可达到灭菌目的。
? 高压蒸汽灭菌
(normal autoclving)
是湿热灭菌中最好的方法，通常
在 1.05kg/cm2的压力下（此时温
度 121oＣ ）处理 15～ 30min。
要排冷，否则会形成假压，虽然
压力达到要求，温度却达不到相
应高度，而影响灭菌效果。
低温抑菌
低温的作用主要是抑菌。它可使微生物的
代谢活力降低，生长繁殖停滞，但仍能保
持活性。
低温法常用于保藏食品和菌种。
包括冷藏法和冷冻法
辐 射
辐射主要有紫外光、电离辐射、强可见光。
可用于控制微生物生长和保存食品。
紫外线,波长 265～ 266nm的紫外线杀菌力最强。
紫外辐射对微生物有明显的致死作用，是强杀菌
剂。由于紫外线穿透能力差，不易透过不透明的
物质，故紫外杀菌灯只适用于空气及物体表面消
毒。紫外辐射的杀菌机制是复杂的，现知主要是
由于它对 DNA的作用，最明显的是形成胸腺嘧啶
二聚体。经紫外辐射处理后，受损伤的微生物细
胞若再暴露于可见光中，一部分可恢复正常，称
光复活现象。
干燥和渗透压
微生物代谢离不开水。干燥或提高溶液渗
透压降低微生物可利用水的量或活度，从
而抑制其生长。
过滤除菌
过滤除菌是将液体通过某种多孔的材料，
使微生物与液体分离，现今大多用膜滤器
除菌。此法 可用于对热敏感液体的灭菌，
如含有酶或维生素的溶液、血清等，还可
用于啤酒生产代替巴氏消毒法。
超声波
超声波 (频率在 20000Hz以上 )具有强烈的
生物学作用。其作用是使细胞破裂，内含
物外溢，从而实现杀灭微生物的目的。几
乎所有的微生物都能受其破坏。
科研中常用此法破碎细胞，以研究细胞结
构及化学组成、抗原结构和酶的活性等。
三、控制微生物生长的化学方法
消毒剂和防腐剂
抗代谢物
抗生素
? 化学治疗剂 是指能直接干扰病原微生物的生长繁
殖并可用于治疗感染性疾病的化学药物，按其作用
和性质又可分为抗代谢物和抗生素。
消毒剂和防腐剂
消毒剂 是可抑制或杀灭微生物，对人体也可能产
生有害作用的化学药剂，主要用于抑制或杀灭非
生物体表面、器械、排泄物和环境中的微生物。
防腐剂 是可以抑制微生物但对人和动物毒性较低
的化学药剂，可用于机体表面如皮肤、黏膜、伤
口等处防止感染，也可用于食品、饮料、药品的
防腐。
理想的消毒剂和防腐剂应具有作用快、效力大、
渗透强、易配制、价格低、毒性小、无怪味的特
点。
1、醇类
醇类是脱水剂、蛋白质变性剂，也是脂溶剂，可
使蛋白质脱水、变性，损害细胞而具杀菌能力。
70%～ 75％的乙醇杀菌效果最好,常用于皮肤及器
械的消毒。
醇类物质，随着分子量的增大，杀菌力增强。例
如戊醇＞丁醇＞丙醇＞乙醇＞甲醇。那些高级醇
虽杀菌力强于乙醇，由于丙醇以上的醇不易与水
相混，故一般不用作消毒剂。
2、醛类
醛类的作用主要是使蛋白质烷基化，改变酶
或蛋白质的活性，使微生物的生长受到抑制
或死亡。
常用的醛类是甲醛,37％～ 40％甲醛溶液称
福尔马林,因有刺激性和腐蚀性，不宜在人
体使用，常以 2％甲醛溶液浸泡器械,10％
甲醛溶液进行熏蒸以消毒厂房、无菌室或者
传染病患者的家具、房屋等。
3、酚类
低浓度的酚可破坏细胞膜组分，高浓度的酚
可凝固菌体蛋白。酚还能破坏结合在膜上的
氧化酶与脱氢酶，引起细胞的迅速死亡。
石炭酸 O.5％ 可消毒皮肤,2％～ 5％可消
毒痰、粪便与器皿,5％可喷雾消毒空气。
甲酚 是酚的衍生物，杀菌效果比苯酚强几
倍，但在水中的溶解度较低，可在皂液或碱
性溶液中形成乳浊液。市售的消毒剂 来苏尔
就是甲酚与肥皂的混合液，常用 3％～ 5％的
溶液消毒皮肤、桌面及用具。
4、表面活性剂
主要是破坏菌体细胞膜的结构，造成胞内物质泄
漏、蛋白质变性、菌体死亡。
肥皂 一种阴离子表面活性剂，对肺炎链球菌或
链球菌有效，但对葡萄球菌、结核分枝杆菌无效，
0.25％的肥皂溶液对链球菌的作用比 0.7％来苏尔
