第八章 菌种的保藏
第一节 菌种的衰退和复壮
一、菌种的衰退
二、菌种的复壮
第二节 菌种的保藏
一、菌种保藏的目的
二、菌种保藏的原理
三、菌种保藏的方法
? 性状稳定的菌种是微生物工作最
重要的基本要求，否则生产或科研
都无法正常进行。
? 影响微生物菌种稳定性的因素,
a）变异； b）污染； c）死亡
第一节 菌种的衰退和复壮
? 在微生物的基础研究和应用研究中，选育
一株理想的菌株是一件艰苦的工作，而欲
使菌种始终保持优良性状的遗传稳定性，
便于长期使用，还需要做很多日常的工作。
实际上，由于各种各样的原因，要使菌种
永远不变是不可能的，菌种衰退是一种潜
在的威胁。只有掌握了菌种衰退的某些规
律，才能采取相应的措施，尽量减少菌种
的衰退或使已衰退的菌种得以复壮。
一、菌种的衰退
? 菌种衰退（ degeneration）是指由于自
发突变的结果，而使某物种原有的一系列
生物学性状发生量变或质变的现象。
纯菌种
自发突变
突变个体
传代增殖
原始个体
不纯菌种 衰退菌种
（一）菌种衰退的现象
? 菌落和细胞形态改变
? 生长速度缓慢，产孢子越来越少
? 代谢产物生产能力下降，即出现负突变
? 致病菌对宿主侵染能力下降
? 对外界不良条件的抵抗能力下降等
（二）菌种衰退的原因
? 基因突变 －－主要原因
1、有关基因发生负突变导致菌种衰退
2、表型延迟造成菌种衰退
3、质粒脱落导致菌种衰退
? 连续传代 －－加速衰退
? 不适宜的培养和保藏条件 －－加速衰退
（三）菌种衰退的防止
? 控制传代次数
? 创造良好的培养条件
? 利用不易衰退的细胞移种传代
? 采用有效的菌种保藏方法
? 讲究菌种选育技术
? 定期进行分离纯化
二、菌种的复壮
? 狭义的复壮 －－消极的措施
是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯
种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已
衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达
到恢复原菌株固有性状的相应措施。
? 广义的复壮 －－积极的措施
是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰
退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性
状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个
体。
菌种复壮的主要方法
? 纯种分离法
菌落纯（“菌种纯”）
细胞纯（“菌株纯”）
通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体
中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离
出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性
状。
? 宿主体内复壮法
对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接
种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的
毒性。
? 淘汰法
将衰退菌种进行一定的处理（如药
物、低温、高温等），往往可以起到淘
汰已衰退个体而达到复壮的目的。
? 遗传育种法
把退化的菌种重新进行遗传育
种，从中再选出高产而不易退化的
稳定性较好的生产菌种。
第二节 菌种的保藏
菌种是重要的生物资源，研究和选择良
好的菌种保藏方法具有重要的意义。
一、菌种保藏的目的
? 菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持
其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死
亡、不变异、不被污染，以达到便于研究,
交换和使用等诸方面的需要。
二、菌种保藏的原理
? 首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行
保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢
子、芽孢等。
? 其次应人为地创造环境条件（如,干
燥、低温和缺氧 ），使微生物长期处
于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休
眠状态。
? 尽可能多的采用不同的手段保藏
一些比较重要的微生物菌株
三、菌种保藏方法
? 各种微生物由于遗传特性不同，
因此适合采用的保藏方法也不一
样。一种良好的有效保藏方法，
首先应能保持原菌种的优良性状
长期不变，同时还须考虑方法的
通用性、操作的简便性和设备的
普及性。
? 斜面低温保藏法
? 石蜡油封藏法
? 砂土管保藏法
? 麸皮保藏法
? 甘油悬液保藏法
? 冷冻真空干燥保藏法
? 液氮超低温保藏法
? 宿主保藏法
（一）斜面低温保藏法 －－常用保藏法
? 将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全
后，臵于 4℃ 左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏
期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏,
如此连续不断。
? 此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏
? 此法的主要保藏措施是低温。一般可保存 1～ 6
个月左右。
? 优点是简便易行，容易推广，存活率高；缺点
是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期
短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污
染。
（二）石蜡油封藏法
? 此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体
石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）
上，石蜡油层高出斜面顶端 1cm，使培养物与空气隔绝,
加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或 4℃ 冰箱内
保藏。
? 此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏
不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。
? 此法的主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保
存 1～ 2年左右。
（三）砂土管保藏法
? 一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的
微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的
细菌及酵母则不适用。
? 砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等
诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物
移接方便，经济简便。它的保藏期约 1～ 10年。
? 该法是将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例
分装于小试管中，砂土的高度约 1cm,121℃ 蒸汽灭菌 1～
1.5h，间歇灭菌 3次。 50℃ 烘干后经检查无误后备用。将
待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线
菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后臵于干燥器
中抽真空约 2～ 4h，用火焰熔封管口 (或用石蜡封口 )，臵
于干燥器中，在室温或 4℃ 冰箱内保藏。
（四）麸皮保藏法
? 又称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然
后在低温干燥条件下保存。其制作方法是，将麸皮与水
以一定的比例拌匀，装量为试管体积 2/5，湿热灭菌后经
冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将
试管臵于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干
燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔
封，再保藏，则效果更好。
? 此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏
期在 1年以上。因操作简单、经济实惠，工厂较
多采用。
（五）甘油悬液保藏法
? 此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，臵于低温下
保藏，本法较简便，但需臵备低温冰箱。保藏温
度若采用－ 20℃,保藏期约为 0.5～ 1年，而采用
－ 70℃,保藏期可达 10年。
? 将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经
121℃ 蒸汽灭菌 20min的甘油混合，并使
甘油的终浓度在 10％～ 15％，再分装于
小离心管中，臵低温冰箱中保藏。
? 基因工程菌常采用本法保藏。
（六）冷冻真空干燥保藏法
? 又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂
制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再
在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华
将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空
条件下立即熔封，造成无氧真空环境，最后臵于低温下，
使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。
? 此法适用于各大类微生物。
? 此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有
保护剂，保藏期一般长达 5～ 15年，存活率高,
变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想
的
保藏方法。
? 该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻
干机等设备。
（七）液氮超低温保藏法
? 简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等
作为保护剂，在液氮超低温（－ 196℃ ）下保藏的方法。
其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低
温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免
膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。
? 此法适用于各种微生物菌种的保藏。
? 此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂，保
藏期一般可达到 15年以上，是目前公认的最有
效的菌种长期保藏技术之一。
? 此法的优点是操作简便、高效，且可使用各种
培养形式的微生物进行保藏。其缺点是需购臵
超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用
较高。
（八）宿主保藏法
? 此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、
立克次氏体等）。
? 植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合，
冷冻或干燥保存。
? 噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基
混合直接保存。
? 动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器或体
液，然后分装于试管中密封，低温保存。
? 在上述的菌种保藏方法中，以斜面低温保
藏法、石蜡油封藏法、宿主保藏法最为简
便；砂土管保藏法、麸皮保藏法和甘油悬
液保藏法次之；以冷冻真空干燥保藏法和
液氮超低温保藏法最为复杂，但其保藏效
果最好。应用时，可根据实际需要选用。
? 美国 ATCC采用冷冻干燥保藏法和
液氮保藏法来保藏所有菌种。
? 我国 CCCCM采用斜面低温保藏法,
冷冻干燥保藏法和液氮保藏法进
行菌种保藏。
ATCC采用的两种保藏方法的优点示意图
第一节 菌种的衰退和复壮
一、菌种的衰退
二、菌种的复壮
第二节 菌种的保藏
一、菌种保藏的目的
二、菌种保藏的原理
三、菌种保藏的方法
? 性状稳定的菌种是微生物工作最
重要的基本要求，否则生产或科研
都无法正常进行。
? 影响微生物菌种稳定性的因素,
a）变异； b）污染； c）死亡
第一节 菌种的衰退和复壮
? 在微生物的基础研究和应用研究中，选育
一株理想的菌株是一件艰苦的工作，而欲
使菌种始终保持优良性状的遗传稳定性，
便于长期使用，还需要做很多日常的工作。
实际上，由于各种各样的原因，要使菌种
永远不变是不可能的，菌种衰退是一种潜
在的威胁。只有掌握了菌种衰退的某些规
律，才能采取相应的措施，尽量减少菌种
的衰退或使已衰退的菌种得以复壮。
一、菌种的衰退
? 菌种衰退（ degeneration）是指由于自
发突变的结果，而使某物种原有的一系列
生物学性状发生量变或质变的现象。
纯菌种
自发突变
突变个体
传代增殖
原始个体
不纯菌种 衰退菌种
（一）菌种衰退的现象
? 菌落和细胞形态改变
? 生长速度缓慢，产孢子越来越少
? 代谢产物生产能力下降，即出现负突变
? 致病菌对宿主侵染能力下降
? 对外界不良条件的抵抗能力下降等
（二）菌种衰退的原因
? 基因突变 －－主要原因
1、有关基因发生负突变导致菌种衰退
2、表型延迟造成菌种衰退
3、质粒脱落导致菌种衰退
? 连续传代 －－加速衰退
? 不适宜的培养和保藏条件 －－加速衰退
（三）菌种衰退的防止
? 控制传代次数
? 创造良好的培养条件
? 利用不易衰退的细胞移种传代
? 采用有效的菌种保藏方法
? 讲究菌种选育技术
? 定期进行分离纯化
二、菌种的复壮
? 狭义的复壮 －－消极的措施
是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯
种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已
衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达
到恢复原菌株固有性状的相应措施。
? 广义的复壮 －－积极的措施
是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰
退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性
状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个
体。
菌种复壮的主要方法
? 纯种分离法
菌落纯（“菌种纯”）
细胞纯（“菌株纯”）
通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体
中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离
出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性
状。
? 宿主体内复壮法
对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接
种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的
毒性。
? 淘汰法
将衰退菌种进行一定的处理（如药
物、低温、高温等），往往可以起到淘
汰已衰退个体而达到复壮的目的。
? 遗传育种法
把退化的菌种重新进行遗传育
种，从中再选出高产而不易退化的
稳定性较好的生产菌种。
第二节 菌种的保藏
菌种是重要的生物资源，研究和选择良
好的菌种保藏方法具有重要的意义。
一、菌种保藏的目的
? 菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持
其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死
亡、不变异、不被污染，以达到便于研究,
交换和使用等诸方面的需要。
二、菌种保藏的原理
? 首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行
保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢
子、芽孢等。
? 其次应人为地创造环境条件（如,干
燥、低温和缺氧 ），使微生物长期处