或 0.1％的升汞还强，但一般认为肥皂的作用主要
是机械地移去微生物，微生物附着于肥皂泡沫中
被水冲洗掉。
新洁尔灭 人工合成的季铵盐阳离子表面活性剂，
0.05％～ 0.1％新洁尔灭溶液用于皮肤、黏膜和器
械消毒。
5、染料
一些碱性染料的阳离子可与菌体的羧基或磷酸基
作用，形成弱电离的化合物，妨碍菌体的正常代
谢，抑制生长。例如：结晶紫。
6、氧化剂类
氧化剂作用于蛋白质的巯基，使蛋白质和酶失活，
强氧化剂还可破坏蛋白质的氨基和酚羟基。
常用的氧化剂有卤素（碘酒、氯气等）、过氧化
氢、高锰酸钾。
7、重金属
高浓度的重金属及其化合物都是有效的杀菌剂或
防腐剂，其作用最强的是 Hg,Ag和 Cu。
升汞 l﹕ （ 500～ 2000） 液可杀灭大多数细菌，
腐蚀金属，对动物有剧毒，常用于组织分离时外
表消毒和器皿消毒。
红汞 2％红汞水溶液即红药水常消毒皮肤、黏膜
及小创伤，不可与碘酒共用。
银是温和的消毒剂,0.1％～ l％ 硝酸银可消毒皮
肤,l％ 硝酸银可防治新生儿传染性眼炎。硫酸铜
对真菌和藻类有强杀伤力，与石灰配制的波尔多
液可防治某些植物病害。
8、酸碱类
强酸与强碱具有杀菌力。
无机酸如硫酸、盐酸等杀菌力虽强，但腐蚀性大，
实际上不宜作消毒剂。某些有机酸如苯甲酸可用
作防腐剂。酸菜、饲料青贮则是利用乳酸菌发酵
产生的乳酸抑制腐败性微生物的生长，使之得以
久贮存。
强碱可用作杀菌剂，但由于它们的毒性大，其用
途局限于对排泄物及仓库、棚舍等环境的消毒。
抗代谢物
抗代谢药物又称代谢拮抗物或代谢类似物，是
指一类在化学结构上与细胞内必要代谢物的结
构相似，并可干扰正常代谢活动的化学物质。
具有良好的选择毒力
抗代谢物种类较多
如：磺胺类药物为对氨基苯甲酸的对抗物；
6-巯基嘌呤是嘌呤的对抗物；
5-甲基色氨酸是色氨酸的对抗物；
异烟胼 (雷米封 )是吡哆醇的对抗物。
二氢喋啶 二氢喋酸 二氢叶酸 四氢叶酸
核 酸
氨基酸
前 体
PABA
酶 ① 酶 ② 酶 ③
Glu TMP COOH H2N NH2 SO2 NHR
COOH H2N
NH2 SO2 NHR
磺胺药 (sulphonamides,sulfa drugs)抑菌机理
TMP:三甲基苄二氨嘧啶
(磺胺增效剂 )
磺胺
PABA
强选择毒力
酶①,二氢喋酸合成酶；酶②：二氢叶酸合成酶；酶③：二氢叶酸还原酶
竞争性拮抗作用
磺胺类药物广泛用于临床，是由于它们与微生物
生长所必需的代谢物对氨基苯甲酸 (PABA)间的竞争性
抑制作用，细菌生长所必需的对氨基苯甲酸可以自行
合成，也可从外界环境中获得。若自行合成时，正常
情况下，对氨基苯甲酸则和二氢喋啶在二氢叶酸合成
酶的作用下，合成二氢叶酸。二氢叶酸再通过二氢叶
酸还原酶的作用，生成四氢叶酸。然而磺胺的结构与
对氨基苯酸极其相似，在一定条件下，它们竞争性地
与二氢叶酸合成酶结合，阻止或取代了对氨基甲酸掺
入到叶酸分子中去，从而阻断了细菌细胞重要组分叶
酸的合成。而叶酸是一种辅酶，在氨基酸、维生素的
合成中起重要作用，缺乏此酶，细菌细胞活力受到明
显破坏。磺胺抑制细菌的生长是因为许多细菌需要自
己合成叶酸而生长。由于人和动物可利用现成的叶酸
生活，因此不受磺胺的干扰。
抗生素
一类由微生物或其他生物生命活动过程
中合成的次生代谢产物或其人工衍生物，
它们在很低浓度时就能抑制或干扰它种
生物（包括病原菌、病毒、癌细胞等）
的生命活动的化学治疗剂。
抗菌谱,每种抗生素的杀菌范围。
抗生素的效价
可怕的抗药性 (antibiotic resistance)
第一次用药剂量要足；
避免在一个时期或长期多次使用同种抗生素
不同抗生素（或其他药物）混合使用
对现有抗生素改造
筛选新的更有效的抗生素
生物药物素 (biopharmaceutin)
具有多种生理活性的比抗生素疗效
更为广泛的微生物次生代谢产物。
酶抑制剂
免疫调节剂
受体拮抗剂
抗氧化剂
…..,