于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休
眠状态。
? 尽可能多的采用不同的手段保藏
一些比较重要的微生物菌株
三、菌种保藏方法
? 各种微生物由于遗传特性不同，
因此适合采用的保藏方法也不一
样。一种良好的有效保藏方法，
首先应能保持原菌种的优良性状
长期不变，同时还须考虑方法的
通用性、操作的简便性和设备的
普及性。
? 斜面低温保藏法
? 石蜡油封藏法
? 砂土管保藏法
? 麸皮保藏法
? 甘油悬液保藏法
? 冷冻真空干燥保藏法
? 液氮超低温保藏法
? 宿主保藏法
（一）斜面低温保藏法 －－常用保藏法
? 将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全
后，臵于 4℃ 左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏
期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏,
如此连续不断。
? 此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏
? 此法的主要保藏措施是低温。一般可保存 1～ 6
个月左右。
? 优点是简便易行，容易推广，存活率高；缺点
是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期
短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污
染。
（二）石蜡油封藏法
? 此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体
石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）
上，石蜡油层高出斜面顶端 1cm，使培养物与空气隔绝,
加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或 4℃ 冰箱内
保藏。
? 此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏
不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。
? 此法的主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保
存 1～ 2年左右。
（三）砂土管保藏法
? 一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的
微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的
细菌及酵母则不适用。
? 砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等
诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物
移接方便，经济简便。它的保藏期约 1～ 10年。
? 该法是将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例
分装于小试管中，砂土的高度约 1cm,121℃ 蒸汽灭菌 1～
1.5h，间歇灭菌 3次。 50℃ 烘干后经检查无误后备用。将
待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线
菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后臵于干燥器
中抽真空约 2～ 4h，用火焰熔封管口 (或用石蜡封口 )，臵
于干燥器中，在室温或 4℃ 冰箱内保藏。
（四）麸皮保藏法
? 又称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然
后在低温干燥条件下保存。其制作方法是，将麸皮与水
以一定的比例拌匀，装量为试管体积 2/5，湿热灭菌后经
冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将
试管臵于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干
燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔
封，再保藏，则效果更好。
? 此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏
期在 1年以上。因操作简单、经济实惠，工厂较
多采用。
（五）甘油悬液保藏法
? 此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，臵于低温下
保藏，本法较简便，但需臵备低温冰箱。保藏温
度若采用－ 20℃,保藏期约为 0.5～ 1年，而采用
－ 70℃,保藏期可达 10年。
? 将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经
121℃ 蒸汽灭菌 20min的甘油混合，并使
甘油的终浓度在 10％～ 15％，再分装于
小离心管中，臵低温冰箱中保藏。
? 基因工程菌常采用本法保藏。
（六）冷冻真空干燥保藏法
? 又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂
制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再
在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华
将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空
条件下立即熔封，造成无氧真空环境，最后臵于低温下，
使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。
? 此法适用于各大类微生物。
? 此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有
保护剂，保藏期一般长达 5～ 15年，存活率高,
变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想
的
保藏方法。
? 该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻
干机等设备。
（七）液氮超低温保藏法
? 简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等
作为保护剂，在液氮超低温（－ 196℃ ）下保藏的方法。
其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低
温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免
膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。
? 此法适用于各种微生物菌种的保藏。
? 此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂，保
藏期一般可达到 15年以上，是目前公认的最有
效的菌种长期保藏技术之一。
? 此法的优点是操作简便、高效，且可使用各种
培养形式的微生物进行保藏。其缺点是需购臵
超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用
较高。
（八）宿主保藏法
? 此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、
立克次氏体等）。
? 植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合，
冷冻或干燥保存。
? 噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基
混合直接保存。
? 动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器或体
液，然后分装于试管中密封，低温保存。
? 在上述的菌种保藏方法中，以斜面低温保
藏法、石蜡油封藏法、宿主保藏法最为简
便；砂土管保藏法、麸皮保藏法和甘油悬
液保藏法次之；以冷冻真空干燥保藏法和
液氮超低温保藏法最为复杂，但其保藏效
果最好。应用时，可根据实际需要选用。
? 美国 ATCC采用冷冻干燥保藏法和
液氮保藏法来保藏所有菌种。
? 我国 CCCCM采用斜面低温保藏法,
冷冻干燥保藏法和液氮保藏法进
行菌种保藏。
ATCC采用的两种保藏方法的优点示意图
